Summary
Protokollet beskriver användningen av tråd myography att utvärdera transmural ISO metrisk spänning av mesenteriala artärer isolerade från möss, med särskild hänsyn till modulering av faktorer som frigörs från endotelceller och perivaskulär fett vävnad.
Abstract
Förändrad vaskulär tonen lyhördhet för patofysiologiska stimuli bidrar till utvecklingen av ett brett spektrum av kardiovaskulära och metabola sjukdomar. Endotelial dysfunktion representerar en stor skyldige för minskad vasodilatation och förbättrad vasokonstriktion av artärer. Adipose (fett) vävnader som omger artärerna spela viktiga roller i regleringen av endotel-beroende avslappning och/eller sammandragning av de vaskulära glatt muskel celler. Kors samtalen mellan endotelet och perivaskulär fett vävnad kan bedömas ex vivo med hjälp av monterade blod kärl genom ett trådmyografisystem. Dock bör optimala inställningar fastställas för artärer som härrör från djur av olika arter, åldrar, genetiska bakgrunder och/eller patofysiologiska tillstånd.
Introduction
Dilatationer och sammandragningar av artärer uppnås genom lättnader och kontraktioner, respektive, av deras vaskulära glatt muskel celler. Förändringar i vaskulär respons hos små artärer bidrar till homeostatiska regleringen av arteriellt blod tryck genom autonoma nerver och hormoner som finns i blodet (t. ex. katekolaminer, angiotensin II, serotonin, vasopressin). På lokal nivå, de vaskulära Svaren av glatt muskel celler moduleras av signaler från både endotelcellerna i intima och fett vävnad som omger artärerna (figur 1).
Endotelet är inte bara en passiv barriär, men fungerar också som en yta för att utbyta signaler mellan blodet och de underliggande vaskulära glatt muskel celler. Genom att släppa olika vasoaktiva ämnen, endotelet spelar en kritisk roll i den lokala kontrollen av vaskulär tonen svar1. Till exempel, som svar på acetylkolin, endotelceller kväve oxid syntas (Enos) aktive ras i endotelet att producera kväve oxid (no), som inducerar avslappning av den underliggande vaskulär glatt mus kula tur genom att aktivera lösliga guanylyl guanylatcyklas (SGC) 2. andra vasoaktiva substanser inkluderar produkter av cyklooxygenaser (t. ex. prostacyklin och tromboxan2), lipoxygenas (t. ex. 12-hydroxyeicosatetraenoic syror, 12-hete) och cytokrom P450 Monooxygenaser (hetes och epoxyeicosatrienoic syror, EETs), reaktiva syreradikaler (ROS), och vasoaktiva peptider (t. ex. endotelin-1 och angiotensin II), och endotel-derived hyperpolariserande faktorer (EDHF)3. En delikat balans mellan endotel-härledda vasodilatorer och vasoconstrictors bibehålla den lokala vasomotoriska tonen4,5.
Endotelial dysfunktion kännetecknas av nedskrivning i endotel-beroende vasodilatation6, ett kännetecken för vaskulär åldrande7. Med åldern, förmågan hos endotelet att främja vasodilatation reduceras successivt, beror till stor del på en minskad ingen bio tillgänglighet, liksom onormal uttryck och funktion av eNOS i endotelet och sGC i den vaskulära glatt muskel celler8 , 9 för att , 10. reducerad ingen bio tillgänglighet potentierar produktionen av endotelium-beroende vasoconstrictors11,12. I åldern artärer, endotelial dysfunktion orsakar hyperplasi i media, som återspeglas av den markerade ökningar i vägg tjock lek, antal mediala kärnor, som påminner om den arteriella förtjockning i hypertoni och ateroskleros observerats i mänskliga patienter13,14. Dessutom, patofysiologiska tillstånd såsom fetma, diabetes eller hypertoni påskynda utvecklingen av endotelial dysfunktion15,16.
Perivaskulär fett vävnad (PVAT) frigör många adipokines att reglera vaskulär struktur och funktion17. Den anti-kontraktila effekten av pvat medieras av avslappnande faktorer, såsom adiponectin, no, väteperoxid och svavelväte18,19,20. Emellertid, beroende på plats och patofysiologiska tillstånd, PVAT också kan öka kontraktila svar i olika artärer21. De Pro contractile ämnen som produceras av pvat inkluderar angiotensin-II, leptin, resistin, och ros22,23. I de flesta av studierna på isolerade blod kärl, har PVAT ansetts som ett enkelt strukturellt stöd för kärl teckning och därmed avlägsnas under beredningen av blod kärl ring segment. Eftersom fett dysfunktion representerar en oberoende riskfaktor för hypertoni och associerade kardiovaskulära komplikationer24, bör den pvat som omger blod kärlen övervägas när man undersöker den vaskulära responsen hos olika artärer.
Multi Wire myograph system har använts i stor utsträckning för att undersöka vasomotoriska funktioner i en mängd olika blod kärl, inklusive aorta, mesenteric, renal, femoral, cerebral och kranskärl25,26. De protokoll som beskrivs häri kommer att använda trådmyografi för att utvärdera vaskulär reaktionsförmåga i mesenteriala artärer isolerade från genetiskt modifierade mus modeller, med särskilt fokus på modulering av PVAT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur som användes för följande studier tillhandahölls av medicinska fakulteten, universitetet i Hong Kong. Etiskt godkännande erhölls från institutions kommittén för användning av försöks djur för undervisning och forskning (CULATR, No.: 4085-16).
