Summary
O procedimento a seguir descreve um método para o controle espacial e temporal da iniciação do tumor melanocítico na pele dorsal murina, utilizando um modelo de camundongo geneticamente projetado. Este protocolo descreve macroscópica assim como a iniciação Cutaneous microscópica da melanoma.
Abstract
O melanoma cutâneo é bem conhecido como o câncer de pele mais agressivo. Embora os factores de risco e as alterações genéticas principais continuem a ser documentados com profundidade crescente, a taxa de incidência do melanoma Cutaneous mostrou um aumento rápido e contínuo durante décadas recentes. A fim encontrar métodos preventivos eficazes, é importante compreender as etapas adiantadas da iniciação da melanoma na pele. Os dados precedentes demonstraram que as pilhas de haste foliculares do melanócito (mcscs) nos tecidos adultos da pele podem actuar como pilhas da melanoma da origem ao expressar mutações oncogênico e alterações genéticas. O tumorigenesis que levanta-se de MCSCs melanoma-prone pode ser induzido quando MCSCs transição de um quiescente ao estado ativo. Essa transição em MCSCs propenso a melanoma pode ser promovida pela modulação do estado de atividade das células-tronco do folículo piloso ou por meio de fatores ambientais extríncicos, como ultravioleta-B (UV-B). Estes fatores podem ser manipulados artificialmente no laboratório pela depilação química, que causa a transição de pilhas de haste do folículo de cabelo e de mcscs de um quiescente ao estado ativo, e pela exposição de UV-B usando uma luz do de bancada. Estes métodos fornecem o controle espacial e temporal bem sucedido da iniciação Cutaneous da melanoma na pele dorsal murino. Conseqüentemente, estes sistemas in vivo do modelo serão valiosos para definir as etapas adiantadas da iniciação cutaneous do melanoma e poderiam ser usados para testar métodos potenciais para a prevenção do tumor.
Introduction
O melanoma, a forma maligna dos tumores melanocíticos, é o câncer mais agressivo na pele com melanoma cutâneo responsável pela maioria das mortes por câncer de pele1. Nos Estados Unidos, o melanoma é comumente diagnosticado; prevê-se que seja o 5º a 6º tipo de cancro mais comum entre os novos casos de cancro estimados em 20182. Além disso, embora as incidências globais de câncer tenham demonstrado a tendência de redução gradual nas últimas décadas, as taxas de incidência de melanoma cutâneo nas últimas décadas demonstram um aumento contínuo e rápido em ambos os sexos2.
Para combater o melanoma cutâneo de forma mais eficiente, é importante entender claramente os primeiros acontecimentos do desenvolvimento de melanoma de suas células de origem para melhor identificar métodos preventivos clinicamente efetivos. É sabido agora que as pilhas de haste adultas podem significativamente contribuir à formação do tumor como as origens celulares dos cancros em muitos tipos diferentes de órgãos que incluem os tecidos da pele3,4,5. Similarmente, as pilhas de haste adultas do melanócito (mcscs) na pele dorsal murino podem trabalhar como pilhas da melanoma da origem em cima da ativação aberrante das vias Ras/Raf e de Akt 6. Entretanto, estas mutações oncogênico sozinho não são capazes de induzir eficientemente a formação do tumor dos mcscs quiescentes. os tumores melanocíticos eventualmente desenvolvem-se quando mcscs se torna ativo durante a ciclagem natural do cabelo. No entanto, neste protocolo, descreveremos métodos para induzir artificialmente a ativação celular de mcscs propenso a tumores, facilitando assim o controle preciso do início do melanoma6,7.
