אנו מדווחים על שליח RNA (mrna) אלקטרופורציה כשיטה המאפשרת ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים במערכת דגם העובר שליו. שיטה זו ניתן להשתמש כדי לתייג תאים במהירות ולהקליט את התנועות שלהם vivo על ידי הזמן לשגות המיקרוסקופיה זמן קצר לאחר electroporation.
אנו מדווחים כי mrna אלקטרופורציה מאפשר חלבונים פלורסנט כדי לתייג תאים בעוברי שליו חיים במהירות רבה יותר ובאופן נרחב יותר אלקטרופורציה DNA. היעילות הגבוהה ביותר מאפשרת לפחות 4 mRNAs ברורים להיות שיתוף מעבר עם ~ 87% יעילות. רוב מוצרי ה-mRNAs החשמליים מפוקעים במהלך 2 השעות הראשונות של הפוסט-אלקטרופורציה, ומאפשרות ניסויים תלויי זמן להתבצע בעובר המתפתח. בסופו של דבר, אנו מתארים כיצד התמונה באופן דינאמי בשידור חי העוברים עם mRNAs כי קידוד שונים ממוקד חלבונים פלורסנט ממוקדות.
אלקטרופורציה היא שיטת העברה פיזית המשתמשת בפולס חשמלי כדי ליצור נקבוביות זמניות בקרום הפלזמה, המאפשר חומרים כמו חומצות גרעין או כימיקלים לעבור לתוך ציטוסול. אלקטרופורציה משמשת רבות כדי לספק דנ א לתוך חיידקים, שמרים, צמחים, ותאים מהיונקים1,2,3. הוא משמש באופן שגרתי כדי להחדיר מדים גנטיים לתוך תאים ורקמות היעד בתוך העובר העופות המתפתח ללמוד את השליטה הגנטית של פיתוח או תווית הגירה אוכלוסיות של תאים4,5,6, 7. לאחר מכן עם זאת, מספר מגבלות נסיוניות קיימות גם עם אלקטרופורציה DNA8. למשל, אלקטרופורציה DNA מציג לעתים קרובות מספר משתנה מאוד של וקטורים ביטויים לכל תא ולאחר מכן mRNAs וחלבונים הם לקודד. השונות הזאת עלולה להוביל לטרוגניות משמעותית בתאי התא, המסבך את ניתוח התמונה ואת פרשנות הנתונים9,10. בנוסף, חלבונים מ-DNA אלקטרופורציה רק מתחילים לבטא ~ 3 h פוסט אלקטרופורציה ולא להגיע ליעילות המקסימלית של מספר התא ואת עוצמת הקרינה עד 12 h, כנראה בשל הזמן הנדרש להעביר לתוך הגרעין ולהשלים תמלול ותרגום בvivo11.
לעומת זאת, השימוש ב-mrna משמש באופן יעיל במגוון מערכות מודל, כולל xenopus זריזה oocytes על ידי מיקרוהזרקה12,13, התכנות משנה את תאי הגזע האנושי על ידי mrna lipofectamine החצייה14 , ומרדנות בתאי גזע עצביים בעכברים למבוגרים15. בדקנו את היכולת של mrna אלקטרופורציה כדי לתייג ביעילות תאים במהלך פיתוח מוקדם העופות מתחלקים באמצעות מסונתז mrna באופן מתורבת לקודד חלבונים פלורסנט ברורים (FPs). ללימודים שלנו, השתמשנו pCS2 + וקטור, וקטור ביטוי רב-תכליתי המשמש בדרך כלל להבעת חלבונים ב xenopus ו-דג זברה עוברי. ה-RNA פולימו T7 מיזמים בpCS2 + היתר את הסינתזה של mRNA וחלבון מכל גן משוכפל כאשר משתמשים ב תמלול/מערכת תרגום של מבחנה.
כאן, אנו מדגימים כי mrna אלקטרופורציה מאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים פלורסנט (FPs) בתוך העוברים שליו הגאוגעיים. עיצבנו ויצרנו רבים מוקטורי הביטוי בהם נעשה שימוש במחקרים אלה. לדוגמה, אנו שיכלנו משנה את הגן LifeAct-eGFP16 לתוך pCS2 + וקטור17 לבטא מן היזם CMV ו-SP6 מקדם. הגן המוסף נמצא במורד הזרם של מקדם SP6 ובמעלה הזרם של הזנב SV40 פולי (A)18. ב עוברים שיתוף electroporated עם mRNA ו-DNA, FPs מקודד מ-Mrna המועתק מחוץ לתחום שזוהו לראשונה בתוך 20 דקות של אלקטרופורציה, בעוד FPs של וקטורים ביטוי DNA אותרו רק לאחר 3 h. קידוד Mrna מרובים עבור גרעיני, Golgi, ו חלבונים קרום יכול להיות electroporated לתוך העובר בו זמנית, וכתוצאה מכך ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בתאים בודדים. בסופו של דבר, באמצעות התאוששות vivo פלואורסצנטית לאחר photobleaching לבנה (FRAP) שיטת, אנו מראים כי רוב הריקבון Mrporated הדעיכה בתוך 2 h. כך, ייצור חלבון ראשוני מהיר בשילוב עם תרגום חלבון חדש מוגבל הופך את mrna אלקטרופורציה טכניקה רבת ערך כאשר השליטה הטמפורלית של הביטוי הוא הכרחי.
בפרוטוקול זה, סיפקנו צעד אחר צעד הוראות על איך בדיוק מיקרו הזרקת ו אלקטרופורטה mRNA לתוך התאים של עוברי שליו הגאוגעיים. הדגמנו כי בתוך מתורבת מסונתז mrna אלקטרופורציה מאפשר ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים פלורסנט (FPs) בתוך העוברים שליו הגאוגעיים (איור 2 ו -3). קרינה פלואורסצ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לדוד הוס על תובנות מועילות בעבודה זו. עבודה זו נתמכת בחלקו על ידי מלגת מחקר הקיץ של קרן רוז הילס (2016-2018) ומלגת מחקר של אוניברסיטת דרום קליפורניה ל-ת, מכון מחקר סבן במסגרת הכשרת טרום-דוקטורט לרפואה, ואוניברסיטת דרום קליפורניה מחקר הסמכה עמיתים התוכנית פרס ר
BamHI-HF | New England Biolabs | R3136L | |
BglII | New England Biolabs | R0144S | |
BsrG1-HF | New England Biolabs | R3575S | |
NotI-HF | New England Biolabs | R3189L | |
SalI-HF | New England Biolabs | R3138L | |
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Thermo Fisher | 15593031 | |
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit | Thermo Fisher | AM1340 | |
Fast Green FCF | Sigma Aldrich | F7252 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | 93443 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride |
Whatman No.1 filter paper | Sigma Aldrich | WHA1001125 | |
glycerol | Sigma Aldrich | G9012 | |
Urea | Sigma Aldrich | 51457 | |
pmTurquoise2-Golgi | Addgene | 36205 | pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205) |
pmEGFP-N1-LifeAct | Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722 | ||
pCS2.Lifeact-mGFP | Addgene | This paper | |
pCS.H2B-citrine | Addgene | 53752 | pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752) |
pCS.memb-mCherry | Addgene | #53750 | pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750) |
Zeiss LSM-780 inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software. | |
CUY-21 EDIT in vivo electroporator | Bex Co., Ltd. | ||
Platinum flat square electrode, side length 5 mm | Bex Co., Ltd. | LF701P5E | |
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope | Olympus LifeScience | ||
XM10 Monochrome camera | Olympus LifeScience | ||
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4) | To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment). | ||
1.37 M NaCl | |||
27 mM KCl | |||
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4 | |||
PBS/Triton | Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use. | ||
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4) | |||
0.1% Triton X-100 |