Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59666
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

הפרוצדורה הבאה מתארת שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית של ייזום גידול מלנוציטוטי בעור מוראני, באמצעות דגם עכבר מהונדס גנטית. פרוטוקול זה מתאר מאקרוסקופי כמו גם חניכה מיקרוסקופיים עורית מלנומה.

Abstract

מלנומה עורית ידועה כסרטן העור האגרסיבי ביותר. למרות גורמי הסיכון ושינויים גנטיים העיקריים להמשיך להיות מתועד עם עומק הגוברת, שיעור השכיחות של מלנומה עורית הראה עלייה מהירה ורציפה במהלך העשורים האחרונים. כדי למצוא שיטות מניעה יעיל, חשוב להבין את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה בעור. הנתונים הקודמים הוכיחו כי בתאי גזע מלנוציט הזקיקים (MCSCs) ברקמות העור המבוגר יכול לשמש כתאי מלנומה של המקור בעת המבטא מוטציות אונגניים ושינויים גנטיים. Tuמוריגנזה הנובעים MCSCs נוטה מלנומה יכול להיגרם כאשר MCSCs מעבר מן השקט למצב פעיל. מעבר זה מלנומה נוטה MCSCs ניתן לקדם על ידי אפנון של או שיער זקיק תאי גזע המדינה פעילות או באמצעות גורמים סביבתיים חיצוניים כגון אולטרה סגול-B (UV-B). גורמים אלה יכולים להיות מניפולציות באופן מלאכותי במעבדה על ידי depilation כימיים, מה שגורם מעבר של תאי גזע שיער זקיק ו מן השקט למצב פעיל, ועל ידי חשיפה UV-B באמצעות אור שספסל העליון. שיטות אלה מספקות שליטה מרחבית מוצלחת והטמפורלית של חניכה מלנומה עורית בעור מוריין. לכן, אלה במערכות מודל vivo יהיה בעל ערך להגדיר את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה עורית יכול לשמש כדי לבדוק שיטות פוטנציאליות למניעת גידול.

Introduction

מלנומה, הצורה המממנת של גידולים מלנולוציפטיים, הוא הסרטן האגרסיבי ביותר בעור עם מלנומה עורית אחראי על רוב מקרי המוות של סרטן העור1. בארצות הברית, מלנומה מאובחנת בדרך כלל; הוא הוקרן להיות 5 עד 6th הסרטן הנפוץ ביותר בקרב המקרים המשוער סרטן חדש ב 20182. יתר על כן, בעוד מקרי סרטן הכולל הראו את המגמה של צמצום הדרגתי בעשורים האחרונים, מלנומה עורית שיעור שיעור במהלך העשורים האחרונים להפגין עלייה רציפה ומהירה בשני המינים2.

כדי להילחם מלנומה עורית ביעילות רבה יותר, חשוב להבין בבירור את האירועים המוקדמים של פיתוח מלנומה מתאי המוצא שלהם לזהות טוב יותר קלינית שיטות מניעה יעיל. ידוע כיום כי בתאי גזע בוגרים יכולים לתרום באופן משמעותי להיווצרות הגידול כמקורות הסלולר של סרטן בסוגים רבים ושונים של איברים כולל רקמות העור3,4,5. באופן דומה, מבוגרים תאי גזע מלנוציט (MCSCs) בעור המורין הישן יכול לעבוד כתאי מלנומה של המקור על הפעלה חריגה של Ras/חיל הארץ ו akt מסלולים6. עם זאת, אלה מוטציות אונגניים לבד אינם מסוגלים ביעילות לגרום להיווצרות הגידול מן השקט MCSCs. גידולים מלנולוציפטיים בסופו של דבר להתפתח כאשר MCSCs להיות פעיל במהלך רכיבה על שיער טבעי. עם זאת, בפרוטוקול זה, נתאר שיטות כדי לגרום באופן מלאכותי הפעלה תאית של MCSCs מועדת הגידול, ובכך להקל על שליטה מדויקת של חניכה מלנומה6,7.

באמצעות השיטות המתוארות כאן, שליטה מרחבית וטמפורלית של חניכה מלנומה עורית מפני גידול MCSCs ביטוי אונגניים BrafV600E יחד עם אובדן של ביטוי pten ניתן לבצע בהצלחה, כמו שאנחנו דיווחו בעבר על6. שיטה זו משלבת ממצאים קודמים כי הפגנת שיער זקיק גזע הפעלה של תא דרך הסרת שיער כמו גם איך חשיפה של העור murine ל-UV-B יכול להקל על ההפעלה של MCSCs תושב זקיק השיער וטרנסלוקציה של הסלולר הזה אוכלוסיית המשנה לאפידרמיס הפוליקולרית6,8,9,10. אלה במערכות מודל vivo יכול לספק מידע חשוב לגבי איך שינויים פיסיולוגיים וסביבתיים יכולים לשנות את הסטטוס התאי של מלנומה נוטה MCSCs, אשר בתורו יכול לגרום לחניכה משמעותית של מלנומה בעור.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל ההליכים בעלי החיים מבוצעים בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת קורנל ולהשתמש בוועדה (IACUC).

