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Cancer Research

स्थानिक और अस्थाई Mutant मेलेनोमा के नियंत्रण से उत्परिवर्ती Melanocyte स्टेम कोशिकाओं

Published: June 7, 2019 doi: 10.3791/59666
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Sciences, Cornell University
* These authors contributed equally

Summary

निंनलिखित प्रक्रिया का वर्णन एक स्थानिक और लौकिक नियंत्रण के लिए मेलोनोसाइटिक ट्यूमर मुरीन पृष्ठीय त्वचा में दीक्षा, एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल में मैक्रोस्कोपिक के साथ ही सूक्ष्म त्वचीय मेलानोमा दीक्षा का वर्णन है ।

Abstract

त्वचीय मेलेनोमा अच्छी तरह से सबसे आक्रामक त्वचा कैंसर के रूप में जाना जाता है । हालांकि जोखिम कारकों और प्रमुख आनुवंशिक परिवर्तन लगातार गहराई के साथ प्रलेखित किया जा करने के लिए जारी है, त्वचीय मेलेनोमा की घटना दर हाल के दशकों के दौरान एक तेजी से और लगातार वृद्धि दिखाई है । आदेश में प्रभावी preventative तरीकों को खोजने के लिए, यह त्वचा में मेलेनोमा दीक्षा के प्रारंभिक चरणों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । पिछले डेटा का प्रदर्शन किया है कि वयस्क त्वचा के ऊतकों में कूपिक melanocyte स्टेम सेल (mcscs) मूल के मेलेनोमा कोशिकाओं के रूप में कार्य जब अर्बुदीय उत्परिवर्तनों और आनुवंशिक परिवर्तन व्यक्त कर सकते हैं । मेलेनोमा-प्रवण MCSCs से उत्पन्न होने वाले ट्यूमर को प्रेरित किया जा सकता है जब MCSCs एक शांत से सक्रिय राज्य में संक्रमण करते हैं । मेलेनोमा-प्रवण MCSCs में इस संक्रमण या तो बाल कूप स्टेम ' कोशिकाओं गतिविधि राज्य या पराबैंगनी-बी (यूवी बी) के रूप में बाह्य पर्यावरणीय कारकों के माध्यम से के मॉडुलन द्वारा पदोंनत किया जा सकता है । इन कारकों कृत्रिम रूप से प्रयोगशाला में रासायनिक depilation द्वारा हेरफेर किया जा सकता है, जो बाल कूप स्टेम सेल और MCSCs के संक्रमण का कारण बनता है एक शांत से सक्रिय राज्य के लिए, और यूवी बी जोखिम द्वारा एक बेंच टॉप प्रकाश का उपयोग । इन तरीकों से murine पृष्ठीय त्वचा में त्वचीय मेलानोमा दीक्षा का सफल स्थानिक और लौकिक नियंत्रण प्रदान करते हैं । इसलिए, vivo मॉडल सिस्टम में इन त्वचीय मेलानोमा दीक्षा के प्रारंभिक कदम को परिभाषित करने के लिए मूल्यवान हो जाएगा और ट्यूमर की रोकथाम के लिए संभावित तरीकों का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

मेलानोमा, मेलानोसाइटिक ट्यूमर का घातक रूप त्वचा कैंसर से होने वाली मौतों के बहुमत के लिए त्वचीय मेलानोमा जिम्मेदार के साथ त्वचा में सबसे अधिक आक्रामक कैंसर है1. संयुक्त राज्य अमेरिका में, मेलेनोमा सामांयतः निदान किया है; यह २०१८2में अनुमानित नए कैंसर के मामलों के बीच सबसे आम कैंसर प्रकार के 5वें से 6वें होने का अनुमान है । इसके अलावा, जबकि कुल मिलाकर कैंसर की घटनाओं हाल के दशकों में क्रमिक कमी की प्रवृत्ति को दिखाया है, त्वचीय मेलेनोमा घटना दर पिछले कुछ दशकों के दौरान दोनों लिंग2में एक निरंतर और तेजी से वृद्धि प्रदर्शित करता है ।

त्वचीय मेलेनोमा का मुकाबला करने के लिए और अधिक कुशलता से, यह स्पष्ट रूप से अपने मूल की कोशिकाओं से मेलेनोमा विकास की प्रारंभिक घटनाओं को समझने के लिए बेहतर नैदानिक प्रभावी preventative तरीकों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है । अब यह ज्ञात है कि वयस्क स्टेम सेल काफी त्वचा ऊतकों3,4,5सहित अंगों के कई विभिंन प्रकार में कैंसर के सेलुलर मूल के रूप में ट्यूमर गठन के लिए योगदान कर सकते हैं । इसी तरह, murine पृष्ठीय त्वचा में वयस्क melanocyte स्टेम सेल (MCSCs) मूल की मेलेनोमा कोशिकाओं के रूप में काम कर सकते है आरएएस/ तथापि, केवल ये ऑनकोजेनिक म्यूटेशन ही शांत MCSCs से ट्यूमर के गठन को कुशलतापूर्वक प्रेरित नहीं कर पाते हैं । मेलानोसाइटिक ट्यूमर अंततः विकसित जब MCSCs प्राकृतिक बाल साइकिल चालन के दौरान सक्रिय हो जाते हैं । हालांकि, इस प्रोटोकॉल में, हम तरीकों का वर्णन करने के लिए कृत्रिम रूप से ट्यूमर के सेलुलर सक्रियण प्रेरित mcscs, इस प्रकार मेलेनोमा दीक्षा6,7के सटीक नियंत्रण की सुविधा ।

