Summary
Das folgende Verfahren beschreibt eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der melanozytischen Tumorinitiation in der Murin-Sdorsal-Haut mit Hilfe eines gentechnisch veränderten Mausmodells. Dieses Protokoll beschreibt sowohl die makroskopische als auch die mikroskopische kutane Melanom-Annenentzündung.
Abstract
Das kutane Melanom gilt als der aggressivste Hautkrebs. Obwohl die Risikofaktoren und großen genetischen Veränderungen weiterhin mit zunehmender Tiefe dokumentiert werden, hat sich die Inzidenzrate des kutanen Melanoms in den letzten Jahrzehnten rasant und kontinuierlich erhöht. Um wirksame Präventionsmethoden zu finden, ist es wichtig, die frühen Schritte der Melanominitiation in der Haut zu verstehen. Frühere Daten haben gezeigt, dass follikuläre Melanozyten-Stammzellen (MCSCs) im erwachsenen Hautgewebe als Melanomzellen des Ursprungs wirken können, wenn sie onkogene Mutationen und genetische Veränderungen ausdrücken. Die Tumorigenese, die aus melanoma-anfälligen MCSCs entsteht, kann beim Übergang von MCSCs von einem ruhigen in einen aktiven Zustand induziert werden. Dieser Übergang in melanoma-anfälligen MCSCs kann durch die Modulation des Aktivitätszustandes von Haarfollikelstammzellen oder durch extrinsische Umweltfaktoren wie Ultraviolett-B-Werte (UV-B) gefördert werden. Diese Faktoren können im Labor durch chemische Enthaarung künstlich manipuliert werden, was den Übergang von Haarfollikelstammzellen und MCSCs von einem ruhigen in einen aktiven Zustand und durch UV-B-Exposition mit einem Benchtop-Licht bewirkt. Diese Methoden ermöglichen eine erfolgreiche räumliche und zeitliche Kontrolle der Hautmelanominitiation in der Murin-Srufenhaut. Daher werden diese in vivo-Modellsystemen wertvoll sein, um die frühen Schritte der Hautmelanom-Initiation zu definieren und könnten verwendet werden, um mögliche Methoden zur Tumorprävention zu testen.
Introduction
Das Melanom, die bösartige Form von melanozytischen Tumoren, ist die aggressivste Krebserkrankung in der Haut, bei dem das kälteste Melanom für dieMehrzahl der Hautkrebssterben verantwortlich ist. In den Vereinigten Staaten wird Melanom häufig diagnostiziert; Es wird prognostiziert, dass es die 5. bis 6. häufigste Krebsart unter den geschätzten neuen Krebsfällen 20182 seinwird. Darüber hinaus zeigen die Inzidenz der Hautveränderungen in den letzten Jahrzehnten zwar den Trend zur allmählichen Reduktion, doch die inkutanen Melanominzizessraten in den letzten Jahrzehnten zeigen einenkontinuierlichen und raschen Anstieg beider Geschlechter.
Um das kahreale Melanom effizienter zu bekämpfen, ist es wichtig, die frühen Ereignisse der Melanomentwicklung aus ihren Ursprungszellen klar zu verstehen, um klinisch wirksame Präventionsmethoden besser zu identifizieren. Es ist inzwischen bekannt, dass adulte Stammzellen wesentlich zur Tumorbildung beitragen können, da die zelluläre Herkunft von Krebserkrankungen in vielen verschiedenen Arten von Organen, einschließlich Hautgewebe3,4,5. In ähnlicher Weise können adulte Melanozyten-Stammzellen (MCSCs) in der Murin-Sruckhaut bei aberwitziger Aktivierung der Ras/Raf und Fort-Wege 6als Melanomzellen des Ursprungs wirken. Diese onkogenen Mutationen allein sind jedoch nicht in der Lage, die Tumorbildung aus ruhigen MCSCs effizient zu induzieren. Melanozytische Tumoren entwickeln sich schließlich, wenn MCSCs beim natürlichen Haarfahren aktiv werden. In diesem Protokoll werden wir jedoch Methoden beschreiben, um die zelluläre Aktivierung von tumoranfälligen MCSCs künstlich zu induzieren und so eine genaue Kontrolle der Melanominitiation6,7zuermöglichen.
