Summary
La procédure suivante décrit une méthode de contrôle spatial et temporel de l’initiation de tumeurs mélanocytaires dans la peau dorsale murin, à l’aide d’un modèle de souris génétiquement modifiée. Ce protocole décrit l’initiation des mélanomes cutanés macroscopiques et microscopiques.
Abstract
Le mélanome cutané est bien connu comme le cancer de la peau le plus agressif. Bien que les facteurs de risque et les modifications génétiques majeures continuent d’être documentés avec une profondeur croissante, le taux d’incidence du mélanome cutané a montré une augmentation rapide et continue au cours des dernières décennies. Afin de trouver des méthodes préventives efficaces, il est important de comprendre les premiers pas de l’initiation du mélanome dans la peau. Des données antérieures ont démontré que les cellules souches de mélanocytes folliculaires (MCSCs) dans les tissus cutanés adultes peuvent agir comme des cellules d’origine du mélanome lorsqu’elles expriment des mutations oncogéniques et des altérations génétiques. La tumorigenèse causée par les MCSC sujettes aux mélanomes peut être induite lorsque les MCSCs passent d’un état de repos à actif. Cette transition dans les MCSCs sujettes aux mélanomes peut être favorisée par la modulation de l’état d’activité des cellules souches du follicule pileux ou par des facteurs environnementaux extrinsiques tels que l’ultraviolet-B (UV-B). Ces facteurs peuvent être manipulés artificiellement en laboratoire par dépilation chimique, ce qui provoque la transition des cellules souches de follicule pileux et des MCSCs d’un état de repos à actif, et par l’exposition UV-B utilisant une lumière de paillehaut. Ces méthodes permettent un contrôle spatial et temporel réussi de l’initiation du mélanome cutané dans la peau dorsale murin. Par conséquent, ces systèmes de modèles in vivo seront utiles pour définir les premiers pas de l’initiation du mélanome cutané et pourraient être utilisés pour tester les méthodes potentielles de prévention des tumeurs.
Introduction
Le mélanome, la forme maligne des tumeurs mélanocytaires, est le cancer le plus agressif dans la peau avec un mélanome cutané responsable de la majorité des décès par cancer de la peau1. Aux États-Unis, le mélanome est couramment diagnostiqué; Il devrait s’agir du 5ème au 6ème type de cancer le plus fréquent parmi les nouveaux cas de cancer estimés en 20182. En outre, alors que les incidences globales sur le cancer ont montré la tendance de la réduction progressive au cours des dernières décennies, les taux d’incidence des mélanomes cutanés au cours des dernières décennies démontrent une augmentation continue et rapide des deux sexes2.
Pour lutter plus efficacement contre le mélanome cutané, il est important de bien comprendre les premiers événements du développement du mélanome à partir de leurs cellules d’origine afin de mieux identifier les méthodes préventives cliniquement efficaces. Il est maintenant connu que les cellules souches adultes peuvent contribuer significativement à la formation de tumeurs comme les origines cellulaires des cancers dans de nombreux types différents d’organes, y compris les tissus de la peau3,4,5. De même, les cellules souches de mélanocytes adultes (mcscs) dans la peau dorsale murin peuvent fonctionner comme des cellules de mélanome d’origine lors d’une activation aberrante des voies RAS/RAF et Akt 6. Cependant, ces mutations oncogéniques seules ne sont pas en mesure d’induire efficacement la formation de tumeurs des MCSC quiescents. les tumeurs mélanocytaires finissent par se développer lorsque les MCSCs deviennent actifs lors du cyclisme sur les cheveux naturels. Cependant, dans ce protocole, nous décrirons des méthodes pour induire artificiellement l’activation cellulaire des mcscs sujettes à la tumeur, facilitant ainsi un contrôle précis du mélanome initiation6,7.
