Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

التحكم المكاني والزماني للبدء من الميلانوما من الخلايا الجذعية المتحولة للخلايا الصباغية

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59666
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

يصف الاجراء التالي طريقه للسيطرة المكانية والزمانيه لبدء ورم الخلايا الصباغية في الجلد الظهري المريد ، وذلك باستخدام نموذج الماوس المهندسة وراثيا. يصف هذا البروتوكول المجهرية بالاضافه إلى بدء الورم الميلاني الجلدي.

Abstract

الورم الميلاني الجلدي معروف جيدا بسرطان الجلد الأكثر عدوانيه. وعلي الرغم من استمرار توثيق عوامل الخطر والتغيرات الجينية الرئيسية بعمق متزايد ، فقد اظهر معدل الاصابه بسرطان الجلد الجلدي زيادة سريعة ومستمرة خلال العقود الاخيره. من أجل العثور علي أساليب وقائية فعاله ، من المهم ان نفهم الخطوات المبكرة من البدء في سرطان الجلد. أظهرت البيانات السابقة ان الخلايا الجذعية للخلايا الميلانينيه (MCSCs) في انسجه البشرة البالغة يمكن ان تكون خلايا المنشا الميلانوما عند التعبير عن الطفرات الجينية والتعديلات الوراثية. ويمكن ان يسببه الورم الناجم عن الأورام السرطانية المعرضة للاصابه بسرطان الجلد عند انتقال MCSCs من السكون إلى الحالة النشطة. ويمكن الترويج لهذا الانتقال في MCSCs المعرضة لسرطان الجلد من خلال تحوير اما الخلايا الجذعية بصيلات الشعر ' الدولة النشاط أو من خلال العوامل البيئية الخارجية مثل الاشعه فوق البنفسجية-B (الاشعه فوق البنفسجية-B). يمكن التلاعب بهذه العوامل بشكل مصطنع في المختبر عن طريق أزاله الشعر الكيميائي ، والذي يسبب انتقال الخلايا الجذعية بصيلات الشعرة و MCSCs من الهدوء إلى الحالة النشطة ، والتعرض للاشعه فوق البنفسجية-B باستخدام ضوء السطح. توفر هذه الطرق التحكم المكاني والزماني الناجح لبدء الجلد الميلاني الجلدي في البشرة الظهرية المرجينه. ولذلك ، فان هذه النظم في نموذج الجسم الفيفو تكون ذات قيمه لتحديد الخطوات المبكرة للبدء الجلدية الميلانوما ويمكن استخدامها لاختبار الطرق المحتملة للوقاية من الأورام.

Introduction

الميلانوما ، الشكل الخبيث للأورام الصباغية ، هو السرطان الأكثر عدوانيه في الجلد مع الميلانوما الجلدية المسؤولة عن معظم وفيات سرطان الجلد1. في الولايات المتحدة ، يتم تشخيص سرطان الجلد عاده ؛ ومن المتوقع ان يكون نوع السرطان الأكثر شيوعا من 5 إلى 6 من بين حالات السرطان الجديدة المقدرة في 20182. وعلاوة علي ذلك ، ففي حين أظهرت حالات السرطان العامة اتجاه الانخفاض التدريجي في العقود الاخيره ، فان معدلات الاصابهبالورم الميلانيني الجلدي خلال العقود القليلة الماضية تدل علي زيادة مستمرة وسريعة في كلا الجنسين.

لمكافحه الميلانوما الجلدية بشكل أكثر كفاءه ، من المهم ان نفهم بوضوح الاحداث المبكرة لنمو سرطان الجلد من خلايا المنشا الخاصة بهم للتعرف بشكل أفضل علي الطرق الوقائية الفعالة سريريا. ومن المعروف الآن ان الخلايا الجذعية الكبار يمكن ان تسهم بشكل كبير في تكوين الورم والأصول الخلوية للسرطان في العديد من أنواع مختلفه من الأعضاء بما في ذلك انسجه الجلد3,4,5. المثل ، يمكن للخلايا الجذعية البالغة الخلايا الصباغية (MCSCs) في الجلد الظهري المريد ان تعمل كخلايا من أصل الميلانوما عند التنشيط الشاذ للراس/Raf و akt مسارات6. ومع ذلك ، فان هذه الطفرات اونكوغينيك وحدها ليست قادره علي تحفيز تكوين الورم بكفاءة من MCSCs هادئه. أورام الخلايا الصباغية تتطور في نهاية المطاف عندما تصبح MCSCs نشطه اثناء ركوب الشعر الطبيعي. ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، فاننا سوف تصف أساليب للحث بشكل مصطنع تنشيط الخلوية من mcscs المعرضة للورم ، التالي تسهيل التحكم الدقيق في بدء الورم الميلاني6،7.

من خلال الطرق الموصوفة هنا ، والسيطرة المكانية والزمانيه من سرطان الجلد الشروع الجلدية من MCSCs المعرضة للورم التعبير عن الV600E braf بالاضافه إلى فقدان التعابير pten يمكن ان يؤديها بنجاح ، ونحن سبق ان أبلغت عن6. هذا الأسلوب يدمج النتائج السابقة التي تثبت الخلايا الجذعية الشعرية التنشيط من خلال أزاله الشعر ، فضلا عن كيفيه التعرض للجلد murine إلى الاشعه فوق البنفسجية-B يمكن ان تسهل تفعيل MCSCs المقيمين في بصيلات الشعر ونقل هذه الخلوية السكان الفرعيين إلى البشرة البينية6،8،9،10. ويمكن لهذه النظم في نموذج الجسم الفيزيائي توفير معلومات قيمه فيما يتعلق بكيفية تغيير الفسيولوجية والبيئية يمكن ان تغير الوضع الخلوي لل MCSCs المعرضة للميلانوما ، والتي بدورها يمكن ان تحفز البدء الكبير من سرطان الجلد في البشرة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية جامعه كورنيل والاستخدام (IACUC).