Durch die hier beschriebenen Methoden kann die räumliche und zeitliche Kontrolle der Hautmelanom-Initiation von tumoranfälligen MCSCs, die onkogene BrafV600E ausdrücken , zusammen mit dem Verlust des Pten-Ausdrucks erfolgreich durchgeführt werden, da wir Haben zuvor berichtet6. Diese Methode beinhaltet frühere Befunde, die die Aktivierung von Haarfollikel-Stammzellen durch Depilation sowie die Exposition von Murinhaut gegenüber UV-B die Aktivierung von MCSCs, die sich auf die Haarfollikel stützen, erleichtern und die Translokation dieser Zelle Untervölkerung der interfollikulärenEpidermis6,8, 9,10. Diese in vivo-Modellsystemen können wertvolle Informationen darüber liefern, wie physiologische und ökologische Veränderungen den zellulären Status von melanomafreundlichen MCSCs verändern können, was wiederum zu einer signifikanten Initiation von Melanomen in der Haut führen kann.
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Protocol
Alle tierischen Verfahren werden nach dem Institutional Animal Care and Use Committee der Cornell University (IACUC) durchgeführt.
1. Vorbereitung
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Sammeln Sie Schwanzklammern von 12 Tagen postnatalen Mäusen und verdauen in 400 μL von 0,05 N NaOH bei 95 ° C für 1 h. Vortex und fügen Sie 32 μL von 1 M Tris-HCl, pH 7. Genotyp-Mäuse nach PCR-Protokollen, die durch das Jackson Laboratory zur Verfügung gestellt werden und Mäusen mit demGenotyp von Interesse 6 identifizieren.
- Tyr-CreER – hemizygous (+/CreER)
- LSL-BrafV600E – heterozygous (+/LSL-V600E)
- Pten – homozygous flox (flox/flox)
- LSL-tdTomato – hemizygous (+/LSL-tdTomato)
NOTE: Primer-Sequenzen sind in der Materialtabelle enthalten. - Verwenden Sie einen Haarclipper (elektrischer Trimmer), um die Rückenhaut 2 bis 3 Tage vor allen unten beschriebenen Experimenten zu rasieren, und wenn Mäuse etwa 7 Wochen alt sind. Achten Sie darauf, die dünne Maus nicht mit dem elektrischen Trimmer zu beschädigen, da jede Verletzung eine Wundheilungsreaktion hervorrufen kann, die Haarfollikel-Stammzellen, einschließlich MCSCs, aktiviert.
- Bestimmen Sie, ob der Haarzyklus in Telogen ist und ob die Haut während der Wartezeit verletzt wird. Wenn die Haut Anzeichen einer Verletzung zeigt, sollte die Maus nicht für diese Verfahren verwendet werden.
NOTE: Obwohl der Haarzyklus leicht zwischen genetischen Hintergründen unterscheiden kann, befindet sich der Haarzyklus in der Rückenhaut in der Regel im Telogenzustand11. Das Tyr-CreER Transgene wird MCSCs in Telogenhaut ins Visier nehmen, und die anschließenden genetischen Veränderungen werden dauerhaft in allen Linien des MCSC ausgedrückt, einschließlich differenzierter Melanozyten und melanozytischer Tumoren.
2. Tamoxifen Behandlung für Cre-Lox genetische Rekombination
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Vorbereitung von Tamoxifen für die intraperitoneale Injektion (IP) oder die topische Verabreichung für systemische oder lokalisierte genetische Rekombination
NOTE: Damit Tamoxifen Rekombination herbeiführen kann, muss es zunächst von der Leber zu 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) verstoffwechselt werden, das den Kreterbinden und aktivieren kann. Die topische Anwendung von Tamoxifen wird auf diese Weise nicht verstoffwechselt und 4-OHT muss direkt verwendet werden. Für eine ausreichende Rekombination ist nur eine Methode der Tamoxifen-Lieferung erforderlich.- Tamoxifen: Tamoxifen bei einer Konzentration von 10 mg mL-1 in Maisölaufgelöst . Um bei der Auflösung des Medikaments in Lösung zu helfen, addieren Sie bis zu 10% das Gesamtvolumen von 100% molekularem Ethanol zu dem Medikament in Pulverform, Wirbel für 3 min und fügen Sie dann das restliche Volumen von Maisöl hinzu. Weiter auf den Wirbel, bis kristallines Material in der Lösung nicht mehr erkennbar ist. Die Tamoxifen-Lösung kann durch einen 0,2 μm Filter sterilisiert werden. Gehen Sie zu Schritt 2.2.1 für die Behandlung.
- 4-OHT: Bereiten Sie eine Bestandslösung von Hydroxytamoxifen bis zu 3 mg mL-1 in 100% Ethanol vor. Dann kann eine funktionierende Lösung so weit wie nötig angewendet werden, um den Hautbereich zu erfassen (in der Regel eine einzige Anwendung).
NOTE: Eine Bestandslösung von Hydroxytamoxifen kann bei einer Endkonzentration von 5 mM in 100% Ethanol aufgelöst werden. Um eine Arbeitslösung vorzubereiten, können dann 5 μL von 4OH-tamoxifen Lagenlösung in 15 μL 100% Ethanol verdünnt werden. Für 4 mm 2-Bereichkönnen 1 bis 3 μL Arbeitslösung topisch aufgetragen werden.