Grâce aux méthodes décrites ici, le contrôle spatial et temporel de l’initiation du mélanome cutané à partir de MCSCs à tendance tumorale exprimant des BRAFV600E oncogéniques ainsi que la perte d’expression de PTEN peuvent être exécutés avec succès, car nous ont déjà rapporté6. Cette méthode incorpore les résultats antérieurs qui démontrent l’activation de cellules souches de follicule pileux par dépilation ainsi que comment l’exposition de la peau de murin à UV-B peut faciliter l’activation des mcscs résidant au follicule pileux et à la translocation de ce cellulaire sous-population à l’épiderme interfolliculaire6,8,9,10. Ces systèmes de modèles in vivo peuvent fournir des informations précieuses sur la façon dont les changements physiologiques et environnementaux peuvent altérer l’État cellulaire des MCSC sujettes aux mélanomes, qui à leur tour peuvent induire une initiation significative du mélanome dans la peau.
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Protocol
Toutes les procédures animales sont exécutées conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Cornell (IACUC).
1. la préparation
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Prélever des clips de queue à partir de souris postnatales de 12 jours et digérer dans 400 μL de 0,05 N NaOH à 95 ° c pendant 1 h. vortex et ajouter 32 μL de Tris-HCl 1 M, pH 7. Les souris génotypes selon les protocoles de PCR fournis par le laboratoire Jackson et identifient les souris ayant un génotype d’intérêt6.
- Tyr-creer -hemizyzygote (+/creer)
- LSL-BRAFV600E – hétérozygote (+/LSL-V600E)
- PTEN -Flox homozygote (Flox/Flox)
- LSL-tdtomate – hemizyte (+/LSL-tdtomate)
Remarque: Les séquences d’amorce sont fournies dans le tableau des matériaux. - Utilisez une tondeuse à cheveux (tondeuse électrique) pour raser la peau dorsale 2 à 3 jours avant toutes les expériences décrites ci-dessous, et lorsque les souris ont environ 7 semaines d’âge. Prenez soin de ne pas endommager la peau mince de la souris à l’aide de la tondeuse électrique comme toute blessure peut susciter une réponse de guérison de la plaie qui activera les cellules souches de follicule pileux, y compris MCSCs.
- Déterminez si le cycle capillaire est en telogène et si la peau est blessée pendant la période d’attente. Si la peau montre un signe de blessure, la souris ne doit pas être utilisée pour ces procédures.
Remarque: Bien que le cycle des cheveux peut légèrement différer entre les milieux génétiques, à cet âge, le cycle des cheveux dans la peau dorsale est généralement dans l’État télogène11. Le transgène Tyr-CreER ciblera les MCSC dans la peau télogène, et les altérations génétiques ultérieures seront exprimées de façon permanente dans toutes les lignées du CMCC, y compris les mélanocytes différenciés et les tumeurs mélanocytaires.
2. traitement du tamoxifène pour la recombinaison génétique Cre-lox
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Préparation du tamoxifène pour injection intrapéritonéale (IP) ou administration topique pour une recombinaison génétique systémique ou localisée
Remarque: Pour que le tamoxifène induise une recombinaison, il doit d’abord être métabolisé par le foie en 4-hydroxytamoxifen (4-OHT), qui peut se lier et activer le creer. L’application topique du tamoxifène ne sera pas métabolisée de cette façon et 4-OHT doit être utilisé directement. Une seule méthode de livraison du tamoxifène est nécessaire pour une recombinaison suffisante.- Tamoxifène: préparer le tamoxifène à une concentration de 10 mg mL-1 dissous dans l’huile de maïs. Pour aider à la dissolution du médicament en solution, ajouter jusqu’à 10% de volume total de 100% d’éthanol de qualité moléculaire au médicament sous forme de poudre, Vortex pendant 3 min, puis ajouter le volume restant d’huile de maïs. Continuez à tourbillonner jusqu’à ce que le matériau cristallin ne soit plus apparent en solution. La solution de tamoxifen peut être stérilisée en passant par un filtre de 0,2 μm. Passez à l’étape 2.2.1 pour le traitement.
- 4-OHT: préparer une solution d’action de l’hydroxytamoxifène jusqu’à 3 mg ml-1 dans 100% éthanol. Ensuite, une solution de travail peut être appliquée autant que nécessaire pour couvrir la zone d’intérêt de la peau (généralement une seule application).