1. förberedelser
- Beredning av droger
- Förvara läkemedel på lämpligt sätt enligt vad som anges i material säkerhets data bladet (MSDS) omedelbart efter att du fått dem. Lös upp läkemedlen i pulver form i lösnings medel som hög koncentration lager lösningar och sedan alikvot för lagring vid-20 ° c.
Obs: de flesta droger löses i destillerat vatten för att förbereda beståndet lösningar; värme eller ultraljudsbehandling kan krävas för vissa droger. Om droger inte helt löses upp i vatten, en droppe 1 M NaOH kan tillsättas, medan för grundläggande droger en droppe 1 M HCl kan användas. Hydrofoba läkemedel kan lösas i dimetylsulfoxid (DMSO) eller absolut etanol. I de senare fallen bör den slutliga koncentrationen av bad kar (i M) vara känd och lämpliga kontroller utföras för att utesluta effekterna av lösnings medlen. - Före experimentet, lös upp läkemedels Ali kvoter (material tabell) i Krebs-ringer bikarbonatlösning (Krebs) innehåll ande 115 mm nacl, 4,6 mm kcl, 2,5 mm CaCl2, 1,17 mm mgso4, 1,17 mm KH2Po4, 25 mm NaHCO3, 11,1 mm D-glukos och 0,01 mm EDTA, pH 7,4.
- För kumulativa koncentrations-responskurvor, Förbered lagren och arbets lösningarna för olika läkemedel med seriella utspädningar (tabell 1).
- Förvara läkemedel på lämpligt sätt enligt vad som anges i material säkerhets data bladet (MSDS) omedelbart efter att du fått dem. Lös upp läkemedlen i pulver form i lösnings medel som hög koncentration lager lösningar och sedan alikvot för lagring vid-20 ° c.
- Ställa in instrumentet
- Kalibrera kraft givaren för alla kanaler innan du använder myograph-systemet varje dag, eller varje gång systemet har flyttats.
Obs: den detaljerade kalibrerings proceduren varierar beroende på modell. I allmänhet en två gram vikt appliceras på käftar och motsvarande kraft bör 9,81 ± 0,1 mN. Om avläsningen är avstängd med mer än 0,1 mN, ska givaren kalibreras på nytt. För det system som används i detta protokoll (se material tabellen) skall drift värden för kraft givaren under kalibreringen vara mellan 3000 och 3500. Om givarens värde är högre eller lägre måste kraft givaren bytas ut. - Justera och justera monterings stöden i varje kammare. Kontinuerlig och upprepad användning av myograph kammaren kan orsaka en viss förskjutning av monterings stödet, som behöver tillfällig justering innan experiment för att säkerställa att käftarna är korrekt justerade.
Obs: särskild uppmärksamhet behövs vid justering av monterings stöden eftersom kraft givarna är mycket känsliga och ömtåliga. - Slå på värmare och gas (95% O2 och 5% co2) minst 30 min före försöket för att tillåta att kamrarna och buffertarna värms upp till 37 ± 0,1 ° c och utjämnade med gas blandningen.
- Kontrol lera temperaturen på termometern för att säkerställa noggrannheten av värmaren. Temperaturen kan modifieras för att köra kylning eller uppvärmningen experiment. Om temperaturen inte är korrekt inställd, Använd Offset funktionen på maskinen för att öka eller minska inställningarna för att nå önskad temperatur.
- Vid slutet av experimentet, rengör alla kamrarna och stäng av värmaren samt gasen som körs till installationen.
- Stäng inte av gasen innan all vätska i kammaren har sugits ut ur systemet, annars kan syran/destillerat vatten Regurgitate och nå organ kammaren under nästa användning.
- För att rengöra kamrarna i trådmyografen är det effektivaste sättet att utföra syra tvätt med en utspädd ättiksyralösning. Rengör kanten och insidan av kamrarna med en bomulls pinne.
- Efter tvättning, skölj kamrarna noggrant med destillerat vatten. Torka utsidan av kamrarna med en våt trasa för att avlägsna torkat salt. Etanol kan också användas om hydrofoba läkemedel har använts under experimentet.
- Ett exempel på tvätt proceduren är följande. Fyll kamrarna med 8% ättiksyralösning och inkubera i 2 min. Använd en bomullstippad applikator för att mekaniskt rengöra stål kammarens yta. Undvik all kontakt med aluminium delen av myograph.
- Aspirera ättiksyra och tvätta myograph kammaren och stöder flera gånger med destillerat vatten och torka ytorna med hjälp av absorberande papper eller bomull-tip applikatorer.
- Kalibrera kraft givaren för alla kanaler innan du använder myograph-systemet varje dag, eller varje gång systemet har flyttats.
- Dissektion av de mesenteriska arteriella ringarna
Anmärkning: djur som används för den aktuella studien var fettrik diet matas manliga Adipo-SIRT1 möss och vilda typ littermates som kontroller. Varje djur vägde ungefärligt 45 g på tiden av experimenten.- Euthanize musen genom intraperitoneal injektion av pentobarbitalnatrium (50 mg/kg).
- Med kirurgisk sax och pincett, utföra en Mid-line laparotomi att avslöja buken innehåll.
- Samla in den mesenteriiska arkad i en kisel-belagd petriskål.