1-الاعداد

  1. جمع مقاطع الذيل من 12 يوما بعد الولادة الفئران وهضم في 400 μL من 0.05 N NaOH في 95 درجه مئوية ل 1 ح. دوامه وأضافه 32 μL من 1 M تريس-HCl ، pH 7. الفئران النمط الجيني وفقا لبروتوكولات PCR المقدمة من خلال مختبر جاكسون وتحديد الفئران مع النمط الجيني للفائدة6.
    - صور-CreER- hemizygous(+/creer)
    - LSL-BrafV600E – غير متجانس (+/Lsl-v600e)
    - Pten- flox العائمة (فلويكس/فلويكس)
    - LSL-tdTomato- hemizygous(+/lsl-tdorord)
    ملاحظه: وترد التسلسلات التمهيدية في جدول المواد.
  2. استخدم مقص الشعر (أداه تشذيب كهربائيه) لحلاقه الجلد الظهري قبل 2 إلى 3 أيام من كل التجارب الموصوفة أدناه ، وعندما تكون الفئران حوالي 7 أسابيع من العمر. الحرص علي عدم الاضرار الجلد الماوس رقيقه باستخدام الانتهازي الكهربائية كما اي أصابه قد تثير استجابه التئام الجروح التي سوف تنشط الخلايا الجذعية بصيلات الشعر ، بما في ذلك MCSCs.
  3. تحديد ما إذا كانت دوره الشعر في تساقط وما إذا كان الجلد مصابا خلال فتره الانتظار. إذا كان الجلد يظهر اي علامة علي الاصابه ، لا ينبغي استخدام الماوس لهذه الإجراءات.
    ملاحظه: علي الرغم من ان دوره الشعر قد تختلف قليلا بين الخلفيات الوراثية ، في هذا العصر دوره الشعر في الجلد الظهري عاده في الدولة تساقط11. وسوف تستهدف الجينات تير-creer mcscs في الجلد تساقط ، سيتم التعبير عن التعديلات الجينية اللاحقة بشكل دائم في جميع السلالات من mcscs ، بما في ذلك الخلايا الصباغية المتمايزة والأورام الصباغية.

2. العلاج تاموكسيفين ل Cre-Lox الوراثية أعاده الإدماج

  1. اعداد تاموكسيفين للحقن داخل الصفاق (IP) أو الاداره الموضعية لأعاده الإدماج الوراثية الجهازية أو الموضعية
    ملاحظه: من أجل تاموكسيفين للحث علي أعاده الدمج, يجب أولا ان استقلاب الكبد إلى 4-هيدروكسي تاموكسيفين (4-OHT), التي يمكن ربط وتنشيط Creer. لن يتم استقلاب التطبيق الموضعي من تاموكسيفين بهذه الطريقة و 4-OHT يجب ان تستخدم مباشره. مطلوب طريقه واحده فقط من التسليم تاموكسيفين لأعاده تركيبه كافيه.
    1. تاموكسيفين: اعداد تاموكسيفين في تركيز 10 ملغ مل-1 المذاب في زيت الذرة. للمساعدة في حل المخدرات في محلول ، أضافه ما يصل إلى 10 ٪ من الحجم الإجمالي لل 100 ٪ الايثانول الجزيئي الصف إلى المخدرات في شكل مسحوق ، دوامه لمده 3 دقائق ثم أضافه حجم المتبقية من زيت الذرة. الاستمرار في دوامه حتى المواد البلورية لم يعد واضحا في الحل. يمكن تعقيم محلول تاموكسيفين عن طريق تمرير من خلال فلتر 0.2 μm. انتقل إلى الخطوة 2.2.1 للعلاج.
    2. 4-OHT: اعداد حل الأسهم من هيدروكسي تاموكسيفين تصل إلى 3 ملغ مل-1 في 100 ٪ الايثانول. ثم ، يمكن تطبيق حل العمل بقدر الحاجة لتغطيه منطقه الجلد من الفائدة (عموما تطبيق واحد).
      ملاحظه: حل الأسهم من هيدروكسي تاموكسيفين يمكن حله في الايثانول 100 ٪ للتركيز النهائي من 5 ملم. ثم ، لاعداد حل العمل ، يمكن ان تضعف 5 μL من 4OH-تاموكسيفين حل الأسهم إلى 15 μL من الايثانول 100 ٪. ل 4 مم2 المنطقة ، 1 إلى 3 μl من حل العمل يمكن تطبيقها موضعيا.
  2. علاج الفئران مع تاموكسيفين اما بالمنهجية أو موضعيا
    1. للمعالجة الجهازية ، وأداره 2 ملغ من تاموكسيفين عن طريق حقن الملكية الفكرية مره واحده يوميا لمده 3 أيام باستخدام ابره 26 G.
      ملاحظه: باستخدام هذا النموذج ، ما يقرب من 93 ٪ ± 4 ٪ من MCSCs هادئه هي المسمية مع tdTomato6.
    2. لتفعيل الاقليميه ، وأداء واحد العلاج الموضعي مع 4-OHT. غطي منطقه الجلد ذات الاهتمام بحل العمل. يمكن تحديد مقدار الحل العمل حسب حجم منطقه الاهتمام كما هو موضح في الخطوة 2-1-2.
  3. في 48 h بعد الجرعة الاخيره من تاموكسيفين, المضي قدما إلى الخطوة 3 لأزاله الاشعه الكيميائية المستحثة بدء الورم أو إلى الخطوة 4 للاشعه فوق البنفسجية-B بدء الورم المستحث

