Summary
Följande procedur beskriver en metod för rumslig och temporal kontroll av melanocytisk tumör initiering i murina dorsala hud, med hjälp av en genetiskt modifierade mus modell. Detta protokoll beskriver makroskopisk och mikroskopisk kutan melanom initiering.
Abstract
Kutan melanom är välkänd som den mest aggressiva hud cancer. Även om riskfaktorer och stora genetiska förändringar fortsätter att dokumenteras med ökande djup, incidensen av kutan melanom har visat en snabb och kontinuerlig ökning under de senaste decennierna. För att hitta effektiva förebyggande metoder, är det viktigt att förstå de tidiga stegen av melanom initiering i huden. Tidigare data har visat att follikulära melanocytstamceller (MCSCs) i de vuxna hud vävnaderna kan fungera som melanom celler av ursprung när de uttrycker onkogena mutationer och genetiska förändringar. Tumorigenesis till följd av melanom-benägna MCSCs kan induceras när MCSCs över gång från en quiescent till aktivt tillstånd. Denna över gång i melanom-benägen mcscs kan främjas genom modulering av antingen hår säckar stamceller verksamhet stat eller genom yttre miljö faktorer såsom ultraviolett-b (UV-b). Dessa faktorer kan artificiellt manipuleras i laboratoriet genom kemisk depilation, som orsakar över gång av hår säckar stamceller och MCSCs från en quiescent till aktivt tillstånd, och genom UV-B exponering med hjälp av en bänk ljus. Dessa metoder ger framgångs rik rumslig och temporal kontroll av kutan melanom initiering i murina dorsala huden. Därför, dessa in vivo modell system kommer att vara värdefullt att definiera de tidiga stegen av kutan melanom initiering och kan användas för att testa möjliga metoder för tumör prevention.
Introduction
Melanom, den elakartade formen av melanocytiska tumörer, är den mest aggressiva cancer i huden med kutan melanom som ansvarar för majoriteten av hud cancer dödsfall1. I USA, melanom är allmänt diagnostiseras; Det beräknas vara den 5: e till 6: e vanligaste cancer typ bland de uppskattade nya cancer fall i 20182. Dessutom, medan den totala cancer incidensen har visat trenden med gradvis minskning under de senaste decennierna, kutan melanom incidens under de senaste decennierna visar en kontinuerlig och snabb ökning av båda könen2.
För att bekämpa kutana melanom mer effektivt, är det viktigt att tydligt förstå de tidiga händelserna av melanom utveckling från sina ursprungs celler för att bättre identifiera kliniskt effektiva förebyggande metoder. Det är nu känt att vuxna stamceller kan avsevärt bidra till tumör bildning som cellulära ursprunget av cancer i många olika typer av organ inklusive hud vävnader3,4,5. På samma sätt kan vuxna melanocytstamceller (MCSCs) i den murina dorsala huden fungerar som melanom celler av ursprung vid avvikande aktivering av ras/RAF och akt vägar6. Emellertid, dessa onkogena mutationer ensam inte kan effektivt inducera tumör bildning från quiescent MCSCs. Melanocytiska tumörer utvecklas så småningom när MCSCs blir aktiv under naturliga hår cykling. Men i detta protokoll kommer vi att beskriva metoder för att artificiellt inducera cellulär aktivering av tumör-benägen mcscs, vilket underlättar exakt kontroll av melanom initiering6,7.
Genom de metoder som beskrivs här, rumsliga och temporala kontroll av kutan melanom initiering från tumör-benägen MCSCs uttrycker onkogena BRAFV600E tillsammans med förlust av PTEN uttryck kan framgångs rikt utföras, som vi tidigare har rapporterat6. Denna metod innehåller tidigare fynd som visar hår follikeln stamcells aktivering genom avhårning samt hur exponering av murina hud till UV-B kan under lätta aktiveringen av mcscs bosatt i hår säcken och flyttning av denna cellulära subpopulation till interfollicular epidermis6,8,9,10. Dessa in vivo modell system kan ge värdefull information om hur fysiologiska och miljömässiga förändringar kan förändra cellulär status av melanom-benägna MCSCs, vilket i sin tur kan inducera betydande initiering av melanom i huden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur förfaranden utförs i enlighet med Cornell University institutionell djur vård och användning kommitté (IACUC).
