Summary
Følgende prosedyre beskriver en metode for romlig og timelig kontroll av melanocytic tumor initiering i murine rygg hud ved hjelp av en genetisk konstruert musemodell. Denne protokollen beskriver makroskopisk og mikroskopisk hud melanom innvielse.
Abstract
Hud melanom er godt kjent som den mest aggressive hudkreft. Selv om risikofaktorene og de store genetiske endringene fortsatt dokumenteres med økende dybde, har forekomst frekvensen av hud melanom vist en rask og kontinuerlig økning de siste ti årene. For å finne effektive forebyggende metoder, er det viktig å forstå de tidlige trinnene av melanom initiering i huden. Tidligere data har vist at follikulær melanocyte stamceller (MCSCer) i voksen hud vev kan fungere som melanom celler opprinnelse når uttrykke kreftfremkallende mutasjoner og genetiske endringer. Tumorigenesis som oppstår fra melanom utsatt MCSCer kan bli indusert når MCSCer overgang fra en Quiescent til aktiv tilstand. Denne overgangen i melanom utsatt MCSCer kan fremmes av modulering av enten hårsekken stamceller ' aktivitet stat eller gjennom ytre miljømessige faktorer som ultrafiolett-B (UV-B). Disse faktorene kan kunstig manipuleres i laboratoriet av kjemiske hårfjerning, som forårsaker overgangen av hårsekken stamceller og MCSCer fra en Quiescent til aktiv tilstand, og ved UV-B eksponering ved hjelp av et stasjonære lys. Disse metodene gir vellykket romlig og timelig kontroll av hudens melanom initiering i murine rygg hud. Derfor, disse in vivo modellsystemer vil være verdifullt å definere de tidlige trinnene av hud melanom initiering og kan brukes til å teste potensielle metoder for tumor forebygging.
Introduction
Melanom, den ondartede form av melanocytic svulster, er den mest aggressive kreft i huden med hud melanom ansvarlig for flertallet av hudkreft dødsfall1. I USA er melanom ofte diagnostisert; Det anslås å være den 5th til 6th vanligste krefttype blant de estimerte nye krefttilfeller i 20182. Videre, mens den generelle kreft forekomsten har vist trenden med gradvis reduksjon de siste ti årene, viser forekomsten av forekomst av hud melanom i løpet av de siste ti årene en kontinuerlig og rask økning i begge kjønn2.
For å bekjempe hud melanom mer effektivt er det viktig å forstå de tidlige hendelsene i melanom utvikling fra sine Opprinnelses celler for å bedre identifisere klinisk effektive forebyggende metoder. Det er nå kjent at voksne stamceller kan betydelig bidra til tumor dannelse som mobilnettet opprinnelsen til kreft i mange forskjellige typer organer, inkludert hud vev3,4,5. Tilsvarende voksen melanocyte stamceller (MCSCer) i murine rygg hud kan fungere som melanom celler opprinnelse på avvikende aktivering av RAS/RAF og akt trasé6. Men disse kreftfremkallende mutasjoner alene er ikke i stand til å effektivt indusere tumor dannelse fra Quiescent MCSCer. melanocytic svulster etter hvert utvikle seg når MCSCer blir aktive under naturlig hår sykling. Men i denne protokollen, vil vi beskrive metoder for å kunstig indusere mobilnettet aktivering av tumor utsatt MCSCer, og dermed tilrettelegge presis kontroll av melanom Initiation6,7.
Gjennom metodene som er beskrevet her, romlig og timelig kontroll av hud melanom initiering fra tumor utsatt MCSCer uttrykker kreftfremkallende BRAFV600E sammen med tap av Pten uttrykk kan med hell utføres, som vi tidligere har rapportert6. Denne metoden inkorporerer tidligere funn som demonstrerer hårsekken stilk cellen aktivisering gjennom hårfjerning samt hvordan eksponering av murine hud til UV-B kan forenkle aktivering av MCSCer bosatt til hårsekken og translokasjon av denne cellulære pasientpopulasjonen til interfollicular epidermis6,8,9,10. Disse in vivo modellsystemer kan gi verdifull informasjon om hvordan fysiologiske og miljømessige endringer kan endre den cellulære statusen til melanom-utsatt MCSCer, som igjen kan indusere betydelig initiering av melanom i huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer er utført i samsvar med Cornell University institusjonelle Animal Care og use Committee (IACUC).
