Summary

Цифровой ПЦР на основе конкурентного индекса для высокой пропускной способностью анализ фитнеса в сальмонелле

Published: May 13, 2019
doi:

Summary

Этот молекулярный подход для определения бактериальной пригодности облегчает точное и точное обнаружение микроорганизмов с помощью уникальных геномных штрих-кодов ДНК, которые количественно с помощью цифровых ПЦР. Протокол описывает расчет конкурентного индекса штаммов сальмонеллы; однако технология легко адаптируется к протоколам, требующим абсолютной количественной оценки любого генетически легкоподобимого организма.

Abstract

Конкурентный индекс является распространенным методом, используемым для оценки бактериальной пригодности и / или вирулентности. Полезность этого подхода иллюстрируется его легкостью выполнения и его способностью стандартизировать пригодность многих штаммов к организму дикого типа. Техника ограничена, однако, имеющимися фенотипическими маркерами и количеством штаммов, которые могут быть оценены одновременно, создавая необходимость в большом количестве повторных экспериментов. Параллельно с большим количеством экспериментов, затраты на проработку и материальные затраты на количественную оценку бактерий на основе фенотипических маркеров не являются незначительными. Чтобы преодолеть эти негативные аспекты, сохраняя при этом положительные аспекты, мы разработали молекулярный подход к непосредственной количественной оценке микроорганизмов после инженерных генетических маркеров на бактериальные хромосомы. Уникальные, 25 базовых пар ДНК штрих-коды были вставлены в безобидный локус на хромосоме дикого типа и мутант штаммов сальмонеллы. В пробирке были проведены эксперименты по проведению соревнований с использованием инокула, состоящего из объединенных штаммов. После проведения конкурса абсолютные цифры каждого штамма были количественно определены с помощью цифровых ПЦР, и из этих значений были рассчитаны конкурентоспособные индексы для каждого штамма. Наши данные показывают, что этот подход к количественной оценке сальмонеллы является чрезвычайно чувствительным, точным и точным для обнаружения как очень обильные (высокая пригодность) и редких (низкий фитнес) микроорганизмов. Кроме того, эта техника легко адаптируется практически к любому организму с хромосомами, способными к модификации, а также к различным экспериментальным конструкциям, которые требуют абсолютной количественной оценки микроорганизмов.

Introduction

Оценка пригодности и вирулентности патогенных организмов является фундаментальным аспектом микробиологических исследований. Это позволяет проводить сравнения между штаммами или между мутировавшими организмами, что позволяет исследователям определить важность определенных генов в определенных условиях. Традиционно, вирулентность оценка использует животных модель инфекции с использованием различных бактериальных штаммов и наблюдения за результатом инфицированного животного (например, инфекционная доза50, Смертельная доза50, время до смерти, тяжесть симптомов, отсутствие симптомы и т.д.). Эта процедура содержит ценные описания вирулентности, но она требует штаммов, чтобы вызвать значительные различия в результатах, с тем чтобы обнаружить отклонения от дикого типа. Кроме того, результаты являются полуколичественными, поскольку в то время как прогрессирование заболевания и тяжесть симптомов могут быть субъективно количественно с течением времени, интерпретация вирулентности по сравнению с диким типом является более качественной (т.е. больше, меньше или в равной степени вирулентным). Общей альтернативой для выполнения анализов инфекционной инфекции животных является создание конкурентоспособных индексов (CIs), значения, которые непосредственно сравнить фитнес или вирулентность штамма с диким типом аналога в смешанной инфекции1. Этот метод имеет многочисленные преимущества перед традиционной животной моделью инфекции путем стандартизации вирулентности к штамму дикого типа и определения количественной оценки, отражающей степень ослабления. Этот метод также может быть адаптирован для анализа взаимодействия генов в бактериях, определив отмененный конкурентный индекс (COI)2. Расчет COI для группы мутировавших организмов позволяет исследователям определить, независимо ли два гена способствуют патогенезу или если они участвуют в том же пути вирулентности и зависят друг от друга. Кроме того, расчет CI требует перечисления бактерий, которые могут обеспечить ценную информацию о патогенезе организмов. CIs и COIs также позволяют исследователям осла avirulent напряжения которые не причиняют клинические заболевания но все еще имеют разницы в пригодности. Этот метод ограничен использованием традиционных маркеров устойчивости к антибиотикам для выявления штаммов, тем самым ограничивая количество входных штаммов только одним или двумя за один раз. Из-за этого ограничения требуется большое количество экспериментальных групп и репликаций, что в дополнение к увеличению затрат на рабочую силу и материальные затраты, а также увеличивает возможности для изменчивости в экспериментальных условиях и неточных результатов. (Для тщательного анализа преимуществ и применений использования смешанных инфекций для изучения вирулентности, фитнеса и взаимодействия генов см. C.R. Beuzon и D.W. Holden 1)

