Summary
La seguente procedura descrive un metodo per il controllo spaziale e temporale dell'iniziazione tumorale melanocitica nella pelle dorsali murina, utilizzando un modello di topo geneticamente modificato. Questo protocollo descrive l'iniziazione macroscopica e microscopica del melanoma cutaneo.
Abstract
Il melanoma cutaneo è ben noto come il cancro della pelle più aggressivo. Sebbene i fattori di rischio e le principali alterazioni genetiche continuino a essere documentati con maggiore profondità, il tasso di incidenza del melanoma cutaneo ha mostrato un rapido e continuo aumento negli ultimi decenni. Al fine di trovare metodi preventivi efficaci, è importante comprendere i primi passi dell'iniziazione del melanoma nella pelle. I dati precedenti hanno dimostrato che le cellule staminali follicolari dei melanociti (MCSC) nei tessuti cutanei adulti possono fungere da cellule di melanoma di origine quando esprimono mutazioni oncogeniche e alterazioni genetiche. La tumorigenesi derivante da MCSCs inclini al melanoma può essere indotta quando MCSCs passa da uno stato quiescente a uno attivo. Questa transizione in MCSCs inclini al melanoma può essere promossa dalla modulazione dello stato di attività delle cellule staminali follicoli piliferi o da fattori ambientali estrinseci come l'ultravioletto-B (UV-B). Questi fattori possono essere manipolati artificialmente in laboratorio mediante depilazione chimica, che provoca la transizione delle cellule staminali follicoli piliferi e delle MCSC da una condizione di quiescenza a quella attiva, e dall'esposizione UV-B utilizzando una luce da banco. Questi metodi forniscono un controllo spaziale e temporale riuscito dell'iniziazione cutanea del melanoma nella pelle dorsale murina. Pertanto, questi sistemi di modelli in vivo saranno preziosi per definire i primi passi dell'inizio del melanoma cutaneo e potrebbero essere usati per testare i potenziali metodi per la prevenzione del tumore.
Introduction
Il melanoma, la forma maligna dei tumori melanocitici, è il tumore più aggressivo della pelle con melanoma cutaneo responsabile della maggior parte dei decessi per cancro della pelle1. Negli Stati Uniti, il melanoma è comunemente diagnosticato; si prevede di essere il 5° al 6° tipo di cancro più comune tra i nuovi casi di cancro stimato in 20182. Inoltre, mentre le incidenze tumorali complessive hanno evidenziato l'andamento della progressiva riduzione degli ultimi decenni, i tassi di incidenza del melanoma cutaneo negli ultimi decenni dimostrano un aumento continuo e rapido di entrambi i sessi2.
Per combattere il melanoma cutaneo in modo più efficiente, è importante comprendere chiaramente i primi eventi di sviluppo del melanoma dalle loro cellule di origine per identificare meglio i metodi preventivi clinicamente efficaci. Ora è noto che le cellule staminali adulte possono contribuire significativamente alla formazione tumorale come origine cellulare dei tumori in molti tipi diversi di organi, compresi i tessuti cutanei3,4,5. Analogamente, le cellule staminali melanocitarie adulte (MCSC) nella pelle dorsale murina possono funzionare come cellule di melanoma di origine all'attivazione aberrante dei pathway RAS/RAF e Akt 6. Tuttavia, queste mutazioni oncogeniche da sole non sono in grado di indurre efficacemente la formazione tumorale da MCSCs quiescenti. i tumori melanocitici si sviluppano quando MCSCs diventano attivi durante il ciclismo naturale dei capelli. Tuttavia, in questo protocollo, descriveremo i metodi per indurre artificialmente l'attivazione cellulare di MCSCS inclini al tumore, facilitando così un controllo preciso dell'inizio del melanoma6,7.
