Summary
Protokollen beskriver brugen af trådmyografi til at evaluere den transmural isometriske spænding af mesenteriske arterier isoleret fra mus, med særlig hensyntagen til graduering af faktorer frigivet fra endotelceller og perivaskulære fedtvæv.
Abstract
Ændret vaskulær tone reaktionsevne til patofysiologiske stimuli bidrager til udviklingen af en bred vifte af kardiovaskulære og metaboliske sygdomme. Endothelial dysfunktion repræsenterer en stor synder for den reducerede vasodilatation og øget vasokonstriktion af arterier. Fedtvæv omkring arterierne spiller en vigtig rolle i reguleringen af endothelium-afhængig afslapning og/eller sammentrækning af de vaskulære glatte muskelceller. Kryds samtalerne mellem endotelet og perivaskulære fedtvæv kan vurderes ex vivo ved anvendelse af monterede blodkar ved hjælp af et trådmyografi system. Der bør dog fastsættes optimale indstillinger for arterier, der stammer fra dyr af forskellige arter, aldre, genetiske baggrunde og/eller patofysiologiske forhold.
Introduction
Dilatationer og konstriktioner af arterier opnås ved relaxationer og sammentrækninger, henholdsvis af deres vaskulære glatte muskelceller. Ændringer i vaskulære reaktionsevne af små arterier bidrager til den homeostatiske regulering af arteriel blodtryk ved autonome nerver og hormoner til stede i blodet (f. eks catecholaminer, angiotensin II, serotonin, vasopressin). På lokalt plan er de vaskulære reaktioner af glatte muskelceller moduleret af signaler fra både endotelcellerne i intima og fedtvæv omkring arterierne (figur 1).
Endotelet er ikke kun en passiv barriere, men fungerer også som en overflade til at udveksle signaler mellem blodet og de underliggende vaskulære glatte muskelceller. Ved at frigive forskellige vasoaktive stoffer, endotelet spiller en afgørende rolle i den lokale kontrol af vaskulære tone svar1. For eksempel, som reaktion på acetylcholin, endotel nitrogenoxid syntase (eNOS) er aktiveret i endotelet at producere nitrogenoxid (Nej), som inducerer afslapning af den underliggende vaskulære glatte muskulatur ved at aktivere opløselige guanylylcyclasekoblede cyclase (SGC) 2. andre vasoaktive stoffer omfatter produkter af cyclooxygenaser (f. eks. prostacyclin og thromboxan2), lipoxygenase (f. eks. 12-hydroxyeicosatetraenoinsyre, 12-HETE) og cytokrom P450 Monooxygenaser (hetes og epoxyeicosatrienoic syrer, EETs), reaktive oxygenarter (ROS) og vasoaktive peptider (f. eks. endothelin-1 og angiotensin II) og endothelium-afledte hyperpolariserende faktorer (EDHF)3. En hårfin balance mellem endothelium-afledte vasodilatorer og vasokonstriktorer opretholde den lokale vasomotoriske tone4,5.
Endothelial dysfunktion er karakteriseret ved svækkelse i endothelium-afhængige vasodilatation6, et kendetegn for vaskulær aldring7. Med alderen reduceres evnen af endotelet til at fremme vasodilatation gradvist, hvilket i høj grad skyldes en nedsat biotilgængelighed, samt det unormale udtryk for og funktion af Enosh i endotelet og SGC i de vaskulære glatte muskelceller8 , 9 ud af , 10. nedsat biotilgængelighed potentiates produktion af endothelium-afhængige vasokonstriktorer11,12. I alderen arterier, endotel dysfunktion forårsager hyperplasi i medierne, som afspejles af de markante stigninger i vægtykkelse, antallet af mediale kerner, som minder om den arterielle fortykkelse i hypertension og aterosklerose observeret i humane patienter13,14. Derudover accelererer patofysiologiske tilstande som fedme, diabetes eller hypertension udviklingen af endotel dysfunktion15,16.
Perivaskulære fedtvæv (PVAT) frigiver talrige adipokiner til at regulere vaskulær struktur og funktion17. Den anti-contractile effekt af pvat er medieret af afslappende faktorer, såsom adiponectin, nej, hydrogenperoxid og hydrogensulfid18,19,20. Men afhængigt af placeringen og patofysiologiske tilstand, pvat kan også forbedre kontraktile responser i forskellige arterier21. De Pro-contractile stoffer produceret af pvat omfatter angiotensin-II, leptin, resistin, og ros22,23. I de fleste undersøgelser af isolerede blodkar er PVAT blevet betragtet som en simpel strukturel støtte til Vaskulaturen og dermed fjernet under tilberedningen af blodkar ring segmenter. Da fedtfri dysfunktion udgør en uafhængig risikofaktor for hypertension og tilknyttede kardiovaskulære komplikationer24, bør pvat omkring blodkarrene tages i betragtning ved undersøgelse af den vaskulære reaktionsevne hos forskellige arterier.
Multi wire myograph systemer er blevet almindeligt anvendt til at undersøge vasomotoriske funktioner af en række blodkar, herunder aorta, mesenterisk, renal, femoral, cerebral og koronar arterier25,26. De protokoller, der er beskrevet heri, vil bruge trådmyografi til at evaluere vaskulær reaktionsevne i mesenteriske arterier isoleret fra genetisk modificerede musemodeller, med særligt fokus på modulering af PVAT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr, der blev anvendt til følgende undersøgelse, blev leveret af laboratoriet for det medicinske fakultet, universitetet i Hong Kong. Der blev indhentet etisk godkendelse fra afdelings udvalget for brug af forsøgsdyr til undervisning og forskning (CULATR, nr.: 4085-16).