यहां वर्णित तरीकों के माध्यम से, स्थानिक और ट्यूमर-प्रवण mcscs अर्बुदीय braf व्यक्तV600E साथ pten अभिव्यक्ति की हानि के साथ, के रूप में हम पहले6रिपोर्ट की है । इस विधि पिछले निष्कर्षों कि बाल कूप के माध्यम से स्टेम सेल सक्रियण प्रदर्शन के रूप में अच्छी तरह के रूप में कैसे murine त्वचा के यूवी-बी के लिए जोखिम MCSCs निवासी के बाल कूप और इस सेलुलर के स्थानांतरण के लिए सक्रियण की सुविधा कर सकते है शामिल अंत: पुटकीय एपिडर्मिस6,8,9,10के लिए उपजनसंख्या । Vivo मॉडल सिस्टम में इन के बारे में बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकते है कैसे शारीरिक और पर्यावरण परिवर्तन मेलेनोमा की सेलुलर स्थिति-प्रवण MCSCs, जो बदले में मेलेनोमा की त्वचा में महत्वपूर्ण दीक्षा पैदा कर सकते है बदल सकते हैं ।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं कॉर्नेल विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के अनुसार किया जाता है ।

1. तैयारी

  1. 12 दिन प्रसवोत्तर चूहों से पूंछ क्लिप ले लीजिए और ९५ डिग्री सेल्सियस पर ०.०५ एन NaOH के ४०० μL में 1 एच भंवर के लिए और जोड़ने के ३२ μL 1 मीटर Tris-एचसीएल, पीएच 7 । जेनोटाइप चूहे जैक्सन प्रयोगशाला के माध्यम से प्रदान किए गए पीसीआर प्रोटोकॉल्स के अनुसार और ब्याज6के जीनोटाइप वाले चूहों की पहचान करते हैं ।
    - Tyr-CreER -hemygous (+/
    - Lsl-brafV600E – विषम युग्मज (+/
    - Pten- समयुग्मज फलोक्ष (फ्लॉक्स/
    - Lsl-tdTomato -hemygous (+/
    नोट: सामग्री तालिकामें प्राइमर अनुक्रम प्रदान किए जाते हैं ।
  2. एक बाल क्लिपर (इलेक्ट्रिक trimmer) का प्रयोग करें पृष्ठीय त्वचा दाढ़ी के लिए नीचे वर्णित सभी प्रयोगों से पहले 2 से 3 दिन, और जब चूहे लगभग 7 सप्ताह की उंर के हैं । किसी भी चोट के रूप में mcscs सहित बाल कूप स्टेम कोशिकाओं को सक्रिय करेगा जो एक घाव हीलिंग प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना हो सकता है के रूप में बिजली ट्रिमर का उपयोग कर पतली माउस त्वचा को नुकसान नहीं ध्यान रखना ।
  3. निर्धारित करें कि बाल चक्र टेलोजन में है और क्या त्वचा की प्रतीक्षा अवधि के दौरान घायल है । यदि त्वचा चोट के किसी भी संकेत से पता चलता है, माउस इन प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए ।
    नोट: हालांकि बाल चक्र थोड़ा आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बीच अलग हो सकता है, इस उंर में पृष्ठीय त्वचा में बाल चक्र आमतौर पर टेलोजेन राज्य में11है । Tyr-क्रेयर ट्रांसजीन टेलोजन त्वचा में mcscs को लक्षित करेगा, और बाद में आनुवंशिक परिवर्तन, विशिष्ट मेलानोसाइट्स और मेलानोसाइटिक ट्यूमर सहित mcscs की सभी प्रजातियों में स्थायी रूप से व्यक्त किया जाएगा ।

2. Cre-Lox आनुवंशिक पुनर्संयोजन के लिए tamoxifen उपचार

  1. Intraperitoneal इंजेक्शन (आईपी) या प्रणालीगत या स्थानीयकृत आनुवंशिक पुनर्संयोजन के लिए सामयिक प्रशासन के लिए tamoxifen की तैयारी
    नोट: Tamoxifen के लिए पुनर्संयोजन पैदा करने के लिए आदेश में, यह सबसे पहले 4 करने के लिए जिगर द्वारा metabolized किया जाना चाहिए-hydroxytamoxifen (4-OHT), जो करने के लिए बाध्य और Creerको सक्रिय कर सकते हैं. Tamoxifen के सामयिक आवेदन इस तरह से metabolized नहीं किया जाएगा और 4-OHT सीधे इस्तेमाल किया जाना चाहिए. पर्याप्त पुनर्संयोजन के लिए tamoxifen प्रसव की केवल एक विधि की आवश्यकता है ।
    1. Tamoxifen: 10 मिलीग्राम मिलीलीटर की एकाग्रता पर Tamoxifen तैयार-1 मकई के तेल में भंग । समाधान में दवा के विघटन में सहायता करने के लिए, पाउडर के रूप में दवा के लिए १००% आणविक ग्रेड इथेनॉल की कुल मात्रा 10% तक जोड़ने, भंवर 3 मिनट के लिए और फिर मकई तेल की शेष मात्रा जोड़ें । भंवर के लिए जारी रखें जब तक क्रिस्टलीय सामग्री अब समाधान में स्पष्ट है । Tamoxifen समाधान एक ०.२ μm फिल्टर के माध्यम से पारित द्वारा निष्फल किया जा सकता है । उपचार के लिए कदम 2.2.1 के लिए आगे बढ़ें ।
    2. 4-ओएचटी: १००% एथेनॉल में हाइड्रोजाइटामोक्सिफेन का स्टॉक सॉल्यूशन 3 मिग्रा मल-1 तक तैयार करें । फिर, एक काम समाधान के रूप में ज्यादा के लिए ब्याज की त्वचा क्षेत्र को कवर की जरूरत के रूप में लागू किया जा सकता है (आम तौर पर एक ही आवेदन) ।
      नोट: Hydroxytamoxifen का एक स्टॉक समाधान 5 मिमी के अंतिम एकाग्रता के लिए १००% इथेनॉल में भंग किया जा सकता है. फिर, एक कार्यशील समाधान तैयार करने के लिए, 4OH-टैक्सिफेन स्टॉक समाधान के 5 μL को १००% इथेनॉल के 15 μL में पतला किया जा सकता है । 4 मिमी2 क्षेत्र के लिए, कार्य समाधान के 1 से 3 μl topically लागू किया जा सकता है ।
  2. Tamoxifen के साथ या तो प्रणालीबद्ध या topically चूहों का इलाज
    1. प्रणालीगत उपचार के लिए, 3 दिन एक 26 जी सुई का उपयोग करने के लिए दैनिक एक बार आईपी इंजेक्शन के माध्यम से tamoxifen के 2 मिलीग्राम प्रशासन ।
      नोट: इस मॉडल का उपयोग करते हुए, लगभग ९३%, शांत MCSCs के ± 4% Tdटमाटो6के साथ लेबल रहे हैं ।
    2. क्षेत्रीय सक्रियण के लिए, 4-OHT के साथ एक सामयिक उपचार निष्पादित करें । काम समाधान के साथ ब्याज की त्वचा क्षेत्र को कवर । काम कर समाधान की राशि कदम 2.1.2 में वर्णित के रूप में ब्याज के क्षेत्र के आकार के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है ।
  3. Tamoxifen की अंतिम खुराक के बाद ४८ एच में, रासायनिक विरोमण प्रेरित ट्यूमर दीक्षा के लिए चरण 3 के लिए आगे बढ़ना या यूवी-बी प्रेरित ट्यूमर दीक्षा के लिए 4 कदम

3. रासायनिक Depilation

  1. एक माउस उपचार निंनलिखित आवश्यक सामग्री के साथ एक isoflurane प्रणाली युक्त कमरे से लैस: बाल हटाने क्रीम, सूती, झाड़ू, कागज कपड़े, और पानी ।
  2. ४.५% isoflurane और 1 L/ंयूनतम ऑक्सीजन के साथ ३.५ के साथ प्रेरण चैंबर और anesthetize में माउस प्लेस ।
  3. एक बार श्वसन दर स्थिर हो गया है, की पुष्टि करें कि माउस एक पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन करके संज्ञाहरण के उचित विमान में है और 1 से १.५% isoflurane और 1 L/ंयूनतम ऑक्सीजन के साथ मुख्य ट्यूब संज्ञाहरण को बनाए रखने के लिए माउस हस्तांतरण । एनेस्थिसिया के तहत आंखों को सूखने से रखने के लिए आई ऑइंटमेंट लगाएं ।
  4. एक कपास झाड़ू का उपयोग करने के लिए बाल हटाने क्रीम की एक पतली परत को लागू करने के लिए माउस त्वचा के मुंडा क्षेत्र ।
  5. एक बार क्रीम समान रूप से लागू किया गया है, हटाने शुरू करने के लिए स्वच्छ कपास झाड़ू का उपयोग करें । क्रीम त्वचा के साथ संपर्क में है कि कुल समय 1 मिनट से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  6. धीरे से एक नम कागज कपड़े के साथ त्वचा पोंछ और सुनिश्चित करें कि किसी भी अवशिष्ट क्रीम हटा दिया गया है ।
    नोट: हेयर रिमूवल क्रीम अगर इसे पूरी तरह से ना निकाला जाए तो त्वचा में जलन पैदा हो सकती है । कुछ चूहों, जैसे उन पर एक C57BL/6 पृष्ठभूमि,12जिल्द की सूजन के विकास के लिए प्रवण किया जा सकता है । हालांकि दुर्लभ, कुछ जानवरों बाल हटाने क्रीम आवेदन या यांत्रिक depilation के बाद 24 घंटे के भीतर जिल्द की सूजन का विकास होगा । चूहों के उपचार के बाद दिन की जांच करने के लिए क्षेत्रीय त्वचा जलन के किसी भी लक्षण के लिए देखने के लिए सुनिश्चित करें ।
  7. हटाए गए बाल शाफ्ट और biohazard बिन में इस्तेमाल किया किसी भी सामग्री त्यागें ।
  8. एक खाली, साफ माउस पिंजरे में जब तक संज्ञाहरण पहना है माउस रखें ।
  9. चूहों को उनके पिंजरों में लौटाएं ।

4. यूवी-बी किरणन

  1. निंनलिखित आवश्यक सामग्री के साथ एक isoflurane प्रणाली युक्त एक माउस उपचार कमरे से लैस: यूवी बी प्रकाश प्रणाली, यूवी बी प्रकाश मीटर, माउस के लिए सुरक्षा को कवर, अतिरिक्त यूवी-बी शोधकर्ता के लिए सुरक्षात्मक PPE, और एक टाइमर ।
  2. चूहों ब्याज की यूवी बी खुराक पर विकिरणित किया जाना चाहिए (यानी, 0-180 एमजे/सेमी2) । चूहों को किरणित करने के लिए समय की उचित लंबाई निर्धारित करने के लिए यूवी-बी प्रकाश मीटर का उपयोग करें ।
    नोट: मेगावाट/सेमी2 x समय = खुराक
  3. माउस को isoflurane के साथ संवेदनीकरण । जबकि प्रेरण चैंबर में, ३.५ का उपयोग ४.५% isoflurane और 1 L/
  4. एक बार माउस स्थिर हो जाता है, एक पैर की अंगुली चुटकी के साथ संज्ञाहरण प्रभाव की पुष्टि करें और यूवी चैंबर में स्थित मुख्य संज्ञाहरण ट्यूब के लिए माउस हस्तांतरण । एनेस्थिसिया के तहत आंखों को सूखने से रोकने के लिए आई ऑइंटमेंट लगाएं । 1 से १.५% isoflurane और 1 L/ंयूनतम ऑक्सीजन के साथ संज्ञाहरण बनाए रखें ।
  5. यूवी-बी सुरक्षात्मक सामग्री के साथ पृष्ठीय त्वचा को कवर इतना है कि केवल वांछित क्षेत्र उजागर किया जाएगा ।
    नोट: इस समय उचित पीपीई का उपयोग किया जाना चाहिए । माउस को किरणित करने के लिए आवश्यक समय की लंबाई उपयोग किए गए प्रकाश बल्ब की तीव्रता पर निर्भर करती है, लेकिन यदि आवश्यक समय 30 से अधिक हो तो संज्ञाहरण पर नजर रखने की आवश्यकता हो सकती है ।
  6. यूवी प्रतिरोधी ढक्कन या किसी भी अन्य उपयुक्त सामग्री का उपयोग पराबैंगनी कक्ष को कवर ।
  7. यूवी-बी लैंप को चालू करें और विशिष्ट उद्देश्य के लिए शोधकर्ताओं द्वारा निर्धारित समय के लिए माउस को किरणित करे ।
  8. यूवी प्रणाली और isoflurane बंद करें, तो एक खाली माउस पिंजरे के लिए माउस जगह जब तक संज्ञाहरण बंद पहना है ।
  9. चूहों को उनके पिंजरों में लौटाएं ।

5. ऊतक प्रसंस्करण

  1. त्वचा अलगाव
    1. निंनलिखित प्राप्त करने से पहले शुरू: necropsy उपकरण, फिल्टर कागज और कागज तौलिए।
    2. IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार चूहों euthanize, और आगे बढ़ने से पहले मौत की पुष्टि करें ।
    3. एक बाल क्लिपर का उपयोग करना, पृष्ठीय त्वचा क्षेत्र से किसी भी बाल दाढ़ी । हल्के से एक लिंट मुक्त ऊतक के साथ क्षेत्र को साफ करने के लिए क्षेत्र स्पष्ट ।
    4. पूंछ के आधार के ठीक ऊपर तेज कैंची से एक छोटा सा चीरा बनाओ ।
    5. चीरा में बड़े कुंद कैंची डालें और subdermal संयोजी ऊतकों को अलग.
    6. ध्यान से ऊतक के किनारे के साथ तेज कैंची के साथ काटने से ब्याज की त्वचा क्षेत्र को अलग ।
    7. एक साफ कागज तौलिया पर त्वचा के ऊतकों प्लेस और सुस्त संदंश का उपयोग करने के लिए त्वचा खिंचाव इतना है कि यह तौलिया का पालन करता है और सिखाया जाता है । इस कदम को ऊतक के लिए अतिरिक्त सहायता प्रदान करने के लिए इतना है कि यह हेरफेर किया जा सकता है और संसाधित करते हुए अपने आकार को बनाए रखने के कार्य करता है ।
      नोट: केवल त्वचा ऊतक के बाहरी क्षेत्रों को संभालने के लिए सावधान रहना, के रूप में संदंश त्वचा जो histologically देखा जा सकता है को नुकसान हो सकता है ।
  2. ऊतक नियतन
    1. आधे और लेबल में फिल्टर कागज के एक टुकड़े को उचित रूप से मोड़ें । तह पेपर में कागज तौलिया समर्थन के साथ साथ त्वचा प्लेस तुरंत क्रीज के निकट, यह सुनिश्चित करना है कि नमूना चिकनी है और तह या crumpled नहीं है । खुले पक्षों स्टैपल द्वारा फिल्टर कागज सील, और फिर ट्रिम कर दीजिए ताकि शेष कागज भविष्य के नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      नोट: यह कदम इसलिए किया जाता है ताकि फिक्सेशन के दौरान स्किन का शेप बरकरार रहे ।
    2. पूरी तरह से कमरे के तापमान पर या रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 से 5 घंटे के लिए 10% तटस्थ buffered फॉर्मेलिन में ऊतक के नमूने डूब ।
    3. निर्धारण के बाद, formalin से नमूनों को हटाने, विआयनीकृत पानी (2x, 5 मिनट प्रत्येक) में धोने और ऊतक ब्लॉकों बनाने के लिए आगे बढ़ें । ध्यान से त्वचा ऊतक (यानी, अवशिष्ट कागज) से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को हटा दें ।
  3. जमे हुए ऊतक ब्लॉक बनाना (चित्रा 1)
    1. त्वचा के नमूने के किनारों को छांटो ताकि वे दांतेदार नहीं है और फिर 3 सैसेटल कटौती कर रहे हैं । इन स्ट्रिप की चौड़ाई क्राउल्ड (5 एमएम) की ऊंचाई से ज्यादा नहीं होनी चाहिए । अगले, अनुप्रस्थ कटौती करने के लिए त्वचा के टुकड़े जो cryomold (20 मिमी) की चौड़ाई से अब नहीं कर रहे है और एंबेड किया जा सकता है । पृष्ठीय त्वचा के शेष आधे के साथ दोहराएं, या अंय उपयोगों के लिए ऊतक बचाने के (वैकल्पिक रूप से, आधा निर्धारण से पहले बचाने के लिए) ।
      नोट: यह उचित उंमुखीकरण में त्वचा के टुकड़े रखने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    2. एक चित्र अभिविंयास में cryomold (25 x 20 x 5 मिमी3) ओरिएंट और जगह अक्टूबर के शीर्ष पर त्वचा के 4 से 5 टुकड़े । एक बार सभी टुकड़ों जगह में हैं, ठीक संदंश के 2 जोड़े का उपयोग करने के लिए त्वचा की लंबी बढ़त cryomold के नीचे लाने के लिए । त्वचा अब अक्टूबर के लम्बवत् मोल्ड के आधार पर खड़ा होना चाहिए । इस कदम के दौरान अक्टूबर के भीतर हवा जेब के गठन को कम करने के लिए ध्यान रखना (चित्रा 1) ।
    3. दूसरे होंठ के लिए अक्टूबर के साथ मोल्ड भरें, और सूखी बर्फ की सपाट सतह पर जगह है । का प्रयोग करें संदंश किसी भी त्वचा टुकड़े कि हस्तांतरण के दौरान स्थानांतरित कर सकते है समायोजित के रूप में ब्लॉक को फ्रीज शुरू होता है । एक बार नीचे की परत जम जाती है, ऊतकों में हेरफेर असंभव हो जाएगा ।
    4. विश्लेषण के लिए 8-10 μm स्लाइड्स काटें ।
  4. Formalin फिक्स्ड पैराफिन एंबेडेड (FFPE) ऊतक ब्लॉकों बनाना
    1. प्लेस एक लेबल कैसेट में स्थिर त्वचा के 2 टुकड़े और इथेनॉल की सांद्रता बढ़ाने में डिहाइड्रेट (30 मिनट के लिए ७५% इथेनॉल, 30 मिनट के लिए ८५%, 30 मिनट के लिए ९०%, 30 मिनट के लिए ९५%, 2x 30 मिनट के लिए १००%, जाइलिन या जाइलिन विकल्प 2x 30 के लिए) । 58-60 ° पर पैराफिन के साथ सेते, पहले 30 मिनट के लिए, और फिर रात भर ।
    2. तरल पैराफिन के साथ एक 24 x 24 मिमी2 स्टेनलेस स्टील ऊतक मोल्ड में ऊतक एम्बेड करें और-5 डिग्री सेल्सियस पर जमना । ऊतक उंमुखीकरण जमे हुए ऊतक ब्लॉकों की है कि इतना है कि एकाधिक बालों के रोम के पार अनुदैर्ध्य वर्गों कल्पना किया जा सकता है (चित्रा 1) के समान होना चाहिए ।
    3. एक बार पैराफिन जम गया है, मोल्ड हटाने और विश्लेषण के लिए 5-10 μm वर्गों में कटौती ।

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Representative Results

त्वचीय मेलानोमा रासायनिक विकृति से प्रेरित दीक्षा

रासायनिक विपिलन की प्रक्रिया को चित्र 2में दर्शाया गया है । जब चूहों 7 सप्ताह प्रसवोत्तर हैं, उनके पृष्ठीय त्वचा टेलोजन में है । टेलोजन के दौरान, बाल कूप स्टेम सेल और MCSCs एक शांत, आराम की स्थिति में जाना जाता है । शेविंग के बाद स्किन को कोई खास हेयर ग्रोथ नहीं दिखानी चाहिए । दूसरी ओर, रासायनिक विरोमण बाल कूप स्टेम सेल सक्रियकरण, जो बदले में ब्याज के क्षेत्र से महत्वपूर्ण बाल विकास से पता चलता है (चित्रा 2) को प्रेरित कर सकते हैं । इसी प्रकार, ट्यूमर के संभावित mcscs भी अर्बुदीय उत्परिवर्तनों को व्यक्त करने के लिए तेजी से ट्यूमर गठन के लिए सक्रिय होने की जरूरत है । रासायनिक विपिलन काफी बाल कूप स्टेम सेल और mcscs के सक्रियण को प्रेरित कर सकते हैं । मेलेनोमा एक सक्रिय राज्य में mcscs प्रवण ट्यूमर फार्म कर सकते हैं, और सूक्ष्म मेलेनोमा दीक्षा 2 सप्ताह के भीतर रासायनिक विरोमण के बाद मनाया जा सकता है का उपयोग वंशावली एलील एलएसएल-tdTomato (चित्र 3)

त्वचीय मेलानोमा यूवी-बी विकिरण से प्रेरित दीक्षा

रासायनिक depilation के लिए इसी प्रकार, यूवी बी शांत ट्यूमर प्रवण MCSCs से ट्यूमर दीक्षा प्रेरित कर सकते हैं (चित्रा 4). जबकि एक शांत राज्य में ट्यूमर प्रवण MCSCs युक्त murine त्वचा कोई महत्वपूर्ण ट्यूमर दीक्षा और महत्वपूर्ण pigmentation की कमी से पता चलता है, पृष्ठीय त्वचा को उजागर यूवी बी (दो बार, १८० mJ/ स्थूल रूप से स्पष्ट हैं (चित्र 4a, ब) । जबकि यूवी बी काफी 2 सप्ताह के भीतर macroscopically स्पष्ट ट्यूमर दीक्षा प्रेरित कर सकते हैं, सनस्क्रीन के आवेदन त्वचा में यूवी-बी मध्यस्थता मेलेनोमा दीक्षा की रक्षा कर सकते हैं, एक यूवी प्रतिरोधी कपड़े के समान (चित्रा 4C, डी) ।

महत्वपूर्ण बात, यूवी बी अपने कूपिक स्टेम सेल आला से अंत: कूपिक epidermis के लिए MCSCs के प्रत्यक्ष स्थानांतरण लाती है । इसके अलावा, यूवी बी mcsc उत्पन्न कर सकते हैं-त्वचीय मेलेनोमा गठन interfollicular epidermis भर में, और सूक्ष्म फेनोटाइप के द्वारा मनाया जा सकता है पता लगाने के वंशावली मार्कर, tdटमॅटो (चित्रा 5) । इन ट्यूमर कोशिकाओं के रूप में घातक हैं, वे तेजी से और invasively बढ़ने (चित्रा 5) । पृष्ठीय त्वचा के समान, यूवी बी प्रेरित मेलानोमा दीक्षा विशेष रूप से अन्य त्वचा क्षेत्रों में मनाया जा सकता है, इस तरह के कान त्वचा के रूप में (चित्रा 6). नियंत्रण यूवी प्रतिरोधी कपड़े से कवर त्वचा की तुलना में, कान त्वचा यूवी-बी को उजागर करने मेलेनोमा दीक्षा का एक उच्च बोझ के कारण उच्च pigmentation दर्शाता है (चित्रा 6) ।

Figure 1
चित्रा 1: त्वचा ऊतक अलगाव और cryo-embedding । इच्छामृत्यु के बाद, ब्याज और cryomold अक्टूबर युक्त में एंबेड त्वचा के माउस पृष्ठीय त्वचा क्षेत्र दाढ़ी । माउस पर बिंदीदार रेखा मध्यरेखा का प्रतिनिधित्व करती है । आम तौर पर, 3 या 4 त्वचा के टुकड़े midline साथ लाइन खंड 3-4 के साथ अलग किया जा सकता है; ऐसा ही एक टुकड़ा 1/2/3/4 आयत द्वारा दर्शाया गया है । ये त्वचा के टुकड़े OCT में एंबेडेड के रूप में आंकड़ा में दिखाया जाना चाहिए । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: रासायनिक depilation के बाद स्थूल फीनोटाइप । (क) रासायनिक विपिलन का आरेख (ख) शेविंग के बाद बाल चक्र के टेलोजन में होने की पुष्टि हुई । (ग) बाल कूप, जो दोनों बाल कूप और melanocyte स्टेम कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते से बाल शाफ्ट को दूर करने के लिए रासायनिक विरोमण किया गया था । (घ) लगभग एक सप्ताह बाद, जल्दी बाल विकास आसानी से ध्यान देने योग्य हो जाएगा । (ङ) इसके बाद, समय के साथ-साथ बालों की महत्वपूर्ण वृद्धि देखी जा सकती है । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मेलेनोमा रासायनिक depilation द्वारा नियंत्रित दीक्षा का सूक्ष्म अवलोकन । रासायनिक विरोमण काफी शांत ट्यूमर के सक्रियण-प्रवण mcscs प्रेरित कर सकते हैं । तो, सूक्ष्म ट्यूमर दीक्षा के द्वारा प्रदर्शन किया गया था मार्कर Tdटमाटो अनुरेखण 2 सप्ताह के भीतर मनाया जा सकता है । इस आंकड़े को दर्शाता है सूक्ष्म फेनोटाइप 16 दिनों के बाद 3 दिन tamoxifen आईपी इंजेक्शन द्वारा रासायनिक विरोमण द्वारा पीछा दृश्य का एक ही क्षेत्र के विभिंन visualizations का उपयोग कर । (क) बाल कूप से निकलने वाली टीटटमाटर+ ट्यूमर कोशिकाएं, जो डी पी ए परमाणु काउंटर दाग के साथ विलीन हो जाती हैं । (ख) बाल कूप तथा अंतरापुटक बाह्यचर्म श्वेत में उल्लिखित हैं । (ग) एक योजनाबद्ध दिखा कैसे tdटमाटो+ ट्यूमर कोशिकाओं बाल कूप से Dermis में आक्रमण, चंद्रमा से संशोधित, एच एट अल.6. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4: यूवी-बी विकिरण द्वारा प्रेरित त्वचीय मेलेनोमा के स्थूल फेनोटाइप । चूहों tamoxifen द्वारा 3 दिन के लिए इलाज किया गया (3 करने के लिए दिन 1) 2 यूवी बी जोखिम के बाद (4 और 6 दिन). (क) उत्परिवर्ती एमसीएससी युक्त पृष्ठीय त्वचा पर यूवी-बी विकिरण का आरेख । (ख) नियंत्रण और यूवी-बी के बीच मैक्रोस्कोपिक फेनोटाइप पृष्ठीय त्वचा उजागर । महत्वपूर्ण काले melanocytic ट्यूमर गठन से संबंधित pigmentation 2 सप्ताह के भीतर दूसरी यूवी बी विकिरण के बाद मनाया जा सकता है । (ग) सनस्क्रीन एप्लीकेशन का आरेख । (घ) जबकि यूवी-बी काफी उत्परिवर्ती mcscs से ट्यूमर दीक्षा प्रेरित कर सकते हैं, सनस्क्रीन के आवेदन काफी दबाया यूवी बी-मध्यस्थता ट्यूमर दीक्षा (16 दिनों के बाद दूसरा यूवी-बी विकिरण) दिखाया । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: यूवी बी प्रेरित त्वचीय मेलेनोमा का सूक्ष्म अवलोकन । चूहे 3 दिन के लिए आईपी इंजेक्शन द्वारा tamoxifen के साथ इलाज किया गया (3 दिन) 2 यूवी बी जोखिम के बाद (4 दिन और 5) । (क-ग) प्रारंभिक में ट्यूमर दीक्षा interfollicular एपिडर्मिस वंशावली द्वारा प्रदर्शन Tdटमाटो 17 दिन में दिखाया जा सकता है । (क) tdटमाटो + ट्यूमर कोशिकाओं को बाल कूप से अंतपुटक एपिडर्मिस में माइग्रेट करते हुए दिखाया गया है । Dapi एक परमाणु काउंटर दाग के रूप में प्रयोग किया जाता है । (ख) dapi धुंधला हटा दिया जाता है और बिंदीदार रेखा बाल follicles और interfollicular एपिडर्मिस के स्थान को इंगित करता है । (ग) यूवी-बी उद्भासन के बाद इस प्रकार की योजनाबद्ध रूप से एक-दूसरे की त्वचा में जडटमाटर+ कोशिका प्रवास को दर्शाता है । चंद्रमा एट अल6से संशोधित । (D-F) फिर, ट्यूमर कोशिकाओं तेजी से बढ़ने और (25 दिन) नीचे चमड़े के ऊतकों पर आक्रमण । (घ) tdटमाटो+ ट्यूमर कोशिकाओं का प्रजनन और त्वचीय ऊतकों में आक्रमण जारी है । Dapi एक परमाणु काउंटर दाग के रूप में प्रयोग किया जाता है । (ई) dapi धुंधला हटा दिया जाता है और बिंदीदार रेखा बाल follicles और interfollicular एपिडर्मिस के स्थान को इंगित करता है । (च) डर्मिस और मेलानोसाइटिक ट्यूमर के विकास में tdटमाटो+ सेल आक्रमण को दर्शाते हुए योजनाबद्ध । चंद्रमा एट अल6से संशोधित । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: यूवी बी-कान त्वचा में मेलानोमा प्रेरित के स्थूल और सूक्ष्म अवलोकन । (क) प्रायोगिक योजना । चूहों tamoxifen द्वारा 3 दिन के लिए इलाज किया गया (3 दिन) यूवी बी विकिरण के लिए 3 जोखिम के बाद (दिन 4, 6 और 8). (ख) अत्यधिक वृद्धि हुई मेलानोमा को यूवी-बी विकिरण द्वारा प्रारंभ करने के दिन 28 को मैक्रोस्कोमिकली और माइक्रोस्कोप से देखा गया था । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

बानगी आनुवंशिक परिवर्तन अक्सर त्वचा मेलेनोमा ट्यूमर में पाया13अच्छी तरह से वर्णित किया गया है । सबसे प्रमुख चालक उत्परिवर्तन BrafV600Eहै, और brafV600Eके लिए एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल Mediated मेलेनोमा Bosenberg समूह14 द्वारा उत्पंन और जैक्सन प्रयोगशाला में जमा किया गया था । इस माउस मॉडल का उपयोग करना, हमारे हाल ही के अध्ययन में ट्यूमर के सेलुलर सक्रियण की आवश्यकता का प्रदर्शन-संभावित MCSCs के महत्वपूर्ण दीक्षा के लिए BrafV600E-mediated मेलेनोमा पृष्ठीय त्वचा में6.

Depilation पृष्ठीय त्वचा6,10पर murine बाल कूप स्टेम सेल सक्रियण प्रेरित करने के लिए एक प्रभावी विधि होने के लिए जाना जाता है । Murine MCSCs बाल कूप के भीतर स्थित हैं, और इसके अलावा, कूपिक MCSCs के सेलुलर स्थिति बाल कूप की स्थिति के साथ सिंक्रनाइज़ है8कोशिकाओं स्टेम । बाल कूप स्टेम कोशिकाओं के कृत्रिम मॉडुलन mcsc स्थिति में परिवर्तन कर सकते हैं, इस प्रकार विरोमण सीधे दोनों melanocyte और बाल कूप स्टेम कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं । Mcscs के लिए इस सक्रियकरण विधि ट्यूमर के लिए आवेदन किया जा सकता है-प्रवण mcscs आनुवंशिक रूप से इंजीनियर मेलानोमा माउस मॉडल में त्वचीय मेलेनोमा दीक्षा के प्रारंभिक चरण की जांच करने के लिए । एक रासायनिक विरोमण विधि के माध्यम से, murine पृष्ठीय त्वचा में ब्याज के क्षेत्र में मेलेनोमा गठन सीधे शुरू किया जा सकता है । Depilation ऐसे एपिलेशन या तोड़ के रूप में विभिंन तरीकों से किया जा सकता है, जो दोनों के यांत्रिक बालों को हटाने के प्रकार है जहां बाल शाफ्ट बाल कूप से निकाले जाते हैं । हालांकि, इन यांत्रिक विरोमण तरीकों ब्याज के एक विशिष्ट क्षेत्र के संबंध में imprecise जा सकता है । दूसरी ओर, बालों को हटाने क्रीम का उपयोग कर एक रासायनिक विरोमण विधि प्रदर्शन करने के लिए सरल है और बाल चक्र के विश्वसनीय सक्रियण के साथ सटीक आवेदन के लिए अनुमति देता है, और यांत्रिक हटाने की तुलना में त्वचा पर कम कठोर हो सकता है.

विभिन्न जोखिम कारकों में, यूवी-बी त्वचीय मेलानोमा15में सबसे अच्छी तरह से जाना जाता जोखिम कारक है । यूवी-बी विकिरण में कूपिक MCSCs के सीधे प्रवास के लिए प्रेरित करने के लिए जाना जाता है. इसके अलावा, यूवी बी एक मजबूत पर्यावरण तनाव है जो काफी ट्यूमर-प्रवण MCSCs6से मेलेनोमा दीक्षा प्रेरित कर सकते हैं । प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में ऊपर वर्णित है, murine पृष्ठीय त्वचा पर ब्याज की एक छोटी सी क्षेत्र यूवी-बी प्रकाश को उजागर किया जा सकता है, जबकि एक यूवी प्रतिरोधी कपड़े का उपयोग आसानी से अवांछित जोखिम से माउस के बाकी बचाता है । यह उपचार किया जा सकता है, जबकि माउस संज्ञाहरण के तहत है । महत्वपूर्ण बात, MCSCs के प्रवास और यूवी-बी जोखिम के बाद मेलेनोमा के गठन यूवी-बी-खुराक निर्भर6हैं । इसलिए, सफल परिणाम है करने के लिए, यह नियमित रूप से एक यूवी-बी मीटर का उपयोग कर प्रकाश बल्ब की तीव्रता की जाँच करें और जरूरत के रूप में त्वचा और प्रकाश बल्ब के बीच जोखिम समय और दूरी को समायोजित करने के लिए महत्वपूर्ण है । के रूप में आम तौर पर जाना जाता है, त्वचा यूवी बी प्रकाश की एक उच्च खुराक के जवाब में जला कर सकते हैं, लेकिन कमजोर यूवी बी प्रदर्शन भी प्रयोग करने के लिए हानिकारक है के रूप में यह MCSC उद्भव मेलेनोमा पैदा करने के लिए अपर्याप्त हो जाएगा.

प्रोटोकॉल यहां वर्णित मुख्य रूप से पृष्ठीय त्वचा में पर्यावरण जोखिम कारक, यूवी-बी पर केंद्रित है । हालांकि, इसके बाद के संस्करण प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल अलग उद्देश्य के लिए लागू किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, इस तरह के यूवी के रूप में वैकल्पिक प्रकाश स्रोतों या यूवी के तरंग दैर्ध्य के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए भिन्न स्पेक्ट्रोम के प्रकाश बल्बों के साथ प्रोटोकॉल संशोधित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल मुख्यतः पृष्ठीय त्वचा को लक्षित के रूप में यह सुलभ है और MCSCs की स्थिति अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है । हालांकि, यह भी पैर पैड सहित कान, पूंछ या हथेली त्वचा, के रूप में इस तरह के उपांग करने के लिए यूवी प्रकाश जोखिम को लक्षित करने के लिए बदल सकते हैं । एक उदाहरण के रूप में, चित्रा 6में, यह वैकल्पिक ऊतक साइटों पर जल्दी melanocytic ट्यूमर गठन में संभावित अंतर की जांच संभव है । हालांकि, पृष्ठीय त्वचा के विपरीत, इन साइटों में MCSCs की स्थिति कम अच्छी तरह से परिभाषित कर रहे हैं; इसलिए, मेलेनोमा गठन की यादृच्छिक आवृत्तियों के लिए अग्रणी MCSCs के संभावित सहज सक्रियण पर विचार किया जाना चाहिए । इसलिए, पृष्ठीय त्वचा में प्रोटोकॉल की तुलना में, वैकल्पिक दृष्टिकोण सही प्रयोगात्मक परिणाम प्राप्त करने के लिए प्रयोगों की संख्या में वृद्धि की आवश्यकता होगी.

