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Biology

पेरिवस्कुलर वसा ऊतकों द्वारा मॉडुलन पर ध्यान केंद्रित के साथ अलग Mesenteric धमनियों का उपयोग संवहनी टोन प्रतिक्रिया का मूल्यांकन

Published: June 3, 2019 doi: 10.3791/59688
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology and the Department of Pharmacology and Pharmacy, University of Hong Kong

Summary

प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए तार मायोग्राफी का उपयोग करने के लिए mesenteric धमनियों से अलग करने के लिए एक प्रकार का सममितीय तनाव का मूल्यांकन करने के लिए चूहों, endothelial कोशिकाओं और perivascular वसा ऊतकों से जारी किए गए कारकों द्वारा मॉडुलन के विशेष विचार के साथ.

Abstract

परिवर्तित संवहनी टोन प्रतिसादिता पथभौतिकीय उत्तेजकता हृदय और चयापचय रोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के विकास के लिए योगदान देता है । Endothelial शिथिलता कम vasodilatation और धमनियों की वृद्धि वाहिकासंकीर्णन के लिए एक प्रमुख दोषी का प्रतिनिधित्व करता है । वसा (फैट) धमनियों के आसपास के ऊतकों endothelium पर निर्भर छूट और/या संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के संकुचन के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । अंतर-endothelium और perivascular वसा ऊतकों के बीच वार्ता पूर्व vivo का मूल्यांकन किया जा सकता है एक तार पेशीलेखन प्रणाली द्वारा घुड़सवार रक्त वाहिकाओं का उपयोग । तथापि, विभिन्न प्रजातियों, युगों, आनुवंशिक पृष्ठभूमियों और/या रोगभौतिकीय दशाओं के जंतुओं से व्युत्पन्न धमनियों के लिए इष्टतम विन्यास स्थापित किया जाना चाहिए ।

Introduction

धमनियों की विस्फार और संकुचन क्रमशः उनके संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के लिए छूट और सिकुडनों द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । छोटी धमनियों की संवहनी प्रतिक्रिया में परिवर्तन स्वायत्त नसों और रक्त में मौजूद हार्मोन (जैसे, catecholamines, एंजियोटेन्सिन द्वितीय, सेरोटोनिन, vasopressin) द्वारा धमनी रक्तचाप के समस्थैतिक विनियमन के लिए योगदान. स्थानीय स्तर पर, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के संवहनी प्रतिक्रियाओं के दोनों endothelial कोशिकाओं से संकेतों द्वारा संग्राहक हैं और धमनियों के आसपास वसा ऊतक (चित्रा 1).

Endothelium न केवल एक निष्क्रिय बाधा है, लेकिन यह भी रक्त और अंतर्निहित संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के बीच संकेतों का आदान प्रदान करने के लिए एक सतह के रूप में कार्य करता है । विभिंन vasoactive पदार्थ जारी करके, endothelium संवहनी टोन प्रतिक्रियाएं1के स्थानीय नियंत्रण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । उदाहरण के लिए, acetylcholine के जवाब में, endothelial नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (enos) नाइट्रिक ऑक्साइड का उत्पादन करने के लिए endothelial में सक्रिय है (NO), जिसमें घुलनशील guanylyl cyclase सक्रिय द्वारा अंतर्निहित संवहनी चिकनी मांसपेशियों की छूट लाती है (sgc) 2. अंय vasoactive पदार्थ cyclooxygenases के उत्पादों (जैसे, prostacyclin और thromboxane एक2), lipoxygenase (जैसे, 12-hydroxyeicosatetraenoic एसिड, 12-hete), और साइटोक्रोम P450 monooxygenases (hete और epoxyeicosatrienoic एसिड, EETs), प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS), और vasoactive पेप्टाइड्स (जैसे, endothelin-1 और एंजियोटेन्सिन द्वितीय), और endothelium-hyperpolarizing कारक (EDHF)3व्युत्पंन । Endothelium के बीच एक नाजुक संतुलन-वाहिकाविस्फारक व्युत्पंन और वाहिकाविस्फारक स्थानीय रक्तनली का संचालक टोन4,5बनाए रखने के ।

