जीवाणु फिटनेस का निर्धारण करने के लिए यह आणविक आधारित दृष्टिकोण अद्वितीय जीनोमिक डीएनए बारकोड का उपयोग कर सूक्ष्मजीवों का सटीक और सटीक पता लगाने की सुविधा देता है जो डिजिटल पीसीआर के माध्यम से परिमाणित होते हैं। प्रोटोकॉल साल्मोनेला उपभेदों के लिए प्रतिस्पर्धी सूचकांक की गणना का वर्णन करता है; हालांकि, प्रौद्योगिकी आसानी से किसी भी आनुवंशिक रूप से मैले करने योग्य जीव के पूर्ण परिमाणीकरण की आवश्यकता प्रोटोकॉल के लिए अनुकूल है.
एक प्रतिस्पर्धी सूचकांक एक आम तरीका है जीवाणु फिटनेस और / इस दृष्टिकोण की उपयोगिता प्रदर्शन करने के लिए अपनी आसानी और एक जंगली प्रकार के जीव के लिए कई उपभेदों की फिटनेस मानकीकृत करने की क्षमता से उदाहरण है. तकनीक सीमित है, तथापि, उपलब्ध phenotypic मार्करों और उपभेदों कि एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है की संख्या से, दोहराने प्रयोगों की एक बड़ी संख्या के लिए की जरूरत पैदा. प्रयोगों की बड़ी संख्या के साथ समवर्ती, phenotypic मार्करों के आधार पर बैक्टीरिया की मात्रा निर्धारित करने के लिए श्रम और सामग्री की लागत नगण्य नहीं हैं. सकारात्मक पहलुओं को बनाए रखते हुए इन नकारात्मक पहलुओं पर काबू पाने के लिए, हमने जीवाणु गुणसूत्रों पर आनुवंशिक मार्करों को इंजीनियरिंग के बाद सीधे सूक्ष्मजीवों की मात्रा निर्धारित करने के लिए आणविक-आधारित दृष्टिकोण विकसित किया है। अद्वितीय, 25 आधार जोड़ी डीएनए बारकोड जंगली प्रकार और साल्मोनेलाके उत्परिवर्ती उपभेदों के गुणसूत्र पर एक अहानिकर टिड्डी पर डाला गया था। इन विट्रो प्रतियोगिता प्रयोगों में पूल्ड उपभेदों से मिलकर inocula का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया. प्रतियोगिता के बाद, प्रत्येक तनाव की निरपेक्ष संख्या डिजिटल पीसीआर का उपयोग कर मात्रा निर्धारित की गई थी और प्रत्येक तनाव के लिए प्रतिस्पर्धी सूचकांक उन मूल्यों से गणना की गई. हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि Salmonella मात्रा निर्धारित करने के लिए इस दृष्टिकोण बेहद संवेदनशील है, सटीक, और दोनों अत्यधिक प्रचुर मात्रा में (उच्च फिटनेस) और दुर्लभ (कम फिटनेस) सूक्ष्मजीवों का पता लगाने के लिए सटीक. इसके अतिरिक्त, इस तकनीक को आसानी से संशोधन करने में सक्षम गुणसूत्रों के साथ लगभग किसी भी जीव के लिए अनुकूल है, साथ ही विभिन्न प्रयोगात्मक डिजाइन है कि सूक्ष्मजीवों की पूर्ण परिमाणीकरण की आवश्यकता है.