Através dos métodos descritos aqui, o controle espacial e temporal da iniciação cutânea do melanoma de mcscs tumor-propenso expressando BRAFV600E oncogênico junto com a perda de expressão de PTEN pode com sucesso ser executado, porque nós relataram anteriormente6. Este método incorpora os resultados precedentes que demonstram a ativação da pilha de haste do folículo de cabelo com a depilação assim como como a exposição da pele murino a UV-B pode facilitar a ativação do residente de mcscs ao folículo de cabelo e ao translocação deste celular subpopulação à epiderme interfolicular6,8,9,10. Estes sistemas in vivo do modelo podem fornecer a informação valiosa a respeito de como as mudanças fisiológicas e ambientais podem alterar o status celular de MCSCs melanoma-prone, que por sua vez podem induzir a iniciação significativa do melanoma na pele.
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Protocol
Todos os procedimentos animais são realizados de acordo com o Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Cornell (IACUC).
1. preparação
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Colete clipes de cauda de 12 dias de camundongos pós-natal e digerir em 400 μL de 0, 5 N NaOH a 95 ° c por 1 h. Vortex e adicionar 32 μL de 1 M de Tris-HCl, pH 7. Camundongos genótipos de acordo com protocolos de PCR fornecidos pelo laboratório Jackson e identificam camundongos com genótipo de interesse6.
- Tyr-CreER -hemizygous (+/creer)
- LSL-BRAFV600E – heterozygous (+/LSL-v600e)
- PTEN – Flox homozygous (Flox/Flox)
- LSL-tdtomato – hemizygous (+/LSL-tdtomato)
Nota: As sequências de primer são fornecidas na tabela de materiais. - Use uma tosquiadeira de cabelo (ajustador elétrico) para raspar a pele dorsal 2 a 3 dias antes de todas as experiências descritas abaixo, e quando os ratos são aproximadamente 7 semanas da idade. Tome cuidado para não danificar a pele fina do mouse usando o aparador elétrico como qualquer lesão pode provocar uma resposta de cicatrização de feridas que ativará as células-tronco do folículo piloso, incluindo MCSCs.
- Determine se o ciclo capilar está em telógeno e se a pele está ferida durante o período de espera. Se a pele mostra algum sinal de ferimento, o rato não deve ser usado para estes procedimentos.
Nota: Embora o ciclo do cabelo possa diferir ligeiramente entre origens genéticas, nesta idade o ciclo do cabelo na pele dorsal é geralmente no estado do telógena11. O transgene de Tyr-creer visará mcscs na pele do telógena, e as alterações genéticas subseqüentes serão expressas permanentemente em todas as linhagens do MCSC, incluindo melanócitos diferenciados e tumores melanocíticos.
2. tratamento de tamoxifen para recombination genético CRE-LOX
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Preparação de tamoxifeno para injeção intraperitoneal (IP) ou administração tópica para Recombinação genética sistêmica ou localizada
Nota: Em ordem para tamoxifeno para induzir recombinação, ele deve primeiro ser metabolizado pelo fígado para 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT), que pode ligar e ativar o creer. A aplicação tópica de tamoxifeno não será metabolizada desta forma e 4-OHT deve ser usado diretamente. Somente um método de tamoxifeno a entrega é exigido para o suficiente recombination.- Tamoxifeno: Prepare tamoxifeno em uma concentração de 10 mg mL-1 dissolvido em óleo de milho. Para ajudar na dissolução da droga em solução, adicionar até 10% volume total de 100% etanol de grau molecular para a droga em forma de pó, vortex por 3 min e, em seguida, adicione o volume remanescente de óleo de milho. Continue a vórtice até que o material cristalino não seja mais aparente na solução. A solução de tamoxifen pode ser esterilizada passando através de um filtro de 0,2 μm. Prossiga para o passo 2.2.1 para o tratamento.
- 4-OHT: Prepare uma solução de estoque de hidroxitamoxifeno até 3 mg mL-1 em 100% de etanol. Em seguida, uma solução de trabalho pode ser aplicada tanto quanto necessário para cobrir a área da pele de interesse (geralmente uma única aplicação).