1. förberedelser
-
Samla svans klipp från 12 dagar postnatal möss och smälta in 400 μL av 0,05 N NaOH vid 95 ° c för 1 h. Vortex och tillsätt 32 μL 1 M Tris-HCl, pH 7. Genotyp möss enligt PCR-protokoll som tillhandahålls genom Jackson Laboratory och identifiera möss med genotyp av intresse6.
- Tyr-CreER -hemizygous (+/creer)
- Lsl-BRAFV600E -heterozygot (+/lsl-v600e)
- PTEN- homozygot flox (flox/flox)
- Lsl-tdTomato -hemizygous (+/lsl-tdtomato)
Anmärkning: Primer sekvenser finns i tabell över material. - Använd en hår klippare (elektrisk trimmer) för att raka den dorsala huden 2 till 3 dagar före alla experiment som beskrivs nedan, och när möss är cirka 7 veckors ålder. Var noga med att inte skada den tunna musen huden med den elektriska trimmern som någon skada kan framkalla en sårläkning svar som kommer att aktivera hår säckar stamceller, inklusive MCSCs.
- Bestäm om hår cykeln är i telogen och om huden är sårad under vänte tiden. Om huden uppvisar några tecken på skada, bör musen inte användas för dessa procedurer.
Anmärkning: Även om hår cykeln kan skilja sig något mellan genetiska bakgrunder, vid denna ålder hår cykeln i rygg huden är vanligt vis i telogen tillstånd11. Den Tyr-CreER transgenen kommer att rikta mcscs i telogen hud, och de efterföljande genetiska förändringar kommer att vara permanent uttryckt i alla linjer av MCSC, inklusive differentierade melanocyter och melanocytiska tumörer.
2. tamoxifen behandling för CRE-LOX genetisk Recombination
-
Beredning av tamoxifen för intraperitoneal injektion (IP) eller lokal administrering för systemisk eller lokaliserad genetisk rekombination
Anmärkning: För att tamoxifen inducera rekombination, det måste först metaboliseras av levern till 4-hydroxytamoxifen (4-OHT), som kan binda till och aktivera creer. Topikal applicering av tamoxifen kommer inte att metaboliseras på detta sätt och 4-OHT måste direkt användas. Endast en metod för tamoxifen leverans krävs för tillräcklig rekombination.- Tamoxifen: Förbered tamoxifen vid en koncentration av 10 mg mL-1 upplöst i majsolja. Till stöd i upplösningen av drogen i lösning, tillsätt upp till 10% total volym av 100% molekyl kvalitet etanol till drogen i pulver form, Vortex i 3 min och sedan lägga till resterande volym av majsolja. Fortsätt att virvla tills kristallint material inte längre syns i lösningen. Tamoxifen lösning kan steriliseras genom att passera genom ett 0,2 μm filter. Fortsätt till steg 2.2.1 för behandling.
- 4-OHT: Förbered en stam lösning av hydroxytamoxifen upp till 3 mg mL-1 i 100% etanol. Sedan, en fungerande lösning kan appliceras så mycket som behövs för att täcka huden område av intresse (i allmänhet en enda ansökan).
Anmärkning: En stam lösning av hydroxytamoxifen kan lösas i 100% etanol för en koncentration på 5 mM. Sedan, för att bereda en fungerande lösning, 5 μL av 4OH-tamoxifen stam lösning kan spädas till 15 μL av 100% etanol. För 4 mm2 Area kan 1 till 3 μl arbets lösning appliceras lokalt.
-
Behandling av möss med tamoxifen antingen systemiskt eller topiskt
- För Systemisk behandling, administrera 2 mg tamoxifen via IP-injektion en gång dagligen i 3 dagar med en 26 G nål.
Anmärkning: Med denna modell, cirka 93% ± 4% av quiescent MCSCs är märkta med tdTomato6. - För regional aktivering, utför en topikal behandling med 4-OHT. Täck hud området av intresse med arbets lösningen. Mängden arbets lösning kan bestämmas av storleken på den region av intresse som beskrivs i steg 2.1.2.
- För Systemisk behandling, administrera 2 mg tamoxifen via IP-injektion en gång dagligen i 3 dagar med en 26 G nål.
- Vid 48 h efter den sista dosen av tamoxifen, gå vidare till steg 3 för kemisk avhårning inducerad tumör initiering eller till steg 4 för UV-B inducerad tumör initiering
3. kemisk depilation
- Utrusta en mus behandlings rum som innehåller ett Isofluran system med följande nödvändiga material: hår borttagning grädde, Cottons kompresser, pappers duk, och vatten.