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Behandlung von Mäusen mit Tamoxifen entweder systemisch oder topisch
- Für die systemische Behandlung 2 mg Tamoxifen über IP-Injektion einmal täglich für 3 Tage mit einer 26 G-Nadel verabreichen.
NOTE: Mit diesem Modell sind etwa 93% ± 4% der ruhigen MCSCs mit tdTomato6gekennzeichnet. - Für die regionale Aktivierung, führen Sie eine topische Behandlung mit 4-OHT. Mit der Arbeitslösung wird der Hautbereich bedecken. Die Höhe der Arbeitslösung kann durch die Größe der Interessenregion bestimmt werden, wie sie in Schritt 2.1.2 beschrieben wird.
- Für die systemische Behandlung 2 mg Tamoxifen über IP-Injektion einmal täglich für 3 Tage mit einer 26 G-Nadel verabreichen.
- Bei 48 Stunden nach der letzten Dosis Tamoxifen, gehen Sie zu Schritt 3 für die chemische Depilation induzierte Tumor-Initiation oder zu Schritt 4 für UV-B-induzierte Tumor-Initiation
3. Chemische Depilation
- Ausrüsten Sie einen Mausbehandlungsraum, der ein Isoofluran-System enthält, mit den folgenden notwendigen Materialien: Haarentfernungscreme, Baumwollschwaben, Papiertuch und Wasser.
- Legen Sie die Maus in die Induktionskammer und Betäubung mit 3,5 bis 4,5% Isofluran und 1 L/min Sauerstoff.
- Sobald sich die Atemfrequenz stabilisiert hat, bestätigen Sie, dass sich die Maus in der richtigen Ebene der Anästhesie befindet, indem Sie eine Zehenspinke durchführen und die Maus auf das Hauptrohr übertragen, das Anästhesie mit 1 bis 1,5% isoflurane und 1 L/min Sauerstoff aufrecht erhält. Verwenden Sie die Augensalbe, damit die Augen unter Anästhesie vor dem Trocknen bewahrt werden.
- Verwenden Sie einen Wattestäbchen, um eine dünne Schicht Haarentfernungscreme auf den rasierten Bereich der Maus Haut aufzutragen.
- Sobald die Creme gleichmäßig aufgetragen wurde, verwenden Sie saubere Wattestäbchen, um mit der Entfernung zu beginnen. Die Gesamtzeit, die die Creme mit der Haut in Kontakt setzt, sollte 1 min nicht überschreiten.
- Die Haut mit einem feuchten Papiertuch sanft abwischen und dafür sorgen, dass jede Restcreme entfernt wurde.
NOTE: Haarentfernungscreme kann bei einer vollständigen Entfernung zu Reizungen der Haut führen. Einige Mäuse, wie zum Beispiel solche auf einem C57BL/6 Hintergrund, können anfällig für die Entwicklung von Dermatitis12sein. Obwohl selten, einige Tiere werden Dermatitis innerhalb von 24 Stunden nach Haarentfernung Creme Anwendung oder mechanische Depilation zu entwickeln. Achten Sie darauf, die Mäuse am Tag nach der Behandlung zu überprüfen, um nach Anzeichen von regionalen Hautreizungen zu suchen. - Die entnommenen Haarwellen und alle Materialien, die in einen Bioasikörbe verwendet werden, verwerfen.
- Legen Sie die Maus in einen leeren, sauberen Mauskäfig, bis die Anästhesie abgenutzt ist.
- Bringe die Mäuse in ihre Käfige zurück.
4. UV-B-Irstrahlung
- Rüsten Sie einen Mausbehandlungsraum aus, der ein Isoofluran-System mit den folgenden benötigten Materialien enthält: UV-B-Lichtsystem, UV-B-Lichtmesser, Schutzhülle für die Maus, zusätzliche UV-B-SchutzpSA für Forscher und eine Zeitschaltuhr.
- Die Mäuse sollten mit der UV-B-Dosis bestrahlt werden (d.h. 0-180 mJ/cm2). Mit dem UV-B-Lichtmesser wird die passende Zeit für die Bestrahlung der Mäuse ermittelt.
NOTE: mW/cm 2 x time = dose - Die Maus mit Isooflurane betäuben. Während in der Induktionskammer, verwenden Sie 3,5 bis 4,5% isofluran und 1 L/min Sauerstoff.