Endothelial रोग endothelial पर निर्भर vasodilatation6, संवहनी उंर बढ़ने7की एक बानगी में हानि की विशेषता है । उंर के साथ, endothelium की क्षमता vasodilatation को बढ़ावा देने के उत्तरोत्तर कम हो जाता है, मोटे तौर पर एक कम नहीं bioज्नलफधता के कारण, साथ ही साथ असामांय अभिव्यक्ति और endothelium में eNOS के समारोह और संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं में sGC8 , 9 , 10. कम नहीं पशुमूल endothelium पर निर्भर vasoconstrictors11,12के उत्पादन potentiates । वृद्ध धमनियों में, endothelial रोग हाइपरप्लासिया मीडिया में कारण बनता है, के रूप में दीवार की मोटाई में चिह्नित वृद्धि, औसत दर्जे का नाभिक की संख्या, जो उच्च रक्तचाप और atherosclerosis में धमनियों में और अधिक मोटा होना की याद ताजा कर रहे हैं द्वारा परिलक्षित मानव में मनाया मरीजों को13,14। इसके अलावा, जैसे मोटापा, मधुमेह या उच्च रक्तचाप endothelial रोग के विकास में तेजी लाने के रूप में रोगविज्ञानी स्थितियों15,16।

पेरिवस्कुलर वसा ऊतक (PVAT) संवहनी संरचना और समारोह17को विनियमित करने के लिए कई adipokines विज्ञप्ति. Pvat के विरोधी सिकुड़ा प्रभाव, जैसे adiponectin, नहीं, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और हाइड्रोजन सल्फाइड18,19,20के रूप में आराम कारकों से मध्यस्थता है । हालांकि, स्थान और pathophysiological स्थिति पर निर्भर करता है, PVAT भी विभिन्न धमनियों में सिकुड़ा प्रतिक्रियाओं में वृद्धि कर सकते हैं21. Pvat द्वारा उत्पादित समर्थक संकुचनशील पदार्थों में एंजियोटेंसिन-II, लेप्टिन, रेजिइन, और ROS22,23शामिल हैं ।  अलग रक्त वाहिकाओं पर अध्ययन के अधिकांश में, PVAT वाहिकाएँ के लिए एक सरल संरचनात्मक समर्थन के रूप में माना गया है और इस तरह रक्त वाहिका अंगूठी खंडों की तैयारी के दौरान हटा दिया. चूंकि वसा रोग उच्च रक्तचाप और संबद्ध हृदय जटिलताओं24के लिए एक स्वतंत्र जोखिम कारक का प्रतिनिधित्व करता है, रक्त वाहिकाओं के आसपास pvat पर विचार किया जाना चाहिए जब संवहनी जवाबदेही की जांच विभिन्न धमनियों ।

बहु तार मायोग्राफ सिस्टम व्यापक रूप से महाधमनी, mesenteric, गुर्दे, ऊरु, मस्तिष्क और कोरोनरी धमनियों सहित रक्त वाहिकाओं की एक किस्म के रक्तनली का संचालक कार्यों की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है25,26. इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करेगा तार मायोग्राफी का मूल्यांकन करने के लिए mesenteric धमनियों में संवहनी प्रतिसादिता आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल से अलग, के साथ मॉडुलन पर एक विशेष ध्यान केंद्रित PVAT.