इसके अलावा, जबकि वर्तमान प्रोटोकॉल मुख्यतः brafV600E-mediated मेलेनोमा दीक्षा दर्शाता है, हमारे पिछले अध्ययन भी एक अर्बुदीय रास के साथ इसी तरह जल्दी मेलेनोमा गठन की सूचना/ Lsl-krasG12D आनुवंशिक विकल्पी6। हालांकि, अन्य चालक म्यूटेशन जैसे उत्परिवर्ती एनआरए जीन भी प्रयोगात्मक प्रणाली के साथ विचार किया जा सकता है यहाँ वर्णित जल्दी मेलेनोमा अन्य अर्बुदीय संयोजनों द्वारा संचालित दीक्षा को समझने के लिए.

एक साथ लिया, यहां वर्णित vivo मॉडल प्रणाली है जो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों में जल्दी त्वचीय मेलानोमा दीक्षा की परीक्षा के लिए अनुमति देता है में एक है । ये murine मॉडल त्वचा में उत्परिवर्ती MCSCs से मेलेनोमा दीक्षा के अस्थाई और स्थानिक नियंत्रण के लिए तरीके प्रदान करते हैं । इन प्रोटोकॉल एक उपंयास के लिए ट्यूमर से जल्दी मेलेनोमा दीक्षा के तंत्र का अध्ययन प्रतिमान-प्रवण MCSCs के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक मंच के लिए शारीरिक और पर्यावरण तनाव है कि मेलेनोमा दीक्षा के लिए योगदान कर सकते है निर्धारित प्रदान करते हैं । Spatiotemporal नियंत्रण के इस स्तर पर भी अधिक सटीक मेलानोमा प्रेरण के लिए एक उपकरण प्रदान कर सकते हैं मेलेनोमा गठन को रोकने में दवा प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, साथ ही ट्यूमर वृद्धि.

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Disclosures

लेखकों ने हितों का टकराव नहीं होने की घोषणा की ।

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य मामलों के लिए रक्षा के सहायक सचिव के कार्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, पुरस्कार W81XWH-16-1-0272 के तहत सहकर्मी की समीक्षा की कैंसर अनुसंधान कार्यक्रम के माध्यम से । राय, व्याख्याओं, निष्कर्ष, और सिफारिशों के लेखकों के है और रक्षा विभाग द्वारा जरूरी समर्थन नहीं कर रहे हैं । यह काम भी एक बीज अनुदान द्वारा कॉर्नेल स्टेम सेल प्रोग्राम से एसी सफेद करने के लिए समर्थन किया गया था । एच चंद्रमा कशेरुकी जीनोमिक्स विद्वान कार्यक्रम के लिए कॉर्नेल केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tamoxifen Sigma T5648-1G For systemic injection
Tamoxifen Cayman Chemical 13258 For systemic injection
Corn oil Sigma 45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen Sigma H7904-25MG For topical treatment
26 G 1/2" needles various Veterinary grade
1 mL syringe various Veterinary grade
Pet hair trimmer Wahl 09990-502
Hair removal cream Nair n/a Available at most drug stores
Cotton swabs various
Ultraviolet light bulb UVP 95-0042-08 model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol various pure ethanol
Histoplast PE Fisher Scientific 22900700 paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10% Sigma HT501128-4L
Clear-Rite 3 Thermo Scientific 6901 xylene substitute
O.C.T. Compound Thermo 23730571
Tissue Cassette Sakura 89199-430 for FFPE processing
Cryomolds Sakura 4557 25 x 20 mm
FFPE metal mold Leica 3803082 24 mm x 24 mm
Isoflurane various Veterinary grade
Anesthesia inhalation system various Veterinary grade
Fine scissor FST 14085-09 Straight, sharp/sharp
Fine scissor FST 14558-09 Straight, sharp/sharp
Metzenbaum FST 14018-13 Straight, blunt/blunt
Forcep FST 11252-00 Dumont #5
Forcep FST 11018-12 Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f Jackson Labs 13590
LSL-tdTomato Jackson Labs 007914 ai14
Cre-1 n/a GCATTACCGGTCGATGCAACGA
GTGATGAG
Cre-2 n/a GAGTGAACGAACCTGGTCGAA
ATCAGTGCG
Braf-V600E-1 n/a TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2 n/a CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1 n/a AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT
AAGTCTGCA
Kras-G12D-2 n/a CCTTTACAAGCGCACGCAGACT
GTAGA
Pten-1 n/a ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2 n/a AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3 n/a GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1 n/a AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2 n/a CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3 n/a GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4 n/a CTGTTCCTGTACGGCATGG

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References

  1. Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
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कैंसर अनुसंधान अंक १४८ त्वचीय मेलेनोमा कैंसर त्वचा melanocyte स्टेम सेल बाल कूप स्टेम सेल depilation पराबैंगनी बी
स्थानिक और अस्थाई Mutant मेलेनोमा के नियंत्रण से उत्परिवर्ती Melanocyte स्टेम कोशिकाओं
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Moon, H., Donahue, L. R., Kim, D., An, L., White, A. C. Spatial and Temporal Control of Murine Melanoma Initiation from Mutant Melanocyte Stem Cells. J. Vis. Exp. (148), e59666, doi:10.3791/59666 (2019).

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