1. הכנה

  1. לאסוף קטעי זנב מ 12 יום עכברים לידתיים ולעכל ב 400 μL של 0.05 N NaOH ב 95 ° צ' עבור 1 h. מערבולת ולהוסיף 32 μL של 1 M טריס-HCl, pH 7. עכברים גנוטיפ על פי פרוטוקולי ה-PCR שסופקו דרך המעבדה ג'קסון ולזהות עכברים עם גנוטיפ של ריבית6.
    - Tyr-creer – hemizygous (+/creer)
    - Lsl-BrafV600E – heterozygous (+/Lsl-v600e)
    - Pten – homozygous flox (flox/flox)
    - Lsl-tdTomato – hemizygous (+/ליטר)
    הערה: רצפים פריימר מסופקים ברשימת חומרים.
  2. השתמש בקוצץ שיער (קוצץ חשמלי) כדי לגלח את העור הקודם 2 עד 3 ימים לפני כל הניסויים המתוארים להלן, וכאשר עכברים הם כ -7 שבועות של גיל. לדאוג לא לפגוע בעור העכבר הדק באמצעות הקוצץ החשמלי כמו כל פציעה עלולה לעורר תגובה ריפוי הפצע אשר יפעיל את השיער זקיק גזע תאים, כולל MCSCs.
  3. קבע אם מחזור השיער הוא בתוך הזמן והאם העור נפצע במהלך תקופת ההמתנה. אם העור מראה סימן כלשהו לפציעה, אין להשתמש בעכבר להליכים אלה.
    הערה: למרות שמחזור השיער עשוי להיות מעט שונה בין הרקעים הגנטיים, בגיל זה מחזור השיער בעור העורבן הוא בדרך כלל במצב הטלנוגן11. The Tyr-CreER הגנטי יהיה יעד MCSCs בעור טלעוגן, ואת השינויים הגנטיים הבאים יהיה להתבטא לצמיתות בכל שלדורות של mcsc, כולל גידולים מלנוציטים ומלנוציטוטיק.

2. טיפול טמוקסיפן לקומבינציה גנטית של היצור-לקס

  1. הכנת טמוקסיפן עבור הזרקת הצפק (IP) או ניהול אקטואלי עבור שילוב גנטי מערכתי או מקומי מחדש
    הערה: על מנת טמוקסיפן כדי לגרום שילוב חוזר, זה חייב להיות מטבוליזם על ידי הכבד ל 4-הידרוקסימטפן (4-OHT), אשר יכול לאגד ולהפעיל את Creer. יישום מקומי של טמוקסיפן לא יהיה חילוף חומרים בדרך זו ו 4-OHT חייב לשמש ישירות. רק שיטה אחת של משלוח טמוקסיפן נדרש עבור שילוב מספיק מחדש.
    1. טממוקסיפן: מכינים טממוקסיפן בריכוז של 10 מ ג-1 מומס בשמן תירס. כדי לסייע פירוק התרופה לתוך פתרון, להוסיף עד 10% נפח הכולל של 100% אתנול כיתה מולקולרית תרופה בצורת אבקה, מערבולת עבור 3 דקות ולאחר מכן להוסיף את הנפח הנותר של שמן תירס. המשך למערבולת עד שהחומר הגבישי אינו גלוי עוד בפתרון. פתרון טמוקסיפן ניתן לעקר על ידי עובר דרך מסנן יקרומטר 0.2. . המשך לשלב 2.2.1 לטיפול
    2. 4-OHT: להכין פתרון מניות של הידרוקסיטמוקסיפן עד 3 מ"ג mL-1 ב 100% אתנול. לאחר מכן, ניתן ליישם פתרון עובד ככל הנדרש כדי לכסות את אזור העור של הריבית (בדרך כלל יישום יחיד).
      הערה: פתרון מניות של הידרוקסיטמוקסיפן יכול להיות מומס ב 100% אתנול עבור ריכוז סופי של 5 מ"מ. לאחר מכן, כדי להכין פתרון עובד, 5 μL של פתרון מניות 4OH-tamoxifen ניתן מדולל לתוך 15 μL של 100% אתנול. עבור 4 מ"מ2 שטח, 1 עד 3 μl של פתרון העבודה ניתן להחיל למריחה על הסביבה.
  2. טיפול בעכברים עם טמוקסיפן או מערכתית או למריחה על העיצוב
    1. עבור טיפול סיסטמי, מנהל 2 מ"ג טמוקסיפן דרך הזרקת IP פעם ביום עבור 3 ימים באמצעות מחט G 26.
      הערה: באמצעות מודל זה, כ 93% ± 4% של השקט MCSCs מתויגים עם tdTomato6.
    2. להפעלה אזורית, בצע טיפול מקומי אחד עם 4-OHT. כסו את תחום העור המעניין בפתרון העבודה. ניתן לקבוע את כמות פתרון העבודה לפי גודל אזור הריבית כפי שמתואר בשלב 2.1.2.
  3. ב 48 h בעקבות המינון האחרון של טמוקסיפן, המשך לשלב 3 עבור הגידול הכימי להסרת שיער המושרה או לשלב 4 עבור UV-B המושרה ליזום גידול

3. להסרת שיער כימית

  1. לצייד חדר טיפול בעכבר המכיל מערכת isof, עם החומרים הנדרשים הבאים: קרם הסרת שיער, שקיות צמר, מטלית נייר, ומים.
  2. מניחים את העכבר לתוך התא אינדוקציה מורדם עם 3.5 כדי 4.5% isofלאנה ו 1 L/min חמצן.
  3. לאחר שקצב הנשימה התייצב, לאשר את העכבר הוא במישור הנכון של הרדמה על ידי ביצוע צביטה הבוהן ולהעביר את העכבר לצינור הראשי שמירה על הרדמה עם 1 כדי 1.5% isofלהקה ו 1 L/min חמצן. להחיל משחה העין כדי לשמור על העיניים מפני ייבוש תוך הרדמה.
  4. השתמש בספוגית כותנה כדי להחיל שכבה דקה של קרם הסרת שיער לאזור מגולח של העור העכבר.
  5. ברגע שהקרם הוחל באופן שווה, השתמש בדגימות כותנה נקיות כדי להתחיל בהסרה. הזמן הכולל שהקרם במגע עם העור לא יעלה על 1 דקות.
  6. לנגב בעדינות את העור במטלית נייר לחה ולהבטיח כי כל קרם שיורית הוסר.
    הערה: קרם להסרת שיער יכול לגרום לגירוי בעור אם הוא לא מוסר לחלוטין. עכברים מסוימים, כגון אלה על רקע C57BL/6, יכול להיות נוטה לפתח דרמטיטיס12. למרות נדיר, כמה בעלי חיים יפתחו דרמטיטיס בתוך 24 שעות לאחר הסרת השיער קרם יישום או להסרת שיער מכני. הקפד לבדוק את העכברים יום לאחר הטיפול כדי לחפש סימנים של גירוי בעור האזורי.
  7. הסירו את פירי השיער שהוסרו ואת כל החומרים ששימשו לתוך תא בידוד.
  8. מניחים את העכבר לתוך כלוב העכבר ריק, נקי עד ההרדמה יש לבשו.
  9. . החזר את העכברים לכלובים שלהם

4. UV-B הקרנה

  1. צייד חדר טיפול בעכבר המכיל מערכת isof, עם החומרים הנדרשים הבאים: UV-B מערכת אור, UV-B מטר אור, כיסוי מגן על העכבר, נוסף UV-B הגנה לחוקר, ו טיימר.
  2. עכברים צריכים להיות לקרינה במינון UV-B של ריבית (כלומר, 0-180 mJ/cm2). השתמש במד אור UV-B כדי לקבוע את אורך הזמן המתאים כדי להאיר את העכברים.
    הערה: mW/cm2 x זמן = מינון
  3. . לדבר עם העכבר בעזרת מלגלית בעוד בחדר האינדוקציה, להשתמש 3.5 כדי 4.5% isofלאנה ו 1 L/min חמצן.
  4. ברגע העכבר מיוצב, לאשר תופעות הרדמה עם צביטה בבוהן ולהעביר את העכבר לצינור ההרדמה הראשי הממוקם בחדר UV. להחיל משחה העין כדי למנוע את העיניים מהתייבשות בזמן הרדמה. שמרו על הרדמה עם 1 עד 1.5%. וחמצן 1 L/דקות
  5. לכסות את העור הגבי עם חומר הגנה UV-B, כך שרק האזור הרצוי יהיה חשוף.
    הערה: בשלב זה, יש לעשות שימוש ב-PPE המתאים. משך הזמן הדרוש כדי לפרק את העכבר תלוי בעוצמת הנורה המשמש, אבל הרדמה אולי צריך להיות מנוטרים אם הזמן הנדרש עולה על 30 s.
  6. מכסים את תא UV באמצעות מכסה עמידות UV או כל חומרים מתאימים אחרים.
  7. הפעל את מנורת UV-B והקרין את העכבר במשך הזמן שנקבע על ידי חוקרים עבור המטרה הספציפית.
  8. כבה את מערכת UV ו-isofלאנה, ואז למקם את העכבר על כלוב העכבר ריק עד ההרדמה יש לבשו.
  9. . החזר את העכברים לכלובים שלהם

5. עיבוד רקמה

  1. בידוד עור
    1. השג את הפרטים הבאים לפני תחילת העבודה: מכשירי נקרופסי, נייר סינון ומגבות נייר.
    2. המתת חסד העכברים לפי פרוטוקולים IACUC שאושרו, ולאשר את המוות לפני שתמשיך.
    3. משתמשים בקוצץ שיער, מגלחים. את כל השערות מאזור העור מצחצח בקלילות את האזור ברקמה נטולת מוך כדי לפנות את האזור.
    4. לעשות חתך קטן עם מספריים חדים ממש מעל הבסיס של הזנב.
    5. הוסף מספריים בוטים גדולים לתוך החתך ולהפריד את רקמות החיבור התת עורי.
    6. לבודד בזהירות את אזור העור של עניין על ידי גזירה עם מספריים חדים לאורך קצה הרקמה.
    7. מניחים את רקמת העור על מגבת נייר נקייה להשתמש מלקחיים עמום כדי למתוח את העור כך שהוא דבק המגבת והוא לימד. שלב זה משמש למתן תמיכה נוספת לרקמות כך שניתן יהיה לתמרן ולעבד אותה תוך שמירה על צורתו.
      הערה: להיזהר רק לטפל באזורים החיצוניים של רקמת העור, כמו מלקחיים עלול לגרום נזק לעור אשר ניתן לראות היסטולוגית.
  2. קיבוע רקמות
    1. מקפלים פיסת נייר סינון במחצית ומתייג בהתאם. מניחים את העור יחד עם גיבוי מגבת נייר לתוך הנייר המקופל הצמוד מיד לקמט, להבטיח כי המדגם הוא חלק ולא מקופל או מקומט. אטום את נייר הסינון על-ידי הידוק הצדדים הפתוחים ולאחר מכן קצץ כך שניתן יהיה להשתמש בנייר הנותר לדגימות עתידיות.
      הערה: שלב זה מבוצע כך העור שומר על צורתו במהלך הקיבעון.
    2. יש להטביע במלואו את דגימת הרקמה ב-10% מחסן ניטרלי באגירה עבור 3 עד 5 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב -4 ° c.
    3. בעקבות קיבעון, להסיר את הדגימות מתוך formalin, לשטוף במים מוכי (2x, 5 דקות כל אחד) ולהמשיך לעשות בלוקים רקמות. הסירו בזהירות כל חומר שרידי מרקמת העור (כלומר, נייר שיורית).
  3. ביצוע בלוקים רקמות קפואות (איור 1)
    1. חתוך את הקצוות של דגימת העור כך שהם לא משוננים ולאחר מכן לבצע 3 חתכים משונן. רוחב של רצועות אלה לא צריך להיות יותר מאשר הגובה של cryomold (5 מ"מ). הבא, לעשות חתכים רוחבי יש פיסות העור אשר אינם ארוכים יותר מאשר ברוחב של cryomold (20 מ"מ) והוא יכול להיות מוטבע. חזרו עם החצי הנותר של העור הקודם, או שמרו את הרקמה לשימושים אחרים (לסירוגין, שמרו חצי לפני הקיבעון).
      הערה: חשוב לשמור על חלקי העור בכיוון הנכון.
    2. אוריינט the cryomold (25 x 20 x 5 מ"מ3) בכיוון לאורך ובמקום 4 כדי 5 פיסות עור על גבי OCT. פעם כל החלקים נמצאים במקום, להשתמש 2 זוגות של מלקחיים עדינים כדי להביא את הקצה הארוך של העור אל החלק התחתון של cryomold. העור צריך עכשיו לעמוד ב-OCT בניצב לבסיס העובש. דאג למזער את היווצרות כיסי האוויר בתוך ה-OCT במהלך שלב זה (איור 1).
    3. ממלאים את העובש עם OCT אל השפה השנייה, ומניחים על המשטח השטוח של הקרח היבש. מלקחיים להשתמש כדי להתאים את כל חלקי העור שייתכן שזזו במהלך ההעברה כמו הבלוק מתחיל להקפיא. לאחר השכבה התחתונה מתחזק, מניפולציה של רקמות יהיה בלתי אפשרי.
    4. גזור 8-10 יקרומטר שקופיות לניתוח.
  4. ביצוע Formalin קבוע פרפין מוטבע (FFPE) רקמה בלוקים
    1. מקום 2 חתיכות של עור קבוע לתוך קלטת בתווית ומייבשים בריכוזים הגוברת של אתנול (75% אתנול עבור 30 דקות, 85% עבור 30 דקות, 90% עבור 30 דקות, 95% עבור 30 דקות, 100% עבור 2x 30 דקות, מחליף את הפקודה קסילן או קסילן עבור 2x 30 דקות). דגירה עם פרפין ב 58-60 °, הראשון 30 דקות, ולאחר מכן לילה.
    2. להטביע את הרקמה 24 x 24 מ"מ2 כייר רקמת פלדת אל-חלד עם פרפין נוזלי ולגבש ב-5 ° c. התמצאות רקמות צריך להיות דומה לזה של גושי רקמה קפואים כך סעיפים האורך על פני זקיקי שיער מרובים יכולים להיות דמיינו (איור 1).
    3. לאחר הפרפין התחזק, להסיר את העובש לחתוך לתוך 5-10 יקרומטר סעיפים לניתוח.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מלנומה עורית חניכה הנגרמת על ידי שיער כימי

הליך ההסרת שיער כימי מתואר באיור 2. כאשר העכברים הם 7-שבועות לאחר הלידה, העור הטייתי שלהם הוא בטלגן. במהלך טלעוגן, תאי גזע שיער זקיק ו MCSCs ידועים להיות בשקט, מצב מנוחה. העור לא צריך להראות צמיחה משמעותית שיער לאחר גילוח. מצד שני, להסרת שיער כימי יכול לגרום זקיק השיער הפעלת תא גזע, אשר בתורו מראה צמיחת שיער משמעותי מאזור הריבית (איור 2). באופן דומה, הגידול נוטה MCSCs ביטוי מוטציות אונגניים גם צריך להיות פעיל עבור היווצרות גידול מואץ. להסרת שיער כימי יכול באופן משמעותי לגרום להפעלה של תא גזע השיער הן זקיק ו-MCSCs. מלנומה נוטה MCSCs במצב פעיל יכול ליצור גידולים, וחניכה מלנומה מיקרוסקופיים ניתן לצפות בתוך 2 שבועות לאחר להסרת שיער כימי באמצעות שושלת היוחסין מעקב אלל lsl-tdtomato (איור 3).

מלנומה עורית חניכה הנגרמת על ידי הקרנה UV-B

בדומה להסרת שיער כימי, UV-B יכול לגרום לחניכה הגידול מתוך השקט גידול מועדים MCSCs (איור 4). בעוד העור murine המכיל MCSCs מועדים לגידול במצב השקט מראה לא חניכה גידול משמעותי וחוסר פיגמנטציה משמעותית, העור השטרם נחשף UV-B (פעמיים, 180 mJ/cm2) מראה שחור פיגמנט גידולים מלנומה מוקדם אשר מובנת מאליה (איור 4A, B). בעוד UV-B יכול באופן משמעותי לגרום לחניכה מעין רור הגידול בתוך 2 שבועות, היישום של קרם הגנה יכול להגן על מלנומה UV-B-בתיווך בעור, בדומה בד עמיד uv (איור 4c, D).

חשוב מכך, UV-B משרה את הרוברטסונית ישירה של MCSCs מן הנישה שלהם תא גזע הזקיקים לאפידרמיס הבינפוליקולרית. יתר על כן, UV-B יכול לגרום MCSC-המקורי מלנומה עורית היווצרות לאורך האפידרמיס הבינפוליקולרית, ואת הפנוטיפים מיקרוסקופיים ניתן לצפות על ידי סמן מעקב השושלת, tdTomato (איור 5). כמו אלה תאים סרטניים הם ממאירים, הם גדלים במהירות ובצורה פולשנית (איור 5). בדומה העור הקודם, מלנומה UV-B המושרה חניכה יכול להיות בעיקר נצפתה באזורים אחרים בעור, כגון עור האוזן (איור 6). בהשוואה לעור השליטה מכוסה על ידי הבד עמידים UV, עור האוזן נחשף UV-B מדגים פיגמנטציה גבוהה יותר בשל נטל גבוה יותר של חניכה מלנומה (איור 6).

Figure 1
איור 1: בידוד רקמת העור והטבעת ההקפאה. לאחר המתת החסד, לגלח את אזור העור על גבי הגוף של עניין ולהטביע את העור בcryomold המכיל OCT. הקו המנוקד בעכבר מייצג את קו האמצע. בדרך כלל, 3 או 4 חתיכות עור ניתן לבודד עם פלח קו 3-4 לאורך קו האמצע; יצירה אחת כזו מצוינת על-ידי מלבן 1/2/3/4. אלה חתיכות עור צריך להיות מוטבע OCT כפי שמוצג בדמות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פנוטיפים מקרוסקופיים לאחר להסרת שיער כימית. (א) תרשים להסרת שיער כימית. (ב) לאחר הגילוח, מחזור השיער אושר להיות בטלעוגן. (ג) להסרת שיער כימי בוצע כדי להסיר את פירי השיער מן זקיקי השיער, אשר יכול להפעיל גם זקיק שיער ותאי גזע מלנוציט. (ד) בסביבות שבוע לאחר מכן, צמיחת שיער מוקדמת יהיה בקלות מורגש. (ה) אז, צמיחה שיער משמעותי ניתן לצפות לאורך זמן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: התבוננות מיקרוסקופית של חניכה מלנומה נשלטת על ידי להסרת שיער כימי. להסרת שיער כימית יכול לגרום באופן משמעותי את ההפעלה של MCSCs מועדת הגידול השקט. לאחר מכן, הגידול מיקרוסקופיים חניכה הפגינו על ידי סמן מעקב השושלת tdTomato ניתן לצפות בתוך 2 שבועות. איור זה מדגים את הפנוטיפים מיקרוסקופיים 16 ימים שלאחר 3 ימים טממוקסיפן על ידי הזרקת IP ואחריו להסרת שיער כימי באמצעות פריטים חזותיים שונים של אותו שדה של השקפה. (א) tdtomato+ תאים סרטניים שמקורם זקיק השיער התמזגה עם כתם גרעיני dapi הדלפק. (ב) זקיקי השיער והאפידרמיס הבינפוליקולרית מתוארים בלבן. (ג) סכמטי מראה כיצד tdtomato+ תאים סרטניים לפלוש לתוך הדרמיס מן זקיק השיער, שונה מן הירח, H. ואח '6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: מקרוסקופי פנוטיפ של מלנומה עורית הנגרמת על ידי הקרנה UV-B. העכברים טופלו על ידי טממוקסיפן במשך 3 ימים (יום 1 עד 3) ואחריו 2 חשיפות UV-B (יום 4 ו 6). (A) דיאגרמה של הקרנה UV-B על העור השחום המכיל מוטציה MCSCs. (ב) מאקרוסקופי פנוטיפ בין השליטה ו-UV-b חשוף העור. שחור משמעותי פיגמנטציה הקשורים היווצרות הגידול מלנוציטוטיק ניתן לצפות בתוך 2 שבועות לאחר ההקרנה UV-B השני. (ג) תרשים של יישום מסנן קרינה. (ד) בעוד UV-B יכול באופן משמעותי לגרום לחניכה הגידול מ מוטציה MCSCs, יישום של קרם הגנה הראה משמעותית דיכא UV-B בתיווך הגידול (16 ימים פוסט ההקרנה Uv-b השני). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: התבוננות מיקרוסקופית של מלנומה עורית הנגרמת על ידי UV. לעכברים טופלו טממוקסיפן על ידי הזרקת IP במשך 3 ימים (יום 1 עד 3) ואחריו 2 חשיפות UV-B (יום 4 ו -5). (א-ג) חניכה הגידול המוקדמים ברחבי האפידרמיס הבינפוליקולרית הפגינו על ידי מעקב השושלת tdTomato ניתן לראות ביום 17. (א) tdtomato + תאים סרטניים מוצגים הגירה זקיק השיער לתוך האפידרמיס הבינפוליקולרית. Dapi משמש ככתם גרעיני הדלפק. (ב) dapi מכתים מוסר קו מנוקד מציין מיקום של זקיקי השיער האפידרמיס הבינקולרית. (ג) סכמטי המציין tdTomato+ תא הגירה מן הנבט השיער כדי אפידרמיס הזקיקים הבאים חשיפה UV-B. השתנה מירח ואח '6. (D-F) אז, תאים סרטניים לצמוח במהירות ולפלוש רקמות עורי למטה (יום 25). (ד) tdtomato+ תאים סרטניים המשיכו להתרבות ולפלוש לתוך רקמות העורי. Dapi משמש ככתם גרעיני הדלפק. (E) dapi מכתים מוסר קו מנוקד מציין את המיקום של זקיקי השיער האפידרמיס הבינקולרית. (ו) סכמטי המציין tdtomato+ תא הפלישה לתוך הגידול דרמיס ומלנוציטוטיק הצמיחה. השתנה מירח ואח '6. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: מקרוסקופי והתבוננות מיקרוסקופית של מלנומה UV-B-המושרה בעור האוזן. (א) הערכה ניסויית. העכברים טופלו על ידי טממוקסיפן במשך 3 ימים (יום 1 עד 3) ואחריו 3 חשיפות להקרנה UV-B (יום 4, 6 ו-8). (ב) גדל באופן משמעותי בחניכה מלנומה על ידי UV-B הקרנה נצפתה מאקרופי, כמו גם מיקרוסקוזה ביום 28. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההיכר שינויים גנטיים לעתים קרובות למצוא גידולים מלנומה עורית כבר תיאר היטב13. המוטציה הדומיננטית ביותר הנהג הוא BrafV600E, ומודל מהונדסים גנטית העכבר עבור brafV600E-תיווך מלנומה נוצר על ידי קבוצת Bosenberg14 והופקד במעבדה ג'קסון. באמצעות מודל זה של העכבר, המחקר האחרון שלנו הפגינו את הדרישה של הפעלה תאית של MCSCs מועדת הגידול עבור חניכה משמעותית של BrafV600E-תיווך מלנומה בעור הרכה6.