Были предприняты попытки преодолеть это ограничение, такие как использование флуоресцентно помеченных клеток количественно через поток цитометрии3,4,5. Этот метод количественно клеток, использующих либо 1) помеченные антитела к фенотипическим маркерам или 2) эндогенно производства флуоресцентных белков. Использование помеченных антител имеет предел обнаружения 1000 клеток / мл, и поэтому требует большого количества клеток для анализа3. Клетки, выражающие флуоресцентные белки, имеют измененную физиологию ивосприимчивы к изменениям в фитнесе в результате высокой экспрессии белка 6. Оба метода ограничены количеством флуоресцентных маркеров, обнаруживаемых с помощью цитометрии потока. Прогресс в молекулярной количественной была достигнута за счет разработки метода microarray, которые обнаружили затусание в 120 штаммов от первоначальной смешанной инфекции более 1000 штаммов в модели мурин7. Этот метод использовал микроаррейный анализ РНК от мутировавших штаммов, которые приводят к значительной изменчивости в результате.  Тем не менее она установила, что большие пулы смешанных инфекций могут быть полезным инструментом и что, используя чувствительные методы обнаружения, можно выявить различия в бактериальной вирулентности. С развитием последовательности следующего поколения, Tn-seq расширил полезность транспозонных мутаций, что позволило мощный метод для количественной оценки бактерий, которые были случайно мутировали8,9,10, 11. Альтернативный протокол был недавно разработан, что устраняет необходимость транспозонов и вместо этого использует ДНК штрих-коды для более легко гораздо выявления и отслеживания геномных изменений и их влияние на фитнес12. Эта технология является важным прогрессом, но вставка геномных штрих-кодов по-прежнему является случайным процессом. Чтобы преодолеть случайность предыдущих экспериментов, Yoon et al. разработали метод расчета CIs штаммов сальмонеллы с помощью уникальных штрих-кодов ДНК, вставленных в точных местах на хромосомых бактерий13. Уникальные штрих-кодированные штаммы были обнаружены с помощью метода на основе qPCR с зеленым цветом SYBR и грунтовками, специфичными для каждого уникального штрих-кода. Этот метод был ограничен ограничениями, налагаемыми qPCR, включая различия в эффективности праймера и низкую чувствительность, о чем свидетельствует необходимость вложенного ПЦР до qPCR. Тем не менее этот подход продемонстрировал, что целевые геномные изменения могут быть использованы для обнаружения и потенциально количественной оценки пулов многочисленных бактериальных штаммов.

В следующем протоколе мы описываем новую методологию для проведения экспериментов бактериальной конкуренции с большими пулами смешанных инокула, а затем точной количественной оценки с использованием высокочувствительной цифровой техники ПЦР. Протокол включает в себя генетически маркировки бактериальных штаммов с уникальным штрих-кодом ДНК вставляется на безобидной области хромосомы. Эта модификация позволяет быстро и точно количественно производить штаммы с использованием современных молекулярных технологий вместо традиционных серийных разбавлений, реплики покрытия и подсчета колоний, образующих единицы, которые полагаются на фенотипические маркеры (т.е. устойчивость к антибиотикам (т.е. устойчивость к антибиотикам ). Изменения позволяют одновременно оценивать многие штаммы в одном объединенном инокулуме, существенно уменьшая возможность экспериментальной изменчивости, поскольку все штаммы подвергаются точно таким же условиям. Кроме того, в то время как этот метод был разработан в Salmonella enterica serovar Typhimurium, он очень адаптируется к любой генетически податливый организм и почти любой экспериментальный дизайн, где точные бактериальные подсчеты необходимы, обеспечивая новый инструмент для повышения точности и пропускной их пропускной связи в микробиологических лабораториях без ограничений, налагаемых предыдущими методами.

Protocol

1. Включите уникальные штрих-коды ДНК на плазмид, содержащий необходимые компоненты для аллелики Exchange ПРИМЕЧАНИЕ: Был создан новый плазмид, названный pSKAP, с высоким числом копий и повышенной эффективностью преобразования по сравнению с существующим иаллеливой би…

Representative Results

Использование этой методологии требует, чтобы соответствующие контрольные реакции выполнялись для проверки чувствительности и специфичности каждого зонда, используемого для определения целевой ДНК. В этом репрезентативном эксперименте мы проверили восемь уникаль…

Discussion

Способность точно количественно оценить микроорганизмы имеет первостепенное значение для исследований микробиологии, а способность перечислять уникальные штаммы из первоначальной смешанной популяции оказалась бесценным инструментом для оценки фитнеса и вирулентности в Бактерий. …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследования, о которых сообщалось в этой публикации, были поддержаны Фондом исследований факультета Джорджа Ф. Хаддикса и Национальным институтом общей медицинской науки Национальных институтов здравоохранения (NIH) под номером премии GM103427. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национальных институтов здравоохранения.