1. præparater
- Forberedelse af lægemidler
- Opbevar lægemidler korrekt som angivet i sikkerheds data bladet (MSDS) umiddelbart efter modtagelsen. Stofferne opløses i pulverform i opløsningsmidler som højkoncentrationsstam opløsninger og derefter alikvot til opbevaring ved-20 °C.
Bemærk: de fleste lægemidler opløses i destilleret vand for at forberede stamopløsningerne; opvarmning eller sonikering kan være nødvendig for nogle lægemidler. Hvis lægemidler ikke opløses fuldstændigt i vand, kan der tilsættes et fald på 1 M NaOH, mens der for basale lægemidler kan anvendes et fald på 1 M HCl. Hydrofobe medicin kan opløses i dimethylsulfoxid (DMSO) eller absolut ethanol. I sidstnævnte tilfælde skal den endelige bade koncentration (i M) være kendt, og der bør foretages passende kontrol for at udelukke virkningerne af opløsningsmidlerne. - Før eksperimentet opløses stof aliquoterne (indholdsoversigten) i Krebs-Ringers bicarbonat opløsning (Krebs) indeholdende 115 mm nacl, 4,6 mm kcl, 2,5 mm CaCl2, 1,17 mm mgso4, 1,17 mm KH2po4, 25 mm NaHCO3, 11,1 mm D-glucose og 0,01 mm EDTA, pH 7,4.
- For kumulative koncentrations-responskurver, forberede bestande og arbejds løsninger af forskellige stoffer ved serielle fortyndinger (tabel 1).
- Opbevar lægemidler korrekt som angivet i sikkerheds data bladet (MSDS) umiddelbart efter modtagelsen. Stofferne opløses i pulverform i opløsningsmidler som højkoncentrationsstam opløsninger og derefter alikvot til opbevaring ved-20 °C.
- Opsætning af instrumentet
- Kalibrer kraft transduceren til alle kanaler, før du bruger myograph-systemet hver dag, eller hver gang systemet er blevet flyttet.
Bemærk: den detaljerede kalibreringsprocedure varierer afhængigt af modellen. Generelt påføres kæberne en vægt på to gram, og den tilsvarende kraft skal 9,81 ± 0,1 mN. Hvis læsningen er slukket med mere end 0,1 mN, skal transduceren kalibreres igen. For det system, der anvendes i denne protokol (Se tabellen over materialer), skal driftsværdierne for kraft transduceren under kalibreringen være mellem 3000 og 3500. Hvis transducerens værdi er højere eller lavere, skal kraft transduceren udskiftes. - Juster og Juster monterings understøtninger i hvert kammer. Kontinuerlig og gentagen brug af myograf kammeret kan forårsage en vis forskydning af monterings støtten, som kræver lejlighedsvis justering før eksperimenter for at sikre, at kæberne er korrekt justeret.
Bemærk: der er behov for særlig opmærksomhed ved justering af monterings understøtninger, da krafttransducere er meget følsomme og skrøbelige. - Tænd varmeapparater og gas (95% O2 og 5% Co2) mindst 30 min før forsøget for at gøre det muligt for kamre og buffere at varmes op til 37 ± 0,1 °c og ækvilibreret med gasblandingen.
- Kontrollér temperaturen på termometret for at sikre, at varmelegemet er korrekt. Temperaturen kan ændres til at køre køling eller opvarmning eksperimenter. Hvis temperaturen ikke er korrekt indstillet, skal du anvende maskinens offset funktion til at forøge eller formindske indstillingerne for at nå den ønskede temperatur.
- I slutningen af eksperimentet, rense alle kamre og slukke for varmelegeme samt gas kører til opsætningen.
- Sluk ikke for gassen, før al væsken i kammeret er suget ud af systemet, ellers kan syre/destilleret vand regurgitere og nå orgel kammeret under næste brug.
- For at rense kamrene af trådmyografen, den mest effektive måde er at udføre syre-vask ved hjælp af en fortyndet eddikesyre opløsning. Rengør kanten og indersiden af kamrene med en vatpind.
- Efter vask skylles kamrene grundigt med destilleret vand. Tør ydersiden af kamrene med en våd klud for at fjerne tørret salt. Ethanol kan også anvendes, hvis der er anvendt hydrofobe medicin under forsøget.
- Et eksempel på vaskeproceduren er som følger. De skal fyldes med 8% eddikesyre og inkube i 2 min. Brug en applikator med bomulds spids til mekanisk at rengøre stål kammerets overflade. Undgå enhver kontakt med aluminiums delen af myografen.
- Der aspireret eddikesyre og vaskes myograph kammer og understøtter flere gange med destilleret vand og tør overfladerne ved hjælp af absorberende papir eller bomuld-spids applikatorer.
- Kalibrer kraft transduceren til alle kanaler, før du bruger myograph-systemet hver dag, eller hver gang systemet er blevet flyttet.
- Dissektion af mesenteriske arteriringe
Bemærk: dyr, der anvendes til den aktuelle undersøgelse, var fedtholdig kost fodret med Adipo-SIRT1-mus og vildtype-littermates som kontrol. Hvert dyr vejede ca. 45 g på tidspunktet for forsøgene.- Euthanize musen ved intraperitoneal injektion af pentobarbital natrium (50 mg/kg).
- Med kirurgisk saks og pincet, udføre en mid-line laparotomi at afsløre abdominal indhold.
- Saml den mesenteriske arkade i en silicium belagt Petri skål.