1. forberedelse
-
Samle halen klipp fra 12 dagers postnatal mus og fordøye i 400 μL av 0,05 N NaOH ved 95 ° c for 1 h. Vortex og tilsett 32 μL av 1 M Tris-HCl, pH 7. Genotype mus i henhold til PCR protokoller gitt gjennom Jackson Laboratory og identifisere mus med genotype av interesse6.
- Tyr-CreER – hemizygous (+/CreER)
- LSL-BRAFV600E – heterozygot (+/LSL-V600E)
- Pten- homozygote flox (flox/flox)
- LSL-tdTomato – hemizygous (+/LSL-tdTomato)
Merk: Primer sekvenser er gitt i tabell over materialer. - Bruk en hårklipper (elektrisk trimmer) for å barbere rygg huden 2 til 3 dager før alle eksperimentene som er beskrevet nedenfor, og når mus er ca. 7 ukers alder. Pass på å ikke skade den tynne musen huden ved hjelp av elektrisk trimmer som enhver skade kan lokke fram et sår helbredende respons som vil aktivere hårsekken stamceller, inkludert MCSCer.
- Bestem om hår syklusen er i telogen og om huden blir såret i løpet av ventetiden. Hvis huden viser noen tegn på skade, bør musen ikke brukes til disse prosedyrene.
Merk: Selv om hår syklusen kan være litt forskjellig mellom genetisk bakgrunn, i denne alderen håret syklus i rygg hud er vanligvis i telogen tilstand11. Tyr-CreER transgene vil målrette MCSCer i telogen hud, og de påfølgende genetiske endringene vil bli permanent uttrykt i alle linjene av MCSC, inkludert differensiert melanocytter og melanocytic svulster.
2. Tamoxifen behandling for grobunn-LOX genetiske rekombinasjon
-
Utarbeidelse av Tamoxifen for intraperitoneal injeksjon (IP) eller aktuell administrasjon for systemisk eller lokalisert genetisk rekombinasjon
Merk: For Tamoxifen å indusere rekombinasjon, må det først være metaboliseres i leveren til 4-hydroxytamoxifen (4-OHT), som kan binde til og aktivere CreER. Aktuell anvendelse av Tamoxifen vil ikke bli metaboliseres på denne måten, og 4-OHT må direkte brukes. Bare én metode for Tamoxifen levering kreves for tilstrekkelig rekombinasjon.- Tamoxifen: Forbered Tamoxifen ved en konsentrasjon på 10 mg mL-1 oppløst i mais olje. For å hjelpe i oppløsningen av stoffet i løsningen, legge opp til 10% total volum på 100% molekyl klasse etanol til stoffet i pulverform, Vortex på 3 min og deretter legge resterende volum av mais olje. Fortsett å Vortex til krystallinsk materialet ikke lenger er synlig i løsningen. Tamoxifen løsning kan steriliseres ved å passere gjennom et 0,2 μm filter. Fortsett til trinn 2.2.1 for behandling.
- 4-OHT: Forbered en lagerløsning av hydroxytamoxifen opptil 3 mg mL-1 i 100% etanol. Deretter kan en fungerende løsning brukes så mye som nødvendig for å dekke hud området av interesse (vanligvis et enkelt program).
Merk: En lagerløsning av hydroxytamoxifen kan oppløses i 100% etanol for en endelig konsentrasjon på 5 mM. Deretter, for å forberede en fungerende løsning, 5 μL av 4OH-Tamoxifen lagerløsning kan fortynnes i 15 μL av 100% etanol. For 4 mm2 areal, 1 til 3 μL arbeids løsning kan brukes lokalt.
-
Behandling av mus med Tamoxifen enten systemisk eller lokalt
- For systemisk behandling, administrere 2 mg Tamoxifen via IP-injeksjon én gang daglig i 3 dager ved hjelp av en 26 G nål.
Merk: Ved hjelp av denne modellen, ca 93% ± 4% av Quiescent MCSCer er merket med tdTomato6. - For regional aktivering, Utfør en aktuell behandling med 4-OHT. Dekk til hud området av interesse med arbeids løsningen. Mengden av arbeids løsning kan bestemmes av størrelsen på regionen av interesse som beskrevet i trinn 2.1.2.
- For systemisk behandling, administrere 2 mg Tamoxifen via IP-injeksjon én gang daglig i 3 dager ved hjelp av en 26 G nål.