- Placera musen i induktions kammaren och söva med 3,5 till 4,5% isofluran och 1 L/min syre.
- När andnings frekvensen har stabiliserats, bekräfta att musen är i rätt plan för anestesi genom att utföra en tå nypa och överföra musen till huvud röret underhålla anestesi med 1 till 1,5% isofluran och 1 L/min syre. Applicera Eye salva för att hålla ögonen från torkning under anestesi.
- Använd en bomullstuss för att tillämpa ett tunt lager av hår borttagning grädde till rakade regionen av musen huden.
- När krämen har tillämpats jämnt, Använd rena bomulls pinnar att börja ta bort. Den totala tiden som krämen är i kontakt med huden bör inte överstiga 1 min.
- Torka försiktigt av huden med en fuktig pappers trasa och se till att eventuell restkräm har avlägsnats.
Anmärkning: Hår borttagning grädde kan orsaka irritation på huden om det inte är helt bort. Vissa möss, såsom de på en C57BL/6 bakgrund, kan vara benägna att utveckla dermatit12. Även sällsynta, vissa djur kommer att utveckla dermatit inom 24 h efter hår borttagning grädde ansökan eller mekanisk depilation. Se till att kontrol lera mössen dagen efter behandlingen för att leta efter tecken på regional hud irritation. - Kassera de borttagna hår axlarna och eventuella material som används i en bio risk behållare.
- Placera musen i en tom, ren mus bur tills anestesi har avklingat.
- Återlämna mössen till sina burar.
4. UV-B bestrålning
- Utrusta en mus behandlings rum som innehåller ett Isofluran system med följande nödvändiga material: UV-B ljus system, UV-B ljus mätare, skyddande beläggning för musen, ytterligare UV-B skyddande PPE för forskare, och en timer.
- Möss bör bestrålas vid UV-B-dosen av intresse (dvs. 0-180 mJ/cm2). Använd UV-B ljus mätaren för att bestämma lämplig tid att bestråla möss.
Obs: MW/cm2 x tid = dos - Anesthetize musen med isofluran. Använd 3,5 till 4,5% isofluran och 1 L/min syre i induktions kammaren.
- När musen är stabiliserad, bekräfta anestesi effekter med en tå nypa och överföra musen till de viktigaste anestesi röret ligger i UV-kammare. Applicera Eye salva för att förhindra att ögonen torkar under anestesi. Underhåll anestesi med 1 till 1,5% isofluran och 1 L/min syre.
- Täck den dorsala huden med UV-B skyddande material så att endast den önskade regionen kommer att exponeras.
Anmärkning: Vid denna tidpunkt bör lämplig personlig skyddsutrustning utnyttjas. Den tid som behövs för att bestråla musen beror på intensiteten av den glöd lampa som används, men anestesi kan behöva övervakas om den tid som krävs överstiger 30 s. - Täck UV-kammaren med UV-resistent lock eller andra lämpliga material.
- Slå på UV-B-lampan och bestråla musen för den tid som bestäms av forskarna för det specifika målet.
- Stäng av UV-systemet och isofluran, placera sedan musen till en tom mus bur tills anestesi har försvunnit.
- Återlämna mössen till sina burar.
5. vävnads beredning
-
Isolering av huden
- Hämta följande innan du börjar: obduktion instrument, filter papper och pappers hand dukar.
- Euthanize mössen enligt IACUC godkända protokoll, och bekräfta döden innan du fortsätter.
- Med hjälp av en hår klippare, raka något hår från rygg hud området. Borsta försiktigt området med en luddfri vävnad för att rensa området.
- Gör ett litet snitt med vassa saxar strax ovanför stjärtbasen.
- Infoga stora trubbiga saxar i snittet och separera subdermala bindväv.
- Isolera försiktigt huden regionen av intresse genom att skära med vassa saxar längs kanten av vävnaden.
- Placera hud vävnaden på en ren pappers hand duk och använda tråkig pincett att sträcka huden så att den fäster på hand duken och lärs ut. Det här steget används för att ge ytterligare stöd för vävnaden så att den kan manipuleras och bearbetas samtidigt som den behåller sin form.
Anmärkning: Var noga med att bara hantera de yttre regionerna av hud vävnaden, eftersom pincett kan orsaka skador på huden som kan ses histologiskt.
-
Vävnad fixering
- Vik en bit filter papper i hälften och etikett på lämpligt sätt. Placera huden tillsammans med pappers hand duk bak sida i vikta papper omedelbart intill globlinjen, se till att provet är slät och inte viks eller skrynklig. Täta filter papperet genom att häftning på de öppna sidorna och trimma sedan så att det återstående papperet kan användas för framtida prover.
Anmärkning: Detta steg utförs så att huden behåller sin form under fixering. - Dränera vävnads provet helt i 10% neutral buffrad formalin i 3 till 5 timmar vid rums temperatur eller över natten vid 4 ° c.
- Efter fixering, ta bort proverna från formalin, tvätta i avjoniserat vatten (2x, 5 min vardera) och fortsätt att göra vävnads block. Ta försiktigt bort eventuellt restmaterial från hud vävnaden (dvs. restpapper).
- Vik en bit filter papper i hälften och etikett på lämpligt sätt. Placera huden tillsammans med pappers hand duk bak sida i vikta papper omedelbart intill globlinjen, se till att provet är slät och inte viks eller skrynklig. Täta filter papperet genom att häftning på de öppna sidorna och trimma sedan så att det återstående papperet kan användas för framtida prover.
-
Tillverkning av frysta vävnads block (figur 1)
- Trimma kanterna på huden provet så att de inte är hackiga och sedan göra 3 sagittal nedskärningar. Bredden på dessa remsor bör inte vara mer än höjden av cryomold (5 mm). Nästa, göra tvärgående nedskärningar ha bitar av huden som inte är längre än bredden på den cryomold (20 mm) och kan bäddas in. Upprepa med den återstående halvan av dorsala huden, eller spara vävnaden för andra användnings områden (omväxlande, spara hälften före fixering).
Anmärkning: Det är viktigt att hålla hud bitarna i rätt orientering. - Orientera cryomold (25 x 20 x 5 mm3) i en stående orientering och placera 4 till 5 bitar av huden ovanpå ULT. När alla bitar är på plats, Använd 2 par fina pincett att föra den långa kanten av huden till botten av cryomold. Huden bör nu stå upp i ULT vinkel rätt mot basen av mögel. Var noga med att minimera bildandet av luft fickor inom ULT under detta steg (figur 1).
- Fyll mögel med ULT till den andra läppen, och placera på den plana ytan av torris. Använd pincett för att justera eventuella hudbitar som kan ha skiftat under överföringen eftersom blocket börjar frysa. När botten skiktet är stelnat, manipulation av vävnader kommer att vara omöjligt.
- Skär 8-10 μm dia bilder för analys.
- Trimma kanterna på huden provet så att de inte är hackiga och sedan göra 3 sagittal nedskärningar. Bredden på dessa remsor bör inte vara mer än höjden av cryomold (5 mm). Nästa, göra tvärgående nedskärningar ha bitar av huden som inte är längre än bredden på den cryomold (20 mm) och kan bäddas in. Upprepa med den återstående halvan av dorsala huden, eller spara vävnaden för andra användnings områden (omväxlande, spara hälften före fixering).
-
Att göra formalin fast paraffin inbäddade (FFPE) vävnads block
- Placera 2 stycken fast hud i en märkt kassett och torka i ökande koncentrationer av etanol (75% etanol för 30 min, 85% för 30 min, 90% för 30 min, 95% för 30 min, 100% för 2x 30 min, xylen eller xylensubstitut för 2x 30 min). Inkubera med paraffin vid 58-60 °, först i 30 min, och sedan över natten.
- Bädda in vävnaden i en 24 x 24 mm2 rost fritt stål vävnad mögel med flytande paraffin och stelna vid-5 ° c. Vävnads orienteringen bör likna den hos frysta vävnads block så att längsgående snitt över flera hår säckar kan visualiseras (figur 1).
- När paraffin har stelnat, ta bort mögel och skär i 5-10 μm sektioner för analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kutan melanom initiering inducerad av kemisk avhårning
Förfarandet för kemisk avhårning avbildas i figur 2. När möss är 7-veckors postnatal, deras rygg hud är i telogen. Under telogen, hår säckar stamceller och MCSCs är kända för att vara i en quiescent, vilande tillstånd. Huden ska inte uppvisa någon signifikant hårväxt efter rakning. Å andra sidan kan kemisk avhårning inducera hår säcken stamcells aktivering, vilket i sin tur visar betydande hårväxt från regionen av intresse (figur 2). Likaså, tumör-benägen MCSCs uttrycker onkogena mutationer måste också vara aktiv för accelererad tumör bildning. Kemisk avhårning kan avsevärt inducera aktivering av både hårfollikeln stamceller och mcscs. melanom-benägna mcscs i ett aktivt tillstånd kan bilda tumörer, och mikroskopisk melanom initiering kan observeras inom 2 veckor efter kemisk avhårning med hjälp av härstamning allle lsl-tdTomato (figur 3).
Kutan melanom initiering inducerad av UV-B-bestrålning
Liknar kemisk depilation, UV-B kan inducera tumör initiering från quiescent tumör-benägen MCSCs (figur 4). Medan murina hud som innehåller tumör-benägen MCSCs i en quiescent tillstånd visar ingen signifikant tumör initiering och brist på signifikant pigmentering, den dorsala huden utsätts för UV-B (två gånger, 180 mJ/cm2) visar svart pigmenterade tidiga melanocytiska tumörer som är makroskopiskt uppenbara (figur 4a, B). Medan UV-B kan avsevärt inducera makroskopiskt uppenbara tumör initiering inom 2 veckor, kan tillämpningen av solskydd skydda UV-B-medierad melanom initiering i huden, liknande en UV-resistent trasa (figur 4c, D).
Viktigt, UV-B inducerar direkt translokering av MCSCs från deras follikulär stamcells nisch till interfollicular epidermis. Dessutom kan UV-B inducera MCSC-ursprung kutana melanom bildning hela interfollicular epidermis, och mikroskopisk fenotyp kan observeras av härstamning markören, tdTomato (figur 5). Eftersom dessa tumör celler är maligna, de växer snabbt och invasivt (figur 5). Liknar den dorsala huden, UV-B-inducerad melanom initiering kan särskilt observeras i andra hud områden, såsom örat huden (figur 6). Jämfört med kontroll huden täcks av UV-resistent trasa, örat huden utsätts för UV-B visar högre pigmentering på grund av en högre belastning av melanom initiering (figur 6).
Figur 1: isolering av hud vävnad och Cryo-inbäddning. Efter döds hjälp, raka musen dorsala huden regionen av intresse och bädda in huden i cryomold innehåller ULT. Den streckade linjen på musen representerar mitt linjen. Typiskt, 3 eller 4 bitar av huden kan isoleras med linje segment 3-4 längs mitt linjen; ett sådant stycke indikeras av rektangel 1/2/3/4. Dessa hud bitar bör bäddas in i ULT som visas i figuren. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: makroskopiska fenotyper efter kemisk avpilering. Adiagram över kemisk avpilering. (B) efter rakning, hår cykeln bekräftades vara i telogen. (C) kemisk avhårning utfördes för att avlägsna hår axlar från hår säckarna, som kan aktivera både hår säcken och melanocytstamceller. (D) ungefär en vecka senare, tidig hårväxt kommer att vara lätt märkbar. (E) sedan, betydande hårväxt kan observeras över tiden. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mikroskopisk observation av melanom initiering som kontrol leras genom kemisk avpilering. Kemisk avhårning kan avsevärt inducera aktivering av quiescent tumör-benägen mcscs. Sedan, mikroskopisk tumör initiering demonstreras av härstamning markören tdTomato kan observeras inom 2 veckor. Denna siffra visar den mikroskopiska fenotyp 16 dagar efter 3 dagar tamoxifen genom IP-injektion följt av kemisk avhårning med olika visualiseringar av samma synfält. Atdtomato+ tumör celler som härstammar från hår säcken slogs samman med DAPI: s nukleära disk fläck. (B) hår säckarna och interfollicular epidermis beskrivs i vitt. (C) en schematisk visar hur tdTomato+ tumör celler invadera i dermis från hår säcken, modifierad från Moon, H. et al.6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: makroskopisk fenotyp av kutant melanom inducerad av UV-B-bestrålning. Möss behandlades med tamoxifen i 3 dagar (dag 1 till 3) följt av 2 UV-B exponeringar (dag 4 och 6). Adiagram över UV-b-bestrålning på rygg huden som innehåller muterade mcscs.bmakroskopisk fenotyp mellan kontroll och UV-b exponerad dorsala hud. Betydande svart pigmentering relaterade till melanocytisk tumör bildning kan observeras inom 2 veckor efter den andra UV-B bestrålning. Cdiagram över solskydds medel. (D) medan UV-b kan avsevärt inducera tumör initiering från muterade mcscs, applicering av solskydd visade signifikant UNDERTRYCKT UV-b-medierad tumör initiering (16 dagar efter den andra UV-b bestrålning). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: mikroskopisk observation av UV-B-inducerad kutan melanom. Möss behandlades med tamoxifen genom IP-injektion i 3 dagar (dag 1 till 3) följt av 2 UV-B exponeringar (dag 4 och 5). (a-C) Tidig tumör initiering i hela interfollicular epidermis demonstreras av härstamnings spårning tdTomato kan visas på dag 17. (A) tdtomato + tumör celler visas migrera från hår säcken till interfollicular epidermis. DAPI används som en nukleär disk fläck. (B) DAPI färgning avlägsnas och prickad linje visar platsen för hår säckarna och interfollicular epidermis. (C) Schematisk indikering av tdTomato+ cell migration från hårgrodden till interfollicular epidermis efter UV-B-exponering. Modifierad från Moon et al.6. (D-F) Sedan, tumör celler växa snabbt och invadera dermal vävnader nedan (dag 25). (D) tdtomato+ tumör celler har fortsatt att proliferera och invadera i huden vävnader. DAPI används som en nukleär disk fläck. (E) DAPI färgning avlägsnas och prickad linje anger placeringen av hår säckarna och interfollicular epidermis. (F) Schematisk visar tdTomato+ cell invasion i dermis och melanocytisk tumör tillväxt. Modifierad från Moon et al.6. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: makroskopisk och mikroskopisk observation av UV-B-inducerad melanom i öron skinn. Aförsöks plan. Möss behandlades med tamoxifen i 3 dagar (dag 1 till 3) följt av 3 exponeringar mot UV-B-bestrålning (dag 4, 6 och 8). (B) signifikant ökning av melanom initiering genom UV-B-bestrålning observerades makroskopiskt såväl som mikroskopiskt vid dag 28. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hallmark genetiska förändringar som ofta finns i kutan melanom tumörer har väl beskrivits13. Den mest dominerande föraren mutation är BRAFV600E, och en genetiskt modifierade mus modell för BRAFV600E-Medierat melanom genererades av Bosenberg grupp14 och deponeras i Jackson Laboratory. Med hjälp av denna mus modell, visade vår senaste studie kravet på cellulär aktivering av tumör-benägen MCSCs för betydande initiering av BRAFV600E-medierat melanom i dorsala hud6.
Depilation är känd för att vara en effektiv metod för att inducera murina hårfollikeln stamcells aktivering på rygg huden6,10. Murine MCSCs är belägna inom hår säckarna, och dessutom är cellulär status follikulär MCSCs synkroniseras med tillståndet i hår säckar stamceller8. Artificiell modulering av hår säckar stamceller kan förändra MCSC status, så avhårning kan direkt aktivera både melanocyte och hår säckar stamceller. Denna aktiverings metod för MCSCs kan tillämpas för tumör benägna MCSCs att undersöka tidiga steg av kutan melanom initiering i genetiskt modifierade melanom mus modeller. Genom en kemisk avhårning metod, melanom formation i regionen av intresse i murina dorsala huden kan initieras direkt. Depilation kan utföras av olika metoder såsom vaxning eller plockning, som båda är typer av mekanisk hår borttagning där hår axlar utvinns ur hår säcken. Dessa mekaniska avhårning metoder kan dock vara oprecisa med avseende på en viss region av intresse. Å andra sidan, en kemisk avhårning metod med hjälp av hår borttagning grädde är enkel att utföra och möjliggör exakt tillämpning med pålitlig aktivering av hår cykeln, och kan vara mindre hårda på huden än mekanisk borttagning.