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes Eppendorf 22600028 Procure from any manufacturer
16 mL culture tubes MidSci 8599 Procure from any manufacturer
5-200 μL pipette tips RAININ 30389241 Procure alternative tip brands with caution based on manufacturing quality
5-50 μL multichannel pipette RAININ 17013804 Use alternative multichannel pipettes with caution
Agarose ThermoFisher Scientific BP160-500 Procure from any manufacturer
BLAST Analysis NCBI N/A https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
C1000 Touch Thermocycler with 96-Deep Well Reaction Module Bio Rad 1851197 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Chemically competent DH5α Invitrogen 18258012 Procure from any manufacturer or prepare yourself
Chloramphenicol ThermoFisher Scientific BP904-100 Procure from any manufacturer
Cytation5 Microplate reader BioTek CYT5MF Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Data Analysis Software (QuantaSoft and QuantaSoft Data Analysis Pro) Bio Rad N/A Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR 96-Well Plates Bio Rad 12001925 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Droplet Reader Oil Bio Rad 1863004 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) Bio Rad 1863024 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1864008 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio Rad 1863009 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Droplet Generation Oil for Probes Bio Rad 1863005 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
Kanamycin ThermoFisher Scientific BP906-5 Procure from any manufacturer
Luria-Bertani agar ThermoFisher Scientific BP1425-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from agar, tryptone, yeast digest, and NaCl
Luria-Bertani broth ThermoFisher Scientific BP1426-2 Procure from any manufacturer or make it yourself from tryptone, yeast digest, and NaCl
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable Bio Rad 1814040 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
PCR Tubes Eppendorf 951010022 Procure from any manufacturer
Petri dishes ThermoFisher Scientific FB0875712 Procure from any manufacturer
pPCR Script Cam SK+ Stratagene/Agilent 211192 No longer available commercially
Primer/Probe Design IDT N/A https://www.idtdna.com/Primerquest/Home/Index
pSKAP and pSKAP_Barcodes Addgene Plasmid numbers 122702-122726 www.addgene.org
PX1 PCR Plate Sealer Bio Rad 1814000 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Generator Bio Rad 1864002 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
QX200 Droplet Reader Bio Rad 1864003 Must procure ddPCR supplies from Bio Rad. Alternatives are not yet available.
S. Typhimurium strain ATCC 14028s ATCC ATCC 14028s www.atcc.org
Take3 Micro-Volume Plate BioTek TAKE3 Procure from any manufacturer, use any system capable of accurately quantifying DNA
Thermo Scientific FastDigest BamHI ThermoFisher Scientific FERFD0054 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest DpnI ThermoFisher Scientific FERFD1704 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific FastDigest HindIII ThermoFisher Scientific FERFD0504 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Gel Extraction and DNA Cleanup Micro Kit ThermoFisher Scientific FERK0832 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific GeneJet Miniprep Kit ThermoFisher Scientific FERK0503 Procure from any manufacturer
Thermo Scientific Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific F534L Procure from any manufacturer
Thermo Scientific T4 DNA Ligase ThermoFisher Scientific FEREL0011 Procure from any manufacturer
Thermocycler Bio Rad 1861096 Procure from any manufacturer
UVP Visi-Blue Transilluminator ThermoFisher Scientific UV95043301 Or other transiluminator that allows visualization of DNA
Water, Molecular Biology Grade ThermoFisher Scientific BP28191 Procure from any manufacturer