- Ved 48 h etter siste dose av Tamoxifen, Fortsett til trinn 3 for kjemisk hårfjerning indusert tumor initiering eller til trinn 4 for UV-B indusert tumor initiering
3. kjemisk hårfjerning
- Utstyre en mus behandlingsrom som inneholder et isoflurane system med følgende nødvendige materialer: hårfjerning krem, bomull pinner, papir klut og vann.
- Plasser musen i induksjon kammeret og bedøve med 3,5 til 4,5% isoflurane og 1 L/min oksygen.
- Når respirasjonsfrekvensen har stabilisert, bekrefter at musen er i riktig planet av anestesi ved å utføre en tå knipe og overføre musen til hoved røret opprettholde anestesi med 1 til 1,5% isoflurane og 1 L/min oksygen. Påfør øyen salve for å holde øynene fra tørking mens under anestesi.
- Bruk en bomullsdott til å bruke et tynt lag av hårfjerning krem til den barberte regionen av musen huden.
- Når kremen er jevnt påført, bruk ren bomullspinner for å begynne fjerningen. Den totale tiden som kremen er i kontakt med huden bør ikke overstige 1 min.
- Tørk forsiktig av huden med en fuktig papir klut, og sørg for at eventuelle rester av kremen er fjernet.
Merk: Hårfjerning krem kan forårsake irritasjon i huden hvis den ikke er helt fjernet. Noen mus, slik som de på en C57BL/6 bakgrunn, kan være utsatt for å utvikle dermatitt12. Selv om sjeldne, vil noen dyr utvikle dermatitt innen 24 h etter hårfjerning krem søknad eller mekaniske hårfjerning. Sørg for å sjekke musene dagen etter behandlingen for å se etter tegn på Regional hudirritasjon. - Kast fjernet hår sjakter og eventuelle materialer som brukes i en Biohazard bin.
- Plasser musen i en tom, ren muse bur til anestesi har slitt av.
- Returner musene til burene.
4. UV-B-bestråling
- Utstyre en mus behandlingsrom som inneholder et isoflurane system med følgende nødvendige materialer: UV-B lyssystem, UV-B lys meter, beskyttende dekker for musen, ekstra UV-B beskyttende PPE for forsker, og en tidtaker.
- Mus bør bestrålt på UV-B-dosen av interesse (dvs. 0-180 mJ/cm2). Bruk UV-B Lysmåleren til å bestemme riktig tidsrom for irradiate av musene.
Merk: MW/cm2 x tid = dose - Bedøve musa med isoflurane. Mens i induksjon kammeret, bruk 3,5 til 4,5% isoflurane og 1 L/min oksygen.
- Når musen er stabilisert, bekrefter anestesi effekter med en tå knipe og overføre musen til hoved anestesi røret ligger i UV-kammer. Påfør øyen salve for å hindre at øynene tørker mens under anestesi. Oppretthold anestesi med 1 til 1,5% isoflurane og 1 L/min oksygen.
- Dekk rygg huden med UV-B beskyttende materiale slik at bare den ønskede regionen vil bli eksponert.
Merk: På dette tidspunktet bør passende PPE benyttes. Hvor lang tid som trengs for å irradiate musen er avhengig av intensiteten av lyspæren som brukes, men anestesi må kanskje overvåkes hvis den nødvendige tiden overstiger 30 s. - Dekk til UV-kammeret ved hjelp av UV-bestandig lokk eller andre egnede materialer.
- Slå på UV-B-lampen og irradiate musen for tiden bestemt av forskere for det spesifikke målet.
- Slå av UV-systemet og isoflurane, og plasser deretter musen til en tom muse bur til anestesi har slitt av.
- Returner musene til burene.
5. tissue bearbeiding
-
Hud isolasjon
- Få følgende før start: obduksjon instrumenter, filter papir og papirhåndklær.
- Euthanize musene i henhold til IACUC godkjente protokoller, og Bekreft døden før du fortsetter.
- Ved hjelp av en hårklipper, barbere hår fra rygg hud området. Lett børste området med et lo fritt vev for å fjerne området.
- Lag et lite snitt med skarp saks like over undersiden av halen.
- Sett store sløv saks inn i snittet og skille subdermal bindevev.
- Nøye isolere huden regionen av interesse ved å kutte med skarp saks langs kanten av vevet.