Attraverso i metodi qui descritti, il controllo spaziale e temporale dell'iniziazione cutanea del melanoma da MCSCs inclini al tumore che esprimono BRAFV600E oncogenico insieme alla perdita dell'espressione PTEN può essere eseguito con successo, come abbiamo hanno riferito in precedenza6. Questo metodo incorpora precedenti risultati che dimostrano l'attivazione delle cellule staminali follicolari dei capelli attraverso la depilazione, così come l'esposizione della pelle di murina a UV-B può facilitare l'attivazione di MCSCs residente al follicolo pilifero e la traslocazione di questo cellulare sottopopolazione all'epidermide interfollicolare6,8,9,10. Questi sistemi di modelli in vivo possono fornire informazioni preziose su come i cambiamenti fisiologici e ambientali possono alterare lo stato cellulare dei MCSC inclini al melanoma, che a loro volta possono indurre una significativa iniziazione del melanoma nella pelle.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tutte le procedure degli animali sono eseguite in conformità con il Comitato istituzionale per l'assistenza e l'uso degli animali della Cornell University (IACUC).
1. la preparazione
-
Raccogliere clip di coda da topi postnatali 12 giorni e digerire in 400 μL di 0,05 N NaOH a 95 ° c per 1 h. Vortex e aggiungere 32 μL di 1 M Tris-HCl, pH 7. I topi di genotipo secondo i protocolli PCR forniti attraverso il laboratorio Jackson e identificano i topi con genotipo di interesse6.
- Tyr-creer – emizygous (+/creer)
- LSL-BRAFV600E – eterozigoti (+/LSL-V600E)
- PTEN – flox omozigote (flox/flox)
- LSL-tdpomodoro – emizygous (+/LSL-tdtomato)
Nota: Le sequenze di primer sono fornite nella tabella dei materiali. - Utilizzare un tagliacapelli (trimmer elettrico) per radersi la pelle dorsale 2 a 3 giorni prima di tutti gli esperimenti descritti di seguito, e quando i topi sono circa 7 settimane di età. Fare attenzione a non danneggiare la pelle del topo sottile utilizzando il trimmer elettrico come qualsiasi lesione può suscitare una risposta di guarigione della ferita che attiverà le cellule staminali del follicolo pilifero, tra cui MCSCs.
- Determinare se il ciclo dei capelli è in telogen e se la pelle è ferita durante il periodo di attesa. Se la pelle Mostra qualsiasi segno di lesione, il mouse non deve essere utilizzato per queste procedure.
Nota: Anche se il ciclo dei capelli può differire leggermente tra gli sfondi genetici, a questa età il ciclo dei capelli nella pelle dorsale è di solito nello stato telogen11. Il transgene Tyr-CreER Bersaglierà MCSCS in pelle telogen, e le successive alterazioni genetiche saranno espresse in modo permanente in tutte le linee del MCSC, compresi i melanociti differenziati e i tumori melanocitici.
2. trattamento con tamoxifene per la Ricomcombinazione genetica cre-lox
-
Preparazione di tamoxifene per iniezione intraperitoneale (IP) o somministrazione topica per la riconcombinazione genetica sistemica o localizzata
Nota: Affinché il tamoxifene induca la ricompressione, deve prima essere metabolizzato dal fegato a 4-idrossitamoxifene (4-OHT), che può legarsi e attivare il creer. Applicazione topica di tamoxifene non sarà metabolizzato in questo modo e 4-OHT deve essere utilizzato direttamente. Solo un metodo di consegna tamoxifene è necessaria per una sufficiente ricomfusione.- Tamoxifene: preparare il tamoxifene ad una concentrazione di 10 mg mL-1 disciolto in olio di mais. Per aiutare nella dissoluzione del farmaco in soluzione, aggiungere fino a 10% volume totale di 100% etanolo di grado molecolare al farmaco in forma di polvere, vortice per 3 min e quindi aggiungere il volume rimanente di olio di mais. Continuare a vortice fino a quando il materiale cristallino non è più evidente in soluzione. La soluzione di tamoxifene può essere sterilizzata passando attraverso un filtro da 0,2 μm. Procedere al passaggio 2.2.1 per il trattamento.
- 4-OHT: preparare una soluzione di stock di idrossitamoxifene fino a 3 mg mL-1 in 100% etanolo. Quindi, una soluzione di lavoro può essere applicata per quanto necessario per coprire l'area di interesse della pelle (in genere una singola applicazione).
Nota: Una soluzione di stock di idrossitamoxifene può essere disciolto in 100% etanolo per una concentrazione finale di 5 mM. Quindi, per preparare una soluzione di lavoro, 5 μL di soluzione di stock 4OH-tamoxifene può essere diluito in 15 μL di 100% etanolo. Per 4 mm2 area, da 1 a 3 μL di soluzione di lavoro può essere applicato per via topica.