- Sprid och stift ner mesenteriskt nätverk i petriskål för att avslöja förgrening av mesenteri och bindväv.
- Under ett mikroskop (10x), och med finsaxar och pincett, försiktigt dissekera omgivande bindväv. Undvik att skada det oavsiktliga skiktet. Alternativt kan omgivande fett vävnad behållas runt blod kärlet för experiment (om det behövs).
- Med hjälp av finsaxar och pincett, punkts katter sekundära grenar av mesenteriala artärer i iskalla Krebs buffert.
Obs: varje forskare bör ha sin egen uppsättning dissektion kit, strängar och stigbyggar. Dessa verktyg bör hållas korrekt och rensas upp varje gång efter försöket som vissa droger är svåra att tvätta bort och rester kan hålla sig till dem.- Håll blod kärlen i kallt Krebs buffert samtidigt separera omgivande bindväv, inklusive PVAT. Under hanteringen av blod kärlet, vara skonsam för att förhindra onödig skada på endotelet.
- Om försöket inbegriper studiet av PVAT, Behåll en sfäriska PVAT-sfär med en diameter på 1,5 till 2 mm runt blod kärlet. Alternativt kan samma kvantiteter fett vävnad tillsättas i varje kammare för experiment.
- Valfritt Ta bort endotelet från dissekeras blod kärlet som en kontroll för att utvärdera endotel-beroendet av svaren. För mesenteriala artärer, ta bort endotelet genom att försiktigt rulla den över en tråd stigbygeln eller ett hår.
- Skär blod kärlet beredd som ovan i små ringar (~ 2 mm längd) och lägg dem i en plast mat rätt full av kolsyrat (95% O2 och 5% co2) Krebs buffert för senare montering i kamrarna av en tråd myograph27.
- Överför fartygs ringarna till en myografkammare placerad under Mikroskop. Ringarna ska placeras jämnt, med den övre och undre stigbygelen parallellt. Den fästa tråden (40 μm) bör vara nypreparerade som droger kan binda till strängarna.
- Trä blod kärlet ringen på en lämplig längd (2 cm) av tråden och fäst i en käke av monterings kammaren genom att skruva för att åtgärda positionen.
- Passera en andra tråd genom ringen och ankare till den motsatta käken.
- Med ringar gängade och säkrade till kammar käftar, montera kammaren på myografinställningen och vrid mikrometerskruven medurs för att flytta kablarna nära varandra tills kraft avläsningen på användar gränssnittet som motsvarar den monterade kammaren är noll eller bara Nedan.
Obs: tråden som fästs vid överkäken bör vara av minimal längd för att säkerställa att spänningen helt kan transdukeras till detektorn. - Equilibrate preparaten vid 37 ° c i minst 30 min före den första appliceringen av kraft med hjälp av den justerbara Mikrometern.
- Bedöma vävnadens lönsamhet i 115 mM högt kalium (NaCl ersatt av KCl på molar basis) krebs innehåll ande 4,6 mm NaCl, 115 mm KCl, 2,5 mm CaCl2, 1,17 mM MGSO4, 1,17 mm KH2Po4, 25 mm NaHCO3 och 11,1 mM D-glukos vid pH 7,4.
Anmärkning: isolerade fartyg anses vara livskraftiga om kontraktila kraft transducerade och registreras som böjning över bas linjen i data registrering program vara i myograph systemet är mer än 40% av deras viloton, som svar på en kontraktila agent. Om artären inte kontrakt på lämpligt sätt, då antingen den optimala basal spänning/vägg trycket inte har justerats ordentligt eller artären kan ha skadats under isolering eller montering av kärlet. - Valfritt Bedöm integriteten av endotelceller genom att tillämpa fenylefrin att inducera sammandragning av kärlet till 50% av det första svaret på KCl (som registrerats av kraft givaren i data inspelnings program), följt av att lägga till 1 μM acetylkolin.
Obs: en bra blod kärl beredning är avgörande för att få konsekventa och korrekta resultat. Ett preparat bör inte användas för experimentet antingen om endotelial integritet testet är otillfredsställande eller det inte svarar på KCl, vilket tyder på att endotelfunktion eller vaskulär smidig muskel kontraktilitet, respektive, inte är tillfredsställande. I detta fall bör preparatet ersättas med en ny ring från samma blod kärl eller ett nytt blod kärl.
2. normalisering för att bestämma den optimala initiala spänningen
Anmärkning: normaliserings förfarandet gör det möjligt att fastställa den optimala inre diametern (IC) i artärer vid vilka blod kärlet upplever ett lämpligt vilande transmural tryck (100 mmHg eller 13,3 kPa för mesenteriala artärer) och ger maximal aktiv styrkor som svar på vasoaktiva substanser.
- Slå på datorn och öppna data inspelnings programmet (se material tabellen).
- Spara experimentet som en "LabChart-datafil" med ett nytt namn för att undvika att skriva över den ursprungliga inställnings filen.
- Öppna fönstret normaliserings inställningar och ange k -faktorn som 1. Acceptera standardvärden för okularet kalibrering (0,3, om fartygets längd är okänd, eller 1 om fartygets längd är känd), mål tryck (13,3), online genomsnitt tid (2) och fördröjnings tid (60). Klicka på OK för att spara inställningarna.