- Plasser huden vevet på en ren papir håndkle og bruke kjedelig tang å strekke huden slik at den overholder håndkleet og blir undervist. Dette trinnet tjener til å gi ekstra støtte for vevet slik at det kan manipuleres og behandles og samtidig opprettholde sin form.
Merk: Vær forsiktig med å bare håndtere de utvendige delene av hud vevet, som pinsett kan forårsake skade på huden som kan sees histologisk.
-
Fiksering av vev
- Brett et stykke filter papir i to og etiketten hensiktsmessig. Plasser huden sammen med papir håndkle backing inn i brettet papiret umiddelbart tilstøtende til det press, slik at prøven er glatt og ikke foldet eller krøllete. Forsegle filter papiret ved å stifte de åpne sidene, og deretter trimme slik at det resterende papiret kan brukes for fremtidige prøver.
Merk: Dette trinnet er utført slik at huden beholder sin form under fiksering. - Senk vevsprøven helt inn i 10% nøytral bufret formalin i 3 til 5 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° c.
- Etter fiksering, Fjern prøvene fra formalin, vask i deionisert vann (2x, 5 min hver) og Fortsett å gjøre vev blokker. Fjern forsiktig eventuelle rester av materialet fra hud vevet (dvs. rest papir).
- Brett et stykke filter papir i to og etiketten hensiktsmessig. Plasser huden sammen med papir håndkle backing inn i brettet papiret umiddelbart tilstøtende til det press, slik at prøven er glatt og ikke foldet eller krøllete. Forsegle filter papiret ved å stifte de åpne sidene, og deretter trimme slik at det resterende papiret kan brukes for fremtidige prøver.
-
Gjør frosne vev blokker (figur 1)
- Trim kantene av huden prøven slik at de ikke er hakkete og deretter lage 3 sagittal kutt. Bredden på disse stripene bør ikke være mer enn høyden på cryomold (5 mm). Deretter gjør tverrgående kutt å ha biter av huden som ikke er lengre enn bredden av cryomold (20 mm) og kan bygges inn. Gjenta med den resterende halvdelen av rygg hud, eller lagre vevet til annen bruk (vekselvis, lagre halvparten før fiksering).
Merk: Det er viktig å holde huden brikker i riktig retning. - Juster cryomold (25 x 20 x 5 mm3) i stående retning og plasser 4 til 5 stykker av huden på toppen av Tilpasningsverktøy for Oct. Når alle brikkene er på plass, bruk 2 par fine tang for å bringe den lange kanten av huden til bunnen av cryomold. Skin skal nå stå opp i OCT vinkelrett på undersiden av mold. Pass på å minimere dannelse av luftlommer i OCT i løpet av dette trinnet (figur 1).
- Fyll mold med OCT til den andre leppe, og plasser på den flate overflaten av tørr is. Bruk tang for å justere eventuelle hud brikker som kan ha forskjøvet under overføringen som blokken begynner å fryse. Når det nederste laget er befestet, manipulasjon av vev vil være umulig.
- Cut 8-10 μm lysbilder for analyse.
- Trim kantene av huden prøven slik at de ikke er hakkete og deretter lage 3 sagittal kutt. Bredden på disse stripene bør ikke være mer enn høyden på cryomold (5 mm). Deretter gjør tverrgående kutt å ha biter av huden som ikke er lengre enn bredden av cryomold (20 mm) og kan bygges inn. Gjenta med den resterende halvdelen av rygg hud, eller lagre vevet til annen bruk (vekselvis, lagre halvparten før fiksering).
-
Making formalin fast parafin embedded (FFPE) vev blokker
- Plasser 2 stykker av fast hud i en merket kassett og tørke i økende konsentrasjoner av etanol (75% etanol for 30 min, 85% i 30 min, 90% i 30 min, 95% i 30 min, 100% for 2x 30 min, xylen eller xylen erstatning for 2x 30 min). Ruge med parafin ved 58-60 °, først i 30 min, og deretter over natten.
- Embed vevet i en 24 x 24 mm2 rustfritt stål vev mold med flytende parafin og stivne ved-5 ° c. Vevet orientering bør være lik som frosne vev blokker slik at langsgående seksjoner over flere hårsekker kan bli visualisere (figur 1).