Nota: Uma solução de estoque de hidroxitamoxifeno pode ser dissolvida em etanol a 100% para uma concentração final de 5 mM. Em seguida, para preparar uma solução de trabalho, 5 μL de solução de estoque de 4OH-tamoxifen podem ser diluídos em 15 μL de etanol a 100%. Para 4 mm2 área, 1 a 3 μL de solução de trabalho pode ser aplicada topicamente.
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Tratamento de camundongos com tamoxifeno, seja sistemicamente ou topicamente
- Para tratamento sistémico, administrar 2 mg de tamoxifeno via injeção de IP uma vez por dia durante 3 dias utilizando uma agulha de 26 G.
Nota: Usando este modelo, aproximadamente 93% ± 4% de MCSCs quiescente são etiquetados com tdTomato6. - Para a ativação regional, realize um tratamento tópico com 4 OHT. Cubra a área da pele de interesse com a solução de trabalho. A quantidade de solução de trabalho pode ser determinada pelo tamanho da região de interesse, conforme descrito na etapa 2.1.2.
- Para tratamento sistémico, administrar 2 mg de tamoxifeno via injeção de IP uma vez por dia durante 3 dias utilizando uma agulha de 26 G.
- Em 48 h depois da última dose de tamoxifeno, avance para o passo 3 para a depilação química induzida por iniciação tumoral ou para a etapa 4 para a iniciação do tumor induzido por UV-B
3. depilação química
- Equipar uma sala de tratamento do rato contendo um sistema de isoflurano com os seguintes materiais necessários: creme de depilação, cotonetes, pano de papel e água.
- Coloque o rato na câmara de indução e anestesiar com 3,5 a 4,5% de isoflurano e 1 L/min de oxigénio.
- Uma vez que a taxa respiratória estabilizou, confirme que o rato está no plano apropriado da anestesia realizando uma pitada do dedo do pé e transfira o rato ao tubo principal que mantém a anestesia com 1 a 1,5% isoflurano e 1 L/oxigênio mínimo. Aplique a pomada do olho para manter os olhos da secagem quando a anestesia.
- Use um cotonete de algodão para aplicar uma fina camada de creme de depilação para a região raspada da pele do mouse.
- Uma vez que o creme foi aplicado uniformemente, use cotonetes limpos do algodão para começar a remoção. O tempo total que o creme está em contacto com a pele não deve exceder 1 min.
- Limpe delicadamente a pele com um pano de papel úmido e assegure-se de que todo o creme residual esteja removido.
Nota: O creme da remoção do cabelo pode causar a irritação à pele se não é removido completamente. Alguns camundongos, como aqueles em um fundo C57BL/6, podem ser propensos a desenvolver dermatite12. Embora rara, alguns animais desenvolverão a dermatite dentro de 24 h após a aplicação do creme da remoção do cabelo ou a depilação mecânica. Certifique-se de verificar os ratos no dia após o tratamento para procurar quaisquer sinais de irritação cutânea regional. - Descarte os eixos de cabelo removidos e quaisquer materiais usados em um escaninho de risco biológico.
- Coloque o mouse em uma gaiola de rato vazia e limpa até que a anestesia tenha desgastado.
- Devolva os ratos para suas gaiolas.
4. irradiação UV-B
- Equipar uma sala de tratamento de mouse contendo um sistema de isoflurano com os seguintes materiais necessários: sistema de luz UV-B, medidor de luz UV-B, cobertura protetora para o mouse, EPI de proteção UV-B adicional para pesquisador e temporizador.
- Os camundongos devem ser irradiados na dose de interesse UV-B (i.e., 0-180 mJ/cm2). Use o medidor de luz UV-B para determinar o período de tempo apropriado para irradiar os camundongos.
Nota: mW/cm2 x tempo = dose - Anestesie o rato com isoflurano. Enquanto na câmara de indução, use 3,5 a 4,5% isoflurano e 1 L/min de oxigênio.
