Summary
Aşağıdaki prosedür, genetik olarak tasarlanan bir fare modelini kullanarak, murine dorsal deride melansitik tümör başlamasını uzamsal ve temporal kontrol etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol makroskopik ve mikroskopik kutanöz Melanom inisiyasyonu açıklanmaktadır.
Abstract
Kutanöz Melanom en agresif cilt kanseri olarak bilinir. Risk faktörleri ve büyük genetik değişiklikler artan derinlik ile belgelenmeye devam etse de, kutanöz Melanom insidansı oranı son yıllarda hızlı ve sürekli bir artış göstermiştir. Etkili önleyici yöntemler bulmak için, Deride Melanom başlaması erken adımlarını anlamak önemlidir. Önceki veriler, Yetişkin deri dokularında foliküler melanosit kök hücrelerinin (MCSCs) Onkojenik mutasyonlar ve Genetik değişikliklerin ifade edildiğinde Orijin Melanom hücreleri olarak hareket edebilecektir göstermiştir. Meloma eğilimli MCSCs 'den kaynaklanan tumorigenesis, MCSCs 'nin sessiz bir şekilde aktif duruma geçişinde indüklenir. Melanoma eğilimli MCSCs bu geçiş ya saç folikül kök hücrelerinin modülasyon tarafından teşvik edilebilir ' aktivite devlet veya ultraviyole-b (UV-b) gibi ekstrensek çevresel faktörler aracılığıyla. Bu faktörler suni kimyasal epilasyon ile laboratuvarda manipüle edilebilir, hangi saç folikül kök hücreleri ve MCSCs bir sessiz aktif duruma geçiş neden, ve UV-B pozlama bir tezgah ışığı kullanarak. Bu yöntemler, murine dorsal deride kutanöz Melanom başlamasını başarılı bir uzamsal ve temporal kontrol sağlar. Bu nedenle, bu in vivo model sistemleri, kutanöz Melanom başlatılması erken adımlarını tanımlamak için değerli olacak ve tümör önleme için potansiyel yöntemleri test etmek için kullanılabilir.
Introduction
Melanom, melositik tümörlerin malign formu, deri kanseri ölümlerinin çoğunluğu için sorumlu kutanöz melanom ile deride en agresif kanserdir1. Amerika Birleşik Devletleri 'nde, melanom yaygın tanısı; 20182' de tahmin edilen yeni kanser vakaları arasında en yaygın kanser tipi olan 5 ila 6inci olarak tahmin edilmektedir. Ayrıca, genel kanser olayları son yıllarda kademeli azalma eğilimi gösterirken, son birkaç on yıldır kutanöz Melanom insidansı oranları her iki cinsiyette de sürekli ve hızlı bir artış göstermektedir2.
Kutanöz melanom daha verimli bir şekilde mücadele etmek için, klinik olarak etkili önleyici yöntemleri daha iyi belirlemek için köken hücrelerinden Melanom gelişiminin erken olaylarını açıkça anlamak önemlidir. Şimdi yetişkin kök hücrelerinin önemli ölçüde cilt dokularına dahil olmak üzere birçok farklı türde kanserlerin hücre kökeni olarak tümör oluşumuna katkıda bulunabilir bilinmektedir3,4,5. Benzer şekilde, Yetişkin melanosit kök hücreleri (MCSCs) murine dorsal deri RAS/raf ve akt yollar6anormal aktivasyonu üzerine Orijin Melanom hücreleri olarak çalışabilir. Ancak, bu Onkojenik mutasyonlar tek başına verimli MCSCs tümör oluşumuna neden mümkün değildir. Melositik tümörler sonunda MCSCs doğal saç bisiklet sırasında aktif hale zaman gelişir. Ancak, bu protokolde, biz yapay tümör eğilimli MCSCs hücresel aktivasyonunu teşvik etmek için yöntemleri açıklayacağız, böylece Melanom başlatma hassas kontrolünü kolaylaştırmak6/6.