3. أزاله المزيل الكيميائي

  1. تجهيز غرفه العلاج الماوس التي تحتوي علي نظام ايزوفلواني مع المواد المطلوبة التالية: كريم أزاله الشعر ، ومسحات قطنية ، والقماش ورقه ، والماء.
  2. وضع الماوس في غرفه التعريفي وتخدير مع 3.5 إلى 4.5 ٪ ايزوفلونان و 1 لتر/دقيقه الأكسجين.
  3. بمجرد استقرار معدل التنفس ، تاكد من ان الماوس في المستوي الصحيح من التخدير عن طريق اجراء قرصه اصبع القدم ونقل الماوس إلى الأنبوب الرئيسي الحفاظ علي التخدير مع 1 إلى 1.5 ٪ ايزوفلونان و 1 لتر/دقيقه الأكسجين. تطبيق مرهم العين للحفاظ علي العينين من التجفيف بينما تحت التخدير.
  4. استخدام مسحه من القطن لتطبيق طبقه رقيقه من كريم أزاله الشعر إلى منطقه حليقه من الجلد الماوس.
  5. مره واحده وقد تم تطبيق كريم بالتساوي ، واستخدام مسحات القطن نظيفه للبدء في أزاله. الوقت الإجمالي الذي يكون الكريم علي اتصال مع الجلد يجب ان لا تتجاوز 1 دقيقه.
  6. امسح الجلد برفق بقطعه قماش مبلله وتاكد من أزاله اي كريم متبقي.
    ملاحظه: كريم أزاله الشعر يمكن ان يسبب تهيج في الجلد إذا لم يتم ازالته تماما. بعض الفئران ، مثل تلك الموجودة علي خلفيه C57BL/6 ، يمكن ان تكون عرضه للاصابه بالتهاب الجلد12. علي الرغم من ان نادره ، وبعض الكائنات الحيوانية تطوير التهاب الجلد في غضون 24 ساعة بعد أزاله الشعر تطبيق كريم أو مزيل للشعر الميكانيكية. تاكد من التحقق من الفئران في اليوم بعد العلاج للبحث عن اي علامات تهيج الجلد الاقليميه.
  7. تخلص من أعمده الشعر المزالة وأي مواد تستخدم في سله المخاطر البيولوجية.
  8. ضع الماوس في قفص فاره فارغ ونظيف حتى يزول التخدير.
  9. أعاده الفئران إلى اقفاصهم.

4. الاشعه فوق البنفسجية-B التشعيع

  1. تجهيز غرفه العلاج الماوس التي تحتوي علي نظام ايزوفلوان مع المواد المطلوبة التالية: الاشعه فوق البنفسجية-B نظام الضوء ، الاشعه فوق البنفسجية-B متر الخفيفة ، وتغطيه واقيه للماوس ، اضافيه واقيه من الاشعه فوق البنفسجية-B وقائية للباحث ، وتوقيت.
  2. يجب ان تكون الفئران المشعة في جرعه الاشعه فوق البنفسجية-B من الفائدة (اي ، 0-180 مللي جول/سم2). استخدام متر ضوء الاشعه فوق البنفسجية-B لتحديد المدة المناسبة من الوقت لتشع الفئران.
    ملاحظه: mW/cm2 x الوقت = الجرعة
  3. تخدير الماوس مع ايزوفلواني. بينما في الغرفة التعريفي ، استخدم 3.5 إلى 4.5 ٪ ايزوفلونان و 1 لتر/دقيقه الأكسجين.
  4. مره واحده يتم تثبيت الماوس ، وتاكيد اثار التخدير مع قرصه اصبع القدم ونقل الماوس إلى أنبوب التخدير الرئيسي الموجود في غرفه الاشعه فوق البنفسجية. تطبيق مرهم العين لمنع العينين من التجفيف بينما تحت التخدير. الحفاظ علي التخدير مع 1 إلى 1.5 ٪ ايزوفلواني و 1 لتر/دقيقه الأكسجين.
  5. تغطيه الجلد الظهري مع الاشعه فوق البنفسجية-B المواد الواقية بحيث فقط المنطقة المطلوبة سيتم كشفها.
    ملاحظه: وينبغي في الوقت الحالي استخدام معدات الوقاية الخاصة المناسبة. طول الفترة الزمنيه اللازمة ليشع الماوس يعتمد علي كثافة لمبة الضوء المستخدمة ، ولكن قد تحتاج إلى مراقبه التخدير إذا كان الوقت المطلوب يتجاوز 30 ثانيه.
  6. تغطيه غرفه الاشعه فوق البنفسجية باستخدام غطاء مقاوم للاشعه فوق البنفسجية أو اي مواد أخرى مناسبه.
  7. قم بتشغيل مصباح الاشعه فوق البنفسجية-B وأشرق الماوس للوقت الذي يحدده الباحثون للهدف المحدد.
  8. قم بإيقاف تشغيل نظام الاشعه فوق البنفسجية و ايزوفلونان ، ثم ضع الماوس علي قفص فاره فارغ حتى يزول التخدير.
  9. أعاده الفئران إلى اقفاصهم.