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Protocol

निंनलिखित अध्ययन के लिए इस्तेमाल सभी जानवरों के चिकित्सा संकाय, हांगकांग के विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशु इकाई द्वारा प्रदान की गई । शिक्षण और अनुसंधान के लिए प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग पर विभागीय समिति से नैतिक अनुमोदन प्राप्त किया गया था (पुलिया, नं.: 4085-16) ।

1. तैयारी

  1. दवाओं की तैयारी
    1. उचित रूप में सामग्री सुरक्षा डेटा शीट (MSDS) में उन्हें प्राप्त करने के बाद कहा गया के रूप में दवाओं की दुकान । -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण के लिए उच्च एकाग्रता स्टॉक समाधान और फिर aliquot के रूप में सॉल्वैंट्स में पाउडर के रूप में दवाओं को भंग ।
      नोट: अधिकांश दवाओं आसुत पानी में भंग करने के लिए शेयर समाधान तैयार कर रहे हैं; कुछ दवाओं के लिए हीटिंग या sonication की आवश्यकता हो सकती है । यदि दवाएं पूरी तरह से पानी में नहीं घुलती हैं, तो 1 मीटर की एक बूंद को जोड़ा जा सकता है, जबकि बुनियादी दवाओं के लिए 1 मीटर एचसीएल की एक बूंद का इस्तेमाल किया जा सकता है । हाइड्रोफोबिक दवाओं को डाइमेथिलसल्फॉक्साइड (DMSO) या पूर्ण इथेनॉल में भंग किया जा सकता है । उत्तरार्द्ध मामलों में, अंतिम स्नान एकाग्रता (एम में) और ज्ञात होना चाहिए उचित नियंत्रण बाहर सॉल्वैंट्स के प्रभाव को नियम किया जाना चाहिए ।
    2. प्रयोग करने से पहले, दवा aliquots (सामग्री की मेज) krebs-Ringer Bicarbonate समाधान (krebs) जिसमें ११५ Mm nacl, ४.६ Mm kcl, २.५ Mm cacl2, १.१७ मिमी mgso4, १.१७ मिमी KH2पीओ4, 25 मिमी nahco3, में भंग ११.१ मिमी डी-ग्लूकोज और ०.०१ मिमी EDTA, पीएच ७.४ ।
    3. संचई एकाग्रता-प्रतिक्रिया curves के लिए, स्टॉक और विभिंन दवाओं के काम समाधान धारावाहिक dilutions द्वारा तैयार (तालिका 1) ।
  2. यंत्र की स्थापना
    1. प्रत्येक दिन पर myograph प्रणाली का उपयोग करने से पहले सभी चैनलों के लिए बल ट्रांसड्यूसर जांचना, या हर बार प्रणाली स्थानांतरित कर दिया गया है.
      नोट: विस्तृत अंशांकन प्रक्रिया मॉडल के आधार पर बदलता है । सामान्य तौर पर जबड़ों पर दो-ग्राम वजन लगाया जाता है और इसी बल को ९.८१ ± ०.१ mN चाहिए । यदि रीडिंग ०.१ मिलियन से अधिक हो जाती है तो ट्रांसड्यूसर को फिर से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए । वर्तमान प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सिस्टम के लिए ( सामग्री तालिकादेखें) अंशांकन के दौरान बल ट्रांसड्यूसर के लिए ऑपरेटिंग मान ३००० और ३५०० के बीच होना चाहिए । ट्रांसड्यूसर का मान अधिक है या कम है, तो बल ट्रांसड्यूसर प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए ।
    2. समायोजित और प्रत्येक कक्ष में बढ़ते समर्थन संरेखित करें । Myograph चैंबर के निरंतर और दोहराया उपयोग बढ़ते समर्थन है, जो प्रयोग करने से पहले सामयिक समायोजन की जरूरत है सुनिश्चित करने के लिए कि जबड़े ठीक से गठबंधन कर रहे है की कुछ गलत संरेखण का कारण हो सकता है ।
      नोट: विशेष ध्यान जब बल ट्रांसड्यूसर के रूप में बढ़ते समर्थन का समायोजन की जरूरत है बहुत संवेदनशील और नाजुक हैं ।
    3. हीटर और गैस (९५% O2 और 5% CO2) पर स्विच करने के लिए प्रयोग से पहले न्यूनतम 30 मिनट कक्षों और बफ़र्स ३७ ± ०.१ ° c करने के लिए गरम किया जा करने के लिए अनुमति देने के लिए और गैस मिश्रण के साथ equilibrated ।