रोगजनक जीवों की फिटनेस और उग्रता का आकलन माइक्रोबायोलॉजी अनुसंधान का एक मूलभूत पहलू है। यह उपभेदों के बीच या उत्परिवर्तित जीवों के बीच तुलना करने के लिए सक्षम बनाता है, जो शोधकर्ताओं विशिष्ट परिस्थितियों के तहत कुछ जीन के महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. परंपरागत रूप से, उग्र मूल्यांकन विभिन्न जीवाणु उपभेदों का उपयोग कर संक्रमण के एक पशु मॉडल का इस्तेमाल करता है और संक्रमित जानवर के परिणाम को देख (जैसे संक्रामक खुराक50, घातक खुराक50, मौत के लिए समय, लक्षण गंभीरता, की कमी लक्षण, आदि). इस प्रक्रिया उग्रता के मूल्यवान विवरण प्रदान करता है, लेकिन यह क्रम में जंगली प्रकार से विविधताओं का पता लगाने के लिए परिणामों में काफी मतभेद पैदा करने के लिए उपभेदों की आवश्यकता है. इसके अलावा, परिणाम अर्द्ध मात्रात्मक हैं क्योंकि जबकि रोग प्रगति और लक्षण गंभीरता व्यक्तिपरक समय के साथ परिमाणित किया जा सकता है, जंगली प्रकार की तुलना में उग्रता की व्याख्या अधिक गुणात्मक है (यानी अधिक, कम, या समान रूप से उग्र). पशु infectivity परख प्रदर्शन करने के लिए एक आम विकल्प प्रतिस्पर्धी सूचकांक (सीआईए) उत्पन्न करने के लिए है, मूल्यों है कि सीधे फिटनेस या एक मिश्रित संक्रमण1में एक जंगली प्रकार समकक्ष करने के लिए एक तनाव की उग्रता की तुलना. इस तकनीक को एक जंगली प्रकार तनाव के लिए उग्रता मानकीकृत और क्षीणन की डिग्री को प्रतिबिंबित करने के लिए एक परिमाणात्मक मूल्य का निर्धारण द्वारा संक्रमण के एक पारंपरिक पशु मॉडल पर कई फायदे हैं. इस तकनीक को बैक्टीरिया में जीन इंटरैक्शन का विश्लेषण करने के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है, जो रद्द प्रतिस्पर्धी सूचकांक (सीओआई)2का निर्धारण करके किया जा सकता है। उत्परिवर्तित जीवों के एक समूह के लिए एक सीओआई की गणना शोधकर्ताओं को निर्धारित करने के लिए कि क्या दो जीन स्वतंत्र रूप से रोगजनन में योगदान या यदि वे एक ही उग्रता मार्ग में शामिल हैं और एक दूसरे पर निर्भर करने की अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, सीआई की गणना करने के लिए बैक्टीरिया की गणना की आवश्यकता होती है जो जीवों के रोगजनन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। CIs और COIs भी शोधकर्ताओं avirulent उपभेदों कि नैदानिक रोग का कारण नहीं है, लेकिन अभी भी फिटनेस में मतभेद है का आकलन करने के लिए अनुमति देते हैं. इस तकनीक को पारंपरिक एंटीबायोटिक प्रतिरोध मार्करों के उपयोग के लिए उपभेदों की पहचान द्वारा सीमित है, जिससे एक समय में केवल एक या दो के लिए इनपुट उपभेदों की संख्या सीमित. इस सीमा के कारण, प्रयोगात्मक समूहों और प्रतिकृति की बड़ी संख्या की आवश्यकता है, जो श्रम और सामग्री की लागत को जोड़ने के अलावा, भी प्रयोगात्मक स्थितियों और गलत परिणामों में परिवर्तनशीलता के लिए अवसर बढ़ जाती है. (उग्रता, फिटनेस, और जीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए मिश्रित संक्रमण का उपयोग करने के लाभों और अनुप्रयोगों की पूरी तरह से समीक्षा के लिए, C.R. Beuzn और D.W. Holden 1) देखें
इस सीमा को दूर करने के प्रयास किए गए हैं, जैसे प्रवाह साइटोमेट्री3,4,5के माध्यम से मात्रा निर्धारित फ्लोरोसेंट-लेबल कोशिकाओं का उपयोग । इस तकनीक या तो का उपयोग कर कोशिकाओं की मात्रा 1) phenotypic मार्करों या 2 के लिए एंटीबॉडी लेबल अंतर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उत्पादन किया. लेबल किए गए एंटीबॉडी के उपयोग में 1,000 कोशिकाओं/एमएल का पता लगाने की सीमा होती है, और इसलिए3का विश्लेषण करने के लिए उच्च संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली कोशिकाओं में शरीर क्रिया विज्ञान बदल जाता है और उच्च प्रोटीन अभिव्यक्ति6के परिणामस्वरूप फिटनेस परिवर्तन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं . दोनों तरीकों प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करने का पता लगाने योग्य फ्लोरोसेंट मार्करों की संख्या