5. معالجه الانسجه

  1. عزل الجلد
    1. الحصول علي ما يلي قبل البدء: الصكوك الحبال ، ورقه فلتر والمناشف الورقية.
    2. موت ببطء الفئران وفقا لبروتوكولات IACUC المعتمدة ، وتاكيد الموت قبل المضي قدما.
    3. باستخدام مقص الشعر ، احلق اي شعر من منطقه الجلد الظهرية. نظف المنطقة برفق بنسيج خال من الوبر لمسح المنطقة.
    4. جعل شق صغير مع مقص حاد فقط فوق قاعده الذيل.
    5. ادراج مقص حاده كبيره في الشق وفصل الانسجه الضامة تحت الجلد.
    6. عزل بعناية منطقه الجلد من الفائدة عن طريق قطع مع مقص حاد علي طول حافه النسيج.
    7. ضع نسيج الجلد علي منشفه ورقيه نظيفه واستخدم ملقطا مملا لتمدد الجلد بحيث يلتصق بالمنشفة ويتم تدريسه. تعمل هذه الخطوة علي توفير دعم إضافي للانسجه بحيث يمكن التلاعب بها ومعالجتها مع الحفاظ علي شكلها.
      ملاحظه: كن حذرا للتعامل فقط مع المناطق الخارجية من انسجه الجلد ، والملقط قد يسبب ضررا علي الجلد والتي يمكن ان ينظر اليها تشريحيا.
  2. تثبيت الانسجه
    1. اضعاف قطعه من ورقه فلتر في نصف والتسمية بشكل مناسب. ضعي الجلد مع منشفه ورقيه في الورقة المطوية المجاورة مباشره للتجعد ، لضمان ان تكون العينة ناعمه وغير مطوية أو تكومه. قم بختم ورقه الفلتر بتدبيس الجانبين المفتوحين ، ثم تقليم بحيث يمكن استخدام الورق المتبقي للعينات المستقبلية.
      ملاحظه: يتم تنفيذ هذه الخطوة بحيث يحتفظ الجلد شكله اثناء التثبيت.
    2. غمر تماما عينه الانسجه في 10 ٪ محايده الفورمالين المخزنة مؤقتا لمده 3 إلى 5 ح في درجه حرارة الغرفة أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
    3. بعد التثبيت ، وأزاله العينات من formalin ، ويغسل في الماء منزوع الأيونات (2x ، 5 دقيقه لكل منهما) والمضي قدما لجعل كتل الانسجه. قم بازاله اي مواد متبقية بعناية من نسيج الجلد (اي الورق المتبقي).
  3. صنع كتل الانسجه المجمدة (الشكل1)
    1. تقليم حواف عينه الجلد بحيث انها ليست خشنه ومن ثم جعل 3 السهمي التخفيضات. وينبغي ان يكون عرض هذه الشرائط لا يكون أكثر من ارتفاع البرد (5 ملم). بعد ذلك ، اجراء تخفيضات عرضيه ان يكون قطعه من الجلد التي ليست أطول من عرض البرد (20 ملم) ويمكن ان تكون جزءا لا يتجزا. كرر مع النصف المتبقي من الجلد الظهري ، أو حفظ الانسجه لاستخدامات أخرى (بالتناوب ، حفظ نصف قبل التثبيت).
      ملاحظه: من المهم الحفاظ علي قطع الجلد في الاتجاه الصحيح.
    2. توجيه البرد الكبير (25 × 20 × 5 مم3) في اتجاه عمودي ووضع 4 إلى 5 قطع من الجلد علي راس OCT. مره واحده كل القطع في مكانها ، استخدم 2 أزواج من ملقط غرامه لتحقيق الحافة الطويلة من الجلد إلى الجزء السفلي من البرد. يجب ان تكون البشرة الآن واقفا في عمودي OCT إلى قاعده العفن. الحرص علي تقليل تشكيل جيوب الهواء داخل OCT خلال هذه الخطوة (الشكل 1).
    3. ملء العفن مع OCT إلى الشفة الثانية ، ووضع علي سطح مستو من الجليد الجاف. استخدام ملقط لضبط اي قطعه الجلد التي قد تحولت اثناء نقل كما يبدا كتله لتجميد. مره واحده يتم تدعيم الطبقة السفلي ، والتلاعب في الانسجه سيكون من المستحيل.
    4. قطع 8-10 ميكرومتر الشرائح للتحليل.
  4. جعل Formalin ثابته البارافين المضمنة (FFPE) كتل الانسجه
    1. ضع 2 قطعه من الجلد الثابت في الكاسيت المسمي والهيدرات في زيادة تركيزات الايثانول (75 ٪ الايثانول لمده 30 دقيقه ، 85 ٪ لمده 30 دقيقه ، 90 ٪ لمده 30 دقيقه ، 95 ٪ لمده 30 دقيقه ، 100 ٪ ل 2x 30 دقيقه ، أكسلين أو أكسلين بديل ل 2x 30 دقيقه). احتضان مع البارافين في 58-60 درجه مئوية ، أولا لمده 30 دقيقه ، ومن ثم بين عشيه وضحيها.
    2. تضمين النسيج في 24 × 24 ملم2 الفولاذ المقاوم للصدا العفن الانسجه مع البارافين السائل ويصلب في-5 درجه مئوية. وينبغي ان يكون التوجه الانسجه مماثله لتلك الكتل الانسجه المجمدة بحيث يمكن تصور المقاطع الطولية عبر بصيلات الشعر متعددة (الشكل 1).
    3. مره واحده وقد عزز البارافين ، وأزاله العفن وقطع في أقسام 5-10 μm للتحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الجلدية التي يسببها أزاله الجلد بواسطة الكيميائية