- Når parafin har befestet, fjerne mold og skåret i 5-10 μm seksjoner for analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hårfjerning av hud melanom forårsaket av kjemiske
Prosedyren for kjemisk hårfjerning er avbildet i figur 2. Når musene er 7-ukers postnatal, er deres rygg hud i telogen. Under telogen, hårsekken stamceller og MCSCer er kjent for å være i en Quiescent, hviletilstand. Huden skal ikke vise noen signifikant hårvekst etter barbering. På den annen side, kjemisk hårfjerning kan indusere hårsekken stilk cellen aktivisering, som igjen viser betydelig hårvekst fra regionen av interesse (figur 2). Tilsvarende tumor utsatt MCSCer uttrykker kreftfremkallende mutasjoner må også være aktiv for akselerert tumor dannelse. Kjemisk hårfjerning kan signifikant indusere aktiveringen av både stilk cellen og MCSCer. melanom-utsatt MCSCer i en aktiv tilstand kan danne svulster, og mikroskopisk melanom initiering kan observeres innen 2 uker etter kjemisk hårfjerning ved hjelp av avstamning tracing allel LSL-tdTomato (Figur 3).
Oppstart av hud melanom forårsaket av UV-B-bestråling
Analog med kjemikalie hårfjerning, UV-B kanne indusere svulst innvielsen fra Quiescent svulst-liggende MCSCer (skikkelsen 4). Mens murine huden inneholder tumor utsatt MCSCer i en Quiescent tilstand viser ingen signifikant tumor initiering og mangel på betydelig pigmentering, rygg huden utsatt for UV-B (to ganger, 180 mJ/cm2) viser svart pigmentert tidlig melanocytic svulster som er makroskopisk åpenbare (figur 4a, B). Mens UV-B kan signifikant indusere makroskopisk tydelig tumor initiering innen 2 uker, anvendelse av solkrem kan beskytte UV-B-mediert melanom initiering i huden, ligner på en UV-bestandig klut (figur 4c, D).
Viktigere UV-B induserer direkte translokasjon av MCSCer fra deres follikulær stilk cellen nisje til interfollicular epidermis. UV-B kan dessuten fremkalle MCSC-opprinnelse hud melanom formasjon gjennom hele interfollicular epidermis, og mikroskopisk fenotype kan observeres av avstamning tracing markør, tdTomato (figur 5). Ettersom disse tumorceller er ondartet, de vokser raskt og invasivt (figur 5). Ligner på rygg hud, UV-B-indusert melanom initiering kan være spesielt observert i andre hudområder, for eksempel øret huden (figur 6). Sammenlignet med kontroll huden dekket av UV-bestandig klut, viser øre huden eksponert for UV-B høyere pigmentering på grunn av en høyere byrde av melanom initiering (figur 6).
Figur 1: hud vevs isolasjon og fryse-innebygging. Etter døds aktiv, barbere musen rygg hudområde av interesse og bygge inn huden i cryomold som inneholder OCT. Den stiplede linjen på musen representerer midtlinjen. Vanligvis kan 3 eller 4 stykker av huden isoleres med linjesegment 3-4 langs midtlinjen; en slik brikke er indikert med rektangel 1/2/3/4. Disse hud brikkene bør bygges inn i OCT som vist i figuren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: makroskopisk fenotyper etter kjemisk hårfjerning. (A) diagram av kjemisk hårfjerning. (B) etter barbering ble hår syklusen bekreftet å være i telogen. (C) kjemisk hårfjerning ble utført for å fjerne hår sjakter fra hårsekkene, som kan aktivere både hårsekken og melanocyte stamceller. (D) rundt en uke senere, tidlig hårvekst vil være lett merkbar. (E) da kan betydelig hårvekst observeres over tid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: mikroskopisk observasjon av melanom initiering kontrollert av kjemiske hårfjerning. Kjemisk hårfjerning kan signifikant indusere aktiveringen av Quiescent svulst utsatt MCSCer. Deretter, mikroskopisk tumor initiering demonstrert av avstamning tracing markør tdTomato kan observeres innen 2 uker. Denne illustrasjonen viser mikroskopisk fenotype 16 dager etter 3 dager Tamoxifen av IP-injeksjon etterfulgt av kjemiske hårfjerning bruke ulike visualiseringer av samme synsfelt. (A) tdTomato+ tumorceller som stammer fra hårsekken fusjonert med Dapi kjernefysiske mot flekken. (B) hårsekkene og interfollicular epidermis er skissert i hvitt. (C) en skjematisk viser hvordan tdTomato+ tumorceller invadere i dermis fra