- Uma vez que o rato é estabilizado, confirme efeitos da anestesia com uma pitada do dedo do pé e transfira o rato ao tubo principal da anestesia situado na câmara UV. Aplique a pomada do olho para impedir os olhos da secagem quando a anestesia. Manter a anestesia com 1 a 1,5% de isoflurano e 1 L/min de oxigénio.
- Cubra a pele dorsal com material protetor UV-B para que apenas a região desejada será exposta.
Nota: Neste momento, devem ser utilizados EPI apropriados. O tempo necessário para irradiar o mouse depende da intensidade da lâmpada usada, mas a anestesia pode precisar ser monitorada se o tempo necessário exceder 30 s. - Cubra a câmara UV usando a tampa UV-resistente ou todos os outros materiais apropriados.
- Ligar a lâmpada UV-B e irradiar o mouse para o tempo determinado pelos pesquisadores para o objetivo específico.
- Desligue o sistema UV e isoflurano, em seguida, coloque o mouse para uma gaiola de rato vazio até que a anestesia tenha desgastado.
- Devolva os ratos para suas gaiolas.
5. processamento de tecidos
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Isolamento da pele
- Obter o seguinte antes de começar: instrumentos de necropsia, papel de filtro e toalhas de papel.
- Eutanizar os camundongos de acordo com IACUC protocolos aprovados, e confirmar a morte antes de prosseguir.
- Usando uma tosquiadeira de cabelo, raspar todo o cabelo da área dorsal da pele. Escove levemente a área com um tecido sem fiapos para limpar a área.
- Faça uma pequena incisão com tesouras afiadas logo acima da base da cauda.
- Insira grandes tesouras sem corte na incisão e separe os tecidos conectivos subdérmicos.
- Cuidadosamente isolar a região da pele de interesse por corte com tesouras afiadas ao longo da borda do tecido.
- Coloc o tecido da pele em uma toalha de papel limpa e use o fórceps maçante para esticar a pele de modo que adere à toalha e seja ensinado. Esta etapa serve para fornecer o apoio adicional para o tecido de modo que possa ser manipulado e processado ao manter sua forma.
Nota: Tenha cuidado para lidar apenas com as regiões externas do tecido da pele, como o fórceps pode causar danos à pele que pode ser visto histologicamente.
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Fixação do tecido
- Dobre um pedaço de papel de filtro ao meio e rotule apropriadamente. Coloc a pele junto com o revestimento protetor de papel da toalha no papel dobrado imediatamente adjacente ao vinco, assegurando-se de que a amostra seja Lisa e não dobrada ou amassado. Sele o papel de filtro grampeando os lados abertos, e então apare de modo que o papel restante possa ser usado para amostras futuras.
Nota: Esta etapa é executada de modo que a pele conserve sua forma durante a fixação. - Submergir inteiramente a amostra do tecido no formalina tamponado neutro de 10% para 3 a 5 h na temperatura ambiente ou durante a noite em 4 ° c.
- Após a fixação, retire as amostras de formalina, lave em água deionizada (2x, 5 min cada) e proceder para fazer blocos de tecido. Retire cuidadosamente qualquer material residual do tecido da pele (ou seja, papel residual).
- Dobre um pedaço de papel de filtro ao meio e rotule apropriadamente. Coloc a pele junto com o revestimento protetor de papel da toalha no papel dobrado imediatamente adjacente ao vinco, assegurando-se de que a amostra seja Lisa e não dobrada ou amassado. Sele o papel de filtro grampeando os lados abertos, e então apare de modo que o papel restante possa ser usado para amostras futuras.
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Fazer blocos de tecido congelado (Figura 1)
- Aparar as bordas da amostra de pele para que eles não são irregulares e, em seguida, fazer 3 cortes sagital. A largura destas tiras não deve ser mais do que a altura do cryomold (5 milímetros). Em seguida, faça cortes transversais para ter pedaços de pele que não são mais longos do que a largura do crio-mofo (20 mm) e pode ser incorporado. Repita com a metade restante da pele dorsal, ou excepto o tecido para outros usos (alternadamente, excepto a metade antes da fixação).
Nota: É importante manter as peças da pele na orientação adequada. - Oriente a crimolina (25 x 20 x 5 mm3) em uma orientação Retrato e coloque 4 a 5 pedaços de pele em cima da OCT. Uma vez que todas as peças estão no lugar, use 2 pares de fórceps fino para trazer a borda longa da pele para a parte inferior do cryomold. A pele deve agora estar em pé na OCT perpendicular à base do molde. Tome cuidado para minimizar a formação de bolsas de ar dentro da OCT durante esta etapa (Figura 1).
- Encha o molde com OCT para o segundo lábio, e coloque na superfície plana de gelo seco. Use fórceps para ajustar todas as partes da pele que podem ter deslocado durante a transferência como o bloco começa a congelar. Uma vez que a camada inferior é solidificada, a manipulação dos tecidos será impossível.
- Corte 8-10 μm slides para análise.
- Aparar as bordas da amostra de pele para que eles não são irregulares e, em seguida, fazer 3 cortes sagital. A largura destas tiras não deve ser mais do que a altura do cryomold (5 milímetros). Em seguida, faça cortes transversais para ter pedaços de pele que não são mais longos do que a largura do crio-mofo (20 mm) e pode ser incorporado. Repita com a metade restante da pele dorsal, ou excepto o tecido para outros usos (alternadamente, excepto a metade antes da fixação).
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Fazendo formalin fixo parafina incorporado (FFPE) blocos de tecido
- Coloque 2 pedaços de pele fixa em uma gaveta rotulada e desidrata-se em concentrações crescentes de etanol (75% etanol por 30 min, 85% por 30 min, 90% por 30 min, 95% por 30 min, 100% para 2x 30 min, xileno ou xileno substituto para 2x 30 min). Incubar com parafina a 58-60 °, primeiro por 30 min, e depois durante a noite.
- Incorpore o tecido em um molde do tecido do aço inoxidável de 24 x 24 milímetros2 com parafina líquida e solidificar em-5 ° c. A orientação tecidual deve ser semelhante à dos blocos de tecido congelado para que as secções longitudinais em vários folículos pilosos possam ser visualizadas (Figura 1).
- Uma vez que a parafina solidified, retire o molde e corte em seções de 5-10 μm para a análise.
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Representative Results
Iniciação cutânea por melanoma induzida por depilação química
O procedimento de depilação química é representado na Figura 2. Quando os camundongos são 7 semanas pós-natal, sua pele dorsal está em telógeno. Durante o telogen, as pilhas de haste do folículo de cabelo e os MCSCs são sabidos para estar em um estado quiescente, descansando. A pele não deve mostrar nenhum crescimento significativo do cabelo após o barbear. Por outro lado, a depilação química pode induzir a ativação da célula-tronco do folículo piloso, que por sua vez mostra crescimento significativo do cabelo da região de interesse (Figura 2). Similarmente, os mcscs tumor-prone que expressam mutações oncogênico igualmente precisam de ser ativos para a formação acelerada do tumor. A depilação química pode induzir significativamente a ativação de ambas as células-tronco do folículo piloso e MCSCs. MCSCs melanoma-prone em um estado ativo pode formar tumores, e a iniciação microscópica da melanoma pode ser observada dentro de 2 semanas após a depilação química usando o linhagem traçando alelo LSL-tdTomato (Figura 3).
Iniciação cutânea por melanoma induzida por irradiação UV-B
Semelhante à depilação química, o UV-B pode induzir a iniciação tumoral de MCSCs propenso a tumores quiescentes (Figura 4). Quando a pele murino que contem mcscs tumor-propensas em um estado quiescente não mostra nenhuma iniciação significativa do tumor e falta da pigmentação significativa, a pele dorsal expor a UV-B (duas vezes, 180 MJ/cm2) mostra os tumores melanocíticos adiantados pigmentados pretos que são macroscopicamente evidentes (figura 4a, B). Enquanto UV-B pode induzir significativamente a iniciação macroscópica evidente do tumor dentro de 2 semanas, a aplicação de protetor solar pode proteger a iniciação de melanoma UV-B-mediada na pele, semelhante a um pano resistente a UV (Figura 4C, D).
Importante, UV-B induz o translocação direto de mcscs de seu Niche folicular da pilha de haste à epiderme interfollicular. Além disso, o UV-B pode induzir a formação de melanoma cutâneo originado por MCSC em toda a epiderme interfolicular, e o fenótipo microscópico pode ser observado pelo marcador de traçado da linhagem, tdTomato (Figura 5). Como essas células tumorais são malignas, elas crescem rapidamente e invasivamente (Figura 5). Semelhante à pele dorsal, o início da melanoma induzida por UV-B pode ser observado notavelmente em outras áreas da pele, como a pele da orelha (Figura 6). Comparado à pele de controle coberta por tecido resistente a UV, a pele da orelha exposta ao UV-B demonstra maior pigmentação devido a maior carga de iniciação ao melanoma (Figura 6).
Figura 1: isolamento do tecido cutâneo e crioincorporação. Após a eutanásia, depilar a região dorsal da pele do rato de interesse e incorporar a pele em crimolina contendo OCT. A linha pontilhada no mouse representa a linha média. Tipicamente, 3 ou 4 partes de pele podem ser isoladas com linha segmento 3-4 ao longo da linha média; uma dessas peças é indicada pelo retângulo 1/2/3/4. Estas peças de pele devem ser incorporadas na OCT, como mostrado na figura. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: fenótipos macroscópicos após depilação química. (A) diagrama de depilação química. (B) após a barba, o ciclo do cabelo foi confirmado para ser em telogen. (C) a depilação química foi realizada para remover os eixos capilares dos folículos pilosos, que podem ativar o folículo piloso e as células-tronco melanócitos. (D) cerca de uma semana depois, o crescimento precoce do cabelo será facilmente perceptível. (E) Então, o crescimento significativo do cabelo pode ser observado ao longo do tempo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: observação microscópica da iniciação do melanoma controlada por depilação química. A depilação química pode induzir significativamente a ativação de MCSCs propenso a tumores quiescentes. Então, a iniciação microscópica do tumor demonstrada pelo marcador de seguimento da linhagem tdTomato pode ser observada dentro de 2 semanas. Esta figura demonstra o phenotype microscópico 16 dias borne 3 dias tamoxifeno pela injeção do IP seguido pela depilação química usando visualizações diferentes do mesmo campo de visão. (A) tdtomato+ as pilhas do tumor que originam do folículo de cabelo fundiram com a mancha contrária nuclear de DAPI. (B) os folículos pilosos e a epiderme interfolicular são delineados em branco. (C) um esquema mostrando como tdTomato+ células tumorais invadem a derme do folículo piloso, modificada de Moon, H. et al.6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: fenótipo macroscópico de melanoma cutâneo induzido por irradiação UV-B. Os camundongos foram tratados por tamoxifeno por 3 dias (dia 1 a 3) seguidos de 2 exposições UV-B (dia 4 e 6). (A) diagrama da irradiação UV-b na pele dorsal contendo mutante mcscs. (b) fenótipo macroscópico entre controle e UV-b pele dorsal exposta. A pigmentação preta significativa relativa à formação melanocítica do tumor pode ser observada dentro de 2 semanas após a segunda irradiação de UV-B. (C) diagrama da aplicação de protector solar. (D) enquanto UV-b pode induzir significativamente a iniciação do tumor de mcscs mutante, a aplicação de protetor solar mostrou a iniciação tumoral UV-b-negociada significativamente suprimida (16 dias após a segunda irradiação UV-b). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: observação microscópica da melanoma cutâneo induzida por UV-B. Os camundongos foram tratados com tamoxifeno por injeção de IP por 3 dias (dia 1 a 3) seguidos de 2 exposições UV-B (dia 4 e 5). (A-C) A iniciação adiantada do tumor durante todo a epiderme interfollicular demonstrada pelo seguimento da linhagem tdTomato pode ser mostrada no dia 17. (A) as células tumorais de tdtomato + são mostradas migrando do folículo piloso para a epiderme interfolicular. DAPI é usado como uma mancha de contador nuclear. (B) a coloração DAPI é removida e a linha pontilhada indica a localização dos folículos pilosos e da epiderme interfolicular. (C) esquemático indicando tdTomato+ migração de células do germe capilar para a epiderme interfolicular após exposição ao UV-B. Modificado de Moon et al.6. (D-F) Em seguida, as células tumorais crescem rapidamente e invadem os tecidos dérmicos abaixo (dia 25). (D) tdtomato+ células tumorais continuaram a proliferar e invadir os tecidos dérmicos. DAPI é usado como uma mancha de contador nuclear. (E) a coloração DAPI é removida e a linha pontilhada indica a localização dos folículos pilosos e da epiderme interfolicular. (F) esquema indicando tdTomato+ invasão de células na derme e crescimento do tumor melanocítico. Modificado de Moon et al.6. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: observação macroscópica e microscópica da melanoma induzida por UV-B na pele da orelha. A) regime experimental. Os camundongos foram tratados por tamoxifeno por 3 dias (dia 1 a 3) seguidos de 3 exposições à irradiação UV-B (dia 4, 6 e 8). (B) aumento significativo da iniciação do melanoma por irradiação UV-B foi observado Macroscopicamente, bem como microscopicamente no dia 28. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
As alterações genéticas do Hallmark freqüentemente encontradas em tumores Cutaneous da melanoma foram descritas bem13. A mutação de condutor mais dominante é o BRAFV600E, e um modelo de rato geneticamente concebido para o melanoma mediado por BRAFV600Efoi gerado pelo grupo Bosenberg14 e depositado no laboratório Jackson. Usando este modelo do rato, nosso estudo recente demonstrou a exigência da ativação celular de MCSCs tumor-propenso para a iniciação significativa do melanoma V600E-negociado BRAFna pele dorsal6.
A depilação é conhecida por ser um método efetivo para induzir a ativação da célula-tronco do folículo piloso murino na pele dorsal6,10. Murine MCSCs está localizado dentro dos folículos pilosos, e, além disso, o estado celular de MCSCs folicular é sincronizado com o estado das células-tronco do folículo piloso8. A modulação artificial de células-tronco do folículo piloso pode alterar o status de MCSC, assim a depilação pode ativar diretamente as células-tronco de melanócitos e folículo piloso. Este método da ativação para MCSCs pode ser aplicado para MCSCs tumor-propenso para examinar etapas adiantadas da iniciação Cutaneous da melanoma em modelos genetically projetados do rato da melanoma. Através de um método de depilação química, a formação de melanoma na região de interesse na pele dorsal Murina pode ser iniciada diretamente. Depilação pode ser realizada por vários métodos, tais como depilação ou arrancamento, ambos os quais são os tipos de depilação mecânica, onde os eixos do cabelo são extraídos do folículo piloso. No entanto, esses métodos de depilação mecânica podem ser imprecisos em relação a uma região específica de interesse. Por outro lado, um método de depilação química usando creme de depilação é simples de executar e permite a aplicação precisa com a ativação confiável do ciclo do cabelo, e pode ser menos dura na pele do que a remoção mecânica.
