Digitalt PCR-baseret konkurrencemæssigt indeks til analyse af egnethed til salmonella med høj gennemløb
Summary
Denne molekylære tilgang til bestemmelse af bakterie egnethed letter præcis og præcis påvisning af mikroorganismer ved hjælp af unikke genomiske DNA-stregkoder, der kvantificeres via Digital PCR. Protokollen beskriver beregningen af konkurrence indekset for salmonella stammer teknologien er dog let at tilpasse til protokoller, der kræver absolut kvantificering af enhver genetisk-formbare organisme.
Abstract
Et konkurrencepræget indeks er en almindelig metode, der anvendes til at vurdere bakteriel kondition og/eller virulens. Nytten af denne tilgang er eksemplificeret ved sin lethed at udføre og dens evne til at standardisere egnetheden af mange stammer til en vild-type organisme. Teknikken er imidlertid begrænset af tilgængelige fænotypiske markører og antallet af stammer, der kan vurderes samtidigt, hvilket skaber behov for et stort antal replikat eksperimenter. Samtidig med et stort antal eksperimenter er arbejds-og materialeomkostningerne ved kvantificering af bakterier baseret på fænotypiske markører ikke ubetydelige. For at overvinde disse negative aspekter, samtidig med at de positive aspekter bevares, har vi udviklet en molekyl baseret tilgang til direkte kvantificering af mikroorganismer efter ingeniør genetiske markører på bakterielle kromosomer. Unikke, 25 base pair DNA stregkoder blev indsat på en harmløs locus på kromosom af vilde-type og mutant stammer af salmonella. In vitro konkurrence eksperimenter blev udført ved hjælp af inocula bestående af poolede stammer. Efter konkurrencen blev det absolutte antal af hver stamme kvantificeret ved hjælp af digital PCR, og de konkurrencemæssige indekser for hver stamme blev beregnet ud fra disse værdier. Vores data indikerer, at denne tilgang til kvantificering af salmonella er ekstremt følsom, præcis og præcis til påvisning af både meget rigelige (høj kondition) og sjældne (lavt konditions) mikroorganismer. Desuden er denne teknik let kan tilpasses til næsten enhver organisme med kromosomer i stand til modifikation, samt til forskellige eksperimentelle design, der kræver absolut kvantificering af mikroorganismer.
Introduction
Vurdering af egnethed og virulens af patogene organismer er et grundlæggende aspekt af Mikrobiologi forskning. Det gør det muligt at foretage sammenligninger mellem stammer eller mellem muterede organismer, hvilket gør det muligt for forskerne at bestemme betydningen af visse gener under særlige forhold. Traditionelt, virulens vurdering anvender en dyremodel af infektion ved hjælp af forskellige bakteriestammer og observere resultatet af det inficerede dyr (f. eks infektiøs dosis50, dødelig dosis50, tid til døden, symptom sværhedsgrad, manglende symptomer osv.). Denne procedure giver værdifulde beskrivelser af virulens, men det kræver stammer til at forårsage betydelige forskelle i resultaterne for at opdage variationer fra vildtype. Desuden er resultaterne semi-kvantitative, fordi mens sygdomsprogression og symptom sværhedsgrad kan kvantificeres subjektivt over tid, er fortolkningen af virulens sammenlignet med vildtype mere kvalitativ (dvs. mere, mindre eller lige så virulent). Et fælles alternativ til at udføre dyre infektivitetsanalyser er at generere konkurrencebaserede indekser (CIs), værdier, der direkte sammenligner egnethed eller virulens af en stamme til en vildtype modpart i en blandet infektion1. Denne teknik har talrige fordele i forhold til en traditionel dyremodel af infektion ved at standardisere virulens til en vild-type stamme og bestemme en kvantificerbar værdi for at afspejle graden af dæmpning. Denne teknik kan også tilpasses til at analysere geninteraktioner i bakterier ved at bestemme en annulleret ud konkurrencedygtig indeks (COI)2. Ved at beregne en COI for en gruppe af muterede organismer kan forskerne afgøre, om to gener selvstændigt bidrager til patogenesen, eller om de er involveret i den samme virulens pathway og afhængige af hinanden. Derudover, beregning af en CI kræver opregning af bakterier, som kan give værdifuld indsigt i patogenesen af organismer. CIs og COIs giver også forskerne mulighed for at æde apulent stammer, der ikke forårsager klinisk sygdom, men stadig har forskelle i fitness. Denne teknik er begrænset af brugen af traditionelle antibiotikaresistensmarkører til at identificere stammer, og derved begrænse antallet af input stammer til kun en eller to ad gangen. På grund af denne begrænsning er der behov for et stort antal eksperimentelle grupper og replikater, hvilket ud over at tilføje til arbejdskraft-og materialeomkostninger også øger mulighederne for variation i eksperimentelle forhold og unøjagtige resultater. (For en grundig gennemgang af fordele og anvendelser ved at bruge blandede infektioner til at studere virulens, fitness, og gener interaktioner, Se C.R. Beuzón og D.W. Holden 1)
Der er gjort forsøg på at overvinde denne begrænsning, såsom brugen af fluorescently-mærkede celler kvantificeret via flowcytometri3,4,5. Denne teknik kvantificerer celler ved hjælp af enten 1) mærkede antistoffer mod fænotypiske markører eller 2) endogent producerede fluorescerende proteiner. Brugen af mærkede antistoffer har en grænse for påvisning af 1.000 celler/mL, og derfor kræver et stort antal celler til at analysere3. Celler, der udtrykker fluorescerende proteiner, har en ændret fysiologi og er modtagelige for konditions ændringer som følge af højt protein udtryk6. Begge metoder er begrænset af antallet af fluorescerende markører detekterbar ved hjælp af flow cytometri. En avancement i molekyl kvantificering blev opnået gennem udvikling af en mikroarray teknik, der detekterede dæmpning i 120 stammer fra en indledende blandet infektion på over 1.000 stammer i en murine model7. Denne teknik udnyttede en mikroarray analyse af RNA fra muterede stammer, hvilket fører til betydelig variation i resultatet. Ikke desto mindre fastslog den, at store puljer af blandede infektioner kan være et nyttigt redskab, og at der ved