Målet med detta protokoll är att beskriva utformningen och utförandet av in vivo-experiment i Drosophila melanogaster för att bedöma de funktionella konsekvenserna av sällsynta genvarianter förknippade med mänskliga sjukdomar.
Framsteg inom sekvenserings teknik har gjort hela-genomet och hela-exome dataset mer tillgängliga för både klinisk diagnos och avancerad humangenetik forskning. Även om ett antal i silico-algoritmer har utvecklats för att förutsäga patogeniteten hos varianter som identifierats i dessa dataset, är funktionella studier avgörande för att fastställa hur specifika genomiska varianter påverkar protein funktionen, särskilt för genom Varianter. I nätverket för odiagnostiserade sjukdomar (UDN) och andra forsknings konsorer för sällsynta sjukdomar, modellorganismer (MO) inklusive Drosophila, C. elegans, zebrafisk och möss används aktivt för att bedöma funktionen hos den förmodade humana Varianter. Detta protokoll beskriver en metod för funktionell bedömning av sällsynta humana varianter som används i modellorganismerna screening Center Drosophila kärna av UDN. Arbetsflödet börjar med att samla in Human-och MO-information från flera offentliga databaser, med hjälp av MARRVEL-webbresursen för att bedöma om varianten sannolikt kommer att bidra till patientens tillstånd samt utforma effektiva experiment baserade på tillgängliga kunskap och resurser. Därefter genereras genetiska verktyg (t. ex. T2A-GAL4 och UAS-Human cDNA-linjer) för att bedöma funktionerna hos varianter av intresse i Drosophila. Vid utveckling av dessa reagenser, två-pronged funktionella analyser baserade på räddning och överuttryck experiment kan utföras för att bedöma variant funktion. I räddnings grenen är de endogena fluggener “humaniserade” genom att ersätta den ortologösa Drosophila genen med referens eller variant mänskliga transgener. I överuttryck grenen, referens och variant mänskliga proteiner är exogent drivs i en mängd olika vävnader. I båda fallen kan varje och fenotyp (t. ex. dödlighet, ögonmorfologi, elektrofysiologi) användas som en avläsnings bar, oberoende av den sjukdom av intresse. Skillnader observerade mellan referens och variant alleler föreslå en variant-specifik effekt, och därmed sannolik patogenicitet. Detta protokoll möjliggör snabba, in vivo-bedömningar av förmodade sjukdomsframkallande varianter av gener med kända och okända funktioner.
Patienter med sällsynta sjukdomar genomgår ofta en mödosam resa kallad “Diagnostic Odyssey” för att få en korrekt diagnos1. De flesta sällsynta sjukdomar tros ha ett starkt genetiskt ursprung, vilket gör genetiska/genomiska analyser kritiska delar av den kliniska workup. Förutom kandidat gen panel sekvensering och kopiera nummer variation analys baserad på kromosomala mikromatriser, hela-exome (WES) och hela-Genome sekvensering (WGS) teknik har blivit alltmer värdefulla verktyg under det senaste decenniet2, 3. För närvarande, diagnostisk frekvens för att identifiera en känd patogena variant i Wes och WGS är ~ 25% (högre i pediatriska fall)4,5. För de flesta fall som förblir odiagnostiserade efter klinisk WES/WGS, ett vanligt problem är att det finns många kandidat gener och varianter. Nästa generations sekvensering identifierar ofta nya eller Ultra-ovanliga varianter i många gener, och att tolka om dessa varianter bidrar till sjukdoms fenotyper är utmanande. Till exempel, även om de flesta nonsens eller frameshift mutationer i gener tros vara förlust av funktion (LOF) alleler på grund av nonsens-medierad förfall av kodade transkription, trunkera mutationer som finns i den sista exonerna undkomma denna process och kan fungera som godartad eller Gain-of-funktion (GOF) alleler6.
