Summary

Control espacial y temporal de la iniciación del melanoma murino a partir de células madre de melanocitos mutantes

Published: June 07, 2019
doi:

Summary

El siguiente procedimiento describe un método para el control espacial y temporal del inicio del tumor melanocítico en la piel dorsal murina, utilizando un modelo de ratón modificado genéticamente. Este protocolo describe el inicio de melanoma cutáneo macroscópico y microscópico.

Abstract

El melanoma cutáneo es bien conocido como el cáncer de piel más agresivo. Aunque los factores de riesgo y las principales alteraciones genéticas continúan documentándose con una profundidad cada vez mayor, la tasa de incidencia del melanoma cutáneo ha mostrado un aumento rápido y continuo durante las últimas décadas. Con el fin de encontrar métodos preventivos efectivos, es importante entender los primeros pasos de iniciación del melanoma en la piel. Los datos anteriores han demostrado que las células madre foliculares de melanocito (MCSC) en los tejidos de la piel adulta pueden actuar como células del melanoma de origen al expresar mutaciones oncogénicas y alteraciones genéticas. La tumorigénesis derivada de los MCSC propensos al melanoma puede inducirse cuando la MCSCs se transición de un estado inactivo al activo. Esta transición en MCSCs propenso al melanoma puede ser promovida por la modulación del estado de actividad de las células madre del folículo piloso o a través de factores ambientales extrínsecos como el ultravioleta-B (UV-B). Estos factores pueden ser manipulados artificialmente en el laboratorio por depilación química, lo que provoca la transición de las células madre del folículo piloso y MCSC de un estado inactivo a activo, y por la exposición UV-B usando una luz de sobremesa. Estos métodos proporcionan un control espacial y temporal exitoso del inicio del melanoma cutáneo en la piel dorsal murina. Por lo tanto, estos sistemas modelo in vivo serán valiosos para definir los primeros pasos del inicio del melanoma cutáneo y podrían utilizarse para probar métodos potenciales para la prevención de tumores.

Introduction

El melanoma, la forma maligna de los tumores melanocíticos, es el cáncer más agresivo en la piel con melanoma cutáneo responsable de la mayoría de las muertes por cáncer de piel1. En los Estados Unidos, el melanoma es comúnmente diagnosticado; se proyecta que es el tipo de cáncer más común de 5 a 6 entre los nuevos casos de cáncer estimados en 20182. Además, si bien las incidencias generales del cáncer han mostrado la tendencia de reducción gradual en las últimas décadas, las tasas de incidencia de melanoma cutáneo durante las últimas décadas demuestran un aumento continuo y rápido en ambos sexos2.

Para combatir el melanoma cutáneo de manera más eficiente, es importante comprender claramente los primeros acontecimientos del desarrollo del melanoma desde sus células de origen para identificar mejor los métodos preventivos clínicamente efectivos. Ahora se sabe que las células madre adultas pueden contribuir significativamente a la formación de tumores como los orígenes celulares de los cánceres en muchos tipos diferentes de órganos, incluyendo los tejidos de la piel3,4,5. Del mismo modo, las células madre adultas de melanocito (MCSC) en la piel dorsal murina pueden funcionar como células del melanoma de origen tras la activación aberrante de la Ras/Raf y las vías de Akt 6. Sin embargo, estas mutaciones oncogénicas por sí solas no son capaces de inducir eficientemente la formación de tumores de los MCSC en reposo. los tumor melanocíticos eventualmente se desarrollan cuando los MCSC se vuelven activos durante el ciclo natural del cabello. Sin embargo, en este protocolo, describiremos métodos para inducir artificialmente la activación celular de los mcscs propensos a tumores, facilitando así el control preciso de la iniciación del melanoma6,7.

A través de los métodos descritos aquí, el control espacial y temporal del inicio del melanoma cutáneo de MCSCs propensos a tumores que expresan BRAF oncogénicoV600E junto con la pérdida de la expresión PTEN se puede realizar con éxito, ya que han reportado previamente6. Este método incorpora hallazgos previos que demuestran la activación de las células del folículo piloso a través de la depilación, así como la exposición de la piel murina a UV-B puede facilitar la activación de los residentes de MCSCs en el folículo piloso y la translocación de este celular subpoblación a la epidermis interfolicular6,8,9,10. Estos sistemas modelo in vivo pueden proporcionar información valiosa sobre cómo los cambios fisiológicos y ambientales pueden alterar el estado celular de los MCSC propensos al melanoma, que a su vez pueden inducir un inicio significativo del melanoma en la piel.

Protocol

Todos los procedimientos en animales se realizan de acuerdo con el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Cornell (IACUC). 1. preparación Recoja los clips de la cola de los ratones postnatales de 12 días y digárelos en 400 μL de 0,05 N NaOH a 95 ° c durante 1 h. vórtice y añada 32 μL de Tris-HCl de 1 M, pH 7. Ratones de genotipo según protocolos de PCR proporcionados a través del laboratorio de Jackson e identifican ratones con genotip…

Representative Results

El inicio del melanoma cutáneo inducido por depilación química El procedimiento de depilación química se muestra en la figura 2. Cuando los ratones son de 7 semanas después del parto, su piel dorsal está en telógeno. Durante el telógeno, se sabe que las células madre del folículo piloso y los MCSC están en estado de reposo. La piel no debe mostrar un crecimiento signific…

Discussion

Las alteraciones genéticas distintivas que se encuentran frecuentemente en tumores de melanoma cutáneo han sido bien descritas13. La mutación del conductor más dominante es BRAFV600E, y un modelo de ratón genéticamente diseñado para el melanoma de BRAFV600Emediado fue generado por el grupo Bosenberg14 y depositado en el laboratorio Jackson. Con este modelo de ratón, nuestro estudio reciente demostró el requisito de la activac…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la oficina del Subsecretario de defensa para asuntos de salud, a través del programa de investigación de cáncer de Peer revisado bajo el premio W81XWH-16-1-0272. Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las de los autores y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de defensa. Este trabajo también fue apoyado por una subvención de semillas del programa de células madre de Cornell a A.C. White. H. Moon fue apoyada por el Cornell Center para el programa académico de genómica de vertebrados.

Materials

Tamoxifen Sigma T5648-1G For systemic injection
Tamoxifen Cayman Chemical 13258 For systemic injection
Corn oil Sigma 45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen Sigma H7904-25MG For topical treatment
26g 1/2" needles various Veterinary grade
1 mL syringe various Veterinary grade
Pet hair trimmer Wahl 09990-502
Hair removal cream Nair n/a Available at most drug stores
Cotton swabs various
Ultraviolet light bulb UVP 95-0042-08 model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol various pure ethanol
Histoplast PE Fisher Scientific 22900700 paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10% Sigma HT501128-4L
Clear-Rite 3 Thermo Scientific 6901 xylene substitute
O.C.T. Compound Thermo 23730571
Tissue Cassette Sakura 89199-430 for FFPE processing
Cryomolds Sakura 4557 25 x 20 mm
FFPE metal mold Leica 3803082 24 x 24 mm
Isoflurane various Veterinary grade
Anesthesia inhalation system various Veterinary grade
Fine scissor FST 14085-09 Straight, sharp/sharp
Fine scissor FST 14558-09 Straight, sharp/sharp
Metzenbaum FST 14018-13 Straight, blunt/blunt
Forcep FST 11252-00 Dumont #5
Forcep FST 11018-12 Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f Jackson Labs 13590
LSL-tdTomato Jackson Labs 007914 ai14
Cre-1 n/a GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG
Cre-2 n/a GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG
Braf-V600E-1 n/a TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2 n/a CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1 n/a AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA
Kras-G12D-2 n/a CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA
Pten-1 n/a ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2 n/a AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3 n/a GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1 n/a AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2 n/a CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3 n/a GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4 n/a CTGTTCCTGTACGGCATGG

References

  1. Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
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Cite This Article
Moon, H., Donahue, L. R., Kim, D., An, L., White, A. C. Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells. J. Vis. Exp. (148), e59666, doi:10.3791/59666 (2019).

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