- Sprede og PIN ned mesenterisk netværk i Petri skålen til at afsløre forgreningen af mesenterium og bindevæv meshwork.
- Under et mikroskop (10x), og med fine-saks og pincet, forsigtigt dissekere omgivende bindevæv. Undgå at beskadige det utilsigtede lag. Alternativt kan omgivende fedtvæv opbevares omkring blodkar til eksperiment (hvis nødvendigt).
- Ved hjælp af den fine saks og pincet, punktafgifter de sekundære grene af mesenteriske arterier i iskold Krebs buffer.
Bemærk: hver forsker skal have sit eget sæt dissektion kit, strygere og bøjler. Disse værktøjer bør holdes ordentligt og renses op hver gang efter forsøget, da nogle stoffer er svære at vaske væk og rester kan holde sig til dem.- Hold blodkarrene i koldt Krebs buffer, samtidig med at det omgivende bindevæv adskilles, herunder PVAT. Under håndteringen af blodkar, være blid for at forhindre unødvendig skade på endotelet.
- Hvis forsøget involverer en undersøgelse af PVAT, skal du fastholde en kugle af PVAT med en diameter på 1,5 til 2 mm omkring blodkar. Alternativt kan der tilsættes samme mængder fedtvæv i hvert kammer til forsøg.
- Valgfri Fjern endotelet fra det dissekerede blodkar som en kontrol for at evaluere endotelet-afhængigheden af svarene. For mesenteriske arterier, fjerne endotelet ved forsigtigt at rulle det over en wire omrøring eller et hår.
- Skær blodkarrene fremstillet som ovenfor i små ringe (~ 2 mm længde) og læg dem i en plastik skål fuld af tilsat kulsyre (95% O2 og 5% Co2) Krebs buffer til efterfølgende montering i kamrene i en wire myograph27.
- Fartøjs ringene overføres til et myograf kammer, der er placeret under mikroskopet. Ringene skal placeres jævnt med de øvre og nedre bøjler parallelt. Den fastgjorte ledning (40 μm) skal nyforberedes, da stoffer kan binde sig til strengene.
- Tråd blodkar ringen på en passende længde (2 cm) af tråden og Fastgør til en kæbe af monterings kammeret ved at skrue for at fastgøre positionen.
- Pass en anden ledning gennem ringen og anker til den modsatte kæbe.
- Med ringe gevind og fastgjort til kammer kæberne skal du montere kammeret på myograph-opsætningen og dreje mikrometer skruen med uret for at flytte ledningerne tæt på hinanden, indtil den kraft aflæsning på brugergrænsefladen, der svarer til den monterede kammer, er nul eller bare Nedenfor.
Bemærk: ledningen fastgjort til overkæben skal være af minimal længde for at sikre, at spændingen kan være fuldt transduceret til detektoren. - Præparaterne ækvilibreres ved 37 °C i mindst 30 minutter før den første anvendelse af kraft ved hjælp af det justerbare mikrometer.
- Vurdere vævs levedygtigheden i 115 mM højt kalium(NaCl erstattet af KCl på molær basis) Krebs indeholdende 4,6 mm NaCl, 115 mm KCl, 2,5 mm cacl2, 1,17 mM MGSO4, 1,17 mm KH2po4, 25 mm NaHCO3 og 11,1 mM D-glucose ved pH 7,4.
Bemærk: isolerede fartøjer anses for at være levedygtige, hvis kontraktile kraften transduceret og registreres som afbøjning over basislinjen i myograph-systemets dataregistrerings software, er mere end 40% af deres hvile tone som reaktion på en kontraktile agent. Hvis arterie ikke kontrakt korrekt, så enten den optimale basal spænding/vægtryk er ikke blevet korrekt justeret eller arterien kan have været beskadiget under isolation eller montering af fartøjet. - Valgfri Vurdere integriteten af endotelceller ved at anvende phenylephrin til at fremkalde sammentrækning af skibet til 50% af den oprindelige respons på KCl (som registreret af kraft transduceren i data optagelsen software), efterfulgt af tilsætning af 1 μM acetylcholin.
Bemærk: en god forberedelse af blodkar er afgørende for at opnå konsistente og præcise resultater. Et præparat bør ikke anvendes til forsøget, enten hvis endotelintegritets testen er utilfredsstillende, eller det ikke reagerer på KCl, hvilket indikerer, at endotel funktion eller vaskulær glat muskel kontraktilitet, henholdsvis, ikke er tilfredsstillende. I dette tilfælde skal præparatet udskiftes med en ny ring fra det samme blodkar eller et nyt blodkar.
2. normalisering for at bestemme den optimale indledende spænding
Bemærk: normaliseringsproceduren gør det muligt at bestemme den optimale indvendige diameter (IC) af arterier, hvor blodkar heden oplever et passende hvilende transvægtryk (100 mmHg eller 13,3 kPa for mesenteriske arterier) og giver maksimal aktiv respons på vasoaktive stoffer.
- Tænd for computeren, og Åbn dataregistrerings softwaren (Se tabellen over materialer).
- Gem eksperimentet som en "LabChart-datafil" med et nyt navn for at undgå at overskrive den oprindelige indstillings fil.
- Åbn vinduet normaliserings indstillinger , og Angiv k -faktoren som 1. Accepter standardværdierne for okularet kalibrering (0,3, hvis fartøjets længde er ukendt, eller 1 Hvis fartøjets længde er kendt), måltryk (13,3), online gennemsnitstid (2) og forsinkelsestid (60). Klik på OK for at gemme indstillingerne.