-
Trattare i topi con tamoxifene sia a livello sistemico che topico
- Per il trattamento sistemico, somministrare 2 mg di tamoxifene tramite iniezione IP una volta al giorno per 3 giorni con un ago da 26 G.
Nota: Utilizzando questo modello, circa 93% ± 4% dei MCSCs quiescenti sono etichettati con tdTomato6. - Per l'attivazione regionale, eseguire un trattamento topico con 4-OHT. Coprire l'area di interesse della pelle con la soluzione di lavoro. La quantità di soluzione di lavoro può essere determinata dalle dimensioni della regione di interesse, come descritto al punto 2.1.2.
- Per il trattamento sistemico, somministrare 2 mg di tamoxifene tramite iniezione IP una volta al giorno per 3 giorni con un ago da 26 G.
- A 48 h dopo l'ultima dose di tamoxifene, procedere al passo 3 per la depilazione chimica indotta inizio tumore o al passo 4 per l'inizio del tumore indotta da UV-B
3. depilazione chimica
- Dotare una sala di trattamento del mouse contenente un sistema isoflurano con i seguenti materiali richiesti: crema per la depilazione, tamponi di cotoni, panno di carta e acqua.
- Posizionare il mouse nella camera di induzione e anestetizzare con 3,5 a 4,5% isoflurano e 1 L/min di ossigeno.
- Una volta che la frequenza respiratoria si è stabilizzata, confermare che il mouse è nel piano corretto dell'anestesia eseguendo un pizzico di punta e trasferire il mouse al tubo principale mantenendo l'anestesia con 1 a 1,5% isoflurano e 1 L/min di ossigeno. Applicare l'unguento oculare per evitare che gli occhi si asciugarsi durante l'anestesia.
- Utilizzare un batuffolo di cotone per applicare un sottile strato di crema per la depilazione nella regione rasata della pelle del topo.
- Una volta che la crema è stata applicata uniformemente, utilizzare tamponi di cotone puliti per iniziare la rimozione. Il tempo totale che la crema è a contatto con la pelle non deve superare 1 min.
- Strofinare delicatamente la pelle con un panno di carta umido e assicurarsi che qualsiasi crema residua sia stata rimossa.
Nota: Crema depilazione può causare irritazione alla pelle se non è completamente rimosso. Alcuni topi, come quelli su uno sfondo topi C57BL/6, possono essere inclini a sviluppare la dermatite12. Anche se rari, alcuni animali svilupperanno la dermatite entro 24 h dopo l'applicazione di crema per la depilazione o la rasatura meccanica. Assicuratevi di controllare i topi il giorno dopo il trattamento per cercare eventuali segni di irritazione cutanea regionale. - Scartare i pozzi dei capelli rimossi e tutti i materiali utilizzati in un bidone di Biohazard.
- Posizionare il mouse in una gabbia di topo vuota e pulita fino a quando l'anestesia è usurata.
- Restituisci i topi alle loro gabbie.
4. irraggiamento UV-B
- Dotare una sala di trattamento del topo contenente un sistema isoflurano con i seguenti materiali richiesti: sistema di luce UV-B, misuratore di luce UV-B, rivestimento protettivo per il mouse, dpi protettivi UV-B aggiuntivi per ricercatore e un timer.
- I topi devono essere irradiati alla dose di interesse UV-B (cioè 0-180 mJ/cm2). Utilizzare il misuratore di luce UV-B per determinare il periodo di tempo appropriato per irradiare i topi.
Nota: mW/cm2 x tempo = dose - Anestetizzare il topo con l'isoflurano. Mentre nella camera di induzione, utilizzare 3,5 a 4,5% isoflurano e 1 L/min di ossigeno.
- Una volta che il mouse è stabilizzato, confermare gli effetti di anestesia con un pizzico di punta e trasferire il mouse al tubo di anestesia principale situato nella camera UV. Applicare l'unguento oculare per evitare che gli occhi si asciugino durante l'anestesia. Mantenere l'anestesia con 1 a 1,5% isoflurano e 1 L/min di ossigeno.