- Välj kanaler av intresse och mata in tråd diametern (40 μm), vävnads änd punkter (a1:0; a2: vävnads längd uppmätt), initial mikrometeravläsning i normaliserings fönstret.
- Starta normaliserings proceduren genom att applicera den första passiva sträckan på blod kärlet (Vrid mikrometerskruven moturs).
- Vänta tills kärlet stabiliseras (3 min) och mata in den nya mikrometerläsningen i normaliserings fönstret. Vägg spänningen beräknas automatiskt och visas som en punkt på grafen.
Obs: Mikrometern "steg" som används under den passiva sträckan behöver inte vara densamma. De första sträckorna kan vara 20 μm vardera. När sträckorna närmar sig Isobar linjen, kan stegen reduceras till 10 μm, 5 μm, 2 μm eller ännu mindre. Ha huvud fönstret öppet när du justerar mikrometerinställningarna-om en stor spik som överstiger Isobar linjen på en längd/spänning graf (som anger tryck punkter som motsvarar ett förutbestämt värde) visas, minska spänningen. - Efter varje passiv stretch, Byt ut kontrollen Krebs med en ISO osmotisk hög kalium Krebs innehåll ande 115 mM KCl. När sammandragningen når en platå (ca 3 min), registrera den aktiva kraften (F) genom att subtrahera den passiva kraften vid varje sträcka från den kaliumaktiverade kraften. Beräkna vägg spänningen samt interna omkretsen (IC) värden.
- Mät aktiv spänning som utböjning ovanför bas linjen. Den aktiva spänningen (T) beräknas utifrån ekvationen F (mN) = T (mN/mm) x 2 x fartygets längd (mm). Interna omkretsen (IC) värden beräknas från mikrometer data (IC = 205,6 μm + 2 x "gap").
- Ta bort den höga kalium tillstånd genom att ersätta med färska Krebs. Upprepa tvättningen tre gånger under 5 min.
- Upprepa steg 2,5 till 2,8 (genom att inducera passiva sträckor följt av aktiv sammandragning i alternativa svängar) tills den aktiva spänningen börjar minska (figur 2).
- Efter flera omgångar av alternativa sträckor, den passiva längd/spänning kurvor ger värdet av IC100, den inre omkrets av fartyget vid ett transmural tryck på 100 mmHg, som passage punkten med Isobar linje.
Obs: varje mikrometervärde under de passiva sträckorna introduceras manuellt i Programvarunormaliserings-modulen. Programmet registrerar automatiskt motsvarande kraft mätning för att generera den passiva längd/spänning kurvan, vilket ger värdet av IC100 som övergångsställe med Isobar linje (figur 2, höger paneler). Ju närmare den sista punkten är att Isobar linjen men precis ovanför bättre normalisering är utan att skada fartygen. En punkt för långt över Isobar linjen kan fysiskt skada den monterade kärlet, vilket ger opålitliga resultat under experimentet. - Skapa aktiva längd/spänning kurvor för att bestämma IC1 värden och beräkna normalisering k faktor som förhållandet mellan IC1/IC100, som kommer att användas för denna typ av blod kärl i efterföljande myography experiment.
Obs: de aktiva längd-/spännings kurvorna skapas genom att de IC-värden som beräknats utifrån mikrometerdata på x-axeln och aktiva spänningar på y-axeln ritas. IC1 är det värde som ligger inom toppen platå regionen (röda spår i figur 2, höger paneler). Efter plottning av aktiva längd/spänning kurvor och bestämma IC1, normalisering k Factor beräknas som förhållandet mellan IC1/IC100. Baserat på normalisering k Factor, den optimala IC för bas linjen, BETECKNAS som IC1, kommer att visa på passiv längd/spänning kurva. Mikrometerinställningen för denna IC visas under kurvan och bör användas för att ställa in mikropositioner för efterföljande myography experiment. Den initiala spänningen (T) är lika med mål trycket (PI) x IC/2π och den optimala kraften (F) som anbringas på kärlet motsvarar T x 2 x fartygs längd. - Tvätta noggrant ut den höga kalium Krebs och jämvikt förberedelserna för ytterligare 30 till 45 min. Återställ de basala spänningarna till "noll" så att endast aktiva kontraktila svar kommer att registreras under det efterföljande experimentet.
3. fenylefrin-inducerad sammandragningar
Anmärkning: läkemedel som kan väljas för att inducera de vasokonstriktiva svar inkluderar ospecifik adrenoceptoragonist agonist noradrenalin, den selektiva α-1 adrenoceptoragonist agonist fenylefrin, peptid hormonet angiotensin II, och monoamin neurotransmittorn 5-hydroxitryptamin. Fenylefrin används i detta protokoll för undersökning (material tabell).
- Förbered och montera Parade arteriella ringar som beskrivs i avsnitt 1,3, en med PVAT intakt och den andra med PVAT bort, från de intilliggande avsnitten i varje artär för experimentet.
- Efter normalisering (beskrivs i avsnitt 2), pre-kontrakt de arteriella segmenten med hög kalium Krebs buffert genom att lägga till 115 mM KCl lösning till den kammare som innehåller Krebs.
- Vänta på kontraktion till platå (3 min), tvätta bort den höga kalium och ersätta med färska kolsyrat Krebs buffert. Upprepa tvätt tre gånger under 5 min.