- Sobald die Maus stabilisiert ist, bestätigen Sie die Anästhesieeffekte mit einer Zehenspinose und übertragen Sie die Maus auf das Hauptanästhesie-Rohr in der UV-Kammer. Verwenden Sie die Augensalbe, um zu verhindern, dass die Augen unter Anästhesie trocknen. Anästhesie mit 1 bis 1,5% isoflurane und 1 L/min Sauerstoff aufbewahren.
- Die Rückenhaut mit UV-B-Schutzmaterial bedecken, so dass nur die gewünschte Region freigelegt wird.
NOTE: Zu diesem Zeitpunkt sollte die entsprechende PSA genutzt werden. Die Dauer der Bestrahlung der Maus hängt von der Intensität der verwendeten Glühbirne ab, aber die Anästhesie muss überwacht werden, wenn die benötigte Zeit 30 s überschreitet. - Bedecken Sie die UV-Kammer mit UV-beständigem Deckel oder anderen geeigneten Materialien.
- Schalten Sie die UV-B-Lampe ein und bestrahlen Sie die Maus für die von Forschern für das jeweilige Ziel festgelegte Zeit.
- Schalten Sie das UV-System und Isoofluran aus, dann legen Sie die Maus in einen leeren Mauskäfig, bis die Anästhesie abgenutzt ist.
- Bringe die Mäuse in ihre Käfige zurück.
5. Tissue Processing
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Hautisolierung
- Vor dem Start: Nekropsie-Instrumente, Filterpapier und Papierhandtücher.
- Sterbegänglich die Mäuse nach IACUC-zugelassenen Protokollen und bestätigen den Tod vor dem Vorgehen.
- Mit einem Haarclipper, rasieren Sie alle Haare aus dem Rückenbereich der Haut. Den Bereich mit einem lintfreien Gewebe leicht bepinseln, um den Bereich zu reinigen.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt mit scharfer Schere knapp über dem Ansatz des Schwanzes.
- Fügen Sie große stumpfe Scheren in den Schnitt ein und trennen Sie die subdermalen Bindegewebe.
- Isolieren Sie die von Interesse gestorbene Hautregion vorsichtig, indem Sie mit scharfer Schere am Rand des Gewebes schneiden.
- Legen Sie das Hautgewebe auf ein sauberes Papiertuch und ziehen Sie mit stumpfen Zangen die Haut so aus, dass sie sich an das Handtuch hält und gelehrt wird. Dieser Schritt dient dazu, das Gewebe zusätzlich zu unterstützen, damit es manipuliert und verarbeitet werden kann, während es seine Form behält.
NOTE: Achten Sie darauf, nur die äußeren Bereiche des Hautgewebes zu behandeln, da die Zangen Schäden an der Haut verursachen können, die histologisch gesehen werden können.
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Fixierung der Gewebe
- Ein Stück Filterpapier halbieren und entsprechend abmalen. Legen Sie die Haut zusammen mit Papierhandtuchuntergrund in das gefaltete Papier direkt neben die Falte, so dass die Probe glatt ist und nicht gefaltet oder zerbröselt. Das Filterpapier durch das Anziehen der offenen Seiten versiebenhalten und dann so schneiden, dass das restliche Papier für zukünftige Proben verwendet werden kann.
NOTE: Dieser Schritt wird so durchgeführt, dass die Haut ihre Form während der Fixierung behält. - Die Gewebeprobe vollständig in 10% neutrales, gepuffertes Formalin für 3 bis 5 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C untertauchen.
- Nach der Fixierung die Proben aus Formalin entfernen, in deionisiertes Wasser waschen (2x, 5 min) und Gewebe Blöcke herstellen. Entfernen Sie sorgfältig Restmaterial aus dem Hautgewebe (z.B. Restpapier).
- Ein Stück Filterpapier halbieren und entsprechend abmalen. Legen Sie die Haut zusammen mit Papierhandtuchuntergrund in das gefaltete Papier direkt neben die Falte, so dass die Probe glatt ist und nicht gefaltet oder zerbröselt. Das Filterpapier durch das Anziehen der offenen Seiten versiebenhalten und dann so schneiden, dass das restliche Papier für zukünftige Proben verwendet werden kann.
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Herstellung von gefrorenen Gewebeblöcken (Bild 1)
- Die Kanten der Hautprobe so zertrampeln, dass sie nicht gezackt werden und dann 3 Sagittalschnitte machen. Die Breite dieser Streifen sollte nicht mehr als die Höhe des Kryomold (5 mm) sein. Als Nächstes sollten Sie Querschnitte machen, um Teile der Haut zu haben, die nicht länger als die Breite des Kryomold (20 mm) sind und eingebettet werden können. Wiederholen Sie die restliche Hälfte der Rückenhaut, oder speichern Sie das Gewebe für andere Anwendungen (abwechselnd die Hälfte vor der Fixierung speichern).
NOTE: Es ist wichtig, die Hautstücke in der richtigen Ausrichtung zu halten. - Orient die Kryomold (25 x 20 x 5 mm3) in einer Porträtorientierung und platzieren Sie 4 bis 5 Stück Haut auf dem OCT. Sobald alle Stücke vorhanden sind, verwenden Sie 2 Paar feine Zangen, um den langen Rand der Haut auf den Boden der Kryomold zu bringen. Die Haut sollte nun im OCT senkrecht zur Basis der Form stehen. Achten Sie darauf, die Bildung von Lufttaschen innerhalb des OCT während dieses Schrittes zu minimieren (Abbildung1).
- Füllen Sie die Form mit OCT an die zweite Lippe, und legen Sie auf die flache Oberfläche von Trockeneis. Verwenden Sie Zangen, um alle Hautstücke, die während der Übertragung verschoben haben können, während der Block beginnt zu frieren. Sobald die untere Schicht verfestigt ist, ist eine Manipulation des Gewebes unmöglich.
- 8-10 μm Dias für die Analyse schneiden.
- Die Kanten der Hautprobe so zertrampeln, dass sie nicht gezackt werden und dann 3 Sagittalschnitte machen. Die Breite dieser Streifen sollte nicht mehr als die Höhe des Kryomold (5 mm) sein. Als Nächstes sollten Sie Querschnitte machen, um Teile der Haut zu haben, die nicht länger als die Breite des Kryomold (20 mm) sind und eingebettet werden können. Wiederholen Sie die restliche Hälfte der Rückenhaut, oder speichern Sie das Gewebe für andere Anwendungen (abwechselnd die Hälfte vor der Fixierung speichern).
-
Formalin fixierte Paraffin-Embedded (FFPE) Gewebeblöcke
- 2 Stück feste Haut in eine beschriftete Kassette geben und in zunehmendem Ethanol dehydrieren (75% Ethanol für 30 min, 85% für 30 min, 90% für 30 min, 95% für 30 min, 100% für 2x 30 min, Xylen-oder Xylen-Ersatz für 2x 30 min). Mit Paraffin bei 58-60 °, zuerst für 30 min, und dann über Nacht, in die Inkubate.
- Einbetten in eine 24 x 24 mm 2 Edelstahl-Gewebeform mit flüssigem Paraffin und bei-5 ° C. Die Gewebeorientierung sollte der von gefrorenen Gewebeblöcken ähnlich sein, so dass Längsabschnitte über mehrere Haarfollikel visualisiert werden können (Abbildung1).
- Sobald sich das Paraffin verfestigt hat, entfernen Sie die Form und schneiden Sie sie in 5-10 μm-Abschnitte für die Analyse.
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Representative Results
Hautmelanom-Initiation durch chemische Depilation
Das Verfahren der chemischen Depilation ist in Abbildung2 dargestellt. Wenn Mäuse 7-Wochen postnatal sind, ist ihre Rückenhaut in Telogen. Bei Telogen sind Haarfalzen-Stammzellen und MCSCs in einem ruhigen, ruhenden Zustand. Die Haut sollte nach der Rasur kein signifikantes Haarwachstum aufweisen. Auf der anderen Seite kann die chemische Depilation die Aktivierung der Haarfollikel-Stammzellaktivierung auslösen, was wiederum ein signifikantes Haarwachstum aus dem Interessengebiet zeigt (Abbildung2). In ähnlicher Weise müssen auch tumoranfällige MCSCs, die onkogene Mutationen ausdrücken, für eine beschleunigte Tumorbildung aktiv sein. Die chemische Depilation kann die Aktivierung von Haarfollikel-Stammzellen und MCSCs erheblich induzieren. Melanoma-anfällige MCSCs in einem aktiven Zustand können Tumoren bilden, und die mikroskopische Melanominitiation kann innerhalb von 2 Wochen nach der chemischen Depilation mit der Linie verfolgt allele LSL-tdTomato (Abbildung 3).
Hautmelanom-Initiation durch UV-B-Strahlung
Ähnlich wie bei der chemischen Depilation kann UV-B die Tumorinitiation von ruhmfahrenden MCSCs (Abbildung4) auslösen. Während die Murinenhaut, die tumoranfällige MCSCs in einem ruhigen Zustand enthält, keine signifikante Tumorinitiation und keinen signifikanten Pigmentierungszustand aufweist, zeigt die dorsale Haut UV-B (zweimal, 180 mJ/cm 2) schwarz pigmentierte Frühmelanozyten-Tumoren, die Makroskopisch offensichtlich (Abbildung 4A, B). Während UV-B innerhalb von 2 Wochen eine makroskopisch erkennbare Tumorinitiation maßgeblich auslösen kann, kann die Anwendung von Sonnenschutzmitteln die UV-B-vermittelte Melanominitiation in der Haut schützen, ähnlich einem UV-resistenten Tuch (Abbildung 4C, D).