ويرد في الشكل 2الاجراء الخاص بازاله المزيلات الكيميائية. عندما الفئران هي 7 أسابيع بعد الولادة ، والجلد الظهري في telogen. خلال telogen, الخلايا الجذعية بصيلات الشعر و MCSCs ومن المعروف ان تكون في حاله سكون, يستريح. يجب ان تظهر الجلد اي نمو الشعر كبيره بعد الحلاقة. من ناحية أخرى ، يمكن لأزاله الشعر الكيميائية للحث علي تنشيط الخلايا الجذعية الشعرية ، والتي بدورها تظهر نموا كبيرا في الشعر من منطقه الاهتمام (الشكل 2). المثل, MCSCs المعرضة للورم التعبير عن الطفرات الجينية أيضا بحاجه إلى ان تكون نشطه لتشكيل الورم المعجل. أزاله الشعر الكيميائية يمكن ان تحفز بشكل كبير علي تنشيط كل من الخلايا الجذعية بصيلات الشعرة و MCSCs. يمكن ان تكون MCSCs المعرضة للاصابه بسرطان الجلد في حاله نشطه الأورام ، ويمكن ملاحظه بدء الورم الميلاني المجهرية في غضون أسابيع 2 بعد أزاله الشعر الكيميائية باستخدام سلاله تتبع اليل LSL-tdtomato (الشكل 3).

بدء الجلد الجلدي الناجم عن الاشعه فوق البنفسجية-B

علي غرار أزاله الاشعه الكيميائية ، يمكن للاشعه فوق البنفسجية-B ان تحفز بدء الورم من MCSCs المعرض للورم الهادئ (الشكل 4). في حين ان الجلد الذي يحتوي علي الورم MCSCs المعرضة للورم في حاله هادئه يظهر اي بدء الورم الكبير وعدم وجود تصبغ كبير ، والجلد الظهري يتعرض للاشعه فوق البنفسجية-B (مرتين ، 180 mJ/سم2) يظهر الأسود المصطبغة الأورام الصباغية المبكرة التي واضحة كليا (الشكل 4 ا، ب). في حين ان الاشعه فوق البنفسجية-B يمكن ان تحفز بشكل كبير بدء الورم الواضح كليا في غضون 2 أسابيع ، يمكن لتطبيق واقيه من الشمس حماية الاشعه فوق البنفسجية-B-بوساطة الشروع في الجلد ، علي غرار قطعه قماش مقاومه للاشعه فوق البنفسجية (الشكل 4C، D).

والاهم من ذلك ، فان الاشعه فوق البنفسجية-B تقوم بنقل الموقع المباشر ل MCSCs من مشكاة الخلايا الجذعية الجرابيه إلى البشرة البينية. وعلاوة علي ذلك ، يمكن ان تحفز الاشعه فوق البنفسجية-B تكوين الميلانوما الجلدية MCSC المنشا في جميع انحاء البشرة البينية ، ويمكن ملاحظه النمط الظاهري المجهري من قبل علامة تتبع النسب ، tdTomato (الشكل 5). وبما ان هذه الخلايا السرطانية خبيثه ، فانها تنمو بسرعة واينفاسيفيلي (الشكل 5). علي غرار الجلد الظهري ، يمكن ملاحظه بدء سرطان الجلد الناجم عن الاشعه فوق البنفسجية-B بشكل ملحوظ في مناطق البشرة الأخرى ، مثل جلد الاذن (الشكل 6). بالمقارنة مع الجلد السيطرة التي تغطيها القماش المقاوم للاشعه فوق البنفسجية ، والجلد الاذن المعرضة للاشعه فوق البنفسجية-B يوضح تصبغ اعلي بسبب عبء اعلي من البدء في سرطان الجلد (الشكل 6).