      1. हीटर की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए थर्मामीटर पर तापमान की जांच करें । तापमान ठंडा या वार्मिंग प्रयोगों को चलाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । सेट के रूप में तापमान सही नहीं है, तो आवश्यक तापमान तक पहुँचने के लिए सेटिंग्स को बढ़ाने या घटाने के लिए मशीन के ऑफसेट समारोह लागू होते हैं ।
    4. प्रयोग के अंत में, सभी कक्षों को साफ करें और हीटर बंद करने के साथ ही गैस सेटअप करने के लिए चल रहा है ।
      1. बारी नहीं गैस से पहले सभी कक्ष में तरल प्रणाली के बाहर चूसा गया है, अंयथा एसिड/आसुत जल बहना और अगले प्रयोग के दौरान अंग-कक्ष तक पहुंच सकता है ।
      2. के लिए तार myograph के कक्षों को साफ, सबसे प्रभावी तरीका है एक पतला एसिटिक एसिड समाधान का उपयोग कर एसिड धोने प्रदर्शन है । कोठियों के किनारे और अंदर की और रुई के स्वाब से साफ करें ।
      3. धोने के बाद कक्षों को आसुत जल से अच्छी तरह कुल्ला करें । सूखे नमक को निकालने के लिए कोठियों के बाहर गीले कपड़े से पोंछ लें । प्रयोग के दौरान अगर हाइड्रोफोबिक दवाओं का इस्तेमाल किया गया है तो एथेनॉल का भी इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      4. वॉशिंग प्रक्रिया का एक उदाहरण निंनानुसार है । 8% एसिटिक एसिड समाधान के साथ कक्षों को भरने और 2 मिनट के लिए सेते. एक कपास-इत्तला दे दी applicator का उपयोग यंत्रवत् स्टील चैंबर सतह को साफ करने के लिए । Myograph के एल्यूमीनियम भाग के साथ किसी भी संपर्क से बचें ।
      5. एसिटिक एसिड महाप्राण और मायोग्राफ चैंबर धोने और आसुत पानी के साथ कई बार समर्थन करता है और सुखाने शोषक कागज या कपास टिप applicators का उपयोग सतहों ।
  3. आंत्रयोजनीय धमनी के छल्ले का विच्छेदन
    नोट: पशु वर्तमान अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया उच्च वसा आहार फेड पुरुष Adipo-SIRT1 चूहों और नियंत्रण के रूप में जंगली प्रकार littermates थे । प्रत्येक जानवर प्रयोगों के समय लगभग ४५ ग्राम तौला ।
    1. Pentobarbital सोडियम के intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा माउस euthanize (५० मिलीग्राम/
    2. सर्जिकल कैंची और संदंश के साथ, पेट की सामग्री को प्रकट करने के लिए एक मध्य लाइन laparotomy प्रदर्शन ।
    3. एक सिलिकॉन लेपित पेट्री डिश में mesenteric आर्केड ले लीजिए ।
    4. Mesenteric और संयोजी ऊतक meshwork की शाखाओं में बंटी प्रकट करने के लिए पेट्री डिश में आंत्रयोजनी नेटवर्क नीचे फैला और पिन ।
    5. एक खुर्दबीन (10x) के तहत, और ठीक कैंची और संदंश के साथ, ध्यान से संयोजी ऊतकों आसपास के टुकड़े करना । Adventitial परत को नुकसान पहुंचाने से बचें । वैकल्पिक रूप से, आसपास के वसा ऊतकों को प्रयोग के लिए रक्त वाहिका के चारों ओर बनाए रखा जा सकता है (यदि आवश्यक हो) ।
    6. महीन कैंची और संदंश का उपयोग करते हुए, उत्पाद-शुल्क आइस-कोल्ड क्रेब्स बफर में mesenteric धमनियों की माध्यमिक शाखाओं.
      नोट: प्रत्येक शोधकर्ता अपनी विच्छेदन किट, तार और रकेप्स के अपने स्वयं के सेट होना चाहिए । इन उपकरणों को ठीक से रखा जाना चाहिए और सफाई हर बार प्रयोग के बाद के रूप में कुछ दवाओं के लिए दूर धोने के लिए कठिन है और अवशेषों उंहें छड़ी कर सकते हैं ।
      1. PVAT सहित आसपास के संयोजी ऊतकों को अलग करते हुए ठंड Krebs बफर में रक्त वाहिकाओं रखें. रक्त वाहिका की हैंडलिंग के दौरान, endothelium को अनावश्यक क्षति को रोकने के लिए कोमल हो ।
      2. यदि प्रयोग PVAT का अध्ययन शामिल है, तो रक्त वाहिका के चारों ओर PVAT के एक १.५ से 2 मिमी व्यास क्षेत्र को बनाए रखने. वैकल्पिक रूप से, वसा ऊतकों की एक ही मात्रा प्रयोग के लिए प्रत्येक कक्ष में जोड़ा जा सकता है ।