Burada açıklanan yöntemlerle, tümör eğilimli MCSCs 'den gelen kutanöz Melanom başlamanın uzamsal ve temporal kontrolü, Onkojenik BRAFV600E ile birlikte PTEN ifadesi kaybı ile başarıyla gerçekleştirilebilecek, biz daha önce6bildirdi. Bu yöntem, epilasyon yoluyla saç folikül kök hücre aktivasyonu gösteren önceki bulguları içerir yanı sıra nasıl UV-B için murine cilt pozlama bu hücresel saç folikül ve translokasyon MCSCs ikamet aktivasyonunu kolaylaştırabilir interfollicüler epidermis6,8,9,10için alt nüfus. Bu in vivo model sistemler nasıl fizyolojik ve çevresel değişiklikler meloma eğilimli MCSCs hücresel durumunu değiştirebilir ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilir, hangi sırayla ciltte Melanom önemli başlangıcı neden olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri Cornell Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) uyarınca gerçekleştirilir.
1. hazırlık
-
12 günlük postnatal farelerden kuyruk kliplerini toplayın ve 400 μL 'de 0,05 N NaOH 'da 1 saat için 95 °C ' de sindirin. Vortex ve 1 M Tris-HCl, pH 7 ' nin 32 μL 'i ekleyin. Jackson Laboratuvarı aracılığıyla sağlanan PCR protokollerine göre genotip fareler ve ilgi genotip ile fareler tanımlamak6.
- Tyr-creer – gemizigotnyh (+/creer)
- LSL-BRAFV600E – heterozigot (+/LSL-V600E)
- PTEN- homozigot Flox (Flox/Flox)
- LSL-tdtomato -gemizigotnyh (+/LSL-tdtomato)
Not: Primer dizileri malzeme tablosu'nda sağlanmaktadır. - Dorsal cildi tıraş etmek için bir saç kesici (elektrikli düzeltici) kullanın, aşağıda açıklanan tüm deneylere 2 ila 3 gün kala, fareler yaklaşık 7 haftadır. Herhangi bir yaralanma, MCSCs dahil olmak üzere saç folikül kök hücrelerini aktive edecek bir yara iyileşme tepkisi kabul edebilir gibi elektrik düzeltici kullanarak ince fare cilt zarar vermemek için dikkat alın.
- Saç döngüsünün telojen içinde olup olmadığını ve bekleme döneminde cildin yaralanıp yaralandığını belirleyin. Cilt herhangi bir yaralanma belirtisi gösteriyorsa, fare bu prosedürler için kullanılmamalıdır.
Not: Saç döngüsü genetik arka planlar arasında biraz farklılık gösterse de, bu yaşta dorsal deride saç döngüsü genellikle telojen devlet11' de olur. Tyr-creer transgeni telojen deride MCSCs 'yi hedef alacak ve sonraki genetik değişiklikler mcsc 'nin tüm çağlarda farklılaşmış melanosit ve melositik tümörlerin de dahil olduğu sürekli olarak ifade edilecektir.
2. CRE-LOX Genetik rekombinasyon için Tamoxifen tedavisi
-
İntraperitoneal enjeksiyon (IP) veya sistemik veya lokalize Genetik rekombinasyon için topikal yönetim için tamoksifen hazırlanması
Not: Tamoksifen için yeniden kombinasyon sağlamak için, ilk 4-hydroxytamoxifen için karaciğer tarafından metabolize edilmelidir (4-OHT), hangi bağlamak ve creeretkinleştirin. Tamoksifen topikal uygulama bu şekilde metabolize olmayacaktır ve 4-OHT doğrudan kullanılmalıdır. Yeterli rekombinasyon için tek bir tamoksifen Teslimat yöntemi gereklidir.- Tamoksifen: 10 mg ml-1 , Mısır yağında çözünmüş bir konsantrasyonda tamoksifen hazırlayın. Çözelti içine ilacın çözünme yardımcı olmak için,% 10 toplam hacmi% 100 moleküler dereceli etanol toz formunda ilaç, 3 dakika için Vortex ve sonra Mısır yağı kalan hacmi ekleyin. Kristalin malzeme artık çözüm belirgin olana kadar Vortex devam edin. Tamoxifen çözeltisi 0,2 μm filtre üzerinden geçerek sterilize edilebilir. Tedavi için adım 2.2.1 ilerleyin.
- 4-OHT:% 100 etanol içinde 3 mg mL-1 ' e kadar hydroxytamoxifen stok çözümünü hazırlayın. Daha sonra, çalışma çözümü (genellikle tek bir uygulama) ilgi cilt alanı kapsayacak şekilde gerekli kadar uygulanabilir.
Not: Hydroxytamoxifen bir stok çözümü 5 mM son konsantrasyon için% 100 etanol içinde çözülebilir. Daha sonra, çalışma çözümü hazırlamak için, 5 μL 4OH-Tamoxifen stok solüsyonu 15 μL 100% etanol içine seyreltilebilir. 4 mm2 alan için 1 Ila 3 μL çalışma çözeltisi topikal olarak uygulanabilir.