Bland olika riskfaktorer, UV-B är den mest välkända riskfaktorn i kutan melanom15. UV-B bestrålning är känd för att inducera direkt migration av follikulära MCSCs i interfollicular epidermis9. Dessutom, UV-B är en stark miljö stressfaktor som avsevärt kan inducera melanom initiering från tumör-benägen MCSCs6. I det experimentella protokollet som beskrivs ovan, en liten region av intresse på murina dorsala huden kan utsättas för UV-B ljus medan användningen av en UV-resistent trasa lätt skyddar resten av musen från oönskad exponering. Denna behandling kan utföras medan musen är under anestesi. Viktigt, migration av MCSCs och bildandet av MCSC-ursprung melanom efter UV-B exponering är UV-B-dos beroende6. Därför, för att få framgångs rika resultat, är det viktigt att regelbundet kontrol lera intensiteten av glöd lampa med hjälp av en UV-B-mätare och justera exponerings tid och avstånd mellan huden och glöd lampor efter behov. Som är allmänt känt, kan huden bränna som svar på en hög dos av UV-B ljus, men svag UV-B-exponering är också skadligt för experimentet eftersom det kommer att vara otillräcklig för att inducera MCSC-ursprung melanom.
Det protokoll som beskrivs här fokuserar främst på miljö riskfaktorn, UV-B, i rygg huden. Det experimentella protokollet ovan kan dock tillämpas på olika syften. Till exempel kan protokollet modifieras med glöd lampor av olika spektrar för att bestämma effekten av alternativa ljus källor eller våg längder av UV, såsom UV-A. Detta protokoll riktade främst dorsala huden som den är tillgänglig och status för MCSCs är väl definierad. Emellertid, det kan också ändras för att rikta UV-ljus exponering för bihang såsom örat, svans eller Palm hud, inklusive fot kuddar. Som ett exempel, i figur 6, är det möjligt att undersöka eventuell skillnad i tidig melanocytisk tumör bildning på alternativa vävnads ställen. Men till skillnad från den dorsala huden, status MCSCs i dessa områden är mindre väldefinierade; Därför bör den potentiella spontana aktiveringen av MCSCs som leder till slumpmässiga förekomster av melanom bildning övervägas. Därför, jämfört med protokollet i dorsala huden, alternativa metoder kommer att kräva ett ökat antal experiment för att få korrekta experimentella resultat.
Dessutom, medan det nuvarande protokollet främst visar BRAFV600E-medierad melanom initiering, vår tidigare studie rapporterade också liknande tidiga melanom bildning med en onkogen ras/PTEN kombination, med hjälp av LSL-krasG12D genetisk allel6. Emellertid, andra driv rutins mutationer såsom muterade Nras gener kan också övervägas med det experimentella systemet som beskrivs här för att förstå tidiga melanom initiering drivs av andra onkogena kombinationer.
Sammantaget beskrivs här är ett in vivo-modellsystem som möjliggör undersökning av tidig kutan melanom initiering i genetiskt modifierade möss. Dessa murina modeller ger metoder för temporal och spatial kontroll av melanom initiering från muterade MCSCs i huden. Dessa protokoll ger ett nytt paradigm för att studera mekanismerna för tidig melanom initiering från tumör-benägen MCSCs samt en plattform för att bestämma de fysiologiska och miljömässiga stressfaktorer som kan bidra till melanom initiering. Denna nivå av spatiotemporal kontroll kan också ge ett verktyg för mer exakt melanom induktion att testa läkemedels effekt för att förebygga melanom bildning, samt tumör tillväxt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar ingen intresse konflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av kansliet för biträdande sekreterare i försvaret för hälso frågor, genom peer recenserade cancer Research program under tilldelning W81XWH-16-1-0272. Åsikter, tolkningar, satser och rekommendationer är de av författarna och är inte nödvändigt vis godkänts av försvarsdepartementet. Detta arbete stöddes också av ett frö bidrag från Cornell Stem cell program till A.C. White. H. Moon stöddes av Cornell Center for vertebrate genomik Scholar program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648-1G | For systemic injection |
| Tamoxifen | Cayman Chemical | 13258 | For systemic injection |
| Corn oil | Sigma | 45-C8267-2.5L-EA | |
| 4OH-tamoxifen | Sigma | H7904-25MG | For topical treatment |
| 26 G 1/2" needles | various | Veterinary grade | |