Figure 1
الشكل 1: عزل الانسجه الجلدية وتضمينها في البرد. بعد القتل الرحيم ، حلق الماوس منطقه الجلد الظهرية من الفائدة وتضمين الجلد في البرد التي تحتوي علي OCT. يمثل الخط المنقط علي الماوس الخط الأوسط. عاده ، يمكن عزل 3 أو 4 قطع من الجلد مع قطعه الخط 3-4 علي طول الخط الأوسط. ويشار إلى قطعه واحده من قبل المستطيل 1/2/3/4. وينبغي ان تكون جزءا لا يتجزا من هذه القطع الجلد في OCT كما هو مبين في الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الأنماط الظاهرية المجهرية بعد أزاله المزيل الكيميائي. (ا) الرسم التخطيطي لأزاله المزيلات الكيميائية. (ب) بعد الحلاقة ، تم تاكيد دوره الشعر لتكون في telogen. (ج) تم اجراء أزاله الشعر بالمواد الكيميائية للتخلص من الشعرات من بصيلات الشعر ، والتي يمكن ان تنشط كل من بصيلات الشعر والخلايا الجذعية الصباغية. (د) وبعد حوالي أسبوع ، سيكون نمو الشعر في وقت مبكر ملحوظا بسهوله. (ه) ثم ، يمكن ملاحظه نمو الشعر كبيره مع مرور الوقت. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: المراقبة المجهرية لبدء الورم الميلاني الذي يتحكم فيه أزاله المزيل الكيميائي. يمكن لأزاله المزيل الكيميائية بشكل كبير لتحفيز تفعيل MCSCs الورم المعرضة للورم. ثم ، يمكن ملاحظه بدء الورم المجهرية التي تظهر من قبل علامة تتبع السلالة tdTomato في غضون أسابيع 2. يوضح هذا الشكل النمط الظاهري المجهري 16 يوما بعد 3 أيام تاموكسيفين بواسطة حقن IP تليها أزاله المواد الكيميائية باستخدام مرئيات مختلفه من نفس مجال الرؤية. (ا) tdtomato + الخلايا السرطانية الناشئة من بصيلات الشعر اندمجت مع المضادة للبقع النووية dapi. (ب) يتم عرض بصيلات الشعر والبشرة البينية باللون الأبيض. (ج) مخطط يوضح كيف تغزو الخلايا السرطانية + الأورام في الادمه من بصيلات الشعر ، المعدلة من القمر ، h. et al.6. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: النمط الظاهري المجهري للميلانوما الجلدية الناجم عن تشعيع الاشعه فوق البنفسجية-باء. وعولجت الفئران من قبل تاموكسيفين لمده 3 أيام (اليوم 1 إلى 3) تليها 2 التعرض للاشعه فوق البنفسجية-B (اليوم 4 و 6). (ا) رسم تخطيطي للاشعه فوق البنفسجية-باء علي الجلد الظهري الذي يحتوي علي متحولة mcscs. (ب) النمط الظاهري الكلي المجهري بين التحكم والاشعه فوق البنفسجية-b المكشوفة للبشرة الظهرية. يمكن ملاحظه التصبغات السوداء الكبيرة المتعلقة بتكوين ورم الخلايا الصباغية في غضون أسبوعين بعد الاشعه فوق البنفسجية الثانية-B. (ج) رسم تخطيطي لتطبيق الواقي من الشمس. (د) في حين ان الاشعه فوق البنفسجية-B يمكن ان تحفز بشكل كبير بدء الورم من mcscs متحولة ، وأظهرت تطبيق واقيه من الشمس قمعت بشكل كبير الاشعه فوق البنفسجية-b-بوساطة بدء الورم (16 يوما بعد الاشعه فوق البنفسجية الثانية-b التشعيع). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: المراقبة المجهرية لسرطان الجلد الجلدي الناجم عن الاشعه فوق البنفسجية B. وعولجت الفئران مع تاموكسيفين بواسطة حقن الملكية الفكرية لمده 3 أيام (اليوم 1 إلى 3) تليها 2 التعرض للاشعه فوق البنفسجية-B (اليوم 4 و 5). (ا-ج) بدء الورم المبكر في جميع انحاء البشرة البينية التي يظهرها السلالة التي تتبع tdTomato يمكن ان تظهر في اليوم 17. (ا) تظهر الخلايا السرطانية tdtomato + المهاجرة من بصيلات الشعر إلى البشرة البينية. يستخدم dapi كمضاد للبقع النووية. (B) يتم أزاله تلطيخ dapi وخط منقط يشير إلى موقع بصيلات الشعر والبشرة البينية. (ج) التخطيطي الذي يشير إلى tdtomato + هجره الخلايا من جرثومه الشعر إلى البشرة البينية بعد التعرض للاشعه فوق البنفسجية-باء. تعديل من القمر وآخرون6. (مد-واو) ثم تنمو الخلايا السرطانية بسرعة وتغزو الانسجه الجلدية أدناه (اليوم 25). (د) وواصلت الخلايا السرطانية tdtomato للانتشار وتغزو الانسجه الجلدية. يستخدم dapi كمضاد للبقع النووية. (ه) يتم أزاله تلطيخ dapi وخط منقط يشير إلى موقع بصيلات الشعر والبشرة البينية. (و) التخطيطي الذي يشير إلى tdtomato + غزو الخلايا في الادمه ونمو الورم الصباغي. تعديل من القمر وآخرون6. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: المراقبة المجهرية والدقيقة للميلانوما المستحثة بالاشعه فوق البنفسجية في جلد الاذن. (ا) المخطط التجريبي. وعولجت الفئران من قبل تاموكسيفين لمده 3 أيام (اليوم 1 إلى 3) تليها 3 التعرض للاشعه فوق البنفسجية-B (اليوم 4, 6 و 8). (ب) لوحظت زيادة كبيره في البدء بسرطان الجلد بواسطة الاشعه فوق البنفسجية-باء بالمنظار المجهري وكذلك مجهريا في اليوم 28. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

التغييرات الوراثية المميزة التي كثيرا ما وجدت في أورام سرطان الجلد الجلدي وصفت جيدا13. طفرة السائق الأكثر هيمنة هو BrafV600E، وتم إنشاء نموذج الماوس المهندسة وراثيا لسرطان الجلد brafV600Eبوساطة مجموعه Bosenberg14 وأودعت في مختبر جاكسون. باستخدام هذا النموذج الماوس ، أظهرت الدراسة الاخيره لدينا شرط التنشيط الخلوية من MCSCs المعرضة للورم لبدء كبيره من سرطان الجلد V600Eبوساطة brafفي البشرة الظهرية6.