    7. वैकल्पिक एंडोथीलियम-प्रतिक्रियाओं की endothelium-निर्भरता का मूल्यांकन करने के लिए एक नियंत्रण के रूप में विच्छेदित रक्त वाहिका से निकालें । Mesenteric धमनियों के लिए, धीरे से यह एक तार रकाब या एक बाल के ऊपर रोलिंग द्वारा endothelium हटा दें ।
    8. छोटे छल्ले में ऊपर के रूप में तैयार रक्त वाहिका कट (~ 2 मिमी लंबाई) और उन्हें एक प्लास्टिक डिश में डाल दिया वातित से भरा (९५% O2 और 5% सह2) एक तार myograph के कक्षों में बाद में बढ़ते के लिए krebs बफर27.
    9. एक मायोग्राफ कक्ष में बर्तन के छल्ले स्थानांतरित माइक्रोस्कोप के नीचे रखा । छल्ले समान रूप से रखा जाना चाहिए, ऊपरी और निचले रके के साथ समानांतर । संलग्न तार (४० μm) नए तैयार किया जाना चाहिए के रूप में दवाओं तार करने के लिए बाध्य कर सकते हैं ।
    10. तार की एक उपयुक्त लंबाई (2 सेमी) पर रक्त वाहिका अंगूठी धागा और स्थिति को ठीक करने के लिए पंगा लेना द्वारा बढ़ते चैंबर के एक जबड़े के लिए सुरक्षित ।
    11. अंगूठी और विपरीत जबड़े के लिए लंगर के माध्यम से एक दूसरे तार गुजरती हैं ।
    12. के छल्ले के साथ लड़ी पिरोया और चैंबर जबड़े के लिए सुरक्षित, myograph सेटअप पर चैंबर माउंट और सूक्ष्ममापी मोड़ के तारों को एक दूसरे के पास ले जाने के लिए उपयोगकर्ता इंटरफ़ेस पर बल पढ़ने जब तक एक दूसरे के पास स्थानांतरित करने के लिए संबंधित चैंबर घुड़सवार शूंय है या बस नीचे.
      नोट: ऊपरी जबड़े से जुड़ी तार ंयूनतम लंबाई का होना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कि तनाव पूरी तरह से डिटेक्टर को transduced जा सकता है ।
    13. समायोज्य micrometer का उपयोग कर बल के पहले आवेदन करने से पहले न्यूनतम 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर तैयारी equilibrate.
    14. ११५ मिमी उच्च पोटेशियम में ऊतक व्यवहार्यता का आकलन (nacl एक मोलर आधार पर kcl द्वारा प्रतिस्थापित) krebs युक्त ४.६ मिमी nacl, ११५ मिमी kcl, २.५ मिमी cacl2, १.१७ मिमी mgso4, १.१७ मिमी KH2पीओ4, 25 मिमी nahco3 और ११.१ मिमी डी-ग्लूकोज पीएच ७.४ पर ।
      नोट: यदि सिकुड़ा बल transduced और myograph प्रणाली के डेटा रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में आधार रेखा के ऊपर विक्षेप के रूप में दर्ज की गई है, तो अलग जहाजों व्यवहार्य माना जाता है एक सिकुड़ा एजेंट के जवाब में, उनके आराम टोन का ४०% से अधिक है । यदि धमनी उचित रूप से अनुबंध नहीं करती है, तो या तो इष्टतम बेसल तनाव/दीवार के दबाव को ठीक से समायोजित नहीं किया गया है या पोत के अलगाव या आरोपण के दौरान धमनी क्षतिग्रस्त हो गई है ।
    15. वैकल्पिक एक μM acetylcholine जोड़ने के द्वारा (के रूप में डेटा रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में बल ट्रांसड्यूसर द्वारा दर्ज की गई) KCl के लिए प्रारंभिक प्रतिक्रिया के ५०% करने के लिए पोत के संकुचन प्रेरित करने के लिए phenylephrine लागू करके endothelial कोशिकाओं की अखंडता का आकलन करें ।
      नोट: एक अच्छा रक्त वाहिका तैयारी सुसंगत और सटीक परिणाम प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक तैयारी प्रयोग के लिए या तो नहीं किया जाना चाहिए अगर endothelial अखंडता परीक्षण असंतोषजनक है या यह KCl का जवाब नहीं है, यह दर्शाता है कि endothelial समारोह या संवहनी चिकनी मांसपेशी सिकुड़ना, क्रमशः, संतोषजनक नहीं हैं । इस मामले में, तैयारी एक ही रक्त वाहिका या एक नई रक्त वाहिका से एक नया अंगूठी के साथ प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए ।