-
Tamoksifen ile fareleri sistematik veya topikal olarak tedavi etmek
- Sistemik tedavi için, 2 mg tamoksifen IP enjeksiyonu ile günlük olarak 3 gün boyunca 26 G iğne kullanarak yönetin.
Not: Bu modeli kullanarak, yaklaşık 93% ± 4 ' ü sessiz MCSCs tdTomato6ile etiketlenmiştir. - Bölgesel aktivasyon için 4-OHT ile bir topikal tedavi gerçekleştirin. Çalışma çözeltisi ile ilgi cilt alanı kapak. Çalışma çözümü miktarı, adım 2.1.2 ' de açıklandığı gibi ilgi bölgenin boyutuna göre belirlenebilir.
- Sistemik tedavi için, 2 mg tamoksifen IP enjeksiyonu ile günlük olarak 3 gün boyunca 26 G iğne kullanarak yönetin.
- Tamoxifen son doz aşağıdaki 48 h at, 3 adım için kimyasal epilasyon indüklenen tümör başlatma veya adım 4 UV-B kaynaklı tümör başlatma için devam
3. kimyasal epilasyon
- Aşağıdaki gerekli malzemeler ile bir izofluran sistemi içeren bir fare tedavi odası donatmak: epilasyon krem, pamuk SWABS, kağıt bez, ve su.
- Fare indüksiyon odasına yerleştirin ve 3,5 ile anestezize 4,5% Isoflurane ve 1 L/min oksijen.
- Solunum hızı stabilize edildikten sonra, fare bir ayak tutam gerçekleştirerek anestezi uygun düzlemde olduğunu onaylayın ve 1 ila 1,5% Isoflurane ve 1 L/min oksijen ile anestezi korumak ana tüp için fareyi transfer. Anestezi altında iken kurutmadan gözleri tutmak için göz merhem uygulayın.
- Fare cildin tıraş bölgesine epilasyon krem ince bir tabaka uygulamak için bir pamuk çubuk kullanın.
- Krem eşit uygulandığında, kaldırma başlamak için temiz pamuk bezlerden kullanın. Krem cilt ile temas toplam süresi 1 dakika geçmemelidir.
- Cildi nemli bir kağıt bezle hafifçe silin ve herhangi bir kalan krem çıkarıldığından emin olun.
Not: Tamamen kaldırılırsa epilasyon krem cilt tahriş neden olabilir. C57BL/6 arka planda olanlar gibi bazı fareler, dermatit12geliştirmeye eğilimli olabilir. Nadir olsa da, bazı hayvanlar içinde dermatit gelişecektir 24 saç kaldırma krem uygulama veya mekanik epilasyon sonra h. Herhangi bir bölgesel cilt tahrişi belirtileri aramak için tedavi sonrası gün fareler kontrol ettiğinizden emin olun. - Çıkarılan saç şaftlarının ve biyolojik tehlike kutusuna kullanılan herhangi bir malzemeyi atın.
- Anestezi aşınıncaya kadar fareyi boş, temiz bir fare kafesi içine yerleştirin.
- Fareler kafeslerine geri dönün.
4. UV-B ışınlama
- Aşağıdaki gerekli malzemelerle bir izofluran sistemi içeren bir fare tedavi odası donatın: UV-b ışık sistemi, UV-b ışık ölçer, fare için koruyucu kaplama, araştırmacı için ek UV-b koruyucu PPE, ve bir zamanlayıcı.
- Fareler, UV-B dozunda ışınlanmış olmalıdır (i.e., 0-180 mJ/cm2). Fareleri ışınmak için uygun süreyi belirlemek için UV-B ışık ölçer kullanın.
Not: MW/cm2 x zaman = doz - Isoflurane ile fare anestezize. İndüksiyon odasında iken, 3,5 kullanın 4,5% Isoflurane ve 1 L/min oksijen.
- Fare stabilize edildikten sonra, bir ayak tutam ile anestezi etkilerini onaylamak ve UV odasında bulunan ana anestezi tüpü fare transfer. Anestezi altında sırasında kurutulması gözleri önlemek için göz merhem uygulayın. 1 ila 1,5% isofluran ve 1 L/min oksijen ile anestezi koruyun.