- Coprire la pelle dorsale con materiale protettivo UV-B in modo che solo la regione desiderata sarà esposta.
Nota: In questo momento, devono essere utilizzati dpi appropriati. La lunghezza del tempo necessario per irradiare il mouse dipende dall'intensità della lampadina utilizzata, ma potrebbe essere necessario monitorare l'anestesia se il tempo richiesto supera i 30 s. - Coprire la camera UV utilizzando il coperchio resistente ai raggi UV o qualsiasi altro materiale idoneo.
- Accendere la lampada UV-B e irradiare il mouse per il tempo determinato dai ricercatori per l'obiettivo specifico.
- Spegni il sistema UV e l'isoflurano, quindi posiziona il mouse su una gabbia per topi vuota fino a quando l'anestesia non si è esaurita.
- Restituisci i topi alle loro gabbie.
5. lavorazione dei tessuti
-
Isolamento cutaneo
- Prima di iniziare, ottenere quanto segue: strumenti di necroscopia, carta da filtro e asciugamani di carta.
- Euthanize i topi secondo i protocolli approvati da IACUC e confermano la morte prima di procedere.
- Utilizzando un tagliacapelli, radersi i capelli dalla zona della pelle dorsale. Spazzolare leggermente l'area con un tessuto privo di lanugine per liberare l'area.
- Fare una piccola incisione con forbici affilate appena sopra la base della coda.
- Inserire grandi forbici smussati nell'incisione e separare i tessuti connettivi subdermici.
- Isolare accuratamente la regione di pelle di interesse tagliando con forbici affilate lungo il bordo del tessuto.
- Mettere il tessuto della pelle su un panno di carta pulito e utilizzare pinze opache per allungare la pelle in modo che aderisce all'asciugamano e viene insegnato. Questo passaggio serve a fornire un supporto aggiuntivo per il tessuto in modo che possa essere manipolato ed elaborato mantenendo la sua forma.
Nota: Fare attenzione a gestire solo le regioni esterne del tessuto cutaneo, poiché le pinze possono causare danni alla pelle che può essere visto istologicamente.
-
Fissazione dei tessuti
- Piegare un pezzo di carta filtrante a metà e etichettare appropriatamente. Posizionare la pelle insieme al supporto di tovagliolo di carta nella carta piegata immediatamente adiacente alla piega, assicurando che il campione sia liscio e non piegato o sgualcito. Sigillare la carta filtrante pinzando i lati aperti, quindi tagliare in modo che la carta rimanente possa essere utilizzata per i campioni futuri.
Nota: Questo passaggio viene eseguito in modo che la pelle mantenga la sua forma durante la fissazione. - Immergere completamente il campione di tessuto in formalina tamponata neutra al 10% per 3 a 5 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° c.
- Dopo la fissazione, rimuovere i campioni da formalina, lavare in acqua deionizzata (2x, 5 min ciascuno) e procedere a fare blocchi di tessuto. Rimuovere con cautela qualsiasi materiale residuo dal tessuto cutaneo (ad es. carta residua).
- Piegare un pezzo di carta filtrante a metà e etichettare appropriatamente. Posizionare la pelle insieme al supporto di tovagliolo di carta nella carta piegata immediatamente adiacente alla piega, assicurando che il campione sia liscio e non piegato o sgualcito. Sigillare la carta filtrante pinzando i lati aperti, quindi tagliare in modo che la carta rimanente possa essere utilizzata per i campioni futuri.
-
Creazione di blocchi di tessuto congelati (Figura 1)
- Tagliare i bordi del campione di pelle in modo che non siano frastagliati e quindi fare 3 tagli sagittali. La larghezza di queste strisce non deve essere superiore all'altezza del criomantico (5 mm). Successivamente, fare tagli trasversali per avere pezzi di pelle che non sono più lunghi della larghezza del criomantico (20 mm) e possono essere incorporati. Ripetere con la metà restante della pelle dorsale, o salvare il tessuto per altri usi (alternativamente, salvare la metà prima della fissazione).