2. इष्टतम प्रारंभिक तनाव निर्धारित करने के लिए सामान्यीकरण

नोट: सामान्यीकरण प्रक्रिया धमनियों का इष्टतम आंतरिक व्यास (आईसी) के निर्धारण की अनुमति देता है, जिस पर रक्त वाहिका एक उपयुक्त आराम पहुंचाता दबाव (१०० mmHg या १३.३ केपीए mesenteric धमनियों के लिए) अनुभव करता है और अधिकतम सक्रिय उत्पादन वैसोएक्टिव एजेंटों के प्रत्युत्तर में बल ।

  1. कंप्यूटर पर स्विच करें और डेटा रिकॉर्डिंग सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री तालिकादेखें) ।
  2. प्रयोग को मूल सेटिंग फ़ाइल को अधिलेखित करने से बचने के लिए किसी नए नाम के साथ "LabChart डेटा फ़ाइल" के रूप में सहेजें ।
  3. सामान्यीकरण सेटिंग्स विंडो खोलें और k फ़ैक्टर 1 के रूप में सेट करें । नेत्रिका अंशांकन के लिए डिफ़ॉल्ट मान स्वीकार करें (०.३, यदि वेसल लंबाई अज्ञात है, या 1 यदि वेसल लंबाई ज्ञात है), लक्ष्य दबाव (१३.३), ऑनलाइन औसत समय (2) और विलंब समय (६०) । सेटिंग्स सहेजने के लिए ठीक क्लिक करें ।
  4. ब्याज और इनपुट के चैनल का चयन करें तार व्यास (४० μm), ऊतक अंतिमबिंदु (a1:0; a2: ऊतक लंबाई मापा के रूप में), सामान्यीकरण विंडो में प्रारंभिक माइक्रोमीटर पठन.
  5. पहले निष्क्रिय खिंचाव को रक्त वाहिका पर लागू करके सामान्यीकरण प्रक्रिया प्रारंभ करें (सूक्ष्ममापी पेंच काउंटर दक्षिणावर्त मुड़ें).
  6. पोत के लिए प्रतीक्षा करने के लिए स्थिर (3 मिनट) और इनपुट सामांयीकरण विंडो में नए सूक्ष्ममापी पढ़ने । दीवार तनाव स्वचालित रूप से गणना की है और ग्राफ पर एक बिंदु के रूप में दिखाया गया है ।
    नोट: निष्क्रिय खिंचाव के दौरान इस्तेमाल किया सूक्ष्ममापी "कदम" एक ही होने की जरूरत नहीं है । पहले कुछ खंडों में 20 μm प्रत्येक हो सकता है । चूंकि खंड समदाब रेखा के करीब पहुंच जाते हैं, अतः इन चरणों को 10 माइक्रोमीटर, 5 माइक्रोमीटर, 2 माइक्रोमीटर या उससे भी छोटे तक कम किया जा सकता है । माइक्रोमीटर विन्यास को समायोजित करते समय मुख्य चार्ट विंडो खोलें-यदि लंबाई/तनाव ग्राफ पर समदाब रेखा से अधिक बड़ी स्पाइक (जो पूर्व निर्धारित मूल्य के अनुरूप दाब के बिंदुओं को इंगित करती है) प्रकट होती है, तो तनाव को कम करें ।
  7. प्रत्येक निष्क्रिय खिंचाव के बाद, ११५ मिमी KCl युक्त एक आईएसओ-परासरणी उच्च पोटेशियम Krebs के साथ नियंत्रण Krebs की जगह । जब संकुचन एक पठार (लगभग 3 मिनट) तक पहुंचता है, तो पोटेशियम-सक्रियित बल से प्रत्येक खंड पर निष्क्रिय बल को घटाकर सक्रिय बल (F) को रिकॉर्ड करें । दीवार तनाव के रूप में अच्छी तरह के रूप में आंतरिक परिधि (आईसी) मूल्यों की गणना ।
    1. बेस लाइन के ऊपर विक्षेप के रूप में सक्रिय तनाव को मापने । सक्रिय तनाव (T) की गणना समीकरण F (mN) = T (mN/mm) x 2 x वाहिका लंबाई (mm) के आधार पर की जाती है । आंतरिक परिधि (आईसी) मूल्यों सूक्ष्ममापी डेटा से गणना कर रहे हैं (आईसी = २०५.६ μm + 2 एक्स "गैप").