at anvende følsomme detekterings teknikker kan identificeres forskelle i bakteriel virulens. Med udviklingen af den næste generation sekvens, TN-SEQ udvidet nytten af gennemførelse af mutationer, muliggør en kraftfuld metode til kvantificering af bakterier, der blev tilfældigt muteret8,9,10, 11. En alternativ protokol blev for nylig udviklet, der eliminerer behovet for transposoner og i stedet bruger DNA stregkoder til lettere at identificere og spore genomændringer og deres indvirkning på fitness12. Denne teknologi er et stort fremskridt, men indsættelsen af de genomiske stregkoder er stadig en tilfældig proces. For at overvinde tilfældighed af tidligere eksperimenter, Yoon et al. udviklet en metode til at beregne CIs af salmonella stammer ved hjælp af unikke DNA stregkoder indsat på præcise steder på kromosomer af bakterier13. Unikke barkodede stammer blev detekteret ved hjælp af en qPCR-baseret metode med sybr grøn og primere specifikke for hver unik stregkode. Teknikken var begrænset af begrænsninger pålagt af qPCR, herunder forskelle i primer-effektivitet og lav følsomhed, hvilket fremgår af behovet for indlejret-PCR før qPCR. Ikke desto mindre viste denne tilgang, at målrettede genomændringer kunne udnyttes til påvisning og potentielt kvantificering af puljer af flere bakteriestammer.
I den følgende protokol beskriver vi en ny metode til at udføre bakterielle konkurrence eksperimenter med store puljer af blandet inocula efterfulgt af nøjagtig kvantificering ved hjælp af en meget følsom digital PCR-teknik. Protokollen indebærer genetisk mærkning bakteriestammer med en unik DNA-stregkode indsat på en uskadelige region af kromosom. Denne ændring gør det muligt at kvantificere stammer hurtigt og præcist ved hjælp af moderne Molekylær teknologi i stedet for traditionelle serielle fortyndinger, replika plating og tælle kolonidannende enheder, der er afhængige af fænotypiske markører (dvs. antibiotikaresistens ). Ændringerne giver mulighed for samtidig vurdering af mange stammer i et enkelt puljede inoculum, hvilket væsentligt reducerer muligheden for eksperimentel variabilitet, fordi alle stammer er udsat for nøjagtig samme betingelser. Desuden, mens denne teknik blev udviklet i Salmonella enterica blev typhimurium, det er meget tilpasningsdygtig til enhver genetisk formbar organisme og næsten enhver eksperimentel design, hvor nøjagtige bakterietal er påkrævet, hvilket giver en ny værktøj til at øge nøjagtighed og gennemløb i mikrobiologiske laboratorier uden begrænsninger pålagt af tidligere metoder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evnen til præcist at kvantificere mikroorganismer er af afgørende betydning for Mikrobiologi forskning, og evnen til at optælle unikke stammer fra en indledende blandet befolkning har vist sig at være et uvurderligt værktøj til vurdering af egnethed og virulens træk i Bakterier. Men de teknikker til at opnå dette har ikke udviklet sig i takt med den moderne udvikling i molekylær biologi. Teknologien til nemt at ændre kromosomer af mange bakterier, herunder S. Typhimurium, har været tilgængelig i næs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af George F. Haddix præsidentens Fakultets forskningsfond og National Institute of General Medical Science af National Institutes of Health (NIH) under tildeling nummer GM103427. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis repræsenterer de officielle synspunkter af de nationale institutter for sundhed.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
| 16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
| 5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
| 5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
| Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
| BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
| C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
| Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
| Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
| Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
| Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
| PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
| Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
| pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
| Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
| pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
| PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
| S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
| Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
| Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
| Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
| Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
| UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
| Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |
References
- Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
- Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
- Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
- Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
- Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
- Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
- Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
- Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
- Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
- Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
- McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
- Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
- Freter, R., O’Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
- Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
- Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
- Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
- Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
- Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
- Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
- Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
- Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
- Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).