- Vælg kanaler af interesse og Indtast tråddiameteren (40 μm), vævs slutpunkter (a1:0; a2: vævs længde som målt), første mikrometer aflæsning i normaliserings vinduet.
- Start normaliseringsproceduren ved at anvende den første passive strækning på blodkar (Drej mikrometer skruen mod uret).
- Vent på, at beholderen stabiliserer sig (3 min), og Indtast den nye mikrometer aflæsning i normaliserings vinduet. Vægspændingen beregnes automatisk og vises som et punkt på grafen.
Bemærk: mikrometer "trin", der anvendes i den passive strækning behøver ikke at være den samme. De første par strækninger kan være 20 μm hver. Efterhånden som strækningerne kommer tættere på Isobar linjen, kan trinene reduceres til 10 μm, 5 μm, 2 μm eller endnu mindre. Har hoved diagramvinduet åbent, mens du justerer mikrometer indstillingerne — hvis en stor spids, der overskrider Isobar linjen på en længde/spænding Graf (som angiver trykpunkter svarende til en på forhånd fastsat værdi) vises, reducere spændingen. - Efter hver passiv strækning, Udskift kontrollen Krebs med en ISO-osmotisk høj kalium Krebs indeholdende 115 mM KCl. Når sammentrækningen når et plateau (ca. 3 min.), optages den aktive kraft (F) ved at trække den passive kraft i hver strækning fra den kalium aktiverede kraft. Beregn vægspændingen samt de interne omkredsen (IC) værdier.
- Mål aktiv spænding som afbøjning over grundlinjen. Den aktive spænding (T) beregnes ud fra ligningen F (mN) = T (mN/mm) x 2 x fartøjs længde (mm). Interne omkredsen (IC) værdier er beregnet ud fra mikrometer data (IC = 205,6 μm + 2 x "hul").
- Fjern den høje kalium tilstand ved at udskifte med frisk krebs. Vask igen tre gange over 5 min.
- Gentag trin 2,5 til 2,8 (ved at inducere passive strækninger efterfulgt af aktiv sammentrækning i skiftevis sving), indtil den aktive spænding begynder at falde (figur 2).
- Efter flere runder af alternative strækninger, den passive længde/spænding kurver giver værdien af IC100, den indvendige omkreds af fartøjet ved et tværgående Tryk på 100 mmHg, som passagepunkt med Isobar linje.
Bemærk: hver mikrometer værdi under de passive strækninger introduceres manuelt i softwarens normaliserings modul. Programmet registrerer automatisk den tilsvarende kraft måling for at generere den passive længde/spændings kurve, som giver værdien af IC100 som overgangspunkt med Isobar linje (figur 2, højre paneler). Jo tættere det sidste punkt er på Isobar linje, men lige over den bedre normalisering er uden at beskadige skibene. Et punkt for langt over Isobar linjen kan fysisk beskadige det monterede fartøj, hvilket giver upålidelige resultater under forsøget. - Opret den aktive længde/spændings kurver for at bestemme IC1 værdier og beregne normaliseringen k Factor som forholdet mellem IC1/IC100, som vil blive anvendt til denne type blodkar i efterfølgende myografi eksperimenter.
Bemærk: den aktive længde/spændings kurver oprettes ved at afbilde IC-værdier, der er beregnet ud fra mikrometer dataene på x-aksen og aktive spændinger på y-aksen. IC1 er den værdi, der ligger inden for peak plateau regionen (røde spor i figur 2, højre paneler). Efter at have plottede den aktive længde/spændings kurver og fastlægge IC1, beregnes normaliseringen af k -faktoren som forholdet mellem IC1/IC100. Baseret på normaliseringen af k -faktoren, vil den optimale IC for baseline, betegnet som IC1, blive vist på den passive længde/spændings kurve. Mikrometer indstillingen for denne IC vises under kurven og bør anvendes til at indstille mikromanipulator til efterfølgende myografi eksperimenter. Den indledende spænding (T) er lig med måltrykket (PI) x IC/2π, og den optimale kraft (F), der påføres fartøjet, svarer til T x 2 x fartøjs længde. - Grundigt vaskes den høje kalium krebs og ligevægt forberedelserne til en anden 30 til 45 min. Nulstil de basale spændinger til "nul", så kun aktive contraktile svar vil blive registreret under det efterfølgende eksperiment.
3. phenylephrin-induceret sammentrækninger
Bemærk: lægemidler, der kan udvælges til at inducere vasokonstriktive reaktioner omfatter den uspecifikke adrenoceptor agonist noradrenalin, den selektive α-1 adrenoceptor agonist phenylephrin, peptid hormon angiotensin II, og monoamin neurotransmitter 5-hydroxytryptamin. Phenylephrin anvendes i denne protokol til undersøgelse (tabel over materialer).
- Forbered og monter parrede arterielle ringe som beskrevet i afsnit 1,3, en med PVAT intakt og den anden med PVAT fjernet, fra de tilstødende sektioner af hver arterie til eksperimentet.
- Efter normalisering (beskrevet i afsnit 2), præ-kontrakt arteriel segmenter med høj kalium Krebs buffer ved at tilføje 115 mM KCl opløsning til kammeret, der indeholder krebs.
- Vente på sammentrækning til plateau (3 min), skylle den høje kalium og erstatte med frisk kulsyreholdige Krebs buffer. Gentag vask tre gange over 5 min.
- Gentag KCl stimulation og vask tre gange og Optag den maksimale kontraktile respons/spænding til KCl ved at trække baseline spænding fra spændingen på grund af KCl stimulation.