Remarque: Une solution de stock d’hydroxytamoxifène peut être dissoute dans de l’éthanol à 100% pour une concentration finale de 5 mm. Ensuite, pour préparer une solution de travail, 5 μL de solution d’action 4OH-tamoxifen peuvent être diluées dans 15 μL de 100% d’éthanol. Pour une surface de 4 mm2 , 1 à 3 μl de solution de travail peuvent être appliqués par voie topique.
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Traiter les souris avec le tamoxifène soit de façon systémique, soit par voie topique
- Pour le traitement systémique, administrer 2 mg de tamoxifène par injection IP une fois par jour pendant 3 jours à l’aide d’une aiguille de 26 G.
Remarque: À l’aide de ce modèle, environ 93% ± 4% des MCSC quiescents sont étiquetés avec tdTomato6. - Pour l’activation régionale, effectuer un traitement topique avec 4-OHT. Couvrez la zone d’intérêt de la peau avec la solution de travail. La quantité de solution de travail peut être déterminée par la taille de la région d’intérêt, comme décrit à l’étape 2.1.2.
- Pour le traitement systémique, administrer 2 mg de tamoxifène par injection IP une fois par jour pendant 3 jours à l’aide d’une aiguille de 26 G.
- À 48 h après la dernière dose de tamoxifène, passez à l’étape 3 pour l’initiation de la tumeur induite par la dépilation chimique ou à l’étape 4 pour l’initiation de tumeurs induites par UV-B
3. dépilation chimique
- Équipez une salle de traitement de souris contenant un système d’isoflurane avec les matériaux suivants requis: crème d’épilation, écouvillons de cotons, chiffon de papier, et l’eau.
- Placer la souris dans la chambre d’induction et anesthésier avec 3,5 à 4,5% d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène.
- Une fois que la fréquence respiratoire s’est stabilisée, confirmez que la souris est dans le plan approprié de l’anesthésie en effectuant un pincement d’orteil et transférez la souris au tube principal maintenant l’anesthésie avec 1 à 1,5% isoflurane et 1 L/min d’oxygène. Appliquez une pommade oculaire pour empêcher les yeux de sécher pendant l’anesthésie.
- Utilisez un coton-tige pour appliquer une fine couche de crème épilation à la région rasée de la peau de la souris.
- Une fois que la crème a été appliquée uniformément, utilisez des écouvillons de coton propres pour commencer l’enlèvement. Le temps total pendant lequel la crème est en contact avec la peau ne doit pas dépasser 1 min.
- Essuyez délicatement la peau avec un chiffon de papier humide et assurez-vous que toute la crème résiduelle a été enlevée.
Remarque: Crème épilation peut causer une irritation de la peau si elle n’est pas complètement enlevée. Certaines souris, comme celles sur un fond C57BL/6, peuvent être sujettes à la dermatite de développement12. Bien que rare, certains animaux développeront la dermatite dans les 24 h après application de crème épilation ou épilation mécanique. Assurez-vous de vérifier les souris le lendemain du traitement pour rechercher des signes d’irritation cutanée régionale. - Jetez les arbres à cheveux enlevés et tous les matériaux utilisés dans un casier à Biohazard.
- Placez la souris dans une cage de souris vide et propre jusqu’à ce que l’anesthésie s’est usée.
- Retournez les souris dans leur cage.
4. irradiation UV-B
- Équipez une salle de traitement de souris contenant un système d’isoflurane avec les matériaux suivants requis: système de lumière UV-B, indicateur de lumière UV-B, couverture protectrice pour la souris, EPI de protection UV-B supplémentaires pour le chercheur, et une minuterie.
- Les souris doivent être irradiées à la dose d’intérêt UV-B (c.-à-d., 0-180 mJ/cm2). Utilisez le compteur de lumière UV-B pour déterminer la durée de temps appropriée pour irradier les souris.
Note: mW/cm2 x temps = dose - Anesthésier la souris avec l’isoflurane. Dans la chambre d’induction, utiliser 3,5 à 4,5% d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène.
- Une fois que la souris est stabilisée, confirmez les effets d’anesthésie avec un pincement d’orteil et transférez la souris au tube principal d’anesthésie situé dans la chambre UV. Appliquez la pommade oculaire pour empêcher les yeux de sécher pendant l’anesthésie. Maintenir l’anesthésie avec 1 à 1,5% d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène.
- Recouvrir la peau dorsale d’un matériau protecteur UV-B afin que seule la région désirée soit exposée.
Remarque: À ce moment, des EPI appropriés devraient être utilisés. La longueur de temps nécessaire pour irradier la souris dépend de l’intensité de l’ampoule utilisée, mais l’anesthésie peut avoir besoin d’être surveillée si le temps requis dépasse 30 s. - Couvrez la chambre UV en utilisant un couvercle résistant aux UV ou tout autre matériau approprié.
- Allumez la lampe UV-B et irradiez la souris pour le temps déterminé par les chercheurs pour l’objectif spécifique.
- Éteignez le système UV et l’isoflurane, puis placez la souris dans une cage de souris vide jusqu’à ce que l’anesthésie soit usée.
- Retournez les souris dans leur cage.
5. traitement tissulaire
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Isolement de la peau
- Obtenir les éléments suivants avant le démarrage: instruments à necropsie, papier filtre et essuie-tout.
- Euthanasiez les souris selon les protocoles approuvés par l’IACUC et confirmez la mort avant de procéder.
- À l’aide d’une tondeuse à cheveux, rasez tous les poils de la zone de la peau dorsale. Badigeonner légèrement la zone avec un tissu sans peluches pour dégager la zone.
- Faire une petite incision avec des ciseaux pointus juste au-dessus de la base de la queue.
- Insérez de grands ciseaux émoussés dans l’incision et séparez les tissus conjonctifs sous-cutanés.
- Isoler soigneusement la région de la peau d’intérêt en coupant avec des ciseaux pointus le long du bord du tissu.
- Placez le tissu cutané sur une serviette en papier propre et utilisez des pinces ternes pour étirer la peau afin qu’elle adhère à la serviette et qu’elle soit enseignée. Cette étape sert à fournir un soutien supplémentaire pour le tissu afin qu’il puisse être manipulé et traité tout en conservant sa forme.
Remarque: Veillez à ne manipuler que les régions extérieures du tissu cutané, car les forceps peuvent causer des dommages à la peau qui peut être vu histologiquement.
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Fixation tissulaire
- Pliez un morceau de papier filtre en deux et étiquetez-le convenablement. Placez la peau en même temps que le papier absorbant dans le papier plié immédiatement adjacent au pli, en veillant à ce que l’échantillon soit lisse et non plié ou froissé. Sceller le papier filtre en agrafant les côtés ouverts, puis couper de sorte que le papier restant puisse être utilisé pour des échantillons futurs.
Remarque: Cette étape est réalisée de sorte que la peau conserve sa forme pendant la fixation. - Immerger complètement l’échantillon de tissu dans du formol tamponné neutre de 10% pendant 3 à 5 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° c.
- Après la fixation, retirez les échantillons du formol, lavez-les dans de l’eau désionisée (2x, 5 min chacun) et continuez à faire des blocs de tissu. Enlevez soigneusement tout résidu du tissu cutané (c.-à-d. le papier résiduel).
- Pliez un morceau de papier filtre en deux et étiquetez-le convenablement. Placez la peau en même temps que le papier absorbant dans le papier plié immédiatement adjacent au pli, en veillant à ce que l’échantillon soit lisse et non plié ou froissé. Sceller le papier filtre en agrafant les côtés ouverts, puis couper de sorte que le papier restant puisse être utilisé pour des échantillons futurs.
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Fabrication de blocs de tissu congelés (figure 1)
- Coupez les bords de l’échantillon de peau afin qu’ils ne soient pas dentelés, puis faites 3 coupes sagittales. La largeur de ces bandes ne doit pas être supérieure à la hauteur du cryomold (5 mm). Ensuite, faites des coupes transversales pour avoir des morceaux de peau qui ne sont pas plus longs que la largeur du cryomold (20 mm) et peuvent être incorporés. Répéter avec la moitié restante de la peau dorsale, ou sauver le tissu pour d’autres usages (alternativement, économiser la moitié avant la fixation).
Remarque: Il est important de garder les morceaux de peau dans l’orientation appropriée. - Orienter le cryomold (25 x 20 x 5 mm3) en orientation portrait et placer 4 à 5 morceaux de peau sur le dessus de l’oct. Une fois que toutes les pièces sont en place, utilisez 2 paires de pinces fines pour amener le long bord de la peau au fond du cryomold. La peau doit maintenant être debout dans l’OCT perpendiculaire à la base du moule. Prenez soin de minimiser la formation de poches d’air dans l’OPO pendant cette étape (figure 1).
- Remplissez le moule avec le PTOM sur la deuxième lèvre et placez-le sur la surface plane de la glace carbonique. Utilisez des pinces pour ajuster les morceaux de peau qui ont pu se décaler pendant le transfert lorsque le bloc commence à geler. Une fois que la couche inférieure est solidifiée, la manipulation des tissus sera impossible.
- Coupez les diapositives 8-10 μM pour analyse.
- Coupez les bords de l’échantillon de peau afin qu’ils ne soient pas dentelés, puis faites 3 coupes sagittales. La largeur de ces bandes ne doit pas être supérieure à la hauteur du cryomold (5 mm). Ensuite, faites des coupes transversales pour avoir des morceaux de peau qui ne sont pas plus longs que la largeur du cryomold (20 mm) et peuvent être incorporés. Répéter avec la moitié restante de la peau dorsale, ou sauver le tissu pour d’autres usages (alternativement, économiser la moitié avant la fixation).
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Fabrication de blocs de tissu formol à paraffine fixe incorporé (FFPE)
- Placer 2 morceaux de peau fixe dans une cassette étiquetée et déshydrater dans les concentrations croissantes d’éthanol (75% d’éthanol pendant 30 min, 85% pendant 30 min, 90% pendant 30 min, 95% pendant 30 min, 100% pour 2x 30 min, xylène ou xylène substitut pour 2x 30 min). Incuber avec de la paraffine à 58-60 °, d’abord pendant 30 min, puis pendant la nuit.
- Incorporer le tissu dans un moule de tissu en acier inoxydable de 24 x 24 mm2 avec de la paraffine liquide et solidifier à-5 ° c. L’orientation tissulaire doit être semblable à celle des blocs de tissu congelés de sorte que les sections longitudinales sur plusieurs follicules pileux peuvent être visualisées (figure 1).
- Une fois la paraffine solidifiée, retirer le moule et couper en sections de 5-10 μM pour analyse.
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Representative Results
Initiation du mélanome cutané induite par dépilation chimique
La procédure de dépilation chimique est représentée dans la figure 2. Lorsque les souris sont 7 semaines postnatales, leur peau dorsale est en télogène. Au cours de la télogène, les cellules souches du follicule pileux et les MCSCs sont connues pour être dans un état de repos. La peau ne doit pas montrer de croissance significative des cheveux après le rasage. D’autre part, la dépilation chimique peut induire l’activation de cellules souches de follicule pileux, qui à son tour montre la croissance significative de cheveux de la région d’intérêt (figure 2). De même, les MCSC sujettes aux tumeurs exprimant des mutations oncogéniques doivent également être actifs pour accélérer la formation de tumeurs. La dépilation chimique peut induire significativement l’activation de la cellule souche follicule pileuse et des MCSCs. les MCSCs à tendance mélanome dans un état actif peuvent former des tumeurs, et l’initiation microscopique du mélanome peut être observée dans les 2 semaines suivant la dépilation chimique en utilisant le l’allèle LSL-tdTomato (figure 3).
Initiation du mélanome cutané induite par irradiation UV-B
Semblable à la dépilation chimique, l’UV-B peut induire l’initiation de tumeur des MCSCs de tumeur-sujettes de quiescence (figure 4). Alors que la peau murin contenant des MCSC sujettes à la tumeur dans un état de repos ne montre aucune initiation significative de tumeur et manque de pigmentation significative, la peau dorsale exposée aux UV-B (deux fois, 180 MJ/cm2) montre des tumeurs mélanocytaires précoces pigmentées noires qui sont macroscopiquement évidentes (figure 4a, B). Alors que l’UV-B peut induire significativement l’initiation de tumeur évidente macroscopiquement dans les 2 semaines, l’application de l’écran solaire peut protéger l’initiation de mélanome induite par UV-B dans la peau, semblable à un tissu résistant aux UV (figure 4C, D).