Dessutom, förutsäga effekterna av en genom allel är en skrämmande uppgift, eftersom det kan resultera i ett antal olika genetiska scenarier som först beskrivs av Herman Muller på 1930-talet (dvs., amorph, hypomorph, hypermorph, antimorph, neomorph, eller isomorph)7 . Många i silico program och metoder har utvecklats för att förutsäga patogeniteten hos genom varianter baserat på evolutions bevarande, typ av aminosyraförändring, position inom en funktionell domän, allel frekvens i den allmänna befolkningen, och andra parametrar8. Men dessa program är inte en heltäckande lösning för att lösa det komplicerade problemet med variant tolkning. Intressant, en nyligen studie visade att fem i stort sett används variant patogenitet förutsägelse algoritmer (Polyphen9, SIFT10, CADD11, Provean12, mutation taster) överens om patogenicitet ~ 80% av tiden8 . I synnerhet, även när alla algoritmer är överens, returnerar de en felaktig förutsägelse av patogenicitet upp till 11% av tiden. Detta leder inte bara till bristfällig klinisk tolkning utan kan också avskräcka forskare från att följa upp nya varianter genom att felaktigt lista dem som godartade. Ett sätt att komplettera den nuvarande begränsningen i silico modellering är att ge experimentella data som visar effekten av variant funktion in vitro, ex vivo (t. ex., odlade celler, organoider), eller in vivo.
In vivo funktionella studier av sällsynta sjukdomsassocierade varianter i MO har unika styrkor13 och har antagits av många sällsynta sjukdoms forskning initiativ runt om i världen, inklusive odiagnostiserade sjukdomar nätverk (UDN) i USA och sällsynta Sjukdomar modeller & mekanismer (RDMM) nätverk i Kanada, Japan, Europa och Australien14. Utöver dessa samordnade insatser för att integrera MO-forskare i arbetsflödet för diagnostik av sällsynta sjukdomar och mekanistiska studier på nationell nivå har ett antal individuella samarbetsprojekt mellan kliniska forskare och MO-forskarna lett till upptäckten och karakterisering av många nya mänskliga sjukdomsframkallande gener och varianter82,83,84.
I UDN, en centraliserad modell organismer screening Center (MOSC) mottar inlagor av kandidat gener och varianter med en beskrivning av patientens tillstånd och bedömer om varianten är sannolikt att vara patogena med hjälp av informatik verktyg och in vivo Experiment. I fas I (2015-2018) av UDN, MOSC består av en Drosophila kärna [Baylor College of Medicine (BCM)] och Zebrafish Core (University of Oregon) som arbetade tillsammans för att bedöma fall. Med hjälp av informatik analys och ett antal olika experimentella strategier i Drosophila och Zebrafish har Mosc hittills bidragit till diagnosen 132 patienter, identifiering av 31 nya syndrom55, upptäckten av flera nya mänskliga sjukdomsgener (t. ex. EBF315, ATP5F1D16, TBX217, IRF2BPL18, COG419, WDR3720) och fenotypisk expansion av känd sjukdom gener (t. ex. CACNA1AACOX122).
Förutom projekt inom UDN har MOSC Drosophila Core forskare bidragit till nya sjukdomsgen upptäckter i samarbete med centra för Mendelian genomik och andra initiativ (t. ex. ANKLE223, TM2D3 24, NRD125, ogdhl25, ATAD3A26, ARIH127, MARK328, dnmbp29) med samma uppsättning av informatik och genetiska strategier som utvecklats för UDN. Med tanke på betydelsen av MO studier om sällsynta sjukdomar diagnos, MOSC utökades till att omfatta en C. elegans kärna och andra Zebrafish kärna (båda vid Washington University vid St Louis) för fas II (2018-2022) av UDN.
Detta manuskript beskriver ett in vivo funktionella studieprotokoll som aktivt används i UDN Mosc Drosophila Core för att avgöra om genom varianter har funktionella konsekvenser för proteinet av intresse med transgena flugor som uttrycker mänskliga Proteiner. Målet med detta protokoll är att hjälpa MO-forskare att samarbeta med kliniska forskargrupper för att ge experimentella belägg för att en kandidat variant i en gen av intresse har funktionella konsekvenser, vilket underlättar klinisk diagnos. Detta protokoll är mest användbart i ett scenario där en Drosophila forskare kontaktas av en klinisk utredare som har en sällsynt sjukdom patient med en specifik kandidat variant i en gen av intresse.