  8. ताजा Krebs के साथ जगह द्वारा उच्च पोटेशियम हालत निकालें । 5 मिनट से अधिक तीन बार के लिए धोने दोहराएं ।
  9. २.५ करने २.८ के लिए चरणों को दोहराएं (निष्क्रिय खंडों के बाद वैकल्पिक मुड़ता में सक्रिय संकुचन द्वारा उत्प्रेरण द्वारा) सक्रिय तनाव कम करने के लिए प्रारंभ होता है (चित्रा 2) ।
  10. वैकल्पिक हिस्सों के कई दौर के बाद, निष्क्रिय लंबाई/तनाव घटता IC100 के मूल्य दे, १०० mmHg के एक संप्रेषित दबाव में पोत की आंतरिक परिधि, समदाब रेखा के साथ पार बिंदु के रूप में ।
    नोट: निष्क्रिय हिस्सों के दौरान प्रत्येक सूक्ष्ममापी मूल्य मैन्युअल सॉफ्टवेयर सामान्यीकरण मॉड्यूलमें शुरू की है. कार्यक्रम स्वचालित रूप से इसी बल माप रिकॉर्ड करने के लिए निष्क्रिय लंबाई उत्पंन/IC100 के मूल्य देता है जो समदाब रेखा के साथ पार बिंदु के रूप में (चित्रा 2, सही पैनलों) । करीब अंतिम बिंदु समदाब रेखा पर है, लेकिन इसके ठीक ऊपर बेहतर सामान्यीकरण वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाए बिना है । समदाब रेखा से बहुत ऊपर एक बिंदु शारीरिक रूप से घुड़सवार पोत को क्षति पहुंचा सकता है, जिससे प्रयोग के दौरान अविश्वसनीय परिणाम प्राप्त होते हैं ।
  11. सक्रिय लंबाई/तनाव घटता बनाने के लिए ic1 हटाना मूल्यों का निर्धारण और ic1 हटाना के अनुपात के रूप में सामान्यीकरण k कारक की गणना/IC100, जो बाद में पेशीलेखन प्रयोगों में रक्त वाहिका के इस प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
    नोट: सक्रिय लंबाई/तनाव घटता x-अक्ष पर सूक्ष्ममापी डेटा और y-अक्ष पर सक्रिय तनाव से परिकलित आईसी मान प्लॉट करके बनाए जाते हैं । IC1 हटाना सर्वोच्च पठार क्षेत्र के भीतर झूठ बोल मान है ( चित्रा 2में लाल निशान, सही पैनलों). सक्रिय लंबाई/तनाव curves की साजिश रचने और IC1 हटाना का निर्धारण करने के बाद, सामांयीकरण k कारक IC1 हटाना/IC100 के अनुपात के रूप में गणना की है । सामांयीकरण k फ़ैक्टर पर आधारित, आधार रेखा के लिए इष्टतम आईसी, ic1 हटाना के रूप में चिह्नित, निष्क्रिय लंबाई पर दिखाई देगा/तनाव वक्र । इस आईसी के लिए सूक्ष्ममापी सेटिंग वक्र के नीचे प्रकट होता है और बाद में मायोग्राफी प्रयोगों के लिए micropositioner सेट करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । प्रारंभिक तनाव (T) लक्ष्य दबाव (Pi) x IC/2π के बराबर होता है और पोत पर लागू इष्टतम बल (F), T x 2 x जलयान की लंबाई के बराबर होता है ।
  12. अच्छी तरह से बाहर उच्च पोटेशियम Krebs धोने और एक और 30 से ४५ मिनट के लिए तैयारी equilibrate । बेसल तनाव को "शूंय" पर रीसेट करें ताकि बाद के प्रयोग के दौरान केवल सक्रिय संकुचनशील प्रतिक्रियाएं दर्ज की जाएंगी ।