Il est important de noter que l’UV-B induit la translocation directe des MCSCs de leur niche de cellules souches folliculaires à l’épiderme interfolliculaire. En outre, l’UV-B peut induire la formation de mélanome cutané originaire de MCSC dans l’épiderme interfolliculaire, et le phénotype microscopique peut être observé par le marqueur de traçage de lignée, tdTomato (figure 5). Comme ces cellules tumorales sont malignes, elles poussent rapidement et invasivement (figure 5). Semblable à la peau dorsale, l’initiation du mélanome induit par les UV-B peut être observée notamment dans d’autres zones cutanées, comme la peau de l’oreille (figure 6). Comparé à la peau de contrôle recouverte par un tissu résistant aux UV, la peau de l’oreille exposée aux UV-B démontre une pigmentation plus élevée en raison d’une charge plus élevée d’initiation au mélanome (figure 6).
Figure 1: isolement tissulaire de la peau et cryo-incorporation. Après l’euthanasie, raser la région de la peau dorsale de la souris d’intérêt et incorporer la peau dans le cryomold contenant OCT. La ligne pointillée sur la souris représente la ligne médiane. Typiquement, 3 ou 4 morceaux de peau peuvent être isolés avec le segment de ligne 3-4 le long de la ligne médiane; une telle pièce est indiquée par le rectangle 1/2/3/4. Ces morceaux de peau doivent être incorporés dans l’OPO comme indiqué dans la figure. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: phénotypes macroscopiques après dépilation chimique. (A) schéma de dépilation chimique. (B) après le rasage, le cycle capillaire a été confirmé pour être en Telogen. (C) la dépilation chimique a été effectuée pour enlever les arbres à poils des follicules pileux, qui peuvent activer à la fois le follicule pileux et les cellules souches de mélanocytes. (D) environ une semaine plus tard, la croissance précoce des cheveux sera facilement perceptible. (E) puis, la croissance significative des cheveux peut être observée au fil du temps. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: observation microscopique de l’initiation du mélanome contrôlée par dépilation chimique. La dépilation chimique peut induire de façon significative l’activation des MCSC sujettes à la tumeur repos. Ensuite, l’initiation de tumeur microscopique démontrée par le marqueur de traçage de lignée tdTomato peut être observée dans les 2 semaines. Cette figure démontre le phénotype microscopique 16 jours après 3 jours de tamoxifène par injection IP suivie d’une épilation chimique en utilisant différentes visualisations du même champ de vision. (A) tdtomato+ cellules tumorales provenant du follicule pileux fusionnés avec la tache nucléaire de DAPI. (B) les follicules pileux et l’épiderme interfolliculaire sont décrits en blanc. (C) un schéma montrant comment tdTomato+ cellules tumorales envahissent dans le derme du follicule pileux, modifié de la lune, H. et coll.6. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: phénotype macroscopique du mélanome cutané induit par irradiation UV-B. Les souris ont été traitées par le tamoxifène pendant 3 jours (jour 1 à 3), suivies de 2 expositions UV-B (jour 4 et 6). (A) Diagramme de l’irradiation UV-b sur la peau dorsale contenant des MCSC mutants. (b) phénotype macroscopique entre le contrôle et la peau dorsale exposée UV-b. Une pigmentation noire significative liée à la formation de tumeurs mélanocytaires peut être observée dans les 2 semaines suivant la deuxième irradiation UV-B. (C) schéma de l’application de protection solaire. (D) tandis que l’UV-b peut induire significativement l’initiation de tumeur des mcscs mutants, l’application de l’écran solaire a montré considérablement supprimé l’initiation de tumeur induite par UV-b (16 jours après la deuxième irradiation UV-b). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: observation microscopique du mélanome cutané induit par les UV-B. Les souris ont été traitées avec du tamoxifène par injection IP pendant 3 jours (jour 1 à 3), suivies de 2 expositions UV-B (jour 4 et 5). (A-C) L’initiation précoce de tumeurs dans l’épiderme interfolliculaire démontrée par le traçage de la lignée tdTomato peut être montrée au jour 17. (A) les cellules tumorales tdtomato + sont montrées migrer du follicule pileux dans l’épiderme interfolliculaire. DAPI est utilisé comme une tache de compteur nucléaire. (B) la coloration DAPI est enlevée et la ligne pointillée indique l’emplacement des follicules pileux et de l’épiderme interfolliculaire. (C) schéma indiquant la migration de tdTomato+ cellules du germe capillaire vers l’épiderme interfolliculaire après exposition aux UV-B. Modifié de Moon et coll.6. (D-F) Ensuite, les cellules tumorales poussent rapidement et envahissent les tissus cutanés ci-dessous (jour 25). (D) les cellules tumorales tdtomato+ ont continué à proliquer et à envahir les tissus cutanés. DAPI est utilisé comme une tache de compteur nucléaire. (E) la coloration DAPI est enlevée et la ligne pointillée indique l’emplacement des follicules pileux et de l’épiderme interfolliculaire. (F) schéma indiquant le tdTomato+ invasion cellulaire dans le derme et la croissance des tumeurs mélanocytaires. Modifié de Moon et coll.6. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: observation macroscopique et microscopique du mélanome induit par l’UV-B dans la peau de l’oreille. A) système expérimental. Les souris ont été traitées par le tamoxifène pendant 3 jours (jour 1 à 3), suivies de 3 expositions à l’irradiation UV-B (jour 4, 6 et 8). Bune augmentation significative de l’initiation du mélanome par irradiation UV-B a été observée macroscopiquement ainsi que microscopiquement au jour 28. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Les altérations génétiques de marque fréquemment trouvées dans les tumeurs cutanées de mélanome ont été bien décrites13. La mutation de conducteur la plus dominante est BRAFV600E, et un modèle de souris génétiquement modifié pour le mélanome de BRAFV600Ea été généré par le groupe Bosenberg14 et déposé dans le laboratoire de Jackson. En utilisant ce modèle de souris, notre étude récente a démontré l’exigence de l’activation cellulaire des MCSCs sujettes à la tumeur pour l’initiation significative du mélanome médié par le BRAFV600Edans la peau dorsale6.
La dépilation est connue pour être une méthode efficace pour induire l’activation de cellules souches de follicule pileux murin sur la peau dorsale6,10. Les MCSCs de murine sont situés dans les follicules pileux, et en outre, l’État cellulaire des MCSCs folliculaires est synchronisé avec l’état des cellules souches de follicule pileux8. La modulation artificielle des cellules souches de follicule pileux peut altérer le statut MCSC, ainsi la dépilation peut activer directement les cellules souches des mélanocytes et des follicules pileux. Cette méthode d’activation pour les MCSCs peut être appliquée aux MCSC sujettes aux tumeurs pour examiner les premiers pas de l’initiation du mélanome cutané dans les modèles de souris génétiquement modifiées. Grâce à une méthode de dépilation chimique, la formation de mélanome dans la région d’intérêt dans la peau dorsale murin peut être initiée directement. La dépilation peut être effectuée par diverses méthodes telles que l’épilation à la cire ou le plucking, qui sont tous deux des types d’épilation mécanique où les arbres à cheveux sont extraits du follicule pileux. Cependant, ces méthodes de dépilation mécanique peuvent être imprécises en ce qui concerne une région spécifique d’intérêt. D’autre part, une méthode de dépilation chimique utilisant la crème d’épilation est simple à effectuer et permet une application précise avec une activation fiable du cycle des cheveux, et peut être moins sévère sur la peau que l’enlèvement mécanique.
Parmi les divers facteurs de risque, l’UV-B est le facteur de risque le plus connu dans le mélanome cutané15. L’irradiation UV-B est connue pour induire la migration directe des MCSC folliculaires dans l’épiderme interfolliculaire9. En outre, l’UV-B est un puissant facteur de stress environnemental qui peut induire significativement l’initiation du mélanome à partir de MCSCs à tendance tumorale6. Dans le protocole expérimental décrit ci-dessus, une petite région d’intérêt sur la peau dorsale murin peut être exposée à la lumière UV-B tandis que l’utilisation d’un chiffon résistant aux UV protège facilement le reste de la souris contre l’exposition indésirable. Ce traitement peut être effectué pendant que la souris est sous anesthésie. Il est important de noter que la migration des MCSCs et la formation du mélanome d’origine MCSC après l’exposition aux UV-b sont dépendantes de la dose d’UV-B6. Par conséquent, pour avoir des résultats réussis, il est important de vérifier régulièrement l’intensité de l’ampoule à l’aide d’un compteur UV-B et de régler le temps d’exposition et la distance entre la peau et les ampoules si nécessaire. Comme on le sait généralement, la peau peut brûler en réponse à une forte dose de lumière UV-B, mais une faible exposition aux UV-B est également préjudiciable à l’expérience car il sera insuffisant pour induire le mélanome d’origine MCSC.
Le protocole décrit ici se concentre principalement sur le facteur de risque environnemental, UV-B, dans la peau dorsale. Cependant, le protocole expérimental ci-dessus peut être appliqué à différents objectifs. Par exemple, le protocole peut être modifié avec des ampoules de spectres différents pour déterminer l’effet de sources lumineuses alternatives ou de longueurs d’onde d’UV, telles que UV-A. Ce protocole visait principalement la peau dorsale telle qu’elle est accessible et le statut des MCSC est bien défini. Cependant, il peut également être modifié pour cibler l’exposition de la lumière UV aux appendices tels que l’oreille, la queue ou la peau de paume, y compris les coussinets de pied. À titre d’exemple, dans la figure 6, il est possible d’examiner la différence possible dans la formation précoce de tumeurs mélanocytaires dans des sites de tissus alternatifs. Cependant, contrairement à la peau dorsale, le statut des MCSC dans ces sites est moins bien défini; par conséquent, l’activation spontanée potentielle de MCSCs conduisant à des occurrences aléatoires de la formation de mélanome devrait être envisagée. Par conséquent, par rapport au protocole dans la peau dorsale, d’autres approches nécessiteront un nombre accru d’expériences pour obtenir des résultats expérimentaux précis.
De plus, alors que le protocole actuel démontre principalement l’initiation du mélanome par le BRAFV600E, notre étude précédente a également rapporté une formation similaire de mélanome précoce avec une combinaison de RAS/PTEN oncogénique, en utilisant le LSL-KrasG12D allèle génétique6. Cependant, d’autres mutations du conducteur comme les gènes nras mutants peuvent également être envisagées avec le système expérimental décrit ici pour comprendre l’initiation précoce du mélanome entraînée par d’autres combinaisons oncogéniques.
Pris ensemble, décrit ici est un système de modèle in vivo qui permet l’examen de l’initiation du mélanome cutané précoce chez les souris génétiquement modifiées. Ces modèles murins fournissent les méthodes de contrôle temporel et spatial de l’initiation du mélanome à partir de MCSCs mutants dans la peau. Ces protocoles fournissent un nouveau paradigme pour étudier les mécanismes de l’initiation précoce du mélanome à partir de MCSCs à tendance tumorale ainsi qu’une plate-forme pour déterminer les facteurs de stress physiologiques et environnementaux qui peuvent contribuer à l’initiation du mélanome. Ce niveau de contrôle spatio-temporel peut également fournir un outil pour l’induction plus précise de mélanome pour tester l’efficacité de médicament dans la prévention de la formation de mélanome, aussi bien que la croissance tumorale.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été appuyé par le Bureau du sous-secrétaire à la défense pour les affaires de santé, par l’entremise du programme de recherche sur le cancer par les pairs sous le prix W81XWH-16-1-0272. Les opinions, les interprétations, les conclusions et les recommandations sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement approuvées par le ministère de la défense. Ce travail a également été appuyé par une subvention de semences du programme de cellules souches de Cornell à A.C. White. H. Moon a été soutenue par le Cornell Center for Vertéate génomique Scholar Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
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