ومن المعروف أزاله الشعر لتكون وسيله فعاله للحث علي تنشيط الخلايا الجذعية الشعرية murine علي الجلد الظهري6,10. وتقع murine MCSCs داخل بصيلات الشعر ، وعلاوة علي ذلك ، يتم مزامنة حاله الخلوية MCSCs جرابي مع حاله الخلايا الجذعية بصيلات الشعر8. التحوير الاصطناعي للخلايا الجذعية بصيلات الشعر يمكن ان يغير حاله MCSC ، التالي يمكن أزاله شعر الخلايا الجذعية الصباغية والشعرة مباشره. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لتفعيل MCSCs لورم المعرضة MCSCs لفحص الخطوات المبكرة من الجلد الجلدية البدء في نماذج الماوس الميلانوما المهندسة وراثيا. من خلال طريقه أزاله الجلد الكيميائية ، يمكن البدء بشكل مباشر في تشكيل الميلانوما في المنطقة التي تثير الاهتمام في البشرة الظهرية المريدة. يمكن ان يؤديها أزاله الشعر بطرق مختلفه مثل الصبح أو نتف ، وكلاهما من أنواع الحلاقة الميكانيكية حيث يتم استخراج مهاوي الشعر من بصيلات الشعر. ومع ذلك ، فان هذه الأساليب أزاله المزيل الميكانيكية يمكن ان تكون غير دقيقه فيما يتعلق بمنطقه معينه من الفائدة. ومن ناحية أخرى ، فان طريقه أزاله الشعر الكيميائية التي تستخدم الكريم المزيل للشعر بسيطه الأداء وتسمح بتطبيق دقيق مع تنشيط موثوق لدوره الشعر ، وقد تكون اقل قسوة علي الجلد من الازاله الميكانيكية.

من بين عوامل الخطر المختلفة ، الاشعه فوق البنفسجية-B هو عامل الخطر الأكثر شهره في سرطان الجلد الجلدي15. ومن المعروف إشعاع الاشعه فوق البنفسجية-B للحث علي الهجرة المباشرة من MCSCs جرابي في البشرة البينية9. وعلاوة علي ذلك ، الاشعه فوق البنفسجية-B هو الإجهاد البيئية القوية التي يمكن ان تحفز بشكل كبير بدء الميلانوما من MCSCs المعرضة للورم6. في البروتوكول التجريبي الموصوف أعلاه ، يمكن لمنطقه صغيره من الاهتمام علي الجلد الظهري المريد ان تتعرض للضوء الاشعه فوق البنفسجية-B في حين ان استخدام قطعه قماش مقاومه للاشعه فوق البنفسجية يحمي بسهوله بقية الماوس من التعرض غير المرغوب فيه. ويمكن اجراء هذا العلاج في حين ان الماوس تحت التخدير. الأهم من ذلك ، فان هجره MCSCs وتشكيل الورم الميلاني المنشا MCSCS بعد التعرض للاشعه فوق البنفسجية-B هي الاشعه فوق البنفسجية-B-جرعه تعتمد6. لذلك ، لتحقيق نتائج ناجحه ، من المهم التحقق بانتظام من شده اللمبة الضوئية باستخدام مقياس الاشعه فوق البنفسجية-B وضبط وقت التعرض والمسافة بين الجلد والمصابيح الكهربائية حسب الحاجة. كما هو معروف عموما ، يمكن للجلد حرق استجابه لجرعه عاليه من الاشعه فوق البنفسجية-B الخفيفة ، ولكن ضعف التعرض للاشعه فوق البنفسجية-B هو أيضا ضاره للتجربة لأنها لن تكون كافيه للحث علي سرطان الجلد المنشا MCSC.

ويركز البروتوكول الموصوف هنا في المقام الأول علي عامل المخاطر البيئية ، الاشعه فوق البنفسجية-باء ، في الجلد الظهري. غير انه يمكن تطبيق البروتوكول التجريبي المذكور أعلاه علي أهداف مختلفه. علي سبيل المثال ، يمكن تعديل البروتوكول مع المصابيح الضوئية من أطياف مختلفه لتحديد تاثير مصادر الضوء البديلة أو أطوال موجية من الاشعه فوق البنفسجية ، مثل الاشعه فوق البنفسجية-A. واستهدف هذا البروتوكول في المقام الأول الجلد الظهري كما انه يمكن الوصول اليها ووضع MCSCs محدده جيدا. ومع ذلك ، فانه يمكن أيضا ان تكون غيرت لاستهداف التعرض للضوء الاشعه فوق البنفسجية لزوائد مثل الاذن ، الذيل أو جلد النخيل ، بما في ذلك منصات القدم. وكمثال علي ذلك ، في الشكل 6، من الممكن دراسة الفرق المحتمل في تكوين الورم الميلانينيه المبكر في مواقع الانسجه البديلة. ومع ذلك ، علي عكس الجلد الظهري ، ووضع MCSCs في هذه المواقع هي اقل تحديدا جيدا ؛ التالي ، ينبغي النظر في التنشيط التلقائي المحتمل لل MCSCs مما يؤدي إلى تواجد عشوائي لتكوين الميلانوما. التالي ، بالمقارنة مع البروتوكول في الجلد الظهري ، سوف تتطلب النهج البديلة عددا متزايدا من التجارب للحصول علي نتائج تجريبية دقيقه.