- Efter den sidste sammentrækning og vask, refill kammeret med varm, kulsyreholdige Krebs buffer og tillade arterien til at inddrive i ca 30 min, før du udfører den næste opgave.
- Til hvert kammer tilsættes kumulative mængder af phenylephrin (halve log-intervaller fra 10-10 til 10-4 M) for at inducere koncentrations afhængige stigninger i isometriske spændinger i de opaliserende præparater.
- Start med at tilføje en lav koncentration af agonist til kammeret. Efter at have givet tilstrækkelig tid til en stabil sammentrækning (3 – 5 min), tilsættes den næste koncentration. Gentag trinene med stigende koncentrationer af phenylephrin.
- Efter tilsætning af den sidste dosis af agonist (phenylephrin), vaskes stoffet grundigt og genopfyldnings kammeret med frisk Krebs buffer. De koncentrations afhængige reaktioner afbildes som stigende procentdele af KCl-inducerede maksimale sammentrækninger (figur 3).
- Valgfri For at vurdere bidraget fra NO, inkube præparaterne med NO-syntase-hæmmer, L-NAME (10-4 M), i 30 minutter før tilsætning af phenylephrin. L-Name øger phenylephrin-induceret sammentrækninger i de inaktiv præparater af mesenteriske arterier (figur 4).
Bemærk: inhibitorer eller antagonister skal have tilstrækkelig tid til at opnå ligevægt, sædvanligvis 30 – 45 min (være konsistent for ethvert sæt af eksperimenter). - For at udføre en anden koncentrations-respons kurve sekventielt skal kammeret vaskes helt og gentagne gange for at fjerne alle tidligere agonister, indtil der ikke observeres yderligere ændringer i tonen.
Bemærk: parallelle eksperimenter udsætter mindst to ringe fra samme blodkar til agonist, en under kontrolbetingelser og en under tilstedeværelse af inhibitoren (erne); i hver ring vil koncentrations-respons kurven kun blive udført én gang. Det foretrækkes at udføre parallelle eksperimenter, da dette giver en bedre kontrol for lægemidlets virkning og blodkar følsomhed. Serielle eksperimenter får en koncentrations-respons kurve til en agonist i en enkelt ring; at vaske det ud, ændre forsøgsbetingelserne (f. eks. tilføje en inhibitor) og derefter gentage koncentrations respons kurven på den samme ring. I dette tilfælde er det nødvendigt med tidskontrol for at vise, at lægemidlets respons ikke skyldes ændringer i vævet over tid. Man kan aldrig være sikker på, at vævet er i nøjagtig samme tilstand efter udsættelse for et koncentrations-respons eksperiment. Der skal gives tilstrækkelig tid (mindst 30 – 60 min) til, at fartøjs segmenterne kan vende tilbage til deres hvile (basal) spænding, selv om dette i nogle tilfælde ikke kan ske øjeblikkeligt efter afkobling af den høje affinitet fra receptorerne. Derudover kan der anvendes højt kalium Krebs mellem de kumulative koncentrations-responskurver for at reducere desensibilisering28. Husk, at de fleste antagonister ikke kan vaskes helt ud, og dermed holde tilføje det til resten af eksperimentet.
4. endothelium-afhængige relaxationer/kontraktioner
- Forkontrakt en nymonteret arteriel segment (som beskrevet i trin 3,2 til 3,5). Igen, registrere den maksimale kontraktile respons/spænding til KCl ved at trække baseline spænding fra spændingen på grund af KCl stimulation.
- Valgfri Præparaterne inkurueres med NO-syntase-hæmmeren, L-NAME (10-4 M), i 30 minutter før tilsætning af U46619.
- Tilsæt de forudberegnede koncentrationer af U46619 til kammeret og tillade en stabil, vedvarende sammentrækning af arterie segmenter.
Bemærk: Vasodilatoriske reaktioner induceres i mesenteriske arterier på forhånd kontraheret til omkring 80% af de maksimale responser på 115 mM KCl. forskellige agonister kan bruges til at inducere sammentrækning ved aktivering af deres specifikke receptorer. Her er blodkar segmenterne med eller uden PVAT på forhånd indgået med U46619 (1 – 3 x 10-8 M; Materiale), en thromboxan a2-receptor-agonist, for at inducere stabile og vedvarende glatte muskelsammentrækninger. - Tilsæt kumulative koncentrationer af acetylcholin (10-10 til 10-4 M) til orgel kammeret. Koncentrations afhængige vasodilatoriske reaktioner af arterie segmenter præsenteres i procent af U46619-induceret kontraktile responser (figur 5).