להסרת שיער ידוע להיות שיטה יעילה כדי לגרום לשיער מורין זקיק הפעלה של תא גזע על העור על גבי6,10. Murine MCSCs ממוקמים בתוך זקיקי השיער, ויתר על כן, הסטטוס הסלולר של MCSCs פוליקולרית מסונכרן עם המצב של תאי גזע שיער זקיק8. אפנון מלאכותי של תאים גזע זקיק השיער יכול לשנות את מצב MCSC, ובכך להסרת שיער יכול ישירות להפעיל הן מלנוציט ו זקיק השיער בתאי גזע. שיטת הפעלה זו עבור MCSCs יכול להיות מיושם עבור הגידול מועדת MCSCs כדי לבחון את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה עורית במודלים מהונדסים גנטית עכבר של מלנומה. באמצעות שיטת להסרת שיער כימית, היווצרות מלנומה באזור העניין של עור מורנה מורין ניתן ליזום ישירות. להסרת שיער ניתן לבצע על ידי שיטות שונות כגון שעווה או מריטה, שניהם סוגים של הסרת השיער המכני שבו פירים השיער מופק זקיק השיער. עם זאת, שיטות להסרת שיער מכניות אלה יכולות להיות מדויקות ביחס לאזור מסוים של עניין. מצד שני, שיטת להסרת שיער כימית באמצעות קרם הסרת השיער הוא פשוט לבצע ומאפשר יישום מדויק עם הפעלה אמינה של מחזור השיער, והוא עשוי להיות נוקשה פחות על העור מאשר הסרה מכנית.

בין גורמי סיכון שונים, UV-B הוא גורם הסיכון הידוע ביותר של מלנומה עורית15. UV-B הקרנה ידוע לגרום הגירה ישירה של MCSCs הזקיקים לתוך אפידרמיס הזקיקים9. יתר על כן, UV-B הוא גורם מלחיץ סביבתי חזק אשר יכול באופן משמעותי לגרום לחניכה מלנומה מן הגידול נוטה MCSCs6. בפרוטוקול הניסיוני המתואר לעיל, אזור קטן של עניין על העור מורנה מורנה ניתן לחשוף לאור UV-B בעוד השימוש במטלית עמידות UV בקלות מגן על שאר העכבר מפני חשיפה לא רצויה. טיפול זה יכול להתבצע כאשר העכבר נמצא תחת הרדמה. חשוב מכך, הגירה של MCSCs והיווצרות של מלנומה MCSC מקורית לאחר חשיפה UV-B הם מינון UV-B התלויים6. לכן, כדי לקבל תוצאות מוצלחות, חשוב לבדוק בקביעות את עוצמת הנורה תוך שימוש במטר UV-B ולהתאים את זמן החשיפה ואת המרחק בין העור ונורות האור לפי הצורך. כפי שידוע בדרך כלל, העור יכול לצרוב בתגובה למינון גבוה של אור UV-B, אבל חשיפה UV-B חלש הוא גם מזיק לניסוי כפי שהוא יהיה מספיק כדי לגרום מלנומה מקורית MCSC.

הפרוטוקול המתואר כאן מתמקד בעיקר בגורם הסיכון הסביבתי, UV-B, בעור הראש. עם זאת, הפרוטוקול הנסיוני לעיל יכול להיות מיושם על מטרות שונות. למשל, הפרוטוקול ניתן לשנות עם נורות אור של נסרה שונות כדי לקבוע את ההשפעה של מקורות אור חלופיים או אורכי גל של UV, כגון UV-A. פרוטוקול זה מכוון בעיקר את העור הקודם כפי שהוא נגיש והסטטוס של MCSCs מוגדר היטב. עם זאת, זה יכול להיות גם שונה כדי למקד את חשיפת אור UV כדי תוספות כגון האוזן, זנב או עור דקל, כולל רפידות רגל. כדוגמה, באיור 6, ניתן לבחון את ההבדל האפשרי במערך הגידול המוקדם של מלנומה באתרי רקמות חלופיים. עם זאת, בניגוד לעור הראש, מעמדם של MCSCs באתרים אלה פחות מוגדרים היטב; מכאן, ההפעלה הספונטנית הפוטנציאלית של MCSCs המוביל למופעים אקראיים של היווצרות מלנומה צריך להיחשב. לכן, בהשוואה לפרוטוקול שבמעטפת העור, הגישות החלופיות ידרשו מספר מוגבר של ניסיונות להשגת תוצאות נסיוניות מדויקות.