وعلاوة علي ذلك ، في حين ان البروتوكول الحالي يوضح في المقام الأول BrafV600E-بوساطة سرطان الجلد البدء ، وذكرت دراستنا السابقة أيضا تكوين سرطان الجلد في وقت مبكر مماثله مع الجمع بين راس/pten المختلطة ، وذلك باستخدام LSL-krasG12D الوراثية اليل6. ومع ذلك ، الطفرات الأخرى السائق مثل الجينات Nras متحولة يمكن أيضا ان ينظر مع النظام التجريبي الموصوف هنا لفهم بدء سرطان الجلد في وقت مبكر مدفوعا تركيبات أخرى oncoغينيك.

معا, وصفت هنا هو في نظام نموذج الجسم الذي يسمح لفحص المبكرة الجلدية سرطان الجلد البدء في الفئران المهندسة وراثيا. هذه النماذج murine توفر أساليب للسيطرة الزمانيه والمكانية لبدء الميلانوما من مكاس متحولة في الجلد. توفر هذه البروتوكولات نموذجا جديدا لدراسة أليات بدء الورم الميلاني مبكرا من MCSCs المعرضة للورم ، فضلا عن منصة لتحديد الضغوط الفسيولوجية والبيئية التي يمكن ان تسهم في بدء سرطان الجلد. هذا المستوي من التحكم المكانية يمكن ان توفر أيضا أداه لاستقراء سرطان الجلد أكثر دقه لاختبار فعاليه المخدرات في منع تكوين سرطان الجلد ، وكذلك نمو الورم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن أصحاب البلاغ عن اي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل مكتب مساعد وزير الدفاع للشؤون الصحية ، من خلال برنامج أبحاث السرطان الذي استعرضه النظراء تحت الجائزة W81XWH-16-1-0272. الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات هي تلك التي لدي المؤلفين ولا تحظي بالضرورة بتاييد وزاره الدفاع. وكان هذا العمل مدعوما أيضا بمنحه البذور من برنامج الخلايا الجذعية كورنيل إلى الأبيض. وقد دعمت h. القمر من قبل مركز كورنيل لفقاري الجينوم الباحث عن البرنامج.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tamoxifen Sigma T5648-1G For systemic injection
Tamoxifen Cayman Chemical 13258 For systemic injection
Corn oil Sigma 45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen Sigma H7904-25MG For topical treatment
26 G 1/2" needles various Veterinary grade
1 mL syringe various Veterinary grade
Pet hair trimmer Wahl 09990-502
Hair removal cream Nair n/a Available at most drug stores
Cotton swabs various
Ultraviolet light bulb UVP 95-0042-08 model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol various pure ethanol
Histoplast PE Fisher Scientific 22900700 paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10% Sigma HT501128-4L
Clear-Rite 3 Thermo Scientific 6901 xylene substitute
O.C.T. Compound Thermo 23730571
Tissue Cassette Sakura 89199-430 for FFPE processing
Cryomolds Sakura 4557 25 x 20 mm
FFPE metal mold Leica 3803082 24 mm x 24 mm
Isoflurane various Veterinary grade
Anesthesia inhalation system various Veterinary grade
Fine scissor FST 14085-09 Straight, sharp/sharp
Fine scissor FST 14558-09 Straight, sharp/sharp
Metzenbaum FST 14018-13 Straight, blunt/blunt
Forcep FST 11252-00 Dumont #5
Forcep FST 11018-12 Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f Jackson Labs 13590
LSL-tdTomato Jackson Labs 007914 ai14
Cre-1 n/a GCATTACCGGTCGATGCAACGA
GTGATGAG
Cre-2 n/a GAGTGAACGAACCTGGTCGAA
ATCAGTGCG
Braf-V600E-1 n/a TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2 n/a CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1 n/a AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT
AAGTCTGCA
Kras-G12D-2 n/a CCTTTACAAGCGCACGCAGACT
GTAGA
Pten-1 n/a ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2 n/a AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3 n/a GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1 n/a AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2 n/a CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3 n/a GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4 n/a CTGTTCCTGTACGGCATGG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
  4. Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
  5. Blanpain, C. Tracing the cellular origin of cancer. Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).
  6. Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
  7. Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
  8. Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
  9. Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
  10. Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
  11. Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
  12. Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
  13. Vultur, A., Herlyn, M. SnapShot: melanoma. Cancer Cell. 23 (5), 706-706.e1 (2013).
  14. Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
  15. Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 148 ، سرطان الجلد ، الخلايا الجذعية للخلايا الصباغية ، الخلايا الجذعية للشعر ، أزاله الشعر ، الاشعه فوق البنفسجية-B
التحكم المكاني والزماني للبدء من الميلانوما من الخلايا الجذعية المتحولة للخلايا الصباغية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moon, H., Donahue, L. R., Kim, D.,… More

Moon, H., Donahue, L. R., Kim, D., An, L., White, A. C. Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells. J. Vis. Exp. (148), e59666, doi:10.3791/59666 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter