Summary
El siguiente procedimiento describe un método para el control espacial y temporal del inicio del tumor melanocítico en la piel dorsal murina, utilizando un modelo de ratón modificado genéticamente. Este protocolo describe el inicio de melanoma cutáneo macroscópico y microscópico.
Abstract
El melanoma cutáneo es bien conocido como el cáncer de piel más agresivo. Aunque los factores de riesgo y las principales alteraciones genéticas continúan documentándose con una profundidad cada vez mayor, la tasa de incidencia del melanoma cutáneo ha mostrado un aumento rápido y continuo durante las últimas décadas. Con el fin de encontrar métodos preventivos efectivos, es importante entender los primeros pasos de iniciación del melanoma en la piel. Los datos anteriores han demostrado que las células madre foliculares de melanocito (MCSC) en los tejidos de la piel adulta pueden actuar como células del melanoma de origen al expresar mutaciones oncogénicas y alteraciones genéticas. La tumorigénesis derivada de los MCSC propensos al melanoma puede inducirse cuando la MCSCs se transición de un estado inactivo al activo. Esta transición en MCSCs propenso al melanoma puede ser promovida por la modulación del estado de actividad de las células madre del folículo piloso o a través de factores ambientales extrínsecos como el ultravioleta-B (UV-B). Estos factores pueden ser manipulados artificialmente en el laboratorio por depilación química, lo que provoca la transición de las células madre del folículo piloso y MCSC de un estado inactivo a activo, y por la exposición UV-B usando una luz de sobremesa. Estos métodos proporcionan un control espacial y temporal exitoso del inicio del melanoma cutáneo en la piel dorsal murina. Por lo tanto, estos sistemas modelo in vivo serán valiosos para definir los primeros pasos del inicio del melanoma cutáneo y podrían utilizarse para probar métodos potenciales para la prevención de tumores.
Introduction
El melanoma, la forma maligna de los tumores melanocíticos, es el cáncer más agresivo en la piel con melanoma cutáneo responsable de la mayoría de las muertes por cáncer de piel1. En los Estados Unidos, el melanoma es comúnmente diagnosticado; se proyecta que es el tipo de cáncer más común de 5 a 6 entre los nuevos casos de cáncer estimados en 20182. Además, si bien las incidencias generales del cáncer han mostrado la tendencia de reducción gradual en las últimas décadas, las tasas de incidencia de melanoma cutáneo durante las últimas décadas demuestran un aumento continuo y rápido en ambos sexos2.
Para combatir el melanoma cutáneo de manera más eficiente, es importante comprender claramente los primeros acontecimientos del desarrollo del melanoma desde sus células de origen para identificar mejor los métodos preventivos clínicamente efectivos. Ahora se sabe que las células madre adultas pueden contribuir significativamente a la formación de tumores como los orígenes celulares de los cánceres en muchos tipos diferentes de órganos, incluyendo los tejidos de la piel3,4,5. Del mismo modo, las células madre adultas de melanocito (MCSC) en la piel dorsal murina pueden funcionar como células del melanoma de origen tras la activación aberrante de la Ras/Raf y las vías de Akt 6. Sin embargo, estas mutaciones oncogénicas por sí solas no son capaces de inducir eficientemente la formación de tumores de los MCSC en reposo. los tumor melanocíticos eventualmente se desarrollan cuando los MCSC se vuelven activos durante el ciclo natural del cabello. Sin embargo, en este protocolo, describiremos métodos para inducir artificialmente la activación celular de los mcscs propensos a tumores, facilitando así el control preciso de la iniciación del melanoma6,7.