Bemærk: for det meste af eksperimentet, skal den næste koncentration af den afslappende agonist tilsættes straks, når et plateau er observeret for at forhindre rebound i spændinger. Koncentrations afhængige vasodilatoriske reaktioner af arterie segmenter er normaliseret som procentdel af U46619-induceret contraktile svar til at justere for mindre forskelle i innervation og diameter mellem arterie segmenter (figur 5). Små variabilitet i reaktionsevne mellem individuelle ringe opnået fra samme blodkar bliver minimal, når en gruppe på seks eller flere eksperimenter analyseres statistisk. Når man udtrykker respons som en procentdel af det enkelte vævets egne maksimale sammentrækninger, er det hensigtsmæssigt at anvende en parret analyse (f. eks. parret Student's t-test) for at måle svar af samme type væv fra forskellige dyr, som for at sammenligne respons af et enkelt væv før og efter en intervention. Ved analyse af effekten af PVAT bruges tovejs ANOVA efterfulgt af multiple-sammenligning test. - Efter tilsætning af den endelige dosis af den afslappende agonist, fjerne lægemidlet fra hvert kammer og refill med frisk Krebs buffer. Vask kammeret grundigt med Krebs buffer og lad arterie stabilisere i mindst 45 min før du udfører yderligere eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersøgelse af længden/spændingsforholdet for at opnå normaliserings faktoren k
Den mængde strækning, der anvendes på et fartøjs segment, påvirker omfanget af interaktionen mellem aktin og myosin og dermed den maksimale aktive styrke, der er udviklet. Således, for hver type af blodkar, bestemmelse af mængden af stretch er nødvendig for maksimal aktiv kraft er nødvendig for korrekt myography undersøgelser. Her udføres normaliseringen af forholdet mellem længde og spænding for mesenteriske arterier isoleret fra musemodeller (figur 2). De arterielle segmenter blev suspenderet i et fire-kammer wire myograph system (Se tabel over materialer) på rustfrit stål stifter (40 μm diameter). Isometrisk spænding blev indspillet ved hjælp af en analog-til-digital konverter tilsluttet til en computer med et optagelsesprogram. Afdelingerne indeholdt 5 mL Krebs buffer, opbevaret ved 37 °C og tilsat 95% O2 og 5% Co2 for at opretholde pH ved 7,4 under hele forsøget. En passiv længde/spændingsforhold blev etableret ved trinvis strækning af arterie segmenterne indtil den indvendige omkreds svarende til 100 mmHg transvægtryk (IC100) blev opnået. Efter hver strækning (blå pile), 115 mM KCl blev anvendt til at stimulere sammentrækninger (grønne pile). Den aktive længde/spænding kurver (rød) blev plottet ved at udtrække de aktive kraft data (trække den passive kraft på hver strækning fra KCl-aktiverede kraft) på Y-aksen og derefter en graf blev oprettet manuelt med IC værdier beregnet fra mikrometer data på X-aksen. En IC-værdi, der ligger inden for peak-plateauet, er IC1 (stiplede røde linjer). Normaliserings faktoren k blev beregnet som IC1/IC100-forhold, som derefter kunne anvendes på prøver af samme fartøjstype i det efterfølgende forsøg.
Præsentation og beregning af koncentrations-responskurver
De fleste koncentrations-responskurver udføres på en kumulativ måde. En lav koncentration af agonist tilsættes til badet (fortrinsvis begyndende med en koncentration under tærsklen for respons). Efter at have givet tilstrækkelig tid til et muligt respons (3-5 min.) tilsættes den næste koncentration. Når et respons observeres, er det tilladt at nå et plateau, før den næste maksimale respons er opnået. Den halve-log (gennemsnit 3,16-fold) stigninger i koncentrationen af phenylephrin anvendes her for at studere agonist-induceret sammentrækninger (figur 3 og figur 4).
I de fleste tilfælde udtrykkes sammentræknings-responskurver ikke som de rå værdier af spændinger/kraft, men som en procentdel af reference responsen på KCl opnået på det optimale punkt i længden/spændings kurven for det enkelte blodkar segment. Dette justerer for variation i størrelsen eller glat muskel indhold i blodkar, samt korrigerer for remodeling ændringer på grund af aldring eller patologi. Her opnås de maksimale sammentrækninger induceret af 115 mM KCl i begyndelsen af forsøget og anvendes til beregning af phenylephrin-stimulerede sammentrækninger af mesenteriske arterier med eller uden PVAT, i fravær eller tilstedeværelse af L-navn (figur 3 og figur 4).
For at studere agonister, der producerer afslapning, er fartøjerne normalt kontraheret til et ensartet niveau — omkring 50-80% af det maksimale kontraktile respons af dette væv. Da svarene på phenylephrin-induceret sammentrækninger er forskellige mellem de eksperimentelle grupper, den nuværende protokol bruger U46619 til at stimulere stabile kontraktioner før anvendelse af de kumulative koncentrationer af acetylcholin. Den glatte muskulatur afslapning udtrykkes som en procentdel af den oprindelige sammentrækning induceret af U46619 (figur 5).
Koncentrations-respons-kurver kan sammenlignes som tilstedeværelsen af et venstre-eller højre Skift (f. eks. mellem en kontrol kurve og en, der er opnået ved tilstedeværelse af en antagonist) ved at bestemme de koncentrationer, der frembringer lige respons, f. eks. 30% eller 50% af Maksimale. Disse benævnes henholdsvis EF30 og EF50(figur 3b). Statistisk sammenligning af de gennemsnitlige EC50 -værdier bør udføres på logaritmen af deres værdier. Depression af kurver undersøges ved at sammenligne deres respektive maksimale respons (Emax) (figur 3b). I de viste eksempler, de phenylephrin-induceret sammentrækninger i mesenteriske arterier blev forstærket af L-NAME og koncentrationen-responskurver viste en venstre Skift samt en forhøjelse i de maksimale sammentrækninger (figur 4b). De acetylcholin-inducerede relaxationer i mesenteriske arterier blev hæmmet af L-NAME, og koncentrations-respons kurven viste et højre Skift samt reduktion i de maksimale relaxationer (figur 5b).