Wichtig ist, dass UV-B-induziert die direkte Translokation von MCSCs von ihrer follikulären Stammzellennische in die interfollikuläre Epidermis. Darüber hinaus kann UV-B in der gesamten interfollikulären Epidermis eine MCSC-Ursprungsbildung aus der Hautmelanome induzieren, und der mikroskopische Phenotyp kann durch den Linienmessmarker tdTomato (Abbildung5) beobachtet werden. Da diese Tumorzellen bösartig sind, wachsen sie schnell und invasiv (Abbildung 5). Ähnlich wie bei der Rückenhaut ist die UV-B-induzierte Melanominitiation insbesondere in anderen Hautbereichen, wie der Ohrhaut, zu beobachten (Abbildung6). Im Vergleich zur Kontrollhaut, die von UV-beständigem Tuch bedeckt ist, zeigt die UV-B-Ohrenhaut eine höhere Pigmentierung durch eine höhere Melanomentzündung (Abbildung6).
Abbildung 1: Hautgewebelisolierung und Kryoeinbettung. Nach der Sterbehilfe rasieren Sie die Maus Rückenlehne Haut von Interesse und eingebettet Haut in Kryomold mit OCT. Die gestrichelte Linie auf der Maus stellt die Mittellinie dar. Typischerweise können 3 oder 4 Teile der Haut mit der Linie Segment 3-4 entlang der Mittellinie isoliert werden; Ein solches Stück wird durch das Rechteck, das mit dem 1/3/4 angezeigt wird, angezeigt. Diese Hautstücke sollten in das OCT eingebettet werden, wie in der Abbildung gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Makroskopische Phenotypen nach chemischer Depilation. (A) Diagramm der chemischen Depilation. (B) Nach der Rasur wurde der Haarzyklus in Telogen bestätigt. (C) Die chemische Enthaarung wurde durchgeführt, um Haarwellen aus den Haarfollikeln zu entfernen, die sowohl Haarfollikel als auch Melanozyten-Stammzellen aktivieren können. (D) Rund eine Woche später wird sich das frühe Haarwachstum leicht bemerkbar machen. (E) Dann kann man im Laufe der Zeit ein signifikantes Haarwachstum beobachten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Mikroskopische Beobachtung der Melanominitiation, die durch chemische Depilation gesteuert wird. Die chemische Depilation kann die Aktivierung von ruhieszierenden, tumoranfälligen MCSCs erheblich bewirken. Dann kann die mikroskopische Tumor-Initiation, die durch die Abstammungsmarkierung tdTomato demonstriert wird, innerhalb von 2 Wochen beobachtet werden. Diese Abbildung zeigt den mikroskopischen Phenotyp 16 Tage nach 3 Tagen Tamoxifen durch IP-Injektion, gefolgt von einer chemischen Depilation mit verschiedenen Visualisierungen des gleichen Blickfeldes. (A) tdTomato+ Tumorzellen, die aus dem Haarfollikel stammen, das mit dem Atomgegenstau Dapi verschmolzen ist. (B) Haarfollikel und interfollikuläre Epidermis sind in Weiß umrissen. (C) Ein Schema, das zeigt, wie tdTomato + Tumorzellen aus dem Haarfollikel in die Dermis eindringen, modifiziert vom Mond, H.et al. 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Makroskopischer Phenotyp des kutanen Melanoms, der durch UV-B-Bestrahlung induziert wird. Die Mäuse wurden 3 Tage lang mit Tamoxifen behandelt (Tag 1 bis 3), gefolgt von 2 UV-B-Expositionen (Tag 4 und 6). (A) Diagramm der UV-B-Bestrahlung auf der Rückenhaut, die mutierte MCSCs enthält. (B) Makroskopischer Phenotyp zwischen Kontrolle und UV-B-exponierter Rückenlehne. Innerhalb von 2 Wochen nach der zweiten UV-B-B-B-Bestrahlung kann eine signifikante schwarze Pigmentierung im Zusammenhang mit der melanozytischen Tumorbildung beobachtet werden. (C) Diagramm der Sonnenschutzanwendung. D) Während UV-B die Tumorinitiation von mutierten MCSCs signifikant induzieren kann, zeigte die Anwendung von Sonnenschutzmitteln eine signifikant unterdrückte UV-B-vermittelte Tumorinitiation (16 Tage nach der zweiten UV-B-B-Bestrahlung). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Mikroskopische Beobachtung des UV-B-induzierten Hautmelanoms. Die Mäuse wurden 3 Tage lang mit Tamoxifen durch IP-Injektion (Tag 1 bis 3) behandelt, gefolgt von 2 UV-B-Expositionen (Tag 4 und 5). (A-C) Eine frühe Tumor-Initiation in der gesamten interfollikulären Epidermis, die durch die Abstammung von TdTomato nachgewiesen wird, kann am 17. Tag gezeigt werden. (A) tdTomato + Tumorzellen werden gezeigt, die von der Haarfollikel in die interfollikuläre Epidermis wandern. Dapi wird als nuklearer Gegenfleck verwendet. (B) Die Dapi-Färbung wird entfernt und die gestrichelte Linie zeigt die Lage der Haarfollikel und der interfollikulären Epidermis an. (C) Schematic, das tdTomato + Zellmigrationvom Haarkeim in die interfollikuläre Epidermis nach UV-B-Exposition anzeigt. Aus dem Mond und dem alen6 geändert. (D-F) Dann wachsen Tumorzellen schnell und dringen in das dermale Gewebe unter (Tag 25). D) tdTomato+ Tumorzellen haben sich weiter vermehrt und dringen in das dermale Gewebe ein. Dapi wird als nuklearer Gegenfleck verwendet. (E) Die Dapi-Färbung wird entfernt und die gestrichelte Linie zeigt die Lage der Haarfollikel und der interfollikulären Epidermis an. F) Schematic, das eine tTomato+ Zell-Invasion in die Dermis und das melanozytische Tumorwachstum anzeigt. Aus dem Mond und dem alen6 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Makroskopische und mikroskopische Beobachtung von UV-B-induziertem Melanom in der Ohrhaut. A) Experimentelles Schema. Die Mäuse wurden 3 Tage lang mit Tamoxifen (Tag 1 bis 3) behandelt, gefolgt von 3 Belichtungen zur UV-B-Bestrahlung (Tag 4, 6 und 8). B) Die signifikante Melanominitiation durch UV-B-Bestrahlung wurde sowohl an Tag 28 makroskopisch als auch mikroskopisch beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Hallmarkische genetische Veränderungen, die häufig bei Hautmelanomtumoren vorkommen, wurden gutbeschrieben. Die dominanteste Fahrermutation ist BrafV600E, und ein gentechnisch verändertes Mausmodell für BrafV600E-vermitteltes Melanom wurde von der Bosenberg-Gruppe14 erzeugt und im Jackson Laboratory deponiert. Anhand dieses Mausmodells hat unsere aktuelle Studie die Notwendigkeit einer zellulären Aktivierung von tumoranfälligen MCSCs für die signifikante Initiierung von BrafV600E-vermitteltemMelanom in der Rückenhaut 6 nachgewiesen.
Die Enthaarung ist als eine wirksame Methode bekannt, um die Aktivierung von Murinhaar-Follikel-Stammzellaktivierungen auf der Rückenhaut 6,10zuinduzieren. Murine MCSCs befinden sich innerhalb der Haarfollikel, und darüber hinaus wird der zelluläre Status der Follikulär-MCSCs mit dem Zustand der Haarfollikel Stammzellen8synchronisiert. Künstliche Modulation von Haarfollikel-Stammzellen kann den MCSC-Status verändern, so dass die Enthaarung sowohl Melanozyten als auch Haarfollikel-Stammzellen direkt aktivieren kann. Diese Aktivierungsmethode für MCSCs kann bei tumoranfälligen MCSCs eingesetzt werden, um die frühen Schritte der Hautmelanom-Initiation in gentechnisch veränderten Melanommaus zu untersuchen. Durch eine chemische Depilation-Methode kann die Melanombildung im Bereich des Interesses an der Murinenhaut direkt eingeleitet werden. Die Enthaarung kann mit verschiedenen Methoden wie Wachsen oder Zupfen durchgeführt werden, die beide Arten der mechanischen Haarentfernung sind, bei denen Haarwellen aus der Haarfollikel extrahiert werden. Diese mechanischen Depilationsmethoden können jedoch in Bezug auf eine bestimmte Region von Interesse ungenau sein. Auf der anderen Seite ist eine chemische Depilation-Methode mit Haarentfernungscreme einfach durchzuführen und ermöglicht eine präzise Anwendung mit zuverlässiger Aktivierung des Haarzyklus, und kann weniger hart auf der Haut als mechanische Entfernung.