द्वारा सीमित कर रहे हैं. आण्विक परिमाणीकरण में प्रगति एक माइक्रोरेरे तकनीक के विकास के माध्यम से प्राप्त की गई थी , जिसने एक म्यूरीन मॉडल7में 1,000 से अधिक उपभेदों के प्रारंभिक मिश्रित संक्रमण से 120 उपभेदों में क्षीणन का पता लगाया था . इस तकनीक उत्परिवर्तित उपभेदों से आरएनए के एक microarray विश्लेषण का उपयोग किया, जो परिणाम में काफी परिवर्तनशीलता के लिए नेतृत्व. फिर भी, यह स्थापित किया है कि मिश्रित संक्रमण के बड़े पूल एक उपयोगी उपकरण हो सकता है और संवेदनशील पता लगाने की तकनीक का उपयोग करके, जीवाणु उग्रता में मतभेद की पहचान की जा सकती है. अगली पीढ़ी अनुक्रमण के विकास के साथ, Tn-सेक transposon उत्परिवर्तनों की उपयोगिता का विस्तार, बैक्टीरिया हैकि बेतरतीब ढंग से उत्परिवर्तित 8,9,10थे परिमाणित करने के लिए एक शक्तिशाली विधि को सक्षम करने, 11| हाल ही में एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल विकसित किया गया था जो ट्रांसपोसन की आवश्यकता को समाप्त करताहै और इसके बजाय डीएनए बारकोड का उपयोग जीनोमिक परिवर्तनों की और फिटनेस पर उनके प्रभाव को आसानी से पहचानने और ट्रैक करने के लिए करता है . यह तकनीक एक प्रमुख प्रगति है, लेकिन जीनोमिक बारकोड की प्रविष्टि अभी भी एक यादृच्छिक प्रक्रिया है. पिछले प्रयोगों की randomness पर काबू पाने के लिए, Yoon एट अल. बैक्टीरिया13के गुणसूत्रों पर सटीक स्थानों पर डाला अद्वितीय डीएनए बारकोड का उपयोग कर Salmonella उपभेदों के CIs की गणना करने के लिए एक विधि विकसित की है। अद्वितीय बारकोड उपभेदों प्रत्येक अद्वितीय बारकोड के लिए विशिष्ट SYBR हरे और प्राइमर के साथ एक QPCR आधारित विधि का उपयोग कर पाया गया. तकनीक QPCR द्वारा लगाए गए बाधाओं द्वारा सीमित किया गया था, प्राइमर क्षमता और कम संवेदनशीलता में मतभेद सहित, नेस्टेड-पीसीआर के लिए की आवश्यकता से पहले द्वारा सबूत QPCR. फिर भी, इस दृष्टिकोण का प्रदर्शन किया है कि लक्षित जीनोमिक संशोधनों का पता लगाने और कई जीवाणु उपभेदों के संभावित परिमाणात्मक पूल के लिए शोषण किया जा सकता है.
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम मिश्रित inocula के बड़े पूल के साथ जीवाणु प्रतियोगिता प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक उपन्यास पद्धति का वर्णन एक अत्यधिक संवेदनशील डिजिटल पीसीआर तकनीक का उपयोग कर सटीक परिमाणीकरण के बाद. प्रोटोकॉल में गुणसूत्र के अहानिकर क्षेत्र पर सम्मिलित एक अद्वितीय डीएनए बारकोड के साथ आनुवंशिक रूप से लेबल जीवाणु उपभेदों शामिल है। इस संशोधन उपभेदों जल्दी और सही पारंपरिक धारावाहिक कमजोर पड़ने के बजाय आधुनिक आणविक प्रौद्योगिकी का उपयोग कर मात्रा निर्धारित करने की अनुमति देता है, प्रतिकृति चढ़ाना, और गिनती कॉलोनी बनाने इकाइयों है कि phenotypic मार्करों पर भरोसा करते हैं (यानी एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रतिरोध ). संशोधनों एक एकल पूल inoculum में कई उपभेदों के एक साथ मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं, काफी हद तक प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता की संभावना को कम करने क्योंकि सभी उपभेदों सटीक एक ही स्थिति को उजागर कर रहे हैं. इसके अलावा, जबकि इस तकनीक Salmonella enterica serovar Typhimurium में विकसित किया गया था, यह अत्यधिक किसी भी आनुवंशिक रूप से आघात करने योग्य जीव और लगभग किसी भी प्रयोगात्मक डिजाइन जहां सटीक जीवाणु गिनती की आवश्यकता है के लिए अनुकूलनीय है, एक नया प्रदान उपकरण पिछले तरीकों द्वारा लगाए गए बाधाओं के बिना सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं में सटीकता और थ्रूपुट बढ़ाने के लिए।
सूक्ष्मजीवों की सही मात्रा निर्धारित करने की क्षमता सूक्ष्म जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए सर्वोपरि महत्व की है, और एक प्रारंभिक मिश्रित आबादी से अद्वितीय उपभेदों की गणना करने की क्षमता में फिटनेस और उ?…
The authors have nothing to disclose.