- Sadece istenilen bölgenin maruz kalabilmesi için dorsal cildi UV-B koruyucu malzemeyle Kapla.
Not: Şu anda uygun KKD kullanılmalıdır. Fareyi ışınlamam için gereken süre, kullanılan ampulün yoğunluğuna bağlıdır, ancak gerekli süre 30 s 'yi aşarsa anestezinin izlenmesi gerekebilir. - UV odasına UV geçirmez kapak veya diğer uygun malzemeleri kullanarak kapak yapın.
- UV-B lambası açın ve belirli bir amaç için araştırmacılar tarafından belirlenen zaman için fareyi ışınlamak.
- UV sistemi ve İsoflurane kapatın, sonra anestezi yıpranmış kadar boş bir fare kafesi fare yerleştirin.
- Fareler kafeslerine geri dönün.
5. doku Işleme
-
Cilt yalıtımı
- Başlamadan önce aşağıdaki elde: Otopsi aletleri, filtre kağıt ve kağıt havlu.
- IAŞUC onaylı protokollere göre fareler ötenize ve devam etmeden önce ölümü onaylayın.
- Saç kesici kullanarak, dorsal cilt bölgesinden herhangi bir saç tıraş. Alanı temizlemek için hafif bir tüy serbest doku ile alanı hafifçe fırçalayın.
- Kuyruk tabanının hemen üzerinde keskin makas ile küçük bir kesi olun.
- Kesi içine büyük künt makas takın ve subdermal bağ dokularına ayırın.
- Dikkatle doku kenarı boyunca keskin makas ile keserek ilgi cilt bölgesini izole.
- Temiz bir kağıt havlu üzerine cilt dokusu yerleştirin ve böylece havlu yapışır ve öğretilir cildi germek için donuk forseps kullanın. Bu adım, onun şeklini korurken manipüle edilebilir ve işlenmiş böylece doku için ek destek sağlamak için hizmet vermektedir.
Not: Forseps histolojik olarak görülebilir cilde zarar verebilir gibi sadece cilt dokusu dış bölgeleri işlemek için dikkatli olun.
-
Doku fikreme
- Fold yarım filtre kağıt bir parça ve uygun etiket. Cildinizi kağıt havlusu ile birlikte hemen kırışık bitişiğinde katlanmış kağıt içine yerleştirin, numunenin pürüzsüz ve katlanmış veya kırılmış olmadığından emin olmak. Açık kenarları zımbalayarak filtre kağıdını mühürleyin ve ardından kalan kağıdın gelecekteki örnekler için kullanılabilmesi için kırpın.
Not: Bu adım, böylece cilt sabitleme sırasında şeklini korur gerçekleştirilir. - Doku örneğini, oda sıcaklığında 3 ila 5 saat veya 4 °C ' de bir gecede% 10 nötr tampon formalin içinde tamamen taşabilir.
- Fikyasyon sonrasında, formalin örneklerini çıkarın, deiyonize suda yıkayın (2x, 5 dk her) ve doku blokları yapmaya devam edin. Cilt dokusundan herhangi bir kalıntı malzemesi dikkatle çıkarın (yani, kalıntı kağıt).
- Fold yarım filtre kağıt bir parça ve uygun etiket. Cildinizi kağıt havlusu ile birlikte hemen kırışık bitişiğinde katlanmış kağıt içine yerleştirin, numunenin pürüzsüz ve katlanmış veya kırılmış olmadığından emin olmak. Açık kenarları zımbalayarak filtre kağıdını mühürleyin ve ardından kalan kağıdın gelecekteki örnekler için kullanılabilmesi için kırpın.
-
Dondurulmuş doku blokları yapma (Şekil 1)
- Böylece onlar pürüzlü değildir ve sonra 3 sagittal kesikler yapmak cilt örneğinin kenarları Trim. Bu şeritlerin genişliği, cryomold (5 mm) yüksekliğinden daha fazla olmamalıdır. Daha sonra, kısırlık (20 mm) genişliğinden daha uzun olmayan ve gömülü olabilir cilt parçaları var enine kesikler olun. Dorsal cildin kalan yarısı ile tekrarlayın veya diğer kullanımlar için doku kaydetmek (dönüşümlü olarak, sabitleme önce yarım kaydedin).
Not: Cilt parçalarını uygun yönde tutmak önemlidir. - Cryomold (25 x 20 x 5 mm3) ' i dikey yönde YÖNLENDIRMEK ve Ekim 'in üstüne 4 ila 5 adet cilt yerleştirin. Bir kez tüm parçalar yerinde, cryomold alt cilt uzun kenarı getirmek için ince forseps 2 Çift kullanın. Cilt artık kalıp tabanına dik EKIM 'de ayakta olmalıdır. Bu adımda OCT içinde hava ceplerinin oluşumunu en aza indirmek için özen (Şekil 1).
- İkinci dudak için OCT ile kalıp doldurun ve Kuru buzun düz yüzeyine yerleştirin. Blok dondurmaya başlar gibi transfer sırasında kaymış olabilir herhangi bir cilt parçaları ayarlamak için forseps kullanın. Alt tabaka katılaşmış sonra, dokuların manipülasyon imkansız olacaktır.
- Kesme 8-10 μm slaytlar analiz için.
- Böylece onlar pürüzlü değildir ve sonra 3 sagittal kesikler yapmak cilt örneğinin kenarları Trim. Bu şeritlerin genişliği, cryomold (5 mm) yüksekliğinden daha fazla olmamalıdır. Daha sonra, kısırlık (20 mm) genişliğinden daha uzun olmayan ve gömülü olabilir cilt parçaları var enine kesikler olun. Dorsal cildin kalan yarısı ile tekrarlayın veya diğer kullanımlar için doku kaydetmek (dönüşümlü olarak, sabitleme önce yarım kaydedin).
-
Formalin sabit parafin Embedded (FFPE) doku blokları yapma
- Bir etiketli kaset içine sabit Cilt 2 adet yerleştirin ve etanol konsantrasyonları artan susuz (75% etanol 30 dakika için, 85% için 30 dakika, 90% için 30 dakika, 95% için 30 dk,% 100 2x 30 dakika, ksilya veya ksilon yerine 2x 30 dakika). Parafin ile 58-60 °, ilk 30 dakika ve sonra bir gecede inküye.
- Dokusunu 24 x 24 mm2 paslanmaz çelik doku kalıbı ile sıvı parafin ve-5 °c ' de kuvvetlendirmek ile katıştırın. Doku yönünü dondurulmuş doku blokları benzer olmalıdır böylece birden fazla saç folikülleri arasında boyuna bölümler görselleştirilebilir (Şekil 1).
- Parafin katılaşmış bir kez, kalıp kaldırmak ve analiz için 5-10 μm bölümlere kesilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kimyasal epilasyon ile indüklenen kutanöz Melanom başlatılması
Kimyasal epilasyon prosedürü Şekil 2' de tasvir edilir. Fareler 7 haftalık postnatal olduğunda, onların dorsal deri telogen içinde. Telogen sırasında, saç folikül kök hücreleri ve MCSCs bir sessiz, istirahat durumda olduğu bilinmektedir. Cilt tıraş sonrası önemli bir saç büyümesi göstermemelidir. Öte yandan, kimyasal epilasyon saç folikül kök hücre aktivasyonu neden olabilir, hangi sırayla ilgi bölgesinden önemli saç büyümesi gösterir (Şekil 2). Benzer şekilde, tümör eğilimli MCSCs Onkojenik mutasyonlar ifade de hızlandırılmış tümör oluşumu için aktif olması gerekir. Kimyasal epilasyon önemli ölçüde hem saç folikül kök hücresi ve MCSCs aktivasyonu neden olabilir. Melanom eğilimli MCSCs aktif bir durumda tümör oluşturabilir, ve mikroskobik Melanom başlatma içinde görülebilir 2 kimyasal Epilasyon sonrası hafta ISL-tdTomato (Şekil 3).
UV-B ışınlaması ile indüklenen kutanöz Melanom başlatılması
Kimyasal epilasyon benzer şekilde, UV-B sessiz tümör eğilimli MCSCs tümör başlamasını neden olabilir (Şekil 4). Bir sessiz durumda tümör eğilimli MCSCs içeren murine cilt önemli bir tümör başlatılması ve önemli pigmentasyon eksikliği gösterir iken, UV-B maruz dorsal cilt (iki kez, 180 mJ/cm2) siyah pigmentli erken melositik tümörlerin gösterir hangi makroskopik olarak belirgindir (Şekil 4A, B). UV-b, 2 hafta içinde makroskopik olarak belirgin tümör başlamasını önemli ölçüde artırırken, güneş koruyucu uygulanması UV-B-aracılı Melanom başlamasını cilt içinde koruyabilir (Şekil 4c, D).