Nota: È importante tenere i pezzi di pelle in un orientamento corretto. - Orientare il criomantico (25 x 20 x 5 mm3) in un orientamento verticale e posizionare da 4 a 5 pezzi di pelle sulla parte superiore del PTOM. Una volta che tutti i pezzi sono in posizione, utilizzare 2 paia di pinze sottili per portare il bordo lungo della pelle al fondo del criomantico. Ora la pelle dovrebbe essere in piedi nel PTOM perpendicolare alla base dello stampo. Fare attenzione a minimizzare la formazione di sacche d'aria all'interno del PTOM durante questa fase (Figura 1).
- Riempire lo stampo con OCT al secondo labbro e posizionarlo sulla superficie piana del ghiaccio secco. Utilizzare pinze per regolare eventuali pezzi di pelle che possono essere spostati durante il trasferimento come il blocco comincia a congelare. Una volta che lo strato inferiore è solidificato, la manipolazione dei tessuti sarà impossibile.
- Tagliare i vetrini da 8-10 μm per l'analisi.
- Tagliare i bordi del campione di pelle in modo che non siano frastagliati e quindi fare 3 tagli sagittali. La larghezza di queste strisce non deve essere superiore all'altezza del criomantico (5 mm). Successivamente, fare tagli trasversali per avere pezzi di pelle che non sono più lunghi della larghezza del criomantico (20 mm) e possono essere incorporati. Ripetere con la metà restante della pelle dorsale, o salvare il tessuto per altri usi (alternativamente, salvare la metà prima della fissazione).
-
Creazione di blocchi tissutali fissi in paraffina incorporati (FFPE) di formalin
- Mettere 2 pezzi di pelle fissa in una cassetta etichettata e disidratare in concentrazioni crescenti di etanolo (75% etanolo per 30 min, 85% per 30 min, 90% per 30 min, 95% per 30 min, 100% per 2x 30 min, xilene o xilene sostituto per 2x 30 min). Incubare con paraffina a 58-60 °, prima per 30 minuti, e poi durante la notte.
- Incorporare il tessuto in uno stampo di tessuto in acciaio inox 24 x 24 mm2 con paraffina liquida e solidificare a-5 ° c. L'orientamento tissutale deve essere simile a quello dei blocchi di tessuto congelati in modo che le sezioni longitudinali su più follicoli piliferi possano essere visualizzate (Figura 1).
- Una volta che la paraffina si è solidificata, rimuovere lo stampo e tagliare in sezioni 5-10 μm per l'analisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Inizio del melanoma cutaneo indotto dalla depilazione chimica
La procedura di depilazione chimica è raffigurata in Figura 2. Quando i topi sono 7 settimane dopo Natale, la loro pelle dorsale è in telogen. Durante telogen, cellule staminali follicoli piliferi e MCSCs sono noti per essere in uno stato quiescente, riposo. La pelle non dovrebbe mostrare alcuna crescita significativa dei capelli dopo la rasatura. D'altra parte, la depilazione chimica può indurre l'attivazione di cellule staminali follicoli piliferi, che a sua volta Mostra una crescita significativa dei capelli dalla regione di interesse (Figura 2). Analogamente, i MCSC inclini al tumore che esprimono mutazioni oncogeniche devono essere attivi anche per la formazione di tumori accelerati. La depilazione chimica può indurre significativamente l'attivazione di entrambe le cellule staminali follicoli piliferi e MCSCs. i MCSCs inclini al melanoma in uno stato attivo possono formare tumori e l'iniziazione al melanoma microscopico può essere osservata entro 2 settimane dopo la depilazione chimica utilizzando il linea di tracciatura allele LSL-tdTomato (Figura 3).
Inizio del melanoma cutaneo indotto dall'irraggiamento UV-B
Simile alla depilazione chimica, UV-B può indurre l'iniziazione tumorale da MCSCs a rischio di tumore quiescente (Figura 4). Mentre la pelle murina contenente MCSCs inclini al tumore in uno stato di quiescenza non mostra alcuna significativa iniziazione tumorale e mancanza di pigmentazione significativa, la pelle dorsale esposta a UV-B (due volte, 180 mJ/cm2) Mostra tumori melanocitici pigmentato neri che sono macroscopicamente evidenti (Figura 4a, B). Mentre UV-B può indurre significativamente l'iniziazione del tumore macroscopicamente evidente entro 2 settimane, l'applicazione della protezione solare può proteggere l'iniziazione di melanoma mediato da UV-B nella pelle, simile a un panno resistente ai raggi UV (Figura 4c, D).