יתר על כן, בעוד הפרוטוקול הנוכחי ממחיש בעיקר BrafV600E-בתיווך מלנומה חניכה, המחקר הקודם שלנו דיווחו גם דומה מלנומה מוקדם היווצרות עם שילוב Ras/pten אונגניים, באמצעות LSL-קראסG12D גנטית אלל6. עם זאת, מוטציות אחרות הנהג כגון גנים מוטציה Nras יכול להיחשב גם עם המערכת הניסיונית המתוארת כאן כדי להבין מלנומה חניכה מוקדמת מונע על ידי שילובים אחרים אונגניים.

נלקח יחד, תיאר כאן הוא מערכת מודל vivo אשר מאפשר בדיקה של הקודם מלנומה עורית חניכה בעכברים מהונדסים גנטית. אלה מודלים murine לספק את השיטות לשליטה בזמן ובמרחב של חניכה מלנומה מוטציה MCSCs בעור. פרוטוקולים אלה מספקים פרדיגמה הרומן כדי ללמוד את המנגנונים של חניכה מלנומה מוקדם מMCSCs הנוטה לגידול, כמו גם פלטפורמה כדי לקבוע את מנגנוני הפיסיולוגיים וסביבתיים שיכולים לתרום לחניכה מלנומה. רמה זו של שליטה זמן יכול גם לספק כלי מדויק יותר אינדוקציה מלנומה כדי לבדוק את יעילות הסמים במניעת היווצרות מלנומה, כמו גם גידול בגידולים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לא מצהירים. על ניגוד אינטרסים

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי Office של עוזר מזכיר ההגנה לענייני בריאות, באמצעות התוכנית לחקר הסרטן שנסקרו עמית תחת הפרס W81XWH-16-1-0272. דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן אלה של המחברים ואינן בהכרח מיוחסות על-ידי משרד ההגנה. עבודה זו הייתה נתמכת גם על ידי מענק זרע מהתוכנית הגזע קורנל לייט. H. Moon נתמך על ידי מרכז קורנל על תוכנית המלומדים בעלי חוליות גנומיקה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tamoxifen Sigma T5648-1G For systemic injection
Tamoxifen Cayman Chemical 13258 For systemic injection
Corn oil Sigma 45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen Sigma H7904-25MG For topical treatment
26 G 1/2" needles various Veterinary grade
1 mL syringe various Veterinary grade
Pet hair trimmer Wahl 09990-502
Hair removal cream Nair n/a Available at most drug stores
Cotton swabs various
Ultraviolet light bulb UVP 95-0042-08 model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol various pure ethanol
Histoplast PE Fisher Scientific 22900700 paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10% Sigma HT501128-4L
Clear-Rite 3 Thermo Scientific 6901 xylene substitute
O.C.T. Compound Thermo 23730571
Tissue Cassette Sakura 89199-430 for FFPE processing
Cryomolds Sakura 4557 25 x 20 mm
FFPE metal mold Leica 3803082 24 mm x 24 mm
Isoflurane various Veterinary grade
Anesthesia inhalation system various Veterinary grade
Fine scissor FST 14085-09 Straight, sharp/sharp
Fine scissor FST 14558-09 Straight, sharp/sharp
Metzenbaum FST 14018-13 Straight, blunt/blunt
Forcep FST 11252-00 Dumont #5
Forcep FST 11018-12 Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f Jackson Labs 13590
LSL-tdTomato Jackson Labs 007914 ai14
Cre-1 n/a GCATTACCGGTCGATGCAACGA
GTGATGAG
Cre-2 n/a GAGTGAACGAACCTGGTCGAA
ATCAGTGCG
Braf-V600E-1 n/a TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2 n/a CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1 n/a AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT
AAGTCTGCA
Kras-G12D-2 n/a CCTTTACAAGCGCACGCAGACT
GTAGA
Pten-1 n/a ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2 n/a AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3 n/a GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1 n/a AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2 n/a CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3 n/a GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4 n/a CTGTTCCTGTACGGCATGG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
  2. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).
  3. White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
  4. Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
  5. Blanpain, C. Tracing the cellular origin of cancer. Nature Cell Biology. 15 (2), 126-134 (2013).
  6. Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
  7. Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
  8. Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
  9. Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
  10. Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
  11. Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
  12. Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
  13. Vultur, A., Herlyn, M. SnapShot: melanoma. Cancer Cell. 23 (5), 706-706.e1 (2013).
  14. Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
  15. Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).

Tags

סרטן מחקר סוגיה 148 מלנומה עורית סרטן עור תאי גזע מלנוציט תאי גזע שיער זקיק להסרת סגול-B
שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moon, H., Donahue, L. R., Kim, D.,… More

Moon, H., Donahue, L. R., Kim, D., An, L., White, A. C. Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells. J. Vis. Exp. (148), e59666, doi:10.3791/59666 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter