Summary
Følgende procedure beskriver en metode til rumlig og tidsmæssig kontrol af melanocytisk tumor initiering i murine rygskind, ved hjælp af en gensplejset musemodel. I denne protokol beskrives makroskopisk og mikroskopisk kutan melanom-initiering.
Abstract
Kutan melanom er velkendt som den mest aggressive hudkræft. Selv om risikofaktorerne og de store genetiske ændringer fortsat er dokumenteret med stigende dybde, har hyppigheden af kutane melanom vist en hurtig og kontinuerlig stigning i de seneste årtier. For at finde effektive forebyggende metoder, er det vigtigt at forstå de tidlige trin af melanom initiering i huden. Tidligere data har vist, at follikulære melanocytiske stamceller (MCSCs) i voksne hudvæv kan fungere som melanomer celler i oprindelse, når de udtrykker onkogene mutationer og genetiske ændringer. Tumorigenesis som følge af melanom-tilbøjelige MCSCs kan induceres, når MCSCs overgang fra en opstigning til aktiv tilstand. Denne overgang i melanom-tilbøjelige MCSCs kan fremmes ved modulation af enten hårfollikel stamceller ' aktivitet tilstand eller gennem ydre miljøfaktorer såsom ultraviolet-B (UV-B). Disse faktorer kan kunstigt manipuleres i laboratoriet ved kemisk Depilation, som forårsager overgang af hårfollikel stamceller og MCSC'er fra en op til aktiv tilstand, og ved UV-B eksponering ved hjælp af et stationære lys. Disse metoder giver en vellykket rumlig og tidsmæssig kontrol af kutan melanom initiering i murine dorsale hud. Derfor vil disse in vivo modelsystemer være værdifulde til at definere de tidlige trin af kutan melanom initiering og kan bruges til at teste potentielle metoder til tumor forebyggelse.
Introduction
Melanom, den maligne form af melanocytiske tumorer, er den mest aggressive kræft i huden med kutane melanom ansvarlig for de fleste af hudkræft dødsfald1. I USA, melanom er almindeligt diagnosticeret; Det forventes at være den 5th til 6th mest almindelige kræfttype blandt de anslåede nye kræfttilfælde i 20182. Desuden, mens den samlede kræfttilfælde har vist tendensen til gradvis reduktion i de seneste årtier, kutane melanom Incidensrater i løbet af de sidste par årtier demonstrere en kontinuerlig og hurtig stigning i begge køn2.
For at bekæmpe kutane melanom mere effektivt, er det vigtigt klart at forstå de tidlige begivenheder af melanom udvikling fra deres celler i oprindelse for bedre at identificere klinisk effektive forebyggende metoder. Det er nu kendt, at voksne stamceller kan bidrage væsentligt til tumordannelse som den cellulære oprindelse af kræft i mange forskellige typer af organer, herunder hudvæv3,4,5. På samme måde kan voksne melanocytiske stamceller (mcscs) i den murine ryghud arbejde som melanom celler oprindelse ved afvigende aktivering af RAS/RAF og akt Pathways6. Men, disse onkogene mutationer alene er ikke i stand til effektivt at fremkalde tumordannelse fra inaktiv mcscs. melanocytiske tumorer udvikler sig til sidst, når mcscs bliver aktive under naturlig hårcykling. Men, i denne protokol, vil vi beskrive metoder til kunstigt at fremkalde cellulære aktivering af tumor-tilbøjelige mcscs, og dermed lette præcis kontrol af melanom indledning6,7.
Gennem de her beskrevne metoder kan rumlig og tidsmæssig kontrol af kutan melanom initiering fra tumor-tilbøjelige MCSC'er, der udtrykker onkogenic BRAFV600E sammen med tab af pten -udtryk, udføres med succes, da vi tidligere har rapporteret6. Denne metode inkorporerer tidligere fund, der demonstrerer hårfollikel stamcelle aktivering gennem hårfjerning samt hvordan eksponering af murine hud til UV-B kan lette aktivering af MCSCs hjemmehørende til hårfollikel og omplacering af denne cellulære delpopulation til den interfollikulære epidermis6,8,9,10. Disse in vivo modelsystemer kan give værdifulde oplysninger om, hvordan fysiologiske og miljømæssige ændringer kan ændre cellulære status af melanom-tilbøjelige MCSCs, som igen kan fremkalde betydelig initiering af melanom i huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg udføres i overensstemmelse med Cornell Universitets institutionelle Komité for dyrepasning og-brug (IACUC).
1. forberedelse af
-
Saml hale klip fra 12 dage postnatale mus og fordøje i 400 μL af 0,05 N NaOH ved 95 °C i 1 h. vortex og tilsæt 32 μL af 1 M Tris-HCl, pH 7. Genotype-mus i henhold til PCR-protokoller leveret gennem Jackson Laboratory og identificere mus med genotype af interesse6.
- Tyr-CreER- hemizygous (+/creer)
- LSL-BRAFV600E – heterozygot (+/LSL-v600e)
- Pten – homozygot flox (flox/flox)
- LSL-tdtomato – hemizygous (+/LSL-tdtomat)
Bemærk: Primer sekvenser er angivet i tabel over materialer. - Brug en hårklipper (elektrisk trimmer) til at barbere rygskinnen 2 til 3 dage før alle eksperimenter beskrevet nedenfor, og når mus er ca. 7 uger gamle. Pas på ikke at beskadige den tynde muse hud ved hjælp af den elektriske trimmer, da enhver skade kan fremkalde en sårheling respons, som vil aktivere hårfollikel stamceller, herunder MCSCs.
- Find ud af, om hårcyklussen er i telogen, og om huden er såret i venteperioden. Hvis huden viser tegn på skade, bør musen ikke anvendes til disse procedurer.
Bemærk: Selv om hårcyklussen kan variere lidt mellem genetiske baggrunde, i denne alder hårcyklussen i rygskindet er normalt i telogen tilstand11. Tyr-creer transgenet vil målrette mcscs i telogen hud, og de efterfølgende genetiske ændringer vil blive permanent udtrykt i alle slægter af MCSC, herunder differentierede melanocytter og melanocytiske tumorer.
2. Tamoxifen behandling af CRE-LOX genetisk rekombination
-
Præparat af tamoxifen til intraperitoneal injektion (IP) eller lokal administration for systemisk eller lokaliseret genetisk rekombination
Bemærk: For at Tamoxifen at inducere rekombination, det skal først metaboliseres af leveren til 4-hydroxytamoxifen (4-OHT), som kan binde til og aktivere creer. Lokal applikation af Tamoxifen vil ikke blive metaboliseret på denne måde, og 4-OHT skal anvendes direkte. Kun én metode til Tamoxifen levering er nødvendig for tilstrækkelig rekombination.- Tamoxifen: Forbered Tamoxifen i en koncentration af 10 mg mL-1 opløst i majsolie. At støtte i opløsningen af stoffet i opløsning, tilføje op til 10% samlede volumen af 100% Molekylær kvalitet ethanol til stoffet i pulverform, vortex for 3 min og derefter tilføje resterende volumen af majsolie. Fortsæt til vortex, indtil krystallinsk materiale ikke længere er synligt i opløsningen. Tamoxifen opløsning kan steriliseres ved at passere gennem et 0,2 μm filter. Fortsæt til trin 2.2.1 for behandling.
- 4-OHT: Forbered en stamopløsning af hydroxytamoxifen op til 3 mg mL-1 i 100% ethanol. Derefter kan en fungerende løsning anvendes så meget som nødvendigt for at dække huden område af interesse (generelt en enkelt ansøgning).
Bemærk: En stamopløsning af hydroxytamoxifen kan opløses i 100% ethanol til en endelig koncentration på 5 mM. For at tilberede en fungerende opløsning kan 5 μL 4OH-Tamoxifen stamopløsning fortyndes til 15 μL 100% ethanol. For 4 mm2 område kan 1 til 3 μl arbejdsopløsning anvendes topisk.
-
Behandling af mus med Tamoxifen enten systemisk eller topisk
- Til systemisk behandling administreres 2 mg Tamoxifen via IP-injektion én gang dagligt i 3 dage ved hjælp af en 26 G kanyle.
Bemærk: Ved hjælp af denne model er ca. 93% ± 4% af de mest støjsvage MCSCs mærket med tdTomato6. - For regional aktivering, udføre en aktuel behandling med 4-OHT. Dæk hudområdet af interesse med arbejdsopløsningen. Mængden af arbejdsløse kan bestemmes af størrelsen af den region af interesse som beskrevet i trin 2.1.2.
- Til systemisk behandling administreres 2 mg Tamoxifen via IP-injektion én gang dagligt i 3 dage ved hjælp af en 26 G kanyle.
- På 48 h efter den sidste dosis af Tamoxifen, Fortsæt til trin 3 for kemisk hårfjerning induceret tumor initiering eller til trin 4 for UV-B induceret tumor initiering
3. kemisk hårfjerning
- Udstyre en mus behandlingsrum, der indeholder et isofluran system med følgende nødvendige materialer: hårfjerning creme, Cottons servietter, papir klud, og vand.
- Anbring musen i induktions kammeret og anæstetize med 3,5 til 4,5% isofluran og 1 L/min ilt.
- Når åndedræts frekvensen er stabiliseret, skal du bekræfte, at musen er i den rette plan af anæstesi ved at udføre en tå knibe og overføre musen til hovedrøret opretholde anæstesi med 1 til 1,5% isofluran og 1 L/min ilt. Påfør øjensalve for at holde øjnene fra tørring, mens under anæstesi.
- Brug en vatpind til at anvende et tyndt lag hårfjerning creme til det barberede område af musens hud.
- Når cremen er blevet jævnt anvendt, skal du bruge rene vatpinde til at begynde fjernelse. Den samlede tid, hvor cremen er i kontakt med huden, må ikke overstige 1 min.
- Tør forsigtigt huden af med en fugtig papir klud og sørg for, at eventuel rest creme er fjernet.
Bemærk: Hårfjerning creme kan forårsage irritation af huden, hvis det ikke er helt fjernet. Nogle mus, såsom dem på en C57BL/6 baggrund, kan være tilbøjelige til at udvikle dermatitis12. Selv om sjældne, nogle dyr vil udvikle dermatitis inden for 24 h efter hårfjerning creme applikation eller mekanisk Depilation. Sørg for at tjekke musene dagen efter behandlingen for at se efter tegn på regional hudirritation. - Kassér de fjernede håraksler og alle materialer, der anvendes i en biologisk fare beholder.
- Anbring musen i et tomt, rent muse bur, indtil anæstesi er slidt.
- Vend musene tilbage til deres bure.
4. UV-B bestråling
- Udstyre en mus behandlingsrum, der indeholder en isofluran system med følgende nødvendige materialer: UV-B lys system, UV-B lys meter, beskyttende dækning for musen, yderligere UV-B beskyttende PV til forsker, og en timer.
- Mus bør bestråles ved UV-B-dosis af interesse (dvs. 0-180 mJ/cm2). Brug UV-B-lysmåleren til at bestemme den passende længde af tid til at bestråle musene.
Bemærk: MW/cm2 x tid = dosis - Anæstetize musen med isofluran. Mens du er i induktions kammeret, skal du bruge 3,5 til 4,5% isofluran og 1 L/min ilt.
- Når musen er stabiliseret, bekræfte anæstesi effekter med en tå knibe og overføre musen til de vigtigste anæstesi rør placeret i UV-kammer. Påfør øjensalve for at forhindre øjnene i at tørre under anæstesi. Vedligeholde anæstesi med 1 til 1,5% isofluran og 1 L/min ilt.
- Dæk rygskinnen med UV-B-beskyttende materiale, så kun den ønskede region vil blive eksponeret.
Bemærk: På nuværende tidspunkt bør der anvendes passende PV. Længden af tid til at bestråle musen er afhængig af intensiteten af den anvendte pære, men anæstesi kan være nødvendigt at overvåges, hvis den nødvendige tid overstiger 30 s. - Dæk UV-kammeret ved hjælp af UV-resistent låg eller andre egnede materialer.
- Tænd for UV-B-lampen og bestrålings musen for den tid bestemt af forskerne til det specifikke mål.
- Sluk for UV-systemet og isofluran, derefter placere musen til en tom mus bur indtil anæstesi har slidt.
- Vend musene tilbage til deres bure.
5. vævs behandling
-
Isolering af huden
- Anskaf følgende før start: nekropsy instrumenter, filtrerpapir og papirservietter.
- Euthanize musene i henhold til IACUC godkendte protokoller, og bekræft død før du fortsætter.
- Ved hjælp af en hårklipper, barbere ethvert hår fra ryg hud område. Let børste området med en fnugfri væv for at rydde området.
- Lav en lille indsnit med skarpe saks lige over bunden af halen.
- Indsæt store stump saks i indsnittet og adskille subdermal bindevæv.
- Isoler forsigtigt huden region af interesse ved at skære med skarpe saks langs kanten af vævet.
- Anbring hudvævet på et rent papirhåndklæde og brug kedelige pincet til at strække huden, så den klæver til håndklædet og bliver undervist. Dette trin tjener til at give yderligere støtte til vævet, så det kan manipuleres og forarbejdes samtidig bevare sin form.
Bemærk: Vær omhyggelig med kun at håndtere de udvendige områder af hudvævet, da pincet kan forårsage skade på huden, som kan ses histologisk.
-
Vævs fiksering
- Fold et stykke filtrerpapir i halve og Mærk det korrekt. Anbring huden sammen med papirhåndklæde bagside i det foldede papir umiddelbart ved siden af krølle, hvilket sikrer, at prøven er glat og ikke foldet eller krøllet. Forsegl filtrerpapiret ved at hæfte de åbne sider, og trim derefter, så det resterende papir kan bruges til fremtidige prøver.
Bemærk: Dette trin udføres således, at huden bevarer sin form under fiksering. - Vævsprøven nedsænkes fuldt ud i 10% neutral buffer formalin i 3 til 5 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °c.
- Efter fiksering fjernes prøverne fra formalin, vaskes i deioniseret vand (2x, 5 min hver) og Fortsæt med at lave vævs blokke. Fjern forsigtigt eventuelt restmateriale fra hudvævet (dvs. rest papir).
- Fold et stykke filtrerpapir i halve og Mærk det korrekt. Anbring huden sammen med papirhåndklæde bagside i det foldede papir umiddelbart ved siden af krølle, hvilket sikrer, at prøven er glat og ikke foldet eller krøllet. Forsegl filtrerpapiret ved at hæfte de åbne sider, og trim derefter, så det resterende papir kan bruges til fremtidige prøver.
-
Fremstilling af frosne vævs blokke (figur 1)
- Trim kanterne af huden prøven, så de ikke er takkede og derefter gøre 3 sagittale nedskæringer. Bredden af disse strimler bør ikke være mere end højden af kryomold (5 mm). Dernæst gøre tværgående nedskæringer at have stykker af hud, som ikke er længere end bredden af den kryomold (20 mm) og kan indlejres. Gentag med den resterende halvdel af rygskindet, eller Gem vævet til andre formål (skiftevis, Gem halvdelen før fiksering).
Bemærk: Det er vigtigt at holde hud stykker i korrekt orientering. - Drej den kryomold (25 x 20 x 5 mm3) i en stående retning og sted 4 til 5 stykker hud oven på OLT. Når alle stykker er på plads, skal du bruge 2 par fine pincet til at bringe den lange kant af huden til bunden af kryomold. Hud bør nu stå op i OLT vinkelret på bunden af formen. Vær omhyggelig med at minimere dannelsen af luftlommer i OLT under dette trin (figur 1).
- Fyld formen med OCT til den anden læbe, og Placer på den flade overflade af tøris. Brug pincet til at justere eventuelle hudstykker, der kan have skiftet under overførslen, da blokken begynder at fryse. Når det nederste lag er solidificeret, manipulation af væv vil være umuligt.
- Skær 8-10 μm-slides til analyse.
- Trim kanterne af huden prøven, så de ikke er takkede og derefter gøre 3 sagittale nedskæringer. Bredden af disse strimler bør ikke være mere end højden af kryomold (5 mm). Dernæst gøre tværgående nedskæringer at have stykker af hud, som ikke er længere end bredden af den kryomold (20 mm) og kan indlejres. Gentag med den resterende halvdel af rygskindet, eller Gem vævet til andre formål (skiftevis, Gem halvdelen før fiksering).
-
Making formalin fast paraffin indlejret (FFPE) væv blokke
- Placer 2 stykker fast hud i en mærket kassette og dehydrat i stigende koncentrationer af ethanol (75% ethanol for 30 min, 85% for 30 min, 90% for 30 min, 95% for 30 min, 100% for 2x 30 min, xylen eller xylen erstatning for 2x 30 min). Inkube med paraffin ved 58-60 °, først i 30 min, og derefter natten over.
- Integrer vævet i en 24 x 24 mm2 rustfrit stålvæv skimmelsvamp med flydende paraffin og størkne ved-5 °c. Vævs orienteringen skal være den samme som for frosne vævs blokke, så langsgående sektioner på tværs af flere hårsække kan visualiseres (figur 1).
- Når paraffin har solidificeret, fjerne formen og skåret i 5-10 μm sektioner til analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kutan melanom initiering induceret af kemisk hårfjerning
Proceduren for kemisk hårfjerning er afbildet i figur 2. Når mus er 7-ugers postnatal, deres ryghud er i telogen. Under telogen er hårfollikel stamceller og MCSC'er kendt for at være i en hviletilstand. Huden bør ikke vise nogen signifikant hårvækst efter barbering. På den anden side, kemisk hårfjerning kan fremkalde hårfollikel stamcelle aktivering, som igen viser betydelig hårvækst fra regionen af interesse (figur 2). Tilsvarende, tumor-tilbøjelige mcscs udtrykker onkogene mutationer også nødt til at være aktiv for accelereret tumordannelse. Kemisk hårfjerning kan i høj grad inducere aktivering af både follikel stamcelle og MCSCs. melanom-tilbøjelige MCSCs i en aktiv tilstand kan danne tumorer, og mikroskopisk melanom initiering kan observeres inden for 2 uger efter kemisk hårfjerning ved hjælp af linjesporingallel LSL-tdTomato (figur 3).
Kutan melanom initiering induceret af UV-B-bestråling
På samme måde som kemisk hårfjerning kan UV-B fremkalde tumor initiering fra de mest støjsvage, tumor-udsatte MCSCs (figur 4). Mens den murine hud, der indeholder tumor-tilbøjelige mcscs i en inaktiv tilstand viser ingen signifikant tumor initiering og mangel på signifikant pigmentering, ryghud udsat for UV-B (to gange, 180 MJ/cm2) viser sorte pigmenterede tidlige melanocytiske tumorer, som makroskopisk indlysende (figur 4a, B). Mens UV-B kan betydeligt inducere makroskopisk tydelig tumor initiering inden for 2 uger, kan anvendelsen af solcreme beskytte UV-B-medieret melanom initiering i huden, svarende til en UV-resistent klud (figur 4c, D).
Det er vigtigt, at UV-B inducerer den direkte translokation af MCSCs fra deres follikulære stamcelle-niche til det interfollikulære epidermis. Endvidere kan UV-B inducere dannelsen af kutane melanom i den interfollikulære epidermis, og den mikroskopiske fænotype kan observeres ved lineært sporings markør, tdTomato (figur 5). Da disse tumorceller er maligne, de vokser hurtigt og invasivt (figur 5). I lighed med rygskinnen kan UV-B-induceret melanom-initiering især observeres i andre hudområder, såsom ørehuden (figur 6). Sammenlignet med den kontrol hud, der er dækket af UV-resistent klud, viser den ørehud, der udsættes for UV-B, højere pigmentering på grund af en højere byrde af melanom-initiering (figur 6).
Figur 1: isolering af hudvæv og kryo-indlejring. Efter eutanasi, barbere musen dorsale hud region af interesse og indlejre huden i kryomold indeholdende OCT. Den stiplede linje på musen repræsenterer midterlinjen. Typisk kan 3 eller 4 stykker hud isoleres med linjesegment 3-4 langs midterlinjen; et sådant stykke er markeret med rektangel 1/2/3/4. Disse hudstykker bør integreres i OLT som vist i figuren. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: makroskopiske fænotyper efter kemisk hårfjerning. (A) diagram over kemisk hårfjerning. (B) efter barbering blev hårcyklussen bekræftet til at være i telogen. (C) kemisk hårfjerning blev udført for at fjerne håraksler fra hårsækkene, som kan aktivere både hårsækken og melanocytter stamceller. (D) omkring en uge senere, tidlig hårvækst vil være let mærkbar. (E) derefter, signifikant hårvækst kan observeres over tid. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: mikroskopisk observation af melanom initiering kontrolleret af kemisk hårfjerning. Kemisk hårfjerning kan i væsentlig grad inducere aktivering af de op- Derefter kan mikroskopisk tumor initiering påvist af Lineage sporings markøren tdTomato observeres inden for 2 uger. Dette tal viser den mikroskopiske fænotype 16 dage post 3 dage Tamoxifen ved IP-injektion efterfulgt af kemisk hårfjerning ved hjælp af forskellige visualiseringer af samme synsfelt. (A) tdtomato+ tumorceller, der stammer fra hårsækken, fusioneret med dapi nuklear Counter plet. (B) hårfollikler og interfollikulære epidermis er beskrevet i hvidt. (C) en skematisk viser, hvordan tdtomato+ tumorceller invadere i dermis fra hårsækken, modificeret fra Moon, H. et