Unter den verschiedenen Risikofaktoren ist UV-B der bekannteste Risikofaktor bei Hautmelanom15. Die UV-B-Bestrahlung ist dafür bekannt, dass sie die direkte Migration von follikulären MCSCs in die interfollikuläre Epidermis 9 vornimmt. Darüber hinaus ist UV-B ein starker Umweltstressoren, der die Melanominitiation von tumoranfälligen MCSCs6erheblich induzieren kann. Im oben beschriebenen Versuchsprotokoll kann eine kleine Region, die auf der Murin-Smarsal-Haut von Interesse ist, UV-B-Licht ausgesetzt werden, während der Einsatz eines UV-beständigen Tuches den Rest der Maus leicht vor unerwünschter Exposition schützt. Diese Behandlung kann durchgeführt werden, während die Maus unter Narkose steht. Wichtig ist, dass die Migration von MCSCs und die Bildung von MCSC-Ursprungsmelanomen nach UV-B-Exposition UV-B-dosis abhängigsind. 6. Um erfolgreich zu sein, ist es daher wichtig, die Intensität der Glühbirne mit einem UV-B-Meter regelmäßig zu überprüfen und die Belichtungszeit und den Abstand zwischen Haut und Glühbirnen bei Bedarf anzupassen. Wie allgemein bekannt ist, kann die Haut als Reaktion auf eine hohe Dosis UV-B-Licht brennen, aber eine schwache UV-B-Exposition schadet auch dem Experiment, da sie nicht ausreicht, um MCSC-Ursprungsmelanom zu induzieren.
Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich in erster Linie auf den Umweltrisikofaktor UV-B in der Rückenhaut. Das obige Versuchsprotokoll kann jedoch auf verschiedene Ziele angewendet werden. Zum Beispiel kann das Protokoll mit Glühbirnen unterschiedlicher Spektren modifiziert werden, um die Wirkung alternativer Lichtquellen oder Wellenlängen von UV-Licht, wie UV-A, zu bestimmen. Dieses Protokoll zielte in erster Linie auf die Rückenhaut ab, da sie zugänglich ist und der Status von MCSCs gut definiert ist. Es kann aber auch verändert werden, um die UV-Lichteinwirkung von Anhängern wie der Ohr-, Schwanz-oder Palmenhaut, einschließlich der Fußpolster, zu erreichen. Zum Beispiel ist es in Abbildung6 möglich, mögliche Unterschiede bei der frühen melanozytischen Tumorbildung an alternativen Gewebestätten zu untersuchen. Im Gegensatz zur Rückenhaut ist der Status der MCSCs an diesen Standorten jedoch weniger genau definiert; Daher sollte die mögliche spontane Aktivierung von MCSCs, die zu zufälligen Vorkommnissen der Melanombildung führen, in Betracht gezogen werden. Im Vergleich zum Protokoll in der Rückenhaut werden alternative Ansätze daher eine erhöhte Anzahl von Experimenten erfordern, um genaue experimentelle Ergebnisse zu erzielen.
Darüber hinaus, während das aktuelle Protokoll in erster Linie zeigtBraf V600E-vermittelte Melanom-Initiation, wurde in unserer vorherigen Studie auch eine ähnliche frühe Melanombildung mit einer onkogenen Ras/Pten Kombination unter Verwendung der LSL-KrasG12D genetisches Allele 6. Aber auch andere Fahrermutationen wie Mutant-Mras-Gene können mit dem hier beschriebenen Versuchssystem in Betracht gezogen werden, um die frühe Melanominitiation zu verstehen, die von anderen onkogenen Kombinationen angetrieben wird.
Zusammengenommen, hier beschrieben, ist ein In-vivo-Modellsystem, das die Untersuchung der frühen kutanen Melanom-Initiation bei gentechnisch veränderten Mäusen ermöglicht. Diese Murinmodelle liefern die Methoden zur zeitlichen und räumlichen Kontrolle der Melanom-Initiation durch mutierte MCSCs in der Haut. Diese Protokolle bieten ein neuartiges Paradigma, um die Mechanismen der frühen Melanom-Initiation von tumoranfälligen MCSCs zu untersuchen, sowie eine Plattform, um die physiologischen und ökologischen Stressoren zu bestimmen, die zur Melanominitiation beitragen können. Dieses Niveau der räumlichen Kontrolle kann auch ein Instrument für eine präzisere Melanominduktion sein, um die Wirksamkeit von Medikamenten bei der Vorbeugung von Melanombildung sowie Tumorwachstum zu testen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde vom Büro des stellvertretenden Verteidigungsministers für Gesundheitsfragen durch das Peer Reviewed Cancer Research Program unter der Auszeichnung W81XWH-16-1-0272 unterstützt. Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen sind die der Autoren und werden nicht unbedingt vom Verteidigungsministerium unterstützt. Diese Arbeit wurde auch durch ein Saatgutstipendium des Cornell Stem Cell Program an A.C. White unterstützt. H. Moon wurde vom Cornell Center for Vertebrate Genomics Scholar Program unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C.
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
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- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
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