Daha da önemlisi, UV-B, MCSCs 'nin foliküler kök hücre niş interfollicüler epidermis için doğrudan translokasyon indükler. Ayrıca, UV-B, interfoliküler epidermis boyunca MCSC kaynaklı kutanöz Melanom oluşumuna neden olabilir ve mikroskobik fenotip, tdTomato (Şekil 5) ' in soyası izleme işaretleyicisi tarafından gözlemlenebilir. Bu tümör hücrelerinin malign olduğu gibi, hızla ve invazif büyür (Şekil 5). Dorsal deriye benzer şekilde, UV-B kaynaklı Melanom başlatma özellikle kulak derisi gibi diğer cilt alanlarında görülebilir (Şekil 6). UV dayanıklı bez ile kaplı kontrol cilt ile karşılaştırıldığında, UV-B maruz kulak derisi Melanom başlatma daha yüksek bir yük nedeniyle daha yüksek pigmentasyon gösterir (Şekil 6).
Şekil 1: cilt dokusu yalıtımı ve Cryo-katıştırma. Ötenazi takip, ilgi ve EKIM içeren cryomold içine embed cilt fare dorsal cilt bölgesi tıraş. Fare noktalı çizgi orta çizgi temsil eder. Tipik olarak, 3 veya 4 parça Cilt orta çizgi boyunca 3-4 çizgi segment ile izole edilebilir; Bu tür bir parça dikdörtgen 1/2/3/4 tarafından belirtilir. Bu cilt parçaları olarak gösterildiği gibi OCT gömülü olmalıdır. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: kimyasal Epilasyon sonrası makroskopik fenotürleri. (A) kimyasal epilasyon şeması. (B) tıraş olduktan sonra, saç döngüsü telogen olarak teyit edildi. (C) saç köklerinin hem saç folikülleri hem de melanosit kök hücrelerini etkinleştirebilecek saç şaftlarının kaldırılması için kimyasal epilasyon yapıldı. (D) yaklaşık bir hafta sonra, erken saç büyümesi kolayca fark edilecektir. (E) sonra, önemli saç büyüme zamanla görülebilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: kimyasal epilasyon ile kontrollü Melanom başlatılması mikroskobik gözlem. Kimyasal epilasyon, sessiz tümör eğilimli MCSCs 'nin aktivasyonunu önemli ölçüde teşvik edebilir. Daha sonra, mikroskopik tümör başlatılması tarafından gösterilen Lineage izleme Marker tdTomato içinde görülebilir 2 hafta. Bu rakam mikroskobik fenotipi gösterir 16 gün sonrası 3 gün IP enjeksiyonu ile tamoksifen, aynı görüş alanının farklı görselleştirmeleri kullanarak kimyasal epilasyon izledi. (A) tdtomato+ saç folikülünden kaynaklanan tümör hücreleri dapi nükleer sayaç lekesi ile birleştirilir. (B) saç folikülleri ve interfoliküler epidermis beyaz olarak özetlenmiştir. (C) nasıl tdTomato+ tümör hücrelerinin saç folikül dermis içine işgal gösteren bir şematik, Moon, H. ve al.6değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: UV-B radyasyon ile indüklenen kutanöz Melanom makroskopik fenotipi. Fareler tamoksifen tarafından 3 gün (1-3 gün) ve ardından 2 UV-B pozlama (4 ve 6. gün) tarafından tedavi edildi. (A) mutant MCSCs içeren dorsal CILT üzerinde UV-b radyasyon diyagramı. (B) kontrol ve UV-b maruz dorsal cilt arasında makroskopik fenotip. Melositik tümör oluşumuyla ilgili önemli siyah pigmentasyon, ikinci UV-B ışınlarından sonra 2 hafta içinde görülebilir. (C) güneş kremi uygulaması diyagramı. (D) UV-b önemli ölçüde mutant MCSCs gelen tümör başlamasını neden olabilir iken, güneş koruyucu uygulama önemli ölçüde BASTıRıLMıŞ UV-b-aracılı tümör başlatılması gösterdi (16 gün ikinci UV-b ışınlama sonrası). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 5: UV-B kaynaklı kutanöz Melanoma mikroskobik gözlem. Fareler tamoksifen ile IP enjeksiyonu ile tedavi edildi 3 gün (gün 1 için 3) tarafından izlenen 2 UV-B pozlama (gün 4 ve 5). (A-C) İnterfoliküler epidermis boyunca erken tümör başlangıcı, tdTomato izleme tarafından gösterilen, 17 gün içinde gösterilebilir. (A) tdtomato + tümör hücreleri, saç folikülü interfollicüler epidermis içine göç gösterilmiştir. Dapi nükleer sayaç lekesi olarak kullanılır. (B) dapi boyama kaldırılır ve noktalı çizgi saç folikülleri ve interfoliküler epidermis yerini gösterir. (C) UV-B pozlama aşağıdaki interfollicüler epidermis için saç Mikropdan tdTomato+ hücre göç gösteren şematik. Moon ve al.6' dan değiştirildi. (D-F) Sonra, tümör hücreleri hızla büyür ve aşağıdaki dermal dokularda istila (gün 25). (D) tdtomato+ tümör hücreleri dermal dokulara çoğalırlar ve istila etmeye devam etmiştir. Dapi nükleer sayaç lekesi olarak kullanılır. (E) dapi boyama kaldırılır ve noktalı çizgi saç folikülleri ve interfoliküler epidermis konumunu gösterir. (F) dermis ve melanositik tümör büyümesi Içine tdTomato+ hücre istilası gösteren şematik. Moon ve al.6' dan değiştirildi. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 6: kulak derisinde UV-B kaynaklı Melanom makroskopik ve mikroskobik gözlem. (A) deneysel düzeni. Fareler tamoksifen tarafından 3 gün (1 ' e 3 gün) ve ardından UV-B ışınlamalarına 3 pozlama (4, 6 ve 8. gün) tarafından tedavi edildi. (B) UV-B ışınlaması ile önemli ölçüde artmış Melanom başlatılması, 28. günde makroskopik olarak mikroskobik olarak gözlemlenmiştir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kutanöz Melanom tümörlerinde sık görülen Hallmark genetik değişiklikler13' ü iyi nitelendirdi. En dominant sürücü mutasyonu BRAFV600E, ve BRAFV600E-aracılı melanom için genetiği tasarlanan fare modeli Bosenberg grubu tarafından oluşturulan14 ve Jackson Laboratuvarı yatırıldı. Bu fare modelini kullanarak, son çalışmada dorsal cilt6 BRAFV600E-aracılı Melanom önemli başlangıcı için tümör eğilimli MCSCs hücresel aktivasyon gereksinimi göstermiştir.
Epilasyon dorsal cilt üzerinde murine saç folikül kök hücre aktivasyonu teşvik etmek için etkili bir yöntem olduğu bilinmektedir6,10. Murine MCSCs saç folikülleri içinde yer almaktadır, ve dahası, foliküler MCSCs hücresel durumu saç folikül kök hücreleri durumu ile senkronize8. Saç folikül kök hücrelerinin yapay modülasyonu MCSC durumunu değiştirebilir, böylece epilasyon doğrudan hem melanosit ve saç folikül kök hücrelerini etkinleştirebilirsiniz. MCSCs için bu aktivasyon yöntemi genetik olarak tasarlanan Melanom fare modellerinde kutanöz Melanom başlatma erken adımlarını incelemek için tümör eğilimli MCSCs için uygulanabilir. Bir kimyasal epilasyon yöntemi ile, murine dorsal deri ilgi bölgesinde Melanom oluşumu doğrudan başlatılabilir. Epilasyon, her ikisi de saç milleri saç folikülden çıkarılan mekanik epilasyon türleri olan, ağda veya plucking gibi çeşitli yöntemlerle yapılabilir. Ancak, bu mekanik epilasyon yöntemleri ilgi belirli bir bölgeye göre imprecise olabilir. Öte yandan, epilasyon krem kullanarak bir kimyasal epilasyon yöntemi gerçekleştirmek için basittir ve saç döngüsünün güvenilir aktivasyonu ile hassas uygulama için izin verir ve mekanik kaldırma daha cilt üzerinde daha az sert olabilir.
Çeşitli risk faktörleri arasında UV-B, kutanöz Melanom15' te en iyi bilinen risk faktörüdür. UV-B ışınlaması, foliküler MCSCs 'lerin interfollicüler epidermis9' a doğrudan göç etmesini sağlayan bilinmektedir. Ayrıca, UV-B önemli ölçüde tümör eğilimli MCSCs gelen Melanom başlatılması neden olabilir güçlü bir çevresel strese6. Yukarıda açıklanan deneysel protokolde, murine dorsal deride ilgi küçük bir bölge UV-B ışığa maruz kalırken, UV dirençli bir bez kullanımı kolayca fare geri kalanı istenmeyen pozlama korur. Bu tedavi, fare anestezi altında iken gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, MCSCs 'nin göç ve UV-B pozlama aşağıdaki MCSC kaynaklı Melanom oluşumu UV-B-doz bağımlı6. Bu nedenle, başarılı sonuçlar elde etmek için, UV-B metre kullanarak ampul yoğunluğunu düzenli olarak kontrol etmek ve gerektiğinde cilt ve ampuller arasındaki pozlama süresini ve mesafeyi ayarlamak önemlidir. Genellikle bilinen gibi, cilt UV-B ışık yüksek dozda yanıt olarak yanabilir, ama zayıf UV-B pozlama MCSC kaynaklı Melanoma ikna etmek için yetersiz olacak gibi de deney için zararlı.
Burada açıklanan protokol öncelikle çevre risk faktörü, UV-B, dorsal deride odaklanır. Ancak, yukarıdaki Deneysel protokol farklı amaçlar için uygulanabilir. Örneğin, protokol, UV-A gibi alternatif ışık kaynaklarının veya UV dalga boylarında etkisini belirlemek için farklı spektrumların ampuller ile değiştirilebilir. Bu protokol öncelikle dorsal cildi erişilebilir olduğu ve MCSCs 'nin durumu iyi tanımlanmış olarak hedeflenmiştir. Ancak, aynı zamanda ayak pedleri de dahil olmak üzere kulak, kuyruk veya palmiye derisi gibi eklentiler için UV ışık pozlama hedef değiştirilebilir. Örnek olarak, Şekil 6' da, alternatif doku bölgelerinde erken melositik tümör oluşumunda olası farkı incelemek mümkündür. Ancak, dorsal cildin aksine, bu sitelerde MCSCs durumu daha az iyi tanımlanır; Bu nedenle, meloma oluşumunun rasgele oluşumuna yol açan MCSCs 'nin potansiyel spontan aktivasyonu dikkate alınmalıdır. Bu nedenle, dorsal cildin protokolüyle karşılaştırıldığında, alternatif yaklaşımlar doğru deneysel sonuçlar elde etmek için daha fazla sayıda deney gerektirecektir.
Ayrıca, mevcut protokol öncelikle BRAFV600E-aracılı Melanom başlatılması gösterirken, önceki çalışmamızda aynı zamanda Onkojenik RAS/PTEN kombinasyonu ile benzer erken Melanom oluşumu bildirilmiştir, LSL-KRASG12D genetik allel6. Ancak, mutant NRAS genler gibi diğer sürücü mutasyonları da diğer Onkojenik kombinasyonları tarafından tahrik erken Melanom başlatılması anlamak için burada açıklanan deneysel sistemi ile düşünülebilir.
Birlikte alınan, burada açıklanan genetik olarak tasarlanan fareler erken kutanöz Melanom başlatılması incelenmesi için izin veren bir in vivo model sistemidir. Bu duvar modelleri, derideki mutant MCSCs 'den Melanom başlaması için temporal ve uzamsal kontrol yöntemleri sağlar. Bu protokoller, tümör eğilimli MCSCs 'den erken Melanom başlangıcı mekanizmalarının yanı sıra Melanom başlaması için katkı sağlayabilir fizyolojik ve çevresel stresleri belirlemek için bir platform incelemek için yeni bir paradigma sağlar. Bu düzeyde zamanmekansal kontrol aynı zamanda daha hassas Melanom indüksiyon için bir araç sağlayabilir meloma oluşumunun önlenmesi ilaç etkinliğini test etmek, yanı sıra tümör büyüme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.
Acknowledgments
Bu çalışma, sağlık Işleri Savunma Bakanı Yardımcısı tarafından tarafından desteklenmektedir, ödül W81XWH-16-1-0272 altında peer gözden kanser araştırma programı aracılığıyla. Görüşler, Yorumlar, sonuçlar ve öneriler yazarlar vardır ve mutlaka Savunma Bakanlığı tarafından onaylanan değildir. Bu çalışma Cornell kök hücre programından A.C. White 'a bir tohum hibe tarafından da destekleniyordu. H. Moon, Cornell vertebra Genomics öğretim programı Merkezi tarafından destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C.
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M.
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