इस प्रकाशन में रिपोर्ट अनुसंधान जॉर्ज एफ Haddix राष्ट्रपति संकाय अनुसंधान कोष और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (NIH) के जनरल मेडिकल साइंस संस्थान द्वारा पुरस्कार संख्या GM103427 के तहत समर्थित किया गया था. सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व नहीं करता है.
1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | Procure from any manufacturer |
16 mL culture tubes | MidSci | 8599 | Procure from any manufacturer |
5-200 μL pipette tips | RAININ | 30389241 | Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality |
5-50 μL multichannel pipette | RAININ | 17013804 | Use alternative multichannel pipettes with caution |
Agarose | ThermoFisher Scientific | BP160-500 | Procure from any manufacturer |
BLAST Analysis | NCBI | N/A | https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi |
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module | Bio Rad | 1851197 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
Chemically competent DH5α | Invitrogen | 18258012 | Procure from any manufacturer or prepare yourself |
Chloramphenicol | ThermoFisher Scientific | BP904-100 | Procure from any manufacturer |
Cytation5 Microplate reader | BioTek | CYT5MF | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) | Bio Rad | N/A | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
ddPCR 96-Well Plates | Bio Rad | 12001925 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
ddPCR Droplet Reader Oil | Bio Rad | 1863004 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | Bio Rad | 1863024 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1864008 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator | Bio Rad | 1863009 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
Droplet Generation Oil for Probes | Bio Rad | 1863005 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
Kanamycin | ThermoFisher Scientific | BP906-5 | Procure from any manufacturer |
Luria-Bertani agar | ThermoFisher Scientific | BP1425-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl |
Luria-Bertani broth | ThermoFisher Scientific | BP1426-2 | Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl |
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable | Bio Rad | 1814040 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
PCR Tubes | Eppendorf | 951010022 | Procure from any manufacturer |
Petri dishes | ThermoFisher Scientific | FB0875712 | Procure from any manufacturer |
pPCR Script Cam SK+ | Stratagene/Agilent | 211192 | No longer available commercially |
Primer/Probe Design | IDT | N/A | https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index |
pSKAP and pSKAP_Barcodes | Addgene | Plasmid numbers 122702-122726 | www.addgene.org |
PX1 PCR Plate Sealer | Bio Rad | 1814000 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
QX200 Droplet Generator | Bio Rad | 1864002 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
QX200 Droplet Reader | Bio Rad | 1864003 | Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available. |
S. Typhimurium strain ATCC 14028s | ATCC | ATCC 14028s | www.atcc.org |
Take3 Micro-Volume Plate | BioTek | TAKE3 | Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA |
Thermo Scientific FastDigest BamHI | ThermoFisher Scientific | FERFD0054 | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific FastDigest DpnI | ThermoFisher Scientific | FERFD1704 | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific FastDigest HindIII | ThermoFisher Scientific | FERFD0504 | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0832 | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit | ThermoFisher Scientific | FERK0503 | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F534L | Procure from any manufacturer |
Thermo Scientific T4 DNA Ligase | ThermoFisher Scientific | FEREL0011 | Procure from any manufacturer |
Thermocycler | Bio Rad | 1861096 | Procure from any manufacturer |
UVP Visi-Blue Transilluminator | ThermoFisher Scientific | UV95043301 | Or other transiluminator that allows visualization of DNA |
Water, Molecular Biology Grade | ThermoFisher Scientific | BP28191 | Procure from any manufacturer |