References

  1. Beuzón, C. R., Holden, D. W. Use of mixed infections with Salmonella strains to study virulence genes and their interactions in vivo. Microbes and Infection. 3 (14-15), 1345-1352 (2001).
  2. Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Valentine, P. J., Ficht, T. A., Heffron, F. Synergistic effect of mutations in invA and lpfC on the ability of Salmonella typhimurium to cause murine typhoid. Infection and Immunity. 65 (6), 2254-2259 (1997).
  3. Vital, M., Hammes, F., Egli, T. Competition of Escherichia coli O157 with a drinking water bacterial community at low nutrient concentrations. Water Research. 46 (19), 6279-6290 (2012).
  4. Schellenberg, J., Smoragiewicz, W., Karska-Wysocki, B. A rapid method combining immunofluorescence and flow cytometry for improved understanding of competitive interactions between lactic acid bacteria (LAB) and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in mixed culture. Journal of Microbiological Methods. 65 (1), 1-9 (2006).
  5. Becker, D., et al. Robust Salmonella metabolism limits possibilities for new antimicrobials. Nature. 440 (7082), 303 (2006).
  6. Rang, C., Galen, J. E., Kaper, J. B., Chao, L. Fitness cost of the green fluorescent protein in gastrointestinal bacteria. Canadian Journal of Microbiology. 49 (9), 531-537 (2003).
  7. Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), e1000477 (2009).
  8. Ahmer, B. M., Gunn, J. S. Interaction of Salmonella spp. with the intestinal microbiota. Frontiers in Microbiology. 2, 101 (2011).
  9. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  10. Van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767 (2009).
  11. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome‐wide fitness and genetic interactions determined by Tn‐seq, a high‐throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Current Protocols in Microbiology. 36 (1), (2017).
  12. Mutalik, V. K., et al. Dual-barcoded shotgun expression library sequencing for high-throughput characterization of functional traits in bacteria. Nature Communications. 10 (1), 308 (2019).
  13. Yoon, H., Gros, P., Heffron, F. Quantitative PCR-based competitive index for high-throughput screening of Salmonella virulence factors. Infection and Immunity. 79 (1), 360-368 (2011).
  14. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  15. Henard, C. A., Bourret, T. J., Song, M., Vázquez-Torres, A. Control of redox balance by the stringent response regulatory protein promotes antioxidant defenses of Salmonella. Journal of Biological Chemistry. 285 (47), 36785-36793 (2010).
  16. Poteete, A. R., Fenton, A. C. λ red-dependent growth and recombination of phage P22. Virology. 134 (1), 161-167 (1984).
  17. McCollister, B. D., Bourret, T. J., Gill, R., Jones-Carson, J., Vázquez-Torres, A. Repression of SPI2 transcription by nitric oxide-producing, IFNγ-activated macrophages promotes maturation of Salmonella phagosomes. Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 625-635 (2005).
  18. Shaw, J. A., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium has three transketolase enzymes contributing to the pentose phosphate pathway. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11271-11282 (2018).
  19. Freter, R., O’Brien, P., Macsai, M. S. Role of chemotaxis in the association of motile bacteria with intestinal mucosa: in vivo studies. Infection and immunity. 34 (1), 234-240 (1981).
  20. Taylor, R. K., Miller, V. L., Furlong, D. B., Mekalanos, J. J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (9), 2833-2837 (1987).
  21. Nogva, H. K., Dromtorp, S., Nissen, H., Rudi, K. Ethidium monoazide for DNA-based differentiation of viable and dead bacteria by 5′-nuclease PCR. Biotechniques. 34 (4), 804-813 (2003).
  22. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiology Letters. 291 (2), 137-142 (2009).
  23. Nocker, A., Cheung, C. -. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. Journal of Microbiological Methods. 67 (2), 310-320 (2006).
  24. Nocker, A., Mazza, A., Masson, L., Camper, A. K., Brousseau, R. Selective detection of live bacteria combining propidium monoazide sample treatment with microarray technology. Journal of Microbiological Methods. 76 (3), 253-261 (2009).
  25. Nocker, A., Sossa, K. E., Camper, A. K. Molecular monitoring of disinfection efficacy using propidium monoazide in combination with quantitative PCR. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 252-260 (2007).
  26. Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Applied and Environmental Microbiology. 73 (16), 5111-5117 (2007).
  27. Price-Carter, M., Tingey, J., Bobik, T. A., Roth, J. R. The Alternative Electron Acceptor Tetrathionate Supports B12-Dependent Anaerobic Growth ofSalmonella enterica Serovar Typhimurium on Ethanolamine or 1, 2-Propanediol. Journal of Bacteriology. 183 (8), 2463-2475 (2001).
  28. Taylor, R. G., Walker, D. C., McInnes, R. E. coli host strains significantly affect the quality of small scale plasmid DNA preparations used for sequencing. Nucleic Acids Research. 21 (7), 1677 (1993).
  29. Cherepanov, P. P., Wackernagel, W. Gene disruption in Escherichia coli: Tc R and Km R cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene. 158 (1), 9-14 (1995).

Play Video

Cite This Article
Shaw, J. A., Bourret, T. J. Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella. J. Vis. Exp. (147), e59630, doi:10.3791/59630 (2019).

View Video