hårsekken, modifisert fra månen, H. et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: makroskopisk fenotype av hud melanom indusert av UV-B-bestråling. Mus ble behandlet av Tamoxifen i 3 dager (dag 1 til 3) etterfulgt av 2 UV-B-eksponeringer (dag 4 og 6). (A) diagram av UV-b-bestråling på rygg huden som inneholder mutant MCSCer. (B) makroskopisk FENOTYPE mellom kontroll og UV-b eksponert rygg hud. Signifikant svart pigmentering relatert til melanocytic tumor dannelse kan observeres innen 2 uker etter den andre UV-B-bestråling. (C) diagram av solkrem søknad. (D) mens UV-b kan signifikant indusere tumor initiering fra mutant MCSCer, anvendelse av solkrem viste SIGNIFIKANT undertrykt UV-b-mediert tumor initiering (16 dager etter den andre UV-b-bestråling). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: mikroskopisk observasjon av UV-B-indusert hud melanom. Mus ble behandlet med Tamoxifen av IP-injeksjon i 3 dager (dag 1 til 3) etterfulgt av 2 UV-B-eksponeringer (dag 4 og 5). (A-C) Tidlig tumor initiering gjennom hele interfollicular epidermis demonstrert av avstamning tracing tdTomato kan vises på dag 17. (A) tdTomato + tumorceller er vist migrerer fra hårsekken inn i interfollicular epidermis. Dapi brukes som en kjernefysisk skranke flekken. (B) Dapi farging er fjernet og stiplet linje indikerer plassering av hårsekkene og interfollicular epidermis. (C) skjematisk indikerer tdTomato+ celle migrering fra håret bakterie til interfollicular epidermis etter UV-B eksponering. Modifisert fra månen et al.6. (D-F) Deretter vokser tumorceller raskt og invadere Dermal vev nedenfor (dag 25). (D) tdTomato+ tumorceller har fortsatt å spre seg og invadere i Dermal vev. Dapi brukes som en kjernefysisk skranke flekken. (E) Dapi farging er fjernet og stiplet linje indikerer plasseringen av hårsekkene og interfollicular epidermis. (F) skjematisk indikerer tdTomato+ celle invasjon i dermis og melanocytic tumor vekst. Modifisert fra månen et al.6. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: makroskopisk og mikroskopisk observasjon av UV-B-indusert melanom i øre huden. (A) eksperimentell ordning. Mus ble behandlet av Tamoxifen i 3 dager (dag 1 til 3) etterfulgt av 3 eksponeringer til UV-B-bestråling (dag 4, 6 og 8). (B) signifikant økt melanom INITIERING av UV-B-bestråling ble observert makroskopisk så vel som mikroskopisk på dag 28. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hallmark genetiske forandringer ofte funnet i hud melanom svulster er godt beskrevet13. Den mest dominerende føreren mutasjon er BRAFV600E, og en genetisk konstruert musemodell for BRAFV600E-mediert melanom ble generert av Bosenberg gruppe14 og avsatt i Jackson Laboratory. Ved hjelp av denne muse modellen, viste vår siste studie kravet om mobilnettet aktivering av tumor utsatt MCSCer for betydelig initiering av BRAFV600E-mediert melanom i rygg huden6.
Hårfjerning er kjent for å være en effektiv metode for å indusere en murine for Stamcelle hårsekken på rygg huden6,10. Murine MCSCer er plassert i hårsekkene, og dessuten er den cellulære status for follikulær MCSCer synkronisert med tilstanden til hårsekken stamceller8. Kunstig modulering av hårsekken stamceller kan endre MCSC status, og dermed hårfjerning kan direkte aktivere både melanocyte og hårsekken stamceller. Denne aktiveringsmetoden for MCSCer kan anvendes for tumor utsatte MCSCer å undersøke tidlige trinn av hud melanom initiering i genetisk konstruert melanom musemodeller. Gjennom en kjemisk hårfjerning metode, kan melanom dannelse i regionen av interesse i murine rygg hud være direkte igangsatt. Hårfjerning kan utføres av ulike metoder som voksing eller plukker, som begge er typer mekanisk hårfjerning der hår sjakter er Hentet fra hårsekken. Imidlertid kan disse mekaniske hårfjerning metodene være unøyaktige med hensyn til en bestemt region av interesse. På den annen side, en kjemisk hårfjerning metode ved hjelp av hårfjerning krem er enkel å utføre og gir mulighet for presis påføring med pålitelig aktivering av hår syklusen, og kan være mindre harde på huden enn mekanisk fjerning.