Vaskulære reaktioner på forskellige farmakologiske midler kan beregnes som den område-under-The-sammentrækning-kurve (AUCC) for sammentrækninger og område-over-the-Relax-kurve (AARC) for afslapning, henholdsvis ved hjælp af ikke-lineær logistisk regression analyse til sammenligning10 (figur 3C, figur 4c og figur 5c). Virkningen af L-NAME kan sammenlignes med AUCC/AARC'S værdier for at bestemme NO biotilgængelighed (figur 6). Basal og stimuleret frigivelse af NO i mesenteriske arterier med eller uden PVAT kan udtrykkes som forskellene i koncentrations-responskurver af phenylephrin-stimuleret sammentrækning (DAUCC) og acetylcholin-induceret afslapning (DAARC), tilstedeværelse eller fravær af L-navn (figur 6a og figur 6b). I det viste eksempel reducerede tilstedeværelsen af PVAT NO biotilgængelighed i mesenteriske arterier indsamlet fra mus fodret med højt fedtindhold diæt (figur 6c).
Figur 1: et skematisk diagram af væggens struktur i arterierne. Endothelial celler i tunika intima mægle endothelium-afhængige afslapning/sammentrækning af den vaskulære glatte muskulatur, mens signaler frigivet fra perivaskulære fedtvæv moduserer kryds samtalerne mellem forskellige lag af arteriel væggen . Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative spor, der illustrerer et eksperiment for at bestemme de optimale Initial spændinger for musmesenteriske arterier. Blodkar segmenterne blev fremstillet af mesenteriske arterier indsamlet fra de 16-uger gamle mus fodret med standard Chow (A) eller højt fedtindhold kost (B). Efter montering blev de passive og aktive længde/spændings kurver opnået ved trinvise stræk og sekventiel stimulation med 115 mM KCl (venstre paneler). Den aktive sammentrækning genereret med hver stimulering bør øges, efterhånden som fartøjet strækkes, indtil det når et plateau i den optimale længde. Yderligere strækning vil føre til et fald i den aktive sammentrækning. IC100 og IC1 blev bestemt ved at plotte henholdsvis passive og aktive længde/spændinger kurver (højre paneler). Bemærk, at den passive længde/spændings kurve blev genereret af normaliserings modulet efter manuel indføring af mikrometer værdierne, hvorimod den aktive længde/spændinger kurver plottes manuelt efter beregning af spændinger og IC-værdier på hvert trin i KCl Stimulation. Forholdet IC1/IC100 blev beregnet som normalisering k Factor (højre paneler). ). Bemærk også, at kun de sidste fire punkter i den aktive længde/spændings kurve blev vist i figurerne i panel (b). STC: standard Chow fodret musarterie; HFD: højt fedtfattig kost fodret mus arterie. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: output optagelser af vasokonstriktor responser på phenylephrin i mesenteriske arterier med eller uden omgivende PVAT. Kontraktilitet undersøgelser udføres på præparater af mesenteriske arterier fra 16-ugers-gamle Adipo-SIRT1 Transgene mus, hvor den menneskelige SIRT1 er overudtrykt selektivt i fedtvæv29. Kumulative koncentrationer af phenylephrin blev anvendt for at stimulere sammentrækninger af mesenteriske arterier uden (-PVAT) eller med (+ PVAT), (a). Kontraktile responserne blev registreret og beregnet som en procentdel af 115 mM KCl-induceret maksimal sammentrækning (B). De område-under-de sammentrækning kurver (AUCC) blev plottet til sammenligning (C). Bemærk, at PVAT fra Adipo-SIRT1 mus fremkaldte en anti-contractile effekt på reaktionen på phenylephrin. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: output optagelser af vasokonstriktor responser på phenylephrin i mesenteriske arterier med eller uden den omgivende PVAT, og i fravær eller tilstedeværelse af L-Name. Mesenteriske arterier blev indsamlet fra 16-ugers gamle vildtype mus fodret med højt fedtindhold kost. Tredive minutter efter tilsætning af 10-4 M L-navn eller køretøj kontrol, kumulative koncentrationer af phenylephrin blev anvendt til at stimulere sammentrækninger af mesenteriske arterier (a). Kontraktile responserne blev registreret og beregnet som en procentdel af 115 mM KCl-induceret maksimal sammentrækning (B). De område-under-de sammentrækning kurver (AUCC) blev plottet til sammenligning (C). Bemærk, at PVAT fra kosten fede mus ikke fremkalde anti-contractile effekter på respons på phenylephrin. – PVAT: arterielle ringe fremstillet uden PVAT; + PVAT: arterielle ringe tilberedt med den omgivende PVAT; -L-navn: arteriel ringe ikke inkueret med L-NAME; + L-NAME: arterielle ringe inkueret med L-NAME. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: output optagelser af vasodilatator svar til acetylcholin i mesenteriske arterier med eller uden den omgivende PVAT, og i fravær eller tilstedeværelse af L-Name. Mesenteriske arterier blev indsamlet fra 16-uger gamle mus fodret med højt fedtindhold kost. Ved 30 minutter efter tilsætning af 10-4 m L-navn eller kontrol af køretøjet er blodkar segmenterne med eller uden pvat på forhånd indgået med U46619 (1-3 x 10-8 m; Materiale), en thromboxan a2-receptor-agonist, for at inducere stabile og vedvarende glatte muskelsammentrækninger. Kumulative koncentrationer af acetylcholin blev derefter anvendt til at stimulere lempningerne af mesenteriske arterier med eller uden den omgivende PVAT (A). Afslapnings responserne blev registreret og beregnet som procentdel af U46619-induceret sammentrækning (B). Området-over-de afslapnings kurver (AARC) blev afbildet til sammenligning (C). Bemærk, at kun arteriel segmentet med omgivende PVAT vises i panel A. – PVAT: arterier, der er fremstillet uden PVAT; + PVAT: arterielle ringe tilberedt med den omgivende PVAT; -L-navn: arteriel ringe ikke inkueret med L-NAME; + L-NAME: arterielle ringe inkueret med L-NAME. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: illustration af proceduren til beregning af No biotilgængelighed. Området-under-The-sammentrækning-kurver (AUCC) og området-over-the-Relax-kurver (AARC) blev beregnet på grundlag af svarene på kumulative koncentrationer af phenylephrin (a) og acetylcholin (B), hhv. Forskellene mellem præparater, der blev forbehandlet uden og med L-NAME, blev defineret som ∆ AUCC (A) og ∆ Aarc (B) til at repræsentere basal No-bidrag og stimulerede ingen frigivelse. Derfor blev ∆ AUCC (beregnet fra figur 4c), ∆ aarc (beregnet fra figur 5c) og summen af begge (total No biotilgængelighed) præsenteret for at sammenligne No biotilgængelighed i mesenteriske arterier uden og med de omgivende PVAT (C). – PVAT: arterielle ringe fremstillet uden PVAT; + PVAT: arterielle ringe tilberedt med den omgivende PVAT; -L-navn: arteriel ringe ikke inkueret med L-NAME; + L-NAME: arterielle ringe inkueret med L-NAME. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bortset fra de endotelceller, spiller signaler fra pvat en vigtig rolle i reguleringen af glatte muskeltonus reaktivitet30. Sunde pvat frigiver ingen og anti-inflammatorisk adiponectin at udøve en anti-contractile effekt på arterier, som er tabt under patologiske tilstande såsom fedme og metabolisk syndrom31,32. I sygdomstilstande bidrager pvat til udviklingen af endotel dysfunktion og andre kardiovaskulære abnormiteter33,34. Unormal Enosh udtryk og funktion er blevet rapporteret i pvat af arterier fra fede dyr35,36. Da både endotel-og pvat-dysfunktioner bidrager til udviklingen af kardiovaskulære og metaboliske abnormiteter23,37, bør deres rolle overvejes ved udførelse af ex vivo-vaskulære forsøg ved at inkludere i eller fjerne dem fra præparaterne.
Wire myografi systemet giver en bekvem platform til at dissekere vasoaktive signaler frigivet fra pvat ved hjælp af forskellige farmakologiske sonder10,38. Imidlertid er kompositioner i PVAT af forskellige typer af arterier, eller de samme arterier fra dyr med forskellig genetisk baggrund, ikke samme39. Derfor bør trådmyografi resultaterne involverer PVAT ikke sammenlignes på tværs af forskellige typer af arterier eller den samme type arterier fra mus af forskellige stammer. Alder og de underliggende sygdomstilstande påvirker også de cellulære kompositioner i PVAT. Her blev mus fra samme genetiske baggrund, men med forskellige genetiske modifikationer i fedtvæv, brugt til at sammenligne PVAT ' vasomodulerende aktivitet.
Som en hovedkilde til resistens over for blodgennemstrømning vælges mesenteriske arterier til nærværende undersøgelse. Hvilespændingen bestemmer mængden af vasomotoriske reaktionsevne40. Den optimale indledende spænding af blodkar er påvirket af typen af arterie, alder, kost, behandling og genetiske baggrund af dyrene, bør derfor bestemmes individuelt, før de undersøger afslapning/sammentrækning-responskurver. For nærværende demonstration blev de overlegne mesenteriske arterier indsamlet fra 16-ugers gamle mus fodret med standard Chow eller højt fedtindhold kost startende fra en alder af fire uger. Denne protokol understreger, at der skal etableres optimale indstillinger for maksimal aktiv kraftproduktion af arterielle segmenter, før der vurderes farmakologiske reaktioner. Både passive og aktive længde/spændingsforhold er undersøgt for mesenteriske arterier indsamlet fra in-House musemodeller. Der er fastlagt en normaliserings- k -faktor på 1 for præparater fra de 16-ugers gamle dyr, som afviger fra standardværdien på 0,9, eller som anvendes i tidligere publikationer41. Forsigtighed er nødvendig, når man sammenligner normaliseringen nøgletal i litteraturen på grund af mulige forskelle i teknikken, buffer sammensætning og instrument modeller, osv. Især påvirker alder, kost og andre patofysiologiske forhold den passive og aktive spænding samt de farmakodynamiske egenskaber for arterierne42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev ydet økonomisk støtte gennem tilskud fra Rådet for forskning i Hongkong [17124718 og 17121714], Hongkongs fond for sundhed og medicinsk forskning [13142651 og 13142641], den kollaborative forskningsfond i Hongkong [C7055-14G] og den nationale grundlæggende Forskningsprogram i Kina [973 program 2015CB553603].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) | Sigma-Aldrich | N5751 | Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M |
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 | Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α) | Enzo | BML-PG023-0001 | Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M |
| Multiwire myograph | Danish MyoTechnology (DMT) | 620M | |
| PowerLab 4/26 | ADInstruments | ML848 | |
| Labchart7 | ADInstruments | - | |
| Adipo-SIRT1 wild type mice | Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong | CULATR NO.: 4085-16 | |
| Silicon-coated Petri dishes | Danish MyoTechnology (DMT) | ||
| Tungsten wires | Danish MyoTechnology (DMT) | 300331 | |
| Surgical tools |
References
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
- Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
- Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
- Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
- Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
- Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153 (1997).
- Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
- Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
- Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
- Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
- Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
- Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
- Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
- Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
- Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
- Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3 (2018).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
- Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415 (2008).
- Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
- Gao, Y. -J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
- Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
- Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
- Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
- Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
- Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
- Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
- Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
- Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
- Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
- Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
- Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
- Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
- Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
- Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
- Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
- Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
- Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200 (2015).
- Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).