- Upprepa KCl stimulering och tvättning tre gånger och registrera maximal kontraktila svar/spänning till KCl genom att subtrahera bas linjen spänningen från spänningen på grund av KCl stimulering.
- Efter den sista sammandragning och tvättning, fyll kammaren med varm, kolsyrat Krebs buffert och låta artären att återhämta sig i ca 30 min innan du utför nästa uppgift.
- Till varje kammare, tillsätt kumulativa mängder fenylefrin (halv-log steg från 10-10 till 10-4 M) för att inducera koncentrations beroende ökningar i ISO metrisk spänning av quiescent preparat.
- Börja med att tillsätta en låg koncentration av agonist till kammaren. Efter att ha tillräckligt med tid för en stabil kontraktion (3-5 min), tillsätt nästa koncentration. Upprepa stegen med ökande koncentrationer av fenylefrin.
- Efter att ha lagt den sista dosen av agonist (fenylefrin), tvätta ut drogen grundligt och fyll kammaren med färska Krebs buffert. Rita koncentrations beroende svar som ökande procent satser av KCl-inducerad maximal sammandragningar (figur 3).
- Valfritt För att utvärdera bidraget från NO, Inkubera preparaten med NO-syntas-hämmaren, L-namn (10-4 M), under 30 min före tillsats av fenylefrin. L-namn ökar fenylefrin-inducerad sammandragningar i quiescent beredningar av mesenteriala artärer (figur 4).
Anmärkning: inhibitorer eller antagonister måste ha tillräckligt med tid för att uppnå jämvikt, vanligt vis 30 – 45 min (vara konsekvent för alla experiment). - För att utföra en andra koncentrations-responskurva sekventiellt, tvätta kammaren helt och upprepade gånger för att ta bort alla tidigare agonister, tills inga ytterligare förändringar i tonen observeras.
Anmärkning: parallella experiment exponerar minst två ringar som erhållits från samma blod kärl till agonist, en under kontroll förhållanden och en i närvaro av inhibitor (er); i varje ring kommer koncentrations-responskurvan endast att utföras en gång. Det är att föredra att utföra parallella experiment, eftersom detta ger en bättre kontroll för läkemedlet åtgärder och blod kärl känslighet. Serie experiment erhåller en koncentrations-responskurva till en agonist i en singelring; tvätta den, ändra experimentella förhållanden (t. ex. tillsätta en hämmare) och sedan upprepa koncentrations responskurvan på samma ring. I detta fall behövs tids kontroller för att visa att läkemedelsresponsen inte beror på förändringar i vävnaden över tid. Man kan aldrig vara säker på att vävnaden är i exakt samma tillstånd efter exponering för ett koncentrations-respons-experiment. Tillräckligt med tid (minst 30 – 60 min) måste ges för att göra det möjligt för fartygs segmenten att återvända till sin vila (basal) spänning, men i vissa fall, detta kan inte inträffa omedelbart efter dissociation av hög affinitet agonist från receptorerna. Dessutom kan höga kalium Krebs appliceras mellan de kumulativa koncentrations-responskurvorna för att minska desensibilisering28. Kom ihåg att de flesta antagonister inte kan tvättas bort helt, alltså fortsätta att lägga den för resten av experimentet.
4. endotel-beroende lättnader/sammandragningar
- Pre-kontrakt en nymonterad arteriell segment (som beskrivs i steg 3,2 till 3,5). Återigen, spela in den maximala kontraktila svar/spänningar till KCl genom att subtrahera bas linjen spänningen från spänningen på grund av KCl stimulering.
- Valfritt Inkubera preparaten med NO-syntas-hämmaren, L-namn (10-4 M), under 30 min före tillsats av U46619.
- Tillsätt de förkalkylerade koncentrationerna av U46619 i kammaren och låt en stabil, ihållande sammandragning av artärsegmenten.
Anmärkning: Vasodilatory svar induceras i mesenteriala artärer förkontrakterade till cirka 80% av de maximala Svaren till 115 mM KCl. olika agonister kan användas för att inducera kontraktion genom aktivering av deras specifika receptorer. Här är blod kärls segmenten med eller utan PVAT förkontrakterade med U46619 (1 – 3 x 10– 8 M; Material), en tromboxan a2-receptoragonist, för att inducera stabila och ihållande glatta muskel sammandragningar. - Tillsätt kumulativa koncentrationer av acetylkolin (10-10 till 10-4 M) till organ kammaren. Koncentrations beroende vasodilaterande svar på artärsegment presenteras i procent av U46619-inducerad kontraktila svar (figur 5).