Blant ulike risikofaktorer er UV-B den mest kjente risikofaktoren i hud melanom15. UV-B-bestråling er kjent for å indusere direkte migrering av follikulær MCSCer inn i interfollicular epidermis9. Videre er UV-B en sterk miljømessige stressor som kan signifikant indusere melanom initiering fra tumor utsatt MCSCer6. I den eksperimentelle protokollen som er beskrevet ovenfor, kan en liten region av interesse på murine rygg hud utsettes for UV-B-lys mens bruken av en UV-bestandig klut lett beskytter resten av musen mot uønsket eksponering. Denne behandlingen kan utføres mens musen er under anestesi. Viktigere, migrering av MCSCer og dannelse av MCSC-stammer melanom etter UV-B-eksponering er UV-B-dose avhengige6. Derfor, for å få vellykkede resultater, er det viktig å regelmessig sjekke intensiteten av lyspæren ved hjelp av en UV-B meter og justere eksponeringstid og avstand mellom hud og lyspærer etter behov. Som er allment kjent, kan huden brenne som svar på en høy dose av UV-B-lys, men svak UV-B-eksponering er også skadelig for eksperimentet som det vil være utilstrekkelig for å indusere MCSC-stammer melanom.
Protokollen som beskrives her, fokuserer primært på miljørisiko faktoren UV-B i rygg huden. Men den eksperimentelle protokollen ovenfor kan brukes på ulike mål. For eksempel kan protokollen endres med lyspærer av ulik spectrums å bestemme effekten av alternative lyskilder eller bølgelengder av UV, som UV-A. Denne protokollen rettet primært rygg huden som den er tilgjengelig og status for MCSCer er godt definert. Imidlertid, den kanne likeledes være forandret å mål UV lyset avsøring å vedheng som det øre, hale eller Palme hud, inkluderer fot pads. Som et eksempel, i figur 6, er det mulig å undersøke mulige forskjeller i tidlig melanocytic tumor formasjon på alternative vev steder. Men i motsetning til rygg hud, status MCSCer på disse områdene er mindre veldefinert; Herav, det muligheter spontan aktivisering av MCSCer leder å tilfeldig forekomster av melanom formasjon burde være betraktet som. Derfor, sammenlignet med protokollen i rygg huden, vil alternative tilnærminger kreve et økt antall eksperimenter for å oppnå nøyaktige eksperimentelle resultater.
Videre, mens dagens protokoll primært demonstrerer BRAFV600E-mediert melanom innvielse, vår tidligere studie rapporterte også lignende tidlig melanom formasjon med en kreftfremkallende RAS/Pten kombinasjon, ved hjelp av LSL-KrasG12D genetisk allel6. Men andre driver mutasjoner som mutant NRAs gener kan også vurderes med det eksperimentelle systemet som er beskrevet her for å forstå tidlig melanom innvielse drevet av andre kreftfremkallende kombinasjoner.
Til sammen beskrevet her er et in vivo-modell system som gjør det mulig for undersøkelse av tidlig hud melanom initiering i genetisk konstruerte mus. Disse murine modellene gir metoder for timelig og romlig kontroll av melanom initiering fra mutant MCSCer i huden. Disse protokollene gir en roman paradigme å studere mekanismer for tidlig melanom initiering fra tumor utsatt MCSCer samt en plattform for å bestemme fysiologiske og miljømessige stressfaktorer som kan bidra til melanom innvielse. Dette nivået av spatiotemporal kontroll kan også gi et verktøy for mer presis melanom induksjon å teste narkotika effekt i å forebygge melanom formasjon, samt tumor vekst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Office of Assistant Secretary of Defense for Health Affairs, gjennom fagfellevurderte Cancer Research program under prisen W81XWH-16-1-0272. Meninger, tolkninger, konklusjoner og anbefalinger er de av forfatterne og er ikke nødvendigvis godkjent av Department of Defense. Dette arbeidet ble også støttet av et frø stipend fra Cornell Stem Cell program til AC White. H. Moon ble støttet av Cornell Center for virveldyr Genomics Scholar program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C.
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M.
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