Detta protokoll kan delas upp i tre delar: (1) samla in information för att bedöma sannolikheten för att den variant av intresse som ansvarar för patientens fenotyp och genomförbarheten av en funktionell studie i Drosophila, (2) insamling befintliga genetiska verktyg och etablera nya, och (3) utföra funktionella studier in vivo. Den tredje delen kan delas upp i två del element som bygger på hur en variant av intresse kan bedömas (räddnings experiment eller överuttrycksbaserade strategier). Det är viktigt att notera att detta protokoll kan anpassas och optimeras till många scenarier utanför sällsynt monogen sjukdom forskning (t. ex., vanliga sjukdomar, gen-miljö interaktioner, och farmakologiska/genetiska skärmar för att identifiera terapeutiska mål). Möjligheten att fastställa varianternas funktionalitet och patogenicitet kommer inte bara att gynna patienten av intresse genom att tillhandahålla korrekt molekylär diagnos utan också ha bredare effekter på både translationell och grundläggande vetenskaplig forskning.
Experimentella studier med Drosophila melanogaster ger ett robust analyssystem för att bedöma konsekvenserna av sjukdomsassocierade mänskliga varianter. Detta beror på den stora mängden kunskap och olika genetiska verktyg som har genererats av många forskare i flug fältet under det senaste århundradet89. Precis som alla andra experimentella system är det dock viktigt att erkänna de förbehåll och begränsningar som finns.
Varningar i samband …
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Jose Salazar, Julia Wang, och Dr Karen Schulze för kritisk läsning av manuskriptet. Vi erkänner DRS. ning LiU och XI Luo för funktionell karakterisering av de TBX2 varianter som diskuteras här. Odiagnostiserade sjukdomar nätverk modell organismer screening Center stöddes genom National Institutes of Health (NIH) gemensamma fonden (U54 NS093793). H. T. C. stöddes ytterligare av NIH [CNCDP-K12 och NINDS (1K12 NS098482)], American Academy of Neurology (neurovetenskap Research Grant), Burroughs Wellcome Fund (karriär pris för medicinska forskare), Child neurologi Society och Child Neurology Foundation ( PERF Elterman Grant) och NIH-direktörens tidiga självständighets utmärkelse (DP5 OD026426). M. F. W. stöddes ytterligare av Simons Foundation (SFARI Award: 368479). S. Y. stöddes ytterligare av NIH (R01 DC014932), The Simons Foundation (SFARI Award: 368479), Alzheimer ‘ s Association (ny utredare forskningsstipendium: 15-364099), Naman familj Fund för grundforskning, och Caroline Wiess Law Fund för forskning i Molekylär medicin. Konfokalmikroskopi på BCM stöds delvis av NIH Grant U54HD083092 till intellektuella och utvecklingsstörning Research Center (IDDRC) Neurovisualisering kärna.
Drosophila Stocks for UAS-human cDNA transgenesis | |||
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24871 | Specific Reagent: VK33 (3rd chromosome) Injection line |
Injection strains for transgenesis (D. melanogaster) | BDSC | #24872 | Specific Reagent: VK37 (2nd chromosome) Injection line |
Plasmid DNA | |||
Cloning vector | Thermo Fisher | #12536-017 | Specific Reagent: pDONR221 |
Drosophila transgenesis vector | Gift from Drs. Johannes Bischof and Konrad Basler (Bischof et al., 2013 PNAS) | Specific Reagent: pGW-HA.attB | |
Molecular biology kits and reagents | |||
Agarose | Sigma-Aldrich | #A2790 | Specific Reagent: Agarose (molecular biology grade) |
Chemically Competent Cells (E. coli) | Thermo Fisher | #18265017 | Specific Reagent: DH5α |
DNA Gel Extraction kit | Thermo Fisher | #K210012 | Specific Reagent: PureLink Gel Extraction Kit |
DNA Isolation and purification kit | Qiagen | #27104 | Specific Reagent: QIAprep Spin Miniprep Kit |
High Fidelity Polymerase | NEB | #M0491 | Specific Reagent: Q5 Polymerase kit |
Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11789020 | Specific Reagent: Gateway BP Clonase kit |
Recombinase mediated cloning system | Thermo Fisher | #11791100 | Specific Reagent: Gateway LR Clonase II Enzyme kit |
Site Directed Mutagenesis kit | Agilent | #200523 | Specific Reagent: Quick Change II Mutagenesis kit |
Electroretinogram Rig related equipment | |||
ERG Analysis | Molecular Devices | N/A | Specific Reagent: Axon pCLAMP 10 Data Software Package |
ERG Data Collection | LabX | #R150358 | Specific Reagent: ISO-DAM Isolated Biologic Amplifier |
ERG Stimulator | Astro-Med | #S48 | Specific Reagent: Square Pulse Stimulator |