Anmärkning: för de flesta av experimentet, bör nästa koncentration av den avslappnande agonist läggas omedelbart när en platå observeras för att förhindra rebound i spänningar. Koncentrations beroende vasodilaterande svar av artär segment normaliseras som andel av U46619-inducerad kontraktila svar att justera för mindre skillnader i innervation och diameter mellan artären segment (figur 5). Små variabiliteter i reaktionsförmågan mellan individuella ringar som erhålls från samma blod kärl blir minimala när en grupp av sex eller fler experiment analyseras statistiskt. När man uttrycker svar som en procent andel av den enskilda vävnadens egna maximala sammandragningar är det lämpligt att använda en parkopplad analys (t. ex. ihopkopplad Students t-test) för att jämföra Svaren från samma typ av vävnader från olika djur för att jämföra en enda vävnads reaktion före och efter en intervention. Vid analys av effekterna av PVAT används tvåvägsanova följt av flera jämförelse test. - Efter att ha lagt den sista dosen av den avslappnande agonist, ta bort drogen från varje kammare och fyll med färska Krebs buffert. Tvätta kammaren grundligt med Krebs buffert och låt artären stabiliseras i minst 45 min innan du utför några ytterligare experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersökning av längd/spännings förhållanden för att erhålla normaliserings faktorn k
Den sträcka som appliceras på ett fartygs segment påverkar omfattningen av aktin-myosins interaktion och därmed den maximala aktiva kraft som utvecklas. Således, för varje typ av blod kärl, bestämma mängden stretch som behövs för maximal aktiv kraft krävs för ordentlig myography studier. Här, normalisering av längd/spänning relationen utförs för mesenteriala artärer isolerade från mus modeller (figur 2). De arteriella segmenten avbröts i ett fyrkammartrådmyografsystem (se material tabell) på stift av rost fritt stål (40 μm diameter). ISO metrisk spänning registrerades med hjälp av en analog-till-digital omvandlare ansluten till en dator med ett inspelnings program. Chambers innehöll 5 mL Krebs buffert, förvaras vid 37 ° c och luftas med 95% O2 och 5% co2 för att bibehålla pH vid 7,4 hela experimentet. En passiv längd/spänning relation fastställdes genom stegvis sträckning av artären segment tills den inre omkrets motsvarande 100 mmHg transmural tryck (IC100) erhölls. Efter varje sträcka (blå pilar), 115 mM KCl tillämpades för att stimulera sammandragningar (gröna pilar). Den aktiva längd/spänning kurvor (röd) plottas genom att extrahera den aktiva kraft data (subtrahera den passiva kraften vid varje sträcka från KCl-aktiverade kraft) på Y-axeln och sedan en graf skapades manuellt med IC-värden beräknas från mikrometer data på X-axeln. Ett IC-värde som ligger inom topp platån är IC1 (streckad röd linje). Normaliserings faktorn k BERÄKNADES som IC1/IC100-förhållanden, som sedan kunde tillämpas på prover av samma fartygs typ i det efterföljande experimentet.
Presentation och beräkning av koncentrations-responskurvor
De flesta koncentrations-responskurvor utförs på ett kumulativt sätt. En låg koncentration av agonist tillsätts i badet (helst med början med en koncentration under tröskelvärdet för respons). Efter att ha tillåtit tillräckligt med tid för ett möjligt svar (3-5 min), nästa koncentration tillsätts. När ett svar observeras, det är tillåtet att nå en platå innan nästa maximal respons erhålls. Den halva-log (genomsnittlig 3,16-faldig) steg i koncentrationen av fenylefrin tillämpas här för att studera agonist-inducerad sammandragningar (figur 3 och figur 4).
I de flesta fall, kontraktion-respons kurvor uttrycks inte som rå värden av spänning/kraft, men som en procent andel av referens svaret till KCl erhålls vid den optimala punkten av längd/spänning kurvan för enskilda blod kärl segmentet. Detta justerar för variation i storlek eller glatt muskel innehåll i blod kärlet samt korrigerar för remodeling förändringar på grund av åldrande eller patologi. Här, den maximala sammandragningar induceras av 115 mM KCl erhålls i början av experimentet och används för att beräkna fenylefrin-stimulerade sammandragningar av mesenteriala artärer med eller utan PVAT, i avsaknad eller förekomst av L-namn (figur 3 och figur 4).
För att studera agonister som producerar avslappning, är fartygen vanligt vis kontrakterade till en enhetlig nivå-cirka 50-80% av den maximala kontraktila svar av denna vävnad. Eftersom Svaren på fenylefrin-inducerad sammandragningar är olika mellan de experimentella grupperna, det nuvarande protokollet använder U46619 att stimulera stabila sammandragningar innan de kumulativa koncentrationerna av acetylkolin. Den släta muskel avslappning uttrycks som en procent andel av den initiala sammandragning inducerad av U46619 (figur 5).
Koncentrations-responskurvorna kan jämföras med närvaron av en vänsterstyrd eller högerförskjutning (t. ex. mellan en kontroll kurva och en som erhålls i närvaro av en antagonist) genom bestämning av koncentrationerna som ger lika svar, t. ex. 30% eller 50% av Maximal. Dessa benämns EC30 respektive EC50(figur 3b). Statistisk jämförelse av medelvärdet för EG50 -värden bör göras på logaritmen av deras värden. Kurvorna unders öks genom att jämföra deras respektive maximala respons (Emax) (figur 3b). I exemplen som visas, den fenylefrin-inducerad sammandragningar i mesenteriala artärer förstärktes av L-namn och koncentrations-respons kurvor visade en vänsterförskjutning samt en förhöjning i maximal sammandragningar (figur 4b). De acetylkolin-inducerad lättnader i mesenteriala artärer hämmade av L-namn, och koncentrations-responskurvan visade en åt höger Skift samt minskning av maximal lättnader (Figur 5b).
Vaskulära svar på olika farmakologiska agens kan beräknas som området-under-The-contraction-kurva (AUCC) för sammandragningar och Area-ovanför-den-avkoppling-kurva (aarc) för lättnader, respektive, med hjälp av ickelinjära Logistic regression analys för jämförelse10 (figur 3c, figur 4c och figur 5c). Effekten av L-NAME kan jämföras med värdena för AUCC/AARC för att fastställa NO-biotillgängligheten (figur 6). Den basala och stimulerade frisättning av nej i mesenteriska artärer med eller utan pvat kan uttryckas som skillnader i koncentrations-respons kurvor av fenylefrin-stimulerad sammandragning (daucc) och acetylkolin-inducerad avslappning (daarc), i närvaro av eller avsaknad av L-namn (figur 6a och figur 6b). I exemplet som visas, minskad förekomst av PVAT den NO bio tillgängligheten i mesenteriala artärer som samlats in från möss matas med fettrik diet (figur 6C).
Figur 1: ett Schematiskt diagram över vägg strukturen i artärer. Endotelceller i Tunica intima förmedlar endotel-beroende avslappning/sammandragning av den vaskulära glatt mus kula turen, medan signaler som frigörs från perivaskulär fett vävnad modulerar kors samtalen mellan olika skikt av arteriell vägg . Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa spår som illustrerar ett experiment för att fastställa optimala initiala spänningar för mus mesenteriala artärer. Blod kärls segmenten har framställts av mesenteriala artärer som samlats in från de 16 veckor gamla möss som utfodrats med standard Chow (a) eller fettrik diet (B). Efter montering, den passiva och aktiva längd/spänning kurvor erhölls genom steg-Wise stretching och sekventiell stimulering med 115 mM KCl (vänster paneler). Den aktiva kontraktion som genereras med varje stimulering bör öka när kärlet gradvis sträcks, tills det når en platå på optimal längd. Ytterligare stretch kommer att leda till en minskning av den aktiva kontraktion. IC100 och IC1 bestämdes genom plottning av de passiva och aktiva längd/spänningarna kurvor, respektive (höger paneler). Observera att den passiva längden/spänningen kurvan genererades av Normaliserings-modulen efter manuellt inmatning av mikrometervärden, medan den aktiva längd/spänningar kurvor ritas manuellt efter beräkning av spänningar och IC-värden vid varje steg i KCl Stimulering. IC1/IC100 nyckeltal beräknades som normalisering k Factor (höger paneler). ). Observera också att endast de sista fyra punkterna i den aktiva längd/spännings kurvan visades i siffrorna i panelen (B). STC: standard Chow matas mus artär; HFD: hög fetthalt diet matas mus artär. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: output inspelningar av vasokonstriktor svar på fenylefrin i mesenteriala artärer med eller utan omgivande PVAT. Kontraktilitet studier utförs på preparat av mesenteriala artärer från 16-veckors-gamla Adipo-SIRT1 transgena möss, där den mänskliga SIRT1 är överuttryckt selektivt i fett vävnad29. Kumulativa koncentrationer av fenylefrin tillämpades för att stimulera sammandragningar av mesenteriala artärer utan (-PVAT) eller med (+ PVAT), (a). De kontraktila Svaren registrerades och beräknades i procent av 115 mM KCl-inducerad maximal kontraktion (B). Området-under-sammandragningen kurvor (AUCC) var plottas för jämförelse (C). Observera att PVAT från Adipo-SIRT1 möss framkallade en anti-kontraktila effekt på svaret på fenylefrin. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: output inspelningar av vasokonstriktor svar på fenylefrin i mesenteriala artärer med eller utan omgivande PVAT, och i avsaknad eller förekomst av L-namn. Mesenteric artärer samlades in från 16-veckors-gamla vilda typ möss matas med fettrik diet. Trettio min efter tillsats av 10-4 M L-namn eller fordonets kontroll, kumulativa koncentrationer av fenylefrin tillämpades för att stimulera sammandragningar av mesenteriala artärer (a). De kontraktila Svaren registrerades och beräknades i procent av 115 mM KCl-inducerad maximal kontraktion (B). Området-under-sammandragningen kurvor (AUCC) var plottas för jämförelse (C). Observera att PVAT från kosten feta möss inte framkalla anti-kontraktila effekter på svaret på fenylefrin. – PVAT: arteriella ringar beredda utan PVAT. + PVAT: arteriella ringar beredda med omgivande PVAT; -L-NAME: arteriella ringar inkuberas inte med L-namn; + L-namn: arteriella ringar inkuberas med L-namn. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: utdata inspelningar av vasodilator svar på acetylkolin i mesenteriala artärer med eller utan omgivande PVAT, och i avsaknad eller förekomst av L-namn. Mesenteric artärer samlades in från 16-veckors gamla möss matas med fettrik diet. Vid 30 min efter tillsats av 10-4 M L-namn eller fordons kontroll, är blod kärls segmenten med eller utan pvat förkontrakterade med U46619 (1-3 x 10-8 M; Material), en tromboxan a2-receptoragonist, för att inducera stabila och ihållande glatta muskel sammandragningar. Kumulativa koncentrationer av acetylkolin tillämpades sedan för att stimulera lättnader av mesenteriala artärer med eller utan omgivande PVAT (a). Avslappnings Svaren registrerades och beräknades i procent av U46619-inducerad kontraktion (B). Området-ovan-avslappnings kurvor (AARC) plottas för jämförelse (C). Observera att endast det arteriella segmentet med omgivande PVAT visas i panel A. – PVAT: arteriella ringar beredda utan PVAT; + PVAT: arteriella ringar beredda med omgivande PVAT; -L-NAME: arteriella ringar inkuberas inte med L-namn; + L-namn: arteriella ringar inkuberas med L-namn. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: illustration av proceduren för att beräkna ingen bio tillgänglighet. Området-under-The-contraction-kurvor (AUCC) och området-ovanför-den-avslappning-kurvor (AARC) beräknades baserat på svaren på kumulativa koncentrationer av fenylefrin (a) och acetylkolin (B), respectively. Skillnaderna mellan preparat som förbehandlats utan och med L-namn definierades som ∆ AUCC (a) och ∆ Aarc (B) för att representera basal No-bidrag och stimulerad No-frisättning. Därför presenterades ∆ AUCC (beräknat från figur 4c), ∆ aarc (beräknat från figur 5c) och summan av båda (total ingen bio tillgänglighet) för jämförelse av bio tillgängligheten i mesenteriala artärer utan och med omgivande PVAT (C). – PVAT: arteriella ringar beredda utan PVAT. + PVAT: arteriella ringar beredda med omgivande PVAT; -L-NAME: arteriella ringar inkuberas inte med L-namn; + L-namn: arteriella ringar inkuberas med L-namn. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bortsett från endotelcellerna, signaler som härrör från pvat spelar en viktig roll i regleringen av smidig muskeltonus reaktivitet30. Friska pvat befriar ingen och antiinflammatoriska adiponectin att utöva en anti-kontraktila effekt på artärerna, som går förlorad under sjukdoms tillstånd såsom fetma och metabola syndromet31,32. I sjukdoms tillstånd, pvat bidrar till utvecklingen av endotelial dysfunktion och andra kardiovaskulära avvikelser33,34. Onormal Enos uttryck och funktion har rapporter ATS i pvat av artärer från överviktiga djur35,36. Eftersom både endoteliala och pvat-dysfunktioner bidrar till utvecklingen av kardiovaskulära och metabola avvikelser23,37, när de utför ex vivo vaskulär experiment, bör deras roll övervägas genom att inkludera i eller ta bort dem från preparaten.
Trådmyografi systemet ger en bekväm plattform för att dissekera de vasoaktiva signalerna från pvat med olika farmakologiska sonder10,38. Emellertid, kompositionerna i PVAT av olika typer av artärer, eller samma artärer från djur av olika genetiska bakgrund, är inte samma39. Därför tråd myography resultat som involverar PVAT bör inte jämföras mellan olika typer av artärer eller samma typ av artärer från möss av olika stammar. Ålder och den bakomliggande sjukdoms tillstånden påverkar också de cellulära kompositionerna i PVAT. Här användes möss från samma genetiska bakgrund men med olika genetiska modifieringar i sin fett vävnad för att jämföra PVAT: s vasomodulerande aktivitet.
Som en huvudsaklig källa till resistens mot blod flödet, mesenteriska artärer väljs för den aktuella studien. Vilande spänning bestämmer mängden vasomotoriska responsen40. Den optimala initiala spänningen i blod kärlet påverkas av vilken typ av artär, ålder, diet, behandling och genetisk bakgrund av djuren, därför bör bestämmas individuellt innan du undersöker avslappning/kontraktion-respons kurvor. För den nuvarande demonstrationen, den överlägsna mesenteriska artärer samlades in från 16-veckors gamla möss matas med standard Chow eller fettrik diet från fyra veckors ålder. I detta protokoll betonas upprättandet av optimala inställningar för maximal aktiv kraft produktion av arteriella segment innan farmakologiska reaktioner bedöms. Både passiva och aktiva längd/spännings förhållanden studeras för mesenteriala artärer som samlats in från egna mus modeller. En normalisering k faktor 1 har fastställts för preparat från 16-veckors-gamla djur, som skiljer sig från standardvärdet för 0,9 eller de som används av tidigare publikationer41. Försiktighet krävs vid jämförelse av normaliserings förhållandena i litteraturen på grund av möjliga skillnader i teknik, buffertsammansättning och instrument modeller, etc. I synnerhet, ålder, diet och andra patofysiologiska tillstånd påverkar passiv och aktiv spänning samt farmakodynamik egenskaper artärer42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete var finansiellt stöd av bidrag från forsknings bidrag rådet i Hongkong [17124718 och 17121714], Hong Kong Health och Medical forsknings fond [13142651 och 13142641], Collaborative forsknings fonden i Hongkong [C7055-14G], och National Basic Kinas forsknings program [973 program 2015CB553603].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) | Sigma-Aldrich | N5751 | Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M |
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 | Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α) | Enzo | BML-PG023-0001 | Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M |
| Multiwire myograph | Danish MyoTechnology (DMT) | 620M | |
| PowerLab 4/26 | ADInstruments | ML848 | |
| Labchart7 | ADInstruments | - | |
| Adipo-SIRT1 wild type mice | Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong | CULATR NO.: 4085-16 | |
| Silicon-coated Petri dishes | Danish MyoTechnology (DMT) | ||
| Tungsten wires | Danish MyoTechnology (DMT) | 300331 | |
| Surgical tools |
References
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
- Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
- Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
- Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
- Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
- Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153 (1997).
- Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
- Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
- Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
- Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
- Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
- Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
- Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
- Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
- Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
- Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3 (2018).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
- Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415 (2008).
- Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
- Gao, Y. -J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
- Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
- Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
- Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
- Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
- Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
- Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
- Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
- Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
- Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
- Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
- Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
- Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
- Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
- Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
- Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
- Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
- Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200 (2015).
- Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).