al.6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: makroskopisk fænotype af kutant melanom induceret af UV-B-bestråling. Mus blev behandlet med Tamoxifen i 3 dage (dag 1 til 3) efterfulgt af 2 UV-B-eksponeringer (dag 4 og 6). (A) diagram over UV-b-bestråling på rygskindet, der indeholder mutante mcscs. (B) makroskopisk fænotype mellem kontrol og UV-b eksponeret dorsale hud. Signifikant sort pigmentering relateret til melanocytisk tumordannelse kan observeres inden for 2 uger efter den anden UV-B bestråling. (C) diagram af solcreme applikation. (D) mens UV-b i væsentlig grad kan inducere tumor initiering fra mutant mcscs, viste anvendelsen af solcreme signifikant undertrykt UV-b-medieret tumor initiering (16 dage efter den anden UV-b-bestråling). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: mikroskopisk observation af UV-B-induceret kutan melanom. Mus blev behandlet med Tamoxifen ved IP-injektion i 3 dage (dag 1 til 3) efterfulgt af 2 UV-B-eksponeringer (dag 4 og 5). (a-C) Tidlig tumor initiering i hele den interfollikulære epidermis demonstreret ved Lineage sporing tdTomato kan vises på dag 17. (A) tdtomato + tumorceller er vist migrere fra hårsækken til det interfollikulære epidermis. Dapi bruges som en nuklear Counter plet. (B) dapi farvning er fjernet og stiplet linje indikerer placering af hårsækkene og interfollikulært epidermis. C) skematisk angivelse af tdtomato+ celle migration fra hårkimen til den interfollikulære EPIDERMIS efter UV-B-eksponering. Ændret fra Moon et al.6. (D-F) Derefter, tumorceller vokser hurtigt og invadere dermal væv nedenfor (dag 25). (D) tdtomato+ tumorceller er fortsat med at formere sig og invadere det dermale væv. Dapi bruges som en nuklear Counter plet. (E) dapi farvning er fjernet og stiplet linje indikerer placeringen af hårsækkene og interfollikulært epidermis. (F) skematisk indikerer tdtomato+ celle invasion i dermis og melanocytisk tumorvækst. Ændret fra Moon et al.6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: makroskopisk og mikroskopisk observation af UV-B-induceret melanom i ørehuden. A) forsøgsordning. Mus blev behandlet med Tamoxifen i 3 dage (dag 1 til 3) efterfulgt af 3 eksponeringer mod UV-B-bestråling (dag 4, 6 og 8). (B) signifikant øget melanom initiering ved UV-B-bestråling blev observeret makroskopisk såvel som mikroskopisk på dag 28. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kendetegnende genetiske ændringer ofte findes i kutane melanom tumorer er blevet godt beskrevet13. Den mest dominerende driver mutation er BRAFV600E, og en gensplejset musemodel for BRAFV600E-medieret melanom blev genereret af Bosenberg gruppe14 og deponeret i Jackson Laboratory. Ved hjælp af denne musemodel demonstrerede vores nylige undersøgelse kravet om cellulær aktivering af tumor-tilbøjelige MCSCs for den betydelige initiering af BRAFV600E-medieret melanom i rygskin6.
Depilation er kendt for at være en effektiv metode til at fremkalde murine hårfollikel aktivering af stamcelle på rygskindet6,10. Murine MCSCs er placeret i hårsækkene, og desuden synkroniseres den cellulære status for follikulære MCSCs med tilstanden af hårfollikel stamceller8. Kunstig modulation af hårfollikel stamceller kan ændre MCSC status, således kan hårfjerning direkte aktivere både melanocytter og hårfollikel stamceller. Denne aktiveringsmetode for MCSCs kan anvendes til tumor-tilbøjelige MCSCs at undersøge tidlige trin af kutane melanom initiering i genetisk modificerede melanom musemodeller. Gennem en kemisk hårfjerning metode, melanom dannelse i regionen af interesse i murine dorsale hud kan initieres direkte. Depilation kan udføres ved forskellige metoder såsom voksbehandling eller plukning, som begge er typer af mekanisk hårfjerning, hvor håraksler ekstraheres fra hårsækken. Disse mekaniske hårfjerning metoder kan dog være upræcise med hensyn til en bestemt region af interesse. På den anden side, en kemisk hårfjerning metode ved hjælp hårfjerning creme er enkel at udføre og giver mulighed for præcis anvendelse med pålidelig aktivering af hårcyklussen, og kan være mindre barske på huden end mekanisk fjernelse.