| 1 mL syringe | various | Veterinary grade | |
| Pet hair trimmer | Wahl | 09990-502 | |
| Hair removal cream | Nair | n/a | Available at most drug stores |
| Cotton swabs | various | ||
| Ultraviolet light bulb | UVP | 95-0042-08 | model XX-15M midrange UV lamp |
| 200 proof ethanol | various | pure ethanol | |
| Histoplast PE | Fisher Scientific | 22900700 | paraffin pellets |
| Neutral Buffered Formalin, 10% | Sigma | HT501128-4L | |
| Clear-Rite 3 | Thermo Scientific | 6901 | xylene substitute |
| O.C.T. Compound | Thermo | 23730571 | |
| Tissue Cassette | Sakura | 89199-430 | for FFPE processing |
| Cryomolds | Sakura | 4557 | 25 x 20 mm |
| FFPE metal mold | Leica | 3803082 | 24 mm x 24 mm |
| Isoflurane | various | Veterinary grade | |
| Anesthesia inhalation system | various | Veterinary grade | |
| Fine scissor | FST | 14085-09 | Straight, sharp/sharp |
| Fine scissor | FST | 14558-09 | Straight, sharp/sharp |
| Metzenbaum | FST | 14018-13 | Straight, blunt/blunt |
| Forcep | FST | 11252-00 | Dumont #5 |
| Forcep | FST | 11018-12 | Micro-Adson |
| Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f | Jackson Labs | 13590 | |
| LSL-tdTomato | Jackson Labs | 007914 | ai14 |
| Cre-1 | n/a | GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG |
|
| Cre-2 | n/a | GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG |
|
| Braf-V600E-1 | n/a | TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC | |
| Braf-V600E-2 | n/a | CTCTGCTGGGAAAGCGGC | |
| Kras-G12D-1 | n/a | AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA |
|
| Kras-G12D-2 | n/a | CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA |
|
| Pten-1 | n/a | ACTCAAGGCAGGGATGAGC | |
| Pten-2 | n/a | AATCTAGGGCCTCTTGTGCC | |
| Pten-3 | n/a | GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC | |
| tdTomato-1 | n/a | AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA | |
| tdTomato-2 | n/a | CCGAAAATCTGTGGGAAGTC | |
| tdTomato-3 | n/a | GGCATTAAAGCAGCGTATCC | |
| tdTomato-4 | n/a | CTGTTCCTGTACGGCATGG |
References
- Wernli, K. J., Henrikson, N. B., Morrison, C. C., Nguyen, M., Pocobelli, G., Blasi, P. R. Screening for skin cancer in adults: updated evidence report and systematic review for the US preventive services task force. The Journal of the American Medical Association. 316 (4), 436-447 (2016).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A.
- White, A. C., Lowry, W. E. Refining the role for adult stem cells as cancer cells of origin. Trends in Cell Biology. 25 (1), 11-20 (2015).
- Moon, H., Donahue, L. R., White, A. C. Understanding cancer cells of origin in cutaneous tumors. Cancer Stem Cells. , 263-284 (2016).
- Blanpain, C.
- Moon, H., Donahue, L. R., et al. Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure. Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).
- Moon, H., White, A. C. A path from melanocyte stem cells to cutaneous melanoma illuminated by UVB. Molecular & Cellular Oncology. 5 (2), e1409864 (2018).
- Rabbani, P., Takeo, M., et al. Coordinated activation of Wnt in epithelial and melanocyte stem cells initiates pigmented hair regeneration. Cell. 145 (6), 941-955 (2011).
- Chou, W. C., Takeo, M., et al. Direct migration of follicular melanocyte stem cells to the epidermis after wounding or UVB irradiation is dependent on Mc1r signaling. Nature Medicine. 19 (7), 924-929 (2013).
- Keyes, B. E., Segal, J. P., et al. Nfatc1 orchestrates aging in hair follicle stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (51), E4950-9 (2013).
- Müller-Röver, S., Handjiski, B., et al. A comprehensive guide for the accurate classification of murine hair follicles in distinct hair cycle stages. The Journal of Investigative Dermatology. 117 (1), 3-15 (2001).
- Kastenmayer, R. J., Fain, M. A., Perdue, K. A. A retrospective study of idiopathic ulcerative dermatitis in mice with a C57BL/6 background. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science : JAALAS. 45 (6), 8-12 (2006).
- Vultur, A., Herlyn, M.
- Dankort, D., Curley, D. P., et al. Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma. Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).
- Viros, A., Sanchez-Laorden, B., et al. Ultraviolet radiation accelerates BRAF-driven melanomagenesis by targeting TP53. Nature. 511 (7510), 478-482 (2014).