Entre vários fatores de risco, o UV-B é o fator de risco mais conhecido na melanoma cutâneo15. A irradiação UV-B é sabida para induzir a migração direta de MCSCs foliculares na epiderme interfollicular9. Além disso, UV-B é um estressor ambiental forte que possa significativamente induzir a iniciação do melanoma do MCSCs tumor-propenso6. No protocolo experimental descrito acima, uma pequena região de interesse na pele dorsal Murina pode ser exposta à luz UV-B, enquanto o uso de um pano resistente a UV protege facilmente o resto do mouse da exposição indesejada. Este tratamento pode ser realizado enquanto o rato está anestesia. Importante, a migração de MCSCs e a formação de melanoma MCSC-originando que segue a exposição de UV-B são UV-B-dose dependente6. Conseqüentemente, para ter resultados bem sucedidos, é importante verific regularmente a intensidade da ampola usando um medidor de UV-B e ajustar o tempo e a distância da exposição entre a pele e os bulbos claros como necessário. Como é sabido geralmente, a pele pode queimar-se em resposta a uma dose elevada da luz de UV-B, mas a exposição fraca de UV-B é igualmente prejudicial ao experimento porque será insuficiente para induzir o melanoma MCSC-originando.
O protocolo aqui descrito concentra-se principalmente no fator de risco ambiental, UV-B, na pele dorsal. No entanto, o protocolo experimental acima pode ser aplicado a diferentes objetivos. Por exemplo, o protocolo pode ser modificado com lâmpadas de diferentes espectros para determinar o efeito de fontes de luz alternativas ou comprimentos de onda de UV, como UV-A. Este protocolo alvejou primeiramente a pele dorsal porque é acessível e o status de MCSCs é bem definido. No entanto, ele também pode ser alterado para direcionar a exposição à luz UV para apêndices, como a orelha, cauda ou pele de palma, incluindo almofadas de pé. Como exemplo, na Figura 6, é possível examinar a possível diferença na formação de tumores melanocíticos precoces em sítios de tecidos alternativos. Entretanto, ao contrário da pele dorsal, o status de MCSCs nestes locais é menos bem definido; daqui, a ativação espontânea potencial de MCSCs que conduz às ocorrências aleatórias da formação do melanoma deve ser considerada. Portanto, em comparação com o protocolo na pele dorsal, abordagens alternativas exigirá um aumento do número de experimentos para obter resultados experimentais precisos.
Além disso, embora o protocolo atual demonstre principalmente o início do melanoma mediado por BRAFV600E, nosso estudo anterior também relatou formação de melanoma precoce semelhante com uma combinação oncogênica de RAS/PTEN , usando o LSL-KrasG12D alelo genético6. Entretanto, outras mutações do excitador tais como genes do nras do mutante podem igualmente ser consideradas com o sistema experimental descrito aqui para compreender a iniciação adiantada da melanoma conduzida por outras combinações oncogênico.
Tomados em conjunto, descrito aqui é um sistema in vivo modelo que permite o exame da iniciação cutânea precoce de melanoma em camundongos geneticamente modificados. Estes modelos murino fornecem os métodos para o controle temporal e espacial da iniciação do melanoma do mutante mcscs na pele. Estes protocolos fornecem um paradigma novo para estudar os mecanismos da iniciação adiantada do melanoma dos MCSCs tumor-propensas assim como uma plataforma para determinar os estressores fisiológicos e ambientais que podem contribuir à iniciação do melanoma. Este nível de controle armazenamento pode igualmente fornecer uma ferramenta para a indução mais precisa da melanoma para testar a eficácia da droga em impedir a formação do melanoma, assim como o crescimento do tumor.
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Disclosures
Os autores não declaram conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo gabinete do secretário adjunto de defesa para os assuntos da saúde, através do programa de pesquisa de câncer de peer revisado o prêmio W81XWH-16-1-0272. As opiniões, interpretações, conclusões e recomendações são as dos autores e não são necessariamente endossadas pelo departamento de defesa. Este trabalho também foi apoiado por uma concessão de sementes do programa de células-tronco de Cornell para A.C. White. H. Moon foi apoiado pelo Cornell Center for vertebrate Genomics Scholar Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
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