एवियन भ्रूण में कई प्रोटीन की तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति MRNA इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग

Summary

हम दूत आरएनए (mRNA) electroporation एक विधि है कि बटेर भ्रूण मॉडल प्रणाली में कई प्रोटीन की तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति की अनुमति देता है के रूप में रिपोर्ट. इस विधि का उपयोग फ्लोरोसेंट लेबल कोशिकाओं के लिए किया जा सकता है और इलेक्ट्रोपोरेशन के तुरंत बाद समय-चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा विवो आंदोलनों में उनके रिकॉर्ड किया जा सकता है।

Abstract

हम रिपोर्ट करते हैं कि एमआरएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन फ्लोरोसेंट प्रोटीन को डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन की तुलना में अधिक तेजी से और मोटे तौर पर जीवित बटेर भ्रूणों में कोशिकाओं को लेबल करने की अनुमति देता है। उच्च transfection दक्षता कम से कम 4 अलग mRNAs $ 87% दक्षता के साथ सह-transfected होने के लिए अनुमति देता है। इलेक्ट्रोपोरेटेड एमआरनए के अधिकांश पहले 2 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान निम्नीकृत होते हैं, जिससे विकासशील भ्रूण में समय-संवेदी प्रयोगों को किया जा सकता है। अंत में, हम वर्णन कैसे गतिशील छवि लाइव भ्रूण mRNAs के साथ electroporated है कि विभिन्न subcellular लक्षित फ्लोरोसेंट प्रोटीन सांकेतिक संबंधों के लिए.

Introduction

इलेक्ट्रोपोरेशन एक भौतिक transfection विधि है कि एक विद्युत पल्स का उपयोग करता है प्लाज्मा झिल्ली में क्षणिक pores बनाने के लिए, न्यूक्लिक एसिड या रसायनों जैसे पदार्थों साइटोसोल में पारित करने के लिए अनुमति देता है. इलेक्ट्रोपोरेशन का प्रयोग व्यापक रूप से डीएनए को बैक्टीरिया, खमीर, पौधों और स्तनधारी कोशिकाओं^1,2,3में वितरित करने के लिए किया जाता है . यह नियमित रूप से विकास के आनुवंशिक नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए विकास के आनुवंशिक नियंत्रण का अध्ययन करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं और ऊतकों में आनुवंशिक पेलोड शुरू करने के लिए प्रयोग किया जाता है^{4,5,6, 7}. हालांकि, कई प्रयोगात्मक सीमाओं भी डीएनए इलेक्ट्रोपोरेशन⁸के साथ मौजूद हैं। उदाहरण के लिए, डीएनए इलेक्ट्रोपोरिओशन अक्सर प्रति सेल अभिव्यक्ति वैक्टर की अत्यधिक चर संख्या ओंकार और बाद में mRNAs और प्रोटीन वे सांकेतिक कोडित परिचय. यह परिवर्तनशीलता काफी सेल-सेल विषमता का कारण बन सकती है जोछवि विश्लेषण और डेटा व्याख्या 9,¹⁰दोनों को जटिल बना देती है। इसके अतिरिक्त, डीएनए इलेक्ट्रोपोरिशन से प्रोटीन केवल $ 3 एच पोस्ट-इलेक्ट्रोपोरेशन व्यक्त करने के लिए शुरू करते हैं और 12 एच तक सेल संख्या और फ्लोरोसेंट तीव्रता में अधिकतम दक्षता तक नहीं पहुंचते हैं, नाभिक में स्थानांतरित करने और पूरा करने के लिए आवश्यक समय के कारण होने की संभावना दोनों प्रतिलेखन और vivo¹¹में अनुवाद |

इसके विपरीत, MRNA transfection प्रभावी ढंग से मॉडल प्रणालियों की एक किस्म में इस्तेमाल किया गया है, माइक्रोइंजेक्शन द्वारा Xenopus laevis oocytes सहित¹²,^13,MRNA lipofectamine transfection 14 द्वारा मानव स्टेम कोशिकाओं reprogramming , और वयस्क चूहों में recalitant तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं¹⁵इलेक्ट्रोपोरेटिंग . हम mRNA electroporation की क्षमता का परीक्षण करने के लिए कुशलतापूर्वक जल्दी एवियन भ्रूण विकास के दौरान कोशिकाओं लेबल इन विट्रो संश्लेषित mRNAs कि अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन सांकेतिक संबंध में सांकेतिक संबंध रखने में उपयोग कर (FPs). हमारे अध्ययन के लिए, हम pCS2 + वेक्टर, एक बहुउद्देशीय अभिव्यक्ति वेक्टर है कि आमतौर पर Xenopus और ज़ेब्राफ़िश भ्रूण में प्रोटीन व्यक्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है इस्तेमाल किया. चस2 में SP6 और T7 RNA पॉलिमरेज प्रवर्तक किसी भी क्लोन जीन से MRNA और प्रोटीन के संश्लेषण की अनुमति देते हैं जब इसका उपयोग इन विट्रो प्रतिलेखन/अनुवाद प्रणाली में किया जाता है।

यहाँ, हम प्रदर्शित करते हैं कि MRNA electroporation तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अनुमति देता है (FPs) गैस्ट्रेलट बटेर भ्रूण में. हमने इन अध्ययनों में प्रयुक्त कई अभिव्यक्ति सदिशों को डिजाइन और उत्पन्न किया है। उदाहरण के लिए, हमने जीवनक्रिया-इGFP जीन¹⁶ को पीसीएस2+ सदिश¹⁷ में सहयोजने से CMV प्रवर्तक तथा SP6 प्रवर्तक से अभिव्यक्त किया है। सम्मिलित जीन SP6 प्रवर्तक के नीचे और SV40 पाली (A) पूंछ¹⁸के ऊपर निहित है. एमआरएनए और डीएनए के साथ सह-इलेक्ट्रोपोरेटेड भ्रूणों में, इन विट्रो ट्रांस्टेड एमआरएनए से एनकोड किए गए एफपी को पहले इलेक्ट्रोपोट्रेशन के 20 मिनट के भीतर पाया गया था, जबकि डीएनए अभिव्यक्ति वेक्टर से एफपी का पता केवल 3 घंटे के बाद पाया गया था, परमाणु, गोलगी, और के लिए एकाधिक MRNAs एन्कोडिंग के बाद झिल्ली प्रोटीन एक साथ एक भ्रूण में electroporated किया जा सकता है, व्यक्तिगत कोशिकाओं में कई प्रोटीन की त्वरित और कुशल अभिव्यक्ति में जिसके परिणामस्वरूप. अंत में, photobleaching (FRAP) परख के बाद एक में विवो फ्लोरोसेंट वसूली का उपयोग कर, हम बताते हैं कि इलेक्ट्रोपोरेटेड mRNAs क्षय के बहुमत 2 ज के भीतर. इस प्रकार, तेजी से प्रारंभिक प्रोटीन उत्पादन सीमित नए प्रोटीन अनुवाद के साथ संयुक्त MRNA इलेक्ट्रोपोर्शन एक मूल्यवान तकनीक बनाता है जब अभिव्यक्ति के लौकिक नियंत्रण आवश्यक है.

Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं बच्चों के अस्पताल लॉस एंजिल्स और दक्षिणी कैलिफोर्निया संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों के विश्वविद्यालय से अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया. 1. पीढ़ी pCS2 आ?…

Representative Results

MRNA इलेक्ट्रोपोट्रेशन डीएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन की तुलना में अधिक कुशल है हम pCS2 + इस्तेमाल किया. एच 2 बी-सिट्रीन इन विट्रो लिखित एम.आर.ए.एन.ए. चूंकि डीएनए इलेक्ट्रो?…

Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम कैसे ठीक microinect और विद्युत mRNA करने के लिए पर कदम से कदम निर्देश प्रदान की gastrulating बटेर भ्रूण की कोशिकाओं में. हमने यह प्रदर्शित किया कि इन विट्रो संश्लेषित एमआरएनए इलेक्ट्रोपोट्रेशन में ?…

Materials

BamHI-HF	New England Biolabs	R3136L
BglII	New England Biolabs	R0144S
BsrG1-HF	New England Biolabs	R3575S
NotI-HF	New England Biolabs	R3189L
SalI-HF	New England Biolabs	R3138L
Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol	Thermo Fisher	15593031
SP6 mMessage Machine in vitro transcription kit	Thermo Fisher	AM1340
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252
Triton X-100	Sigma Aldrich	93443	4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	2-(4-Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI dihydrochloride
Whatman No.1 filter paper	Sigma Aldrich	WHA1001125
glycerol	Sigma Aldrich	G9012
Urea	Sigma Aldrich	51457
pmTurquoise2-Golgi	Addgene	36205	pmTurquoise2-Golgi was a gift from Dorus Gadella (Addgene plasmid # 36205 ; http://n2t.net/addgene:36205 ; RRID:Addgene_36205)
pmEGFP-N1-LifeAct			Nat. Methods 2008;5:605-7. PubMed ID: 18536722
pCS2.Lifeact-mGFP	Addgene		This paper
pCS.H2B-citrine	Addgene	53752	pCS-H2B-citrine was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53752 ; http://n2t.net/addgene:53752 ; RRID:Addgene_53752)
pCS.memb-mCherry	Addgene	#53750	pCS-memb-mCherry was a gift from Sean Megason (Addgene plasmid # 53750 ; http://n2t.net/addgene:53750 ; RRID:Addgene_53750)
Zeiss LSM-780 inverted microscope	Carl Zeiss Microscopy GmbH		The LSM-780 is a confocal and multi-photon microscope that offers the sensitivity required for vital imaging work. Equipped with a motorized stage, an autofocus device, and a full stage-top blackout incubator, the 780 is an excellent microscope for high-end live cell/embryo imaging. The high-sensitivity 32-channel Quasar detector allows for spectral imaging, linear unmixing, and high color count (>4) image acquisition. Excitation can be performed with 6 lines single photon lasers (405, 458, 488, 514, 564 and 633 nm), Chameleon (Coherent) 2-photon laser (range from 690nm to 1000nm), and run with ZEN 2011 SP7 (Black) system software.
CUY-21 EDIT in vivo electroporator	Bex Co., Ltd.
Platinum flat square electrode, side length 5 mm	Bex Co., Ltd.	LF701P5E
Olympus MVX10 FL Stereo Microscope	Olympus LifeScience
XM10 Monochrome camera	Olympus LifeScience
Phosphate-Buffered Saline (PBS) for HCR (10×, pH 7.4)			To prepare 1 L of a 10× stock solution, combine 80 g of NaCl (Sigma-Aldrich S3014), 2 g of KCl (Sigma-Aldrich P9541), 11.4 g of Na2HPO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich S3264), and 2.7 g of KH2PO4 (anhydrous; Sigma-Aldrich P9791). Adjust the pH to 7.4 with HCl, and bring the final volume to 1 L with ultrapure H2O. Avoid using CaCl2 and MgCl2 in PBS for HCR. It is important that the PBS for HCR is prepared as an RNase-free solution (e.g., via diethylpyrocarbonate [DEPC] treatment).
1.37 M NaCl
27 mM KCl
80 mM Na2HPO4 20 mM KH2PO4
PBS/Triton			Add 1 mL of Triton X-100 (Sigma Aldrich 93443) and 100 mL of 10× PBS to 890 mL of ultrapure distilled H2O. Filter the solution through a 0.2-μm filter and store it at 4 ̊C until use.
1× phosphate-buffered saline (PBS) (DEPC-treated; pH 7.4)
0.1% Triton X-100