Blandt de forskellige risikofaktorer er UV-B den mest kendte risikofaktor i kutant melanom15. UV-B bestråling er kendt for at inducere direkte migration af follikulære MCSCs i den interfollikulære epidermis9. Desuden er UV-B en stærk miljømæssig stressor, som i væsentlig grad kan inducere melanomer initiering fra tumor-tilbøjelige MCSCs6. I den eksperimentelle protokol, der er beskrevet ovenfor, kan en lille region af interesse på murine dorsale hud udsættes for UV-B lys, mens brugen af en UV resistent klud nemt beskytter resten af musen mod uønsket eksponering. Denne behandling kan udføres, mens musen er under anæstesi. Det er vigtigt, at migrationen af MCSC'er og dannelsen af MCSC-med oprindelse i melanom efter UV-B-eksponering er UV-B-dosisafhængige6. Derfor, for at få succesfulde resultater, er det vigtigt regelmæssigt at kontrollere intensiteten af pære ved hjælp af en UV-B meter og justere eksponeringstid og afstand mellem huden og pærer efter behov. Som det er almindeligt kendt, huden kan brænde som reaktion på en høj dosis af UV-B lys, men svag UV-B eksponering er også skadelig for eksperimentet, da det vil være utilstrækkeligt til at inducere MCSC-med oprindelse melanom.
Den protokol, der beskrives her, fokuserer primært på den miljømæssige risikofaktor, UV-B, i rygskindet. Ovennævnte forsøgsprotokol kan dog anvendes på forskellige mål. For eksempel kan protokollen ændres med pærer af forskellige spektrums at bestemme effekten af alternative lyskilder eller bølgelængder af UV, såsom UV-A. Denne protokol er primært rettet mod rygskindet, da det er tilgængeligt, og MCSCs ' status er veldefineret. Men, det kan også ændres til at målrette UV-lys eksponering for vedhæng såsom øre, hale eller palme hud, herunder fodpuder. Som et eksempel, i figur 6, er det muligt at undersøge mulig forskel i tidlig melanocytisk tumordannelse på alternative væv sites. I modsætning til rygskinnen er Mcsc's status i disse områder dog mindre veldefineret; Derfor bør den potentielle spontane aktivering af MCSCs, der fører til tilfældige forekomster af melanom dannelse, overvejes. Sammenlignet med protokollen i rygskindet, vil alternative tilgange derfor kræve et øget antal eksperimenter for at opnå nøjagtige eksperimentelle resultater.
Desuden, mens den nuværende protokol primært viser BRAFV600E-medieret melanom initiering, vores tidligere undersøgelse rapporterede også lignende tidlige melanom dannelse med en onkogene RAS/pten kombination, ved hjælp af LSL-KrasG12D genetisk allel6. Andre driver mutationer såsom mutant Ntm's gener kan dog også overvejes med det eksperimentelle system, der er beskrevet her, for at forstå tidlig melanom initiering drevet af andre onkogene kombinationer.
Tilsammen er beskrevet her et in vivo modelsystem, som gør det muligt at undersøge tidlig kutan melanom initiering i gensplejsede mus. Disse murine modeller giver metoder til tidsmæssig og rumlig kontrol af melanomer initiering fra mutant MCSCs i huden. Disse protokoller giver et nyt paradigme til at studere mekanismerne for tidlig melanom initiering fra tumor-tilbøjelige MCSCs samt en platform til at bestemme de fysiologiske og miljømæssige stressorer, der kan bidrage til melanomer initiering. Dette niveau af spatiotemporal kontrol kan også give et værktøj til mere præcis melanom induktion til at teste stof effektivitet i forebyggelsen af melanomer dannelse, samt tumorvækst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Kontoret for den assisterende forsvarsminister for Sundhedsanliggender, gennem peer reviewed Cancer Research program under tildeling W81XWH-16-1-0272. Udtalelser, fortolkninger, konklusioner, og anbefalinger er dem af forfatterne og er ikke nødvendigvis godkendt af Department of Defense. Dette arbejde blev også støttet af en Seed tilskud fra Cornell Stem Cell program til A.C. White. H. Moon blev støttet af Cornell Center for hvirveldyr Genomics Scholar program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C.
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M.
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