È importante sottolineare che l'UV-B induce la traslocazione diretta di MCSCs dalla loro nicchia di cellule staminali follicolari all'epidermide interfollicolare. Inoltre, l'UV-B può indurre la formazione di melanoma cutaneo originario di MCSC in tutta l'epidermide interfollicolare, e il fenotipo microscopico può essere osservato dal marcatore tracciante di lignaggio, tdTomato (Figura 5). Poiché queste cellule tumorali sono maligne, crescono rapidamente e invasivamente (Figura 5). Analogamente alla pelle dorsale, l'iniziazione al melanoma indotta da UV-B può essere osservata in modo particolare in altre aree cutanee, come la cute dell'orecchio (Figura 6). Rispetto alla pelle di controllo ricoperta da un panno resistente ai raggi UV, la pelle dell'orecchio esposta a UV-B dimostra una maggiore pigmentazione a causa di un maggiore onere dell'iniziazione al melanoma (Figura 6).
Figura 1: isolamento del tessuto cutaneo e cRIO-incorporamento. Dopo l'eutanasia, radersi la regione di interesse della pelle dorsale del topo e incorporare la pelle nel criomantico contenente OCT. La linea tratteggiata sul mouse rappresenta la linea mediana. In genere, 3 o 4 pezzi di pelle possono essere isolati con il segmento di linea 3-4 lungo la linea mediana; uno di questi pezzi è indicato dal rettangolo 1/2/3/4. Questi pezzi di pelle devono essere incorporati nel PTOM come mostrato nella figura. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: fenotipi macroscopici dopo la depilazione chimica. (A) diagramma di depilazione chimica. (B) dopo la rasatura, il ciclo dei capelli è stato confermato in telogen. (C) la depilazione chimica è stata eseguita per rimuovere gli alberi dei capelli dai follicoli piliferi, che possono attivare sia il follicolo pilifero che le cellule staminali melanociti. (D) circa una settimana dopo, la crescita precoce dei capelli sarà facilmente percepibile. (E) quindi, la crescita significativa dei capelli può essere osservata nel tempo. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: osservazione microscopica dell'iniziazione del melanoma controllata da depilazione chimica. La depilazione chimica può indurre significativamente l'attivazione di MCSCs soggetti a tumore quiescente. Quindi, l'iniziazione del tumore microscopico dimostrata dal marcatore di tracciatura di lignaggio tdTomato può essere osservata entro 2 settimane. Questa figura dimostra il microscopico fenotipo 16 giorni post 3 giorni tamoxifene da iniezione IP seguita da depilazione chimica utilizzando diverse visualizzazioni dello stesso campo visivo. (A) tdtomato+ cellule tumorali originarie del follicolo pilifero fuse con la macchia nucleare di DAPI. B) i follicoli piliferi e l'epidermide interfollicolare sono indicati in bianco. (C) uno schema che Mostra come tdTomato+ cellule tumorali invadono nel derma dal follicolo pilifero, modificato da Moon, H. et al.6. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: fenotipo macroscopico del melanoma cutaneo indotto dall'irraggiamento UV-B. I topi sono stati trattati da tamoxifene per 3 giorni (giorno 1 a 3) seguiti da 2 esposizioni UV-B (giorno 4 e 6). A) diagramma dell'irraggiamento UV-b sulla cute dorsale contenente MCSCS mutanti. (B) fenotipo macroscopico tra il controllo e la pelle dorsale esposta ai raggi UV-b. Significativa pigmentazione nera correlata alla formazione del tumore melanocitico può essere osservata entro 2 settimane dopo la seconda irradiazione UV-B. (C) schema di applicazione della protezione solare. (D) mentre UV-b può indurre in modo significativo l'iniziazione tumorale da MCSCS mutanti, l'applicazione di protezione solare ha mostrato significativamente soppresso inizio tumore mediato da UV-b (16 giorni dopo il secondo irraggiamento UV-b). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 5: osservazione microscopica del melanoma cutaneo indotto da UV-B. I topi sono stati trattati con tamoxifene per iniezione di IP per 3 giorni (giorno 1 a 3) seguiti da 2 esposizioni UV-B (giorno 4 e 5). (A-C) L'iniziazione tumorale precoce in tutta l'epidermide interfollicolare dimostrata dalla traccia di lignaggio tdTomato può essere mostrata al giorno 17. (A) le cellule tumorali di tdtomato + sono mostrate migrando dal follicolo pilifero nell'epidermide interfollicolare. DAPI è usato come un contatore nucleare macchia. B) la colorazione DAPI viene rimossa e la linea tratteggiata indica la posizione dei follicoli piliferi e dell'epidermide interfollicolare. C) schema che indica la migrazione delle cellule di tdTomato+ dal germe dei capelli all'epidermide interfollicolare dopo l'esposizione ai raggi UV-B. Modificato da Moon et al.6. (D-F) Poi, le cellule tumorali crescono rapidamente e invadono i tessuti dermici di seguito (giorno 25). D) tdtomato+ cellule tumorali hanno continuato a proliferare e invadono nei tessuti dermici. DAPI è usato come un contatore nucleare macchia. (E) la colorazione DAPI viene rimossa e la linea punteggiata indica la posizione dei follicoli piliferi e dell'epidermide interfollicolare. (F) schema che indica tdTomato+ invasione cellulare nel derma e crescita tumorale melanocitica. Modificato da Moon et al.6. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 6: osservazione macroscopica e microscopica del melanoma indotto da UV-B nella pelle dell'orecchio. A) regime sperimentale. I topi sono stati trattati da tamoxifene per 3 giorni (giorno 1 a 3) seguiti da 3 esposizioni all'irraggiamento UV-B (giorno 4, 6 e 8). B) un aumento significativo dell'inizio del melanoma da irradiazione UV-B è stato osservato macroscopicamente e microscopico al giorno 28. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Le alterazioni genetiche di Hallmark che si trovano frequentemente nei tumori del melanoma cutaneo sono state ben descritte13. La mutazione più dominante del conducente è BRAFV600E, e un modello di topo geneticamente modificato per il melanoma BRAFV600E-mediato è stato generato dal gruppo Bosenberg14 e depositato nel Jackson Laboratory. Utilizzando questo modello di topo, il nostro recente studio ha dimostrato il requisito dell'attivazione cellulare di MCSCs inclini al tumore per l'inizio significativo del melanoma BRAFV600E-mediato nella pelle dorsale6.
La depilazione è nota per essere un metodo efficace per indurre l'attivazione della cellula staminali follicolo murino sulla pelle dorsale6,10. Murine MCSCs si trovano all'interno dei follicoli piliferi, e inoltre, lo stato cellulare dei follicolari MCSCs è sincronizzato con lo stato delle cellule staminali follicolo piliferi8. La modulazione artificiale delle cellule staminali del follicolo pilifero può alterare lo stato MCSC, quindi la depilazione può attivare direttamente sia le cellule staminali di melanociti che follicoli piliferi. Questo metodo di attivazione per MCSCs può essere applicato a MCSCs inclini al tumore per esaminare i primi passi dell'iniziazione al melanoma cutaneo in modelli di topi di melanoma geneticamente modificati. Attraverso un metodo di depilazione chimica, la formazione di melanoma nella regione di interesse nella pelle dorsale murina può essere avviata direttamente. La depilazione può essere eseguita con vari metodi come la ceretta o il pizzicore, entrambi dei quali sono tipi di rimozione dei peli meccanici in cui i pozzi dei capelli vengono estratti dal follicolo pilifero. Tuttavia, questi metodi di depilazione meccanica possono essere imprecisi rispetto ad una specifica regione di interesse. D'altra parte, un metodo di depilazione chimica utilizzando la crema per la rimozione dei peli è semplice da eseguire e consente un'applicazione precisa con l'attivazione affidabile del ciclo dei capelli, e può essere meno dura sulla pelle rispetto alla rimozione meccanica.
Tra i vari fattori di rischio, l'UV-B è il fattore di rischio più noto nel melanoma cutaneo15. L'irraggiamento UV-B è noto per indurre la migrazione diretta dei follicolari MCSCs nell'epidermide interfollicolare9. Inoltre, UV-B è un forte fattore di stress ambientale che può indurre in modo significativo l'iniziazione del melanoma da MCSCs6a rischio di tumore. Nel protocollo sperimentale sopra descritto, una piccola regione di interesse sulla pelle dorsale murina può essere esposta alla luce UV-B mentre l'uso di un panno resistente ai raggi UV protegge facilmente il resto del mouse dall'esposizione indesiderata. Questo trattamento può essere eseguito mentre il topo è in anestesia. È importante sottolineare che la migrazione di MCSCs e la formazione di melanoma originario di MCSC dopo l'esposizione ai raggi UV-b sono a carico di UV-B-dose6. Pertanto, per avere risultati di successo, è importante controllare regolarmente l'intensità della lampadina utilizzando un misuratore UV-B e regolare il tempo di esposizione e la distanza tra la pelle e le lampadine in base alle esigenze. Come è generalmente noto, la pelle può bruciare in risposta ad una dose elevata di luce UV-B, ma l'esposizione debole di UV-B è anche dannosa per l'esperimento in quanto sarà insufficiente per indurre il melanoma originario di MCSC.
Il protocollo qui descritto si concentra principalmente sul fattore di rischio ambientale, UV-B, nella pelle dorsale. Tuttavia, il protocollo sperimentale di cui sopra può essere applicato a diversi obiettivi. Per esempio, il protocollo può essere modificato con lampadine di spettri diversi per determinare l'effetto di fonti di luce alternative o lunghezze d'onda di UV, come UV-A. Questo protocollo ha mirato principalmente alla pelle dorsale in quanto è accessibile e lo stato di MCSCs è ben definito. Tuttavia, può anche essere modificato per indirizzare l'esposizione alla luce UV ad appendici come l'orecchio, la coda o la pelle di Palma, inclusi i piedini. Ad esempio, nella Figura 6, è possibile esaminare la possibile differenza nella formazione del tumore melanocitico precoce nei siti di tessuti alternativi. Tuttavia, a differenza della pelle dorsale, lo stato di MCSCs in questi siti è meno ben definito; Pertanto, deve essere presa in considerazione la potenziale attivazione spontanea di MCSCs che porta a occorrenze casuali della formazione di melanoma. Pertanto, rispetto al protocollo nella pelle dorsale, approcci alternativi richiederanno un aumento del numero di esperimenti per ottenere risultati sperimentali accurati.
Inoltre, mentre il protocollo attuale illustra principalmente l'iniziazione al melanoma mediata da BRAFV600E, il nostro studio precedente ha anche riportato una formazione di melanoma precoce simile con una combinazione di RAS/PTEN oncogena, utilizzando il LSL-KrasG12D genetica allele6. Tuttavia, altre mutazioni del conducente, come i geni NRAS mutanti, possono anche essere prese in considerazione con il sistema sperimentale descritto qui per comprendere l'iniziazione precoce del melanoma guidata da altre combinazioni oncogeniche.
Nel loro insieme, descritto qui è un sistema di modello in vivo che consente l'esame dell'inizio del melanoma cutaneo precoce in topi geneticamente modificati. Questi modelli murini forniscono i metodi per il controllo temporale e spaziale dell'iniziazione del melanoma da MCSCs mutanti nella pelle. Questi protocolli forniscono un nuovo paradigma per studiare i meccanismi di inizio del melanoma precoce da MCSCs inclini al tumore, nonché una piattaforma per determinare i fattori di stress fisiologici e ambientali che possono contribuire all'iniziazione del melanoma. Questo livello di controllo spaziotemporale può anche fornire uno strumento per l'induzione di melanoma più preciso per testare l'efficacia del farmaco nel prevenire la formazione di melanoma, così come la crescita tumorale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dall'ufficio dell'assistente segretario della difesa per gli affari sanitari, attraverso il programma di ricerca sul cancro peer reviewed sotto il premio W81XWH-16-1-0272. Opinioni, interpretazioni, conclusioni e raccomandazioni sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dal dipartimento della difesa. Questo lavoro è stato sostenuto anche da una sovvenzione di seme dal programma di cellule staminali Cornell a A.C. White. H. Moon è stato supportato dal Cornell Center for vertebrate Genomics Scholar Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C.
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M.
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