A través de los métodos descritos aquí, el control espacial y temporal del inicio del melanoma cutáneo de MCSCs propensos a tumores que expresan BRAF oncogénicoV600E junto con la pérdida de la expresión PTEN se puede realizar con éxito, ya que han reportado previamente6. Este método incorpora hallazgos previos que demuestran la activación de las células del folículo piloso a través de la depilación, así como la exposición de la piel murina a UV-B puede facilitar la activación de los residentes de MCSCs en el folículo piloso y la translocación de este celular subpoblación a la epidermis interfolicular6,8,9,10. Estos sistemas modelo in vivo pueden proporcionar información valiosa sobre cómo los cambios fisiológicos y ambientales pueden alterar el estado celular de los MCSC propensos al melanoma, que a su vez pueden inducir un inicio significativo del melanoma en la piel.
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Protocol
Todos los procedimientos en animales se realizan de acuerdo con el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Cornell (IACUC).
1. preparación
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Recoja los clips de la cola de los ratones postnatales de 12 días y digárelos en 400 μL de 0,05 N NaOH a 95 ° c durante 1 h. vórtice y añada 32 μL de Tris-HCl de 1 M, pH 7. Ratones de genotipo según protocolos de PCR proporcionados a través del laboratorio de Jackson e identifican ratones con genotipo de interés6.
- Tyr-pública – hemicigotos (+/CreER)
- LSL-BRAFV600E – heterocigotos (+/LSL-V600E)
- PTEN – Flox homocigotos (Flox/Flox)
- Lei-tdtomato – hemicigotos (+/LSL-tdtomato)
Nota: Las secuencias de imprimación se proporcionan en la tabla de materiales. - Utilice un cortapelos (podadora eléctrica) para afeitar la piel dorsal de 2 a 3 días antes de todos los experimentos descritos a continuación, y cuando los ratones tengan aproximadamente 7 semanas de edad. Tenga cuidado de no dañar la piel delgada del ratón usando la podadora eléctrica ya que cualquier lesión puede provocar una respuesta de cicatrización de heridas que activará las células madre del folículo piloso, incluyendo MCSCs.
- Determine si el ciclo del cabello está en telógeno y si la piel está herida durante el período de espera. Si la piel muestra cualquier signo de lesión, el ratón no debe ser utilizado para estos procedimientos.
Nota: Aunque el ciclo del cabello puede diferir ligeramente entre los fondos genéticos, a esta edad el ciclo del cabello en la piel dorsal es generalmente en el estado telógeno11. El transgénico de Tyr-pública se dirige a los MCSC en la piel telógena, y las alteraciones genéticas subsiguientes se expresarán permanentemente en todos los linajes del FCM, incluyendo los melanocitos diferenciados y los tumores melanocíticos.
2. tratamiento del tamoxifeno para la recombinación genética Cre-Lox
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Preparación del tamoxifeno para la inyección intraperitoneal (IP) o administración tópica para la recombinación genética sistémica o localizada
Nota: Para que el tamoxifeno provoque la recombinación, primero debe ser metabolizado por el hígado a 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT), que puede unirse y activar el pública. La aplicación tópica de tamoxifeno no se metaboliza de esta manera y 4-OHT debe utilizarse directamente. Solo se requiere un método de entrega de tamoxifeno para una recombinación suficiente.- Tamoxifeno: preparar el tamoxifeno a una concentración de 10 mg mL-1 disuelto en aceite de maíz. Para ayudar en la disolución de la droga en solución, añadir hasta 10% volumen total de etanol 100% grado molecular a la droga en forma de polvo, vórtice durante 3 min y luego añadir el volumen restante de aceite de maíz. Continúe hasta el vórtice hasta que el material cristalino ya no sea aparente en la solución. La solución de tamoxifeno se puede esterilizar pasando por un filtro de 0,2 μm. Proceda al paso 2.2.1 para el tratamiento.
- 4-OHT: Prepare una solución en stock de hidroxitamoxifeno hasta 3 mg mL-1 en etanol al 100%. Entonces, una solución de trabajo se puede aplicar tanto como sea necesario para cubrir el área de la piel de interés (generalmente una sola aplicación).
Nota: Se puede disolver una solución en stock de hidroxitamoxifeno en etanol al 100% para una concentración final de 5 mM. A continuación, para preparar una solución de trabajo, se pueden diluir 5 μL de solución de stock de 4OH-tamoxifeno en 15 μL de etanol al 100%. Para 4 mm2 zona, se pueden aplicar por vía tópica de 1 a 3 μl de solución de trabajo.
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Tratamiento de ratones con tamoxifeno ya sea sistémicamente o tópicamente
- Para el tratamiento sistémico, administrar 2 mg de tamoxifeno a través de inyección de IP una vez al día durante 3 días usando una aguja de 26 G.
Nota: Con este modelo, aproximadamente el 93% ± 4% de los MCSCs en reposo están etiquetados con tdTomato6. - Para la activación regional, realice un tratamiento tópico con 4-OHT. Cubra el área de la piel de interés con la solución de trabajo. La cantidad de solución de trabajo se puede determinar por el tamaño de la región de interés como se describe en el paso 2.1.2.
- Para el tratamiento sistémico, administrar 2 mg de tamoxifeno a través de inyección de IP una vez al día durante 3 días usando una aguja de 26 G.
- A las 48 h después de la última dosis de tamoxifeno, proceda al paso 3 para la depilación química inducida por iniciación tumoral o al paso 4 para la iniciación tumoral inducida por UV-B
3. depilación química
- Equipar una sala de tratamiento de ratón que contiene un sistema de isoflurano con los siguientes materiales requeridos: crema de depilación, algodón hisopos, paño de papel y agua.
- Colocar el ratón en la cámara de inducción y anestesiar con 3,5 a 4,5% isoflurano y 1 L/min de oxígeno.
- Una vez que la frecuencia respiratoria se ha estabilizado, confirme que el ratón está en el plano adecuado de la anestesia mediante la realización de un pellizco del dedo del pie y transferir el ratón al tubo principal manteniendo la anestesia con 1 a 1,5% isoflurano y 1 L/min de oxígeno. Aplique ungüento ocular para evitar que los ojos se sequen mientras está bajo anestesia.
- Utilice un bastoncillo de algodón para aplicar una capa delgada de crema para depilación a la región afeitada de la piel del ratón.
- Una vez que la crema se ha aplicado uniformemente, utilice hisopos de algodón limpio para comenzar la extracción. El tiempo total que la crema está en contacto con la piel no debe exceder 1 min.
- Limpie suavemente la piel con un paño de papel húmedo y asegúrese de que se ha quitado cualquier crema residual.
Nota: La crema para depilación puede causar irritación en la piel si no se elimina por completo. Algunos ratones, como los que están en un fondo C57BL/6, pueden ser propensos a desarrollar dermatitis12. Aunque es raro, algunos animales desarrollarán dermatitis dentro de las 24 h después de la aplicación de crema de depilación o depilación mecánica. Asegúrese de revisar los ratones el día después del tratamiento para buscar cualquier signo de irritación regional de la piel. - Deseche los pozos de pelo removidos y cualquier material utilizado en una papelera de riesgo biológico.
- Coloque el ratón en una jaula de ratón vacía y limpia hasta que la anestesia se haya desgastado.
- Devuelva los ratones a sus jaulas.
4. irradiación UV-B
- Equipar una sala de tratamiento de ratón que contiene un sistema isoflurano con los siguientes materiales requeridos: sistema de luz UV-B, medidor de luz UV-B, cubierta protectora para el ratón, EPI adicional de protección UV-B para el investigador, y un temporizador.
- Los ratones deben irradiarse a la dosis de interés UV-B (es decir, 0-180 mJ/cm2). Utilice el medidor de luz UV-B para determinar el período de tiempo adecuado para irradiar los ratones.
Nota: mW/cm2 x Time = dosis - Anestesiar el ratón con isoflurano. Mientras esté en la cámara de inducción, utilice 3,5 a 4,5% de isoflurano y 1 L/min de oxígeno.
- Una vez que el ratón se estabiliza, confirme los efectos de la anestesia con un pellizco del dedo del pie y transfiera el ratón al tubo de anestesia principal ubicado en la cámara UV. Aplique ungüento ocular para evitar que los ojos se sequen mientras está bajo anestesia. Mantener la anestesia con 1 a 1,5% de isoflurano y 1 L/min de oxígeno.
- Cubra la piel dorsal con material protector UV-B para que sólo se exponga la región deseada.
Nota: En este momento, se debe utilizar un EPP apropiado. El tiempo necesario para irradiar el ratón depende de la intensidad de la bombilla utilizada, pero la anestesia puede necesitar ser monitoreada si el tiempo requerido excede los 30 s. - Cubra la cámara UV utilizando una tapa resistente a los rayos UV o cualquier otro material adecuado.
- Encienda la lámpara UV-B e irradie el ratón por el tiempo determinado por los investigadores para el objetivo específico.
- Apague el sistema UV y el isoflurano, luego coloque el ratón en una jaula vacía del ratón hasta que la anestesia se haya desgastado.
- Devuelva los ratones a sus jaulas.
5. procesamiento de tejidos
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El aislamiento cutáneo
- Obtenga lo siguiente antes de comenzar: instrumentos necropsia, papel de filtro y toallas de papel.
- Eutanzar los ratones de acuerdo con los protocolos aprobados por la IACUC, y confirmar la muerte antes de proceder.
- Con un cortaúñas, afeitarse cualquier pelo de la zona dorsal de la piel. Cepille ligeramente el área con un tejido libre de pelusas para despejar el área.
- Haga una pequeña incisión con tijeras afiladas justo por encima de la base de la cola.
- Inserte grandes tijeras contundentes en la incisión y separe los tejidos conectivos subdérmicos.
- Aísle cuidadosamente la región de la piel de interés cortando con tijeras afiladas a lo largo del borde del tejido.
- Coloque el tejido de la piel en una toalla de papel limpia y use fórceps apagados para estirar la piel de manera que se adhiera a la toalla y se enseñe. Este paso sirve para proporcionar soporte adicional para el tejido para que pueda ser manipulado y procesado manteniendo su forma.
Nota: Tenga cuidado de manejar sólo las regiones externas del tejido de la piel, ya que el fórceps puede causar daño a la piel que se puede ver histológicamente.
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Fijación de tejido
- Dobla un trozo de papel de filtro por la mitad y rótulo apropiadamente. Coloque la piel junto con el respaldo de la toalla de papel en el papel doblado inmediatamente adyacente al pliegue, asegurando que la muestra sea lisa y no plegada o arrugado. Selle el papel de filtro grapando los lados abiertos, y luego recorte para que el papel restante se pueda utilizar para futuras muestras.
Nota: Este paso se realiza para que la piel conserve su forma durante la fijación. - Sumergir completamente la muestra de tejido en un 10% de formalina amortiguada neutral durante 3 a 5 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° c.
- Después de la fijación, retire las muestras de formalina, lave en agua desionizada (2x, 5 min cada una) y proceda a hacer bloques de tejido. Retire con cuidado cualquier material residual del tejido de la piel (es decir, papel residual).
- Dobla un trozo de papel de filtro por la mitad y rótulo apropiadamente. Coloque la piel junto con el respaldo de la toalla de papel en el papel doblado inmediatamente adyacente al pliegue, asegurando que la muestra sea lisa y no plegada o arrugado. Selle el papel de filtro grapando los lados abiertos, y luego recorte para que el papel restante se pueda utilizar para futuras muestras.
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Fabricación de bloques de tejido congelado (figura 1)
- Recorte los bordes de la muestra de piel para que no sean dentados y luego haga 3 cortes sagital. La anchura de estas tiras no debe ser superior a la altura del crimomoldeo (5 mm). A continuación, hacer cortes transversales para tener trozos de piel que no son más largas que la anchura del crimomoldeo (20 mm) y se pueden incrustar. Repetir con la mitad restante de la piel dorsal, o guardar el tejido para otros usos (alternativamente, ahorrar la mitad antes de la fijación).
Nota: Es importante mantener las piezas de la piel en la orientación adecuada. - Orientar el crimomoldeo (25 x 20 x 5 mm3) en una orientación vertical y colocar de 4 a 5 pedazos de piel en la parte superior de la Oct. Una vez que todas las piezas están en su lugar, utilice 2 pares de fórceps finos para llevar el borde largo de la piel a la parte inferior del crimomoldeo. Ahora la piel debe estar de pie en el OCT perpendicular a la base del molde. Tenga cuidado de minimizar la formación de bolsas de aire dentro de la OCT durante este paso (figura 1).
- Llene el molde con OCT hasta el segundo labio, y colóquelo sobre la superficie plana de hielo seco. Utilice fórceps para ajustar cualquier pieza de piel que pueda haber desplazado durante la transferencia a medida que el bloque comienza a congelarse. Una vez que la capa inferior se solidifica, la manipulación de los tejidos será imposible.
- Cortar diapositivas de 8-10 μm para su análisis.
- Recorte los bordes de la muestra de piel para que no sean dentados y luego haga 3 cortes sagital. La anchura de estas tiras no debe ser superior a la altura del crimomoldeo (5 mm). A continuación, hacer cortes transversales para tener trozos de piel que no son más largas que la anchura del crimomoldeo (20 mm) y se pueden incrustar. Repetir con la mitad restante de la piel dorsal, o guardar el tejido para otros usos (alternativamente, ahorrar la mitad antes de la fijación).
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Hacer que los bloques de tejido de formol Fixed parafin Embedded (FFPE)
- Coloque 2 piezas de piel fija en un cassette etiquetado y deshidratar en concentraciones crecientes de etanol (75% de etanol durante 30 min, 85% durante 30 min, 90% durante 30 min, 95% durante 30 min, 100% para 2x 30 min, xileno o xileno sustituto durante 2x 30 min). Incubar con parafina a 58-60 °, primero durante 30 min, y luego durante la noche.
- Incrustar el tejido en un molde de tejido de acero inoxidable de 24 x 24 mm2 con parafina líquida y solidificar a-5 ° c. La orientación del tejido debe ser similar a la de los bloques de tejido congelado, de modo que se puedan visualizar secciones longitudinales a través de múltiples folículos pilosos (figura 1).
- Una vez que la parafina se haya solidificado, retire el molde y corte en secciones de 5-10 μm para su análisis.
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Representative Results
El inicio del melanoma cutáneo inducido por depilación química
El procedimiento de depilación química se muestra en la figura 2. Cuando los ratones son de 7 semanas después del parto, su piel dorsal está en telógeno. Durante el telógeno, se sabe que las células madre del folículo piloso y los MCSC están en estado de reposo. La piel no debe mostrar un crecimiento significativo del vello después del afeitado. Por otro lado, la depilación química puede inducir la activación de las células madre del folículo piloso, que a su vez muestra un crecimiento significativo del vello de la región de interés (figura 2). Del mismo modo, los MCSCs propensos a tumores que expresan mutaciones oncogénicas también deben estar activos para la formación acelerada de tumores. La depilación química puede inducir significativamente la activación de las células madre del folículo piloso y de los MCSC. los MCSC propensos al melanoma en un estado activo pueden formar tumores, y el inicio microscópico del melanoma se puede observar dentro de las 2 semanas después de la depilación química utilizando el linaje que traza el alelo LSL-tdTomato (figura 3).
El inicio del melanoma cutáneo inducido por la irradiación UV-B
Al igual que la depilación química, UV-B puede inducir el inicio del tumor a partir de MCSCs propensos a tumores en reposo (figura 4). Mientras que la piel murina que contiene MCSCs propensos a tumores en un estado de reposo no muestra un inicio tumoral significativo y falta de pigmentación significativa, la piel dorsal expuesta a UV-B (dos veces, 180 mJ/cm2) muestra tumores melanocíticos tempranos pigmentados negros que son macroscópicamente evidentes (figura 4a, B). Mientras que UV-B puede inducir significativamente la iniciación del tumor evidente macroscopicamente dentro de 2 semanas, la aplicación de protector solar puede proteger el inicio del melanoma mediado por UV-B en la piel, similar a un paño resistente a los rayos UV (figura 4C, D).
Es importante destacar que UV-B induce la translocación directa de los MCSC desde su nicho de células madre foliculares a la epidermis interfolicular. Además, UV-B puede inducir la formación de melanoma cutáneo originario de la MCSC en toda la epidermis interfolicular, y el fenotipo microscópico puede observarse por el marcador de traza de linaje, tdTomato (figura 5). Como estas células tumorales son malignas, crecen rápida e invasivamente (figura 5). Al igual que la piel dorsal, el inicio del melanoma inducido por UV-B puede observarse notablemente en otras áreas de la piel, como la piel del oído (figura 6). En comparación con la piel de control cubierta por un paño resistente a los rayos UV, la piel del oído expuesta a UV-B demuestra una mayor pigmentación debido a una mayor carga de iniciación del melanoma (figura 6).
Figura 1: aislamiento del tejido cutáneo y crio-incrustación. Después de la eutanasia, afeite la región dorsal del ratón de interés e inserte la piel en el moho que contiene OCT. La línea punteada del ratón representa la línea media. Típicamente, 3 o 4 piezas de piel pueden ser aisladas con segmento de línea 3-4 a lo largo de la línea media; una de estas piezas se indica mediante el rectángulo 1/2/3/4. Estas piezas de piel deben estar incrustadas en la OCT como se muestra en la figura. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: fenotipos macroscópicos después de la depilación química. (A) diagrama de depilación química. (B) después del afeitado, se confirmó que el ciclo del cabello estaba en telógeno. (C) la depilación química se realizó para eliminar los tallos capilares de los folículos pilosos, que pueden activar tanto el folículo piloso como las células madre de melanocitos. (D) alrededor de una semana más tarde, el crecimiento del vello temprano será fácilmente perceptible. (E) entonces, el crecimiento significativo del vello se puede observar con el tiempo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: observación microscópica del inicio del melanoma controlado por depilación química. La depilación química puede inducir significativamente la activación de MCSCs propensos a tumores en reposo. Luego, la iniciación tumoral microscópica demostrada por el marcador de rastreo de linaje tdTomato se puede observar dentro de 2 semanas. Esta figura demuestra el fenotipo microscópico 16 días post 3 días tamoxifeno por inyección IP seguida de depilación química utilizando diferentes visualizaciones del mismo campo de visión. (A) tdtomato+ células tumorales originarias del folículo piloso se fusionaron con la mancha de contador nuclear DAPI. (B) los folículos pilosos y la epidermis interfolicular se describen en blanco. (C) un esquema que muestra cómo las células de tdTomato+ tumor invaden la dermis desde el folículo piloso, modificada de Moon, H. et al.6. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: fenotipo macroscópico de melanoma cutáneo inducido por la irradiación UV-B. Los ratones fueron tratados con tamoxifeno durante 3 días (día 1 a 3) seguido de 2 exposiciones UV-B (día 4 y 6). (A) diagrama de la irradiación UV-b en la piel dorsal que contiene mcscs mutantes. (B) fenotipo macroscópico entre el control y la piel dorsal expuesta UV-b. Se puede observar una pigmentación negra significativa relacionada con la formación de tumores melanocíticos dentro de las 2 semanas posteriores a la segunda irradiación UV-B. (C) diagrama de la aplicación de protección solar. (D) mientras que UV-B puede inducir significativamente la iniciación tumoral de los mcscs mutantes, la aplicación de la protección solar mostró una supresión de tumores mediada por UV-b significativamente suprimida (16 días después de la segunda irradiación UV-b). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: observación microscópica del melanoma cutáneo inducido por UV-B. Los ratones fueron tratados con tamoxifeno mediante inyección IP durante 3 días (día 1 a 3) seguido de 2 exposiciones UV-B (día 4 y 5). (A-C) La iniciación temprana del tumor a lo largo de la epidermis interfolicular demostrada por el rastreo del linaje tdTomato se puede mostrar en el día 17. (A) tdtomato + células tumorales se muestran migrando desde el folículo piloso a la epidermis interfolicular. DAPI se utiliza como una mancha de contador nuclear. (B) la tinción de DAPI se retira y la línea de puntos indica la ubicación de los folículos pilosos y la epidermis interfolicular. (C) esquema que indique tdTomato+ migración celular desde el germen capilar hasta la epidermis interfolicular tras la exposición a UV-B. Modificado de Moon et al.6. (D-F) Luego, las células tumorales crecen rápidamente e invaden los tejidos dérmicos a continuación (día 25). (D) tdtomato+ células tumorales han continuado proliferar e invadir los tejidos dérmicos. DAPI se utiliza como una mancha de contador nuclear. (E) la tinción de DAPI se retira y la línea de puntos indica la ubicación de los folículos pilosos y la epidermis interfolicular. (F) esquema indicando tdTomato+ invasión celular en la dermis y crecimiento tumoral melanocítico. Modificado de Moon et al.6. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: observación macroscópica y microscópica del melanoma inducido por UV-B en la piel del oído. (A) esquema experimental. Los ratones fueron tratados con tamoxifeno durante 3 días (día 1 a 3) seguido de 3 exposiciones a la irradiación UV-B (día 4, 6 y 8). (B) el aumento significativo de la iniciación del melanoma por irradiación UV-B se observó macroscopicamente, así como microscópicamente en el día 28. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las alteraciones genéticas distintivas que se encuentran frecuentemente en tumores de melanoma cutáneo han sido bien descritas13. La mutación del conductor más dominante es BRAFV600E, y un modelo de ratón genéticamente diseñado para el melanoma de BRAFV600Emediado fue generado por el grupo Bosenberg14 y depositado en el laboratorio Jackson. Con este modelo de ratón, nuestro estudio reciente demostró el requisito de la activación celular de los MCSCs propensos a tumores para el inicio significativo del melanoma V600E mediado por BRAFen la piel dorsal6.
La depilación es conocida por ser un método eficaz para inducir la activación de células madre del folículo del vello murino en la piel dorsal6,10. Murine MCSCs se encuentran dentro de los folículos pilosos, y además, el estado celular de los MCSC foliculares se sincroniza con el estado de las células madre del folículo capilar8. La modulación artificial de las células madre del folículo piloso puede alterar el estado de MCSC, por lo que la depilación puede activar directamente las células madre de los melanocitos y los folículo pilosos. Este método de activación para MCSCs se puede aplicar a los MCSCs propensos a tumores para examinar los primeros pasos del inicio del melanoma cutáneo en modelos de ratones con melanoma genéticamente diseñados. A través de un método de depilación química, la formación de melanoma en la región de interés en la piel dorsal murina puede iniciarse directamente. La depilación se puede realizar mediante varios métodos, como encerar o desplullar, ambos son tipos de depilación mecánica donde se extraen los ejes capilares del folículo piloso. Sin embargo, estos métodos de depilación mecánica pueden ser imprecisos con respecto a una región específica de interés. Por otro lado, un método de depilación química con crema de depilación es fácil de realizar y permite una aplicación precisa con una activación fiable del ciclo del cabello, y puede ser menos áspero en la piel que la extracción mecánica.
Entre los diversos factores de riesgo, UV-B es el factor de riesgo más conocido en el melanoma cutáneo15. Se sabe que la irradiación UV-B induce la migración directa de MCSC folicular en la epidermis interfolicular9. Además, UV-B es un fuerte factor de estrés ambiental que puede inducir significativamente el inicio del melanoma a partir de MCSCs6propenso a tumores. En el protocolo experimental descrito anteriormente, una pequeña región de interés sobre la piel dorsal murina puede exponerse a la luz UV-B, mientras que el uso de un paño resistente a los rayos UV protege fácilmente el resto del ratón de la exposición no deseada. Este tratamiento se puede realizar mientras el ratón está bajo anestesia. Es importante destacar que la migración de MCSCs y la formación de melanoma originario de MCSC después de la exposición UV-B son dependientes de la dosis UV-B6. Por lo tanto, para tener resultados exitosos, es importante comprobar regularmente la intensidad de la bombilla usando un medidor UV-B y ajustar el tiempo de exposición y la distancia entre la piel y las bombillas según sea necesario. Como se sabe generalmente, la piel puede quemarse en respuesta a una alta dosis de luz UV-B, pero la exposición débil UV-B también es perjudicial para el experimento, ya que será insuficiente para inducir el melanoma originario de MCSC.
El protocolo descrito aquí se centra principalmente en el factor de riesgo ambiental, UV-B, en la piel dorsal. Sin embargo, el protocolo experimental anterior puede aplicarse a diferentes objetivos. Por ejemplo, el protocolo se puede modificar con bombillas de diferentes espectros para determinar el efecto de fuentes de luz alternativas o longitudes de onda de UV, como UV-A. Este protocolo se dirigió principalmente a la piel dorsal, ya que es accesible y el estado de MCSCs está bien definido. Sin embargo, también se puede alterar para apuntar a la exposición a la luz UV a apéndices como el oído, la cola o la piel de la palma, incluyendo almohadillas para los pies. Como ejemplo, en la figura 6, es posible examinar la posible diferencia en la formación de tumores melanocóticos tempranos en sitios de tejidos alternativos. Sin embargo, a diferencia de la piel dorsal, el estado de los MCSCs en estos sitios está menos bien definido; por lo tanto, se debe considerar la activación espontánea potencial de los MCSC que conducen a ocurrencias aleatorias de formación de melanoma. Por lo tanto, en comparación con el protocolo en la piel dorsal, enfoques alternativos requerirán un mayor número de experimentos para obtener resultados experimentales precisos.
Además, mientras que el protocolo actual demuestra principalmente la iniciación del melanoma mediado por BRAFV600E, nuestro estudio anterior también reportó una formación de melanoma temprano similar con una combinación de ras/PTEN oncogénica, utilizando el LSL-KRASG12D alelo genético6. Sin embargo, otras mutaciones de conductor, como los genes NRAS mutantes, también se pueden considerar con el sistema experimental descrito aquí para comprender el inicio temprano del melanoma impulsado por otras combinaciones oncogénicas.
En conjunto, descrito aquí es un sistema de modelo in vivo que permite el examen de iniciación temprana del melanoma cutáneo en ratones con ingeniería genética. Estos modelos murinos proporcionan los métodos para el control temporal y espacial del inicio del melanoma a partir de MCSCs mutantes en la piel. Estos protocolos proporcionan un paradigma novedoso para estudiar los mecanismos de iniciación temprana del melanoma a partir de MCSCs propensos a tumores, así como una plataforma para determinar los factores de estrés fisiológicos y ambientales que pueden contribuir a la iniciación del melanoma. Este nivel de control espaciotemporal también puede proporcionar una herramienta para la inducción de melanoma más preciso para probar la eficacia de los fármacos en la prevención de la formación de melanoma, así como el crecimiento tumoral.
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Disclosures
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la oficina del Subsecretario de defensa para asuntos de salud, a través del programa de investigación de cáncer de Peer revisado bajo el premio W81XWH-16-1-0272. Las opiniones, interpretaciones, conclusiones y recomendaciones son las de los autores y no están necesariamente respaldadas por el Departamento de defensa. Este trabajo también fue apoyado por una subvención de semillas del programa de células madre de Cornell a A.C. White. H. Moon fue apoyada por el Cornell Center para el programa académico de genómica de vertebrados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
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- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
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