3. फेनीलेफ्रीन प्रेरित संकुचन

नोट: दवाओं है कि वाहिकासंकीर्णन प्रतिक्रियाओं उत्प्रेरण के लिए चुना जा सकता है शामिल अविशिष्ट adrenoceptor एगोनिस्ट norepinephrine, चयनात्मक α-1 adrenoceptor एगोनिस्ट phenylephrine, पेप्टाइड हार्मोन एंजियोटेनसिन द्वितीय, और monoamine न्यूरोट्रांसमीटर 5-hydroxytryptamine. वर्तमान प्रोटोकोल में फेनीलेफ्रीन का प्रयोग परीक्षण के लिए किया जाता है (सामग्री सारणी) ।

  1. तैयार और धारा १.३ में वर्णित के रूप में युग्मित धमनीय छल्ले, एक PVAT बरकरार के साथ और अन्य PVAT के साथ हटा दिया, प्रयोग के लिए प्रत्येक धमनी के निकटवर्ती अनुभागों से.
  2. सामान्यीकरण के बाद (खंड 2 में वर्णित), पूर्व अनुबंध Krebs युक्त चैंबर के लिए ११५ मिमी KCl समाधान जोड़कर उच्च पोटेशियम Krebs बफर के साथ धमनी खंडों.
  3. सिकुड़न के लिए प्रतीक्षा करें पठार (3 मिनट), बाहर उच्च पोटेशियम धोने और ताजा वातित krebs बफर के साथ बदलें । दोहराएं 5 मिनट से अधिक तीन बार धोने ।
  4. Kcl उत्तेजना को दोहराने और तीन बार धोने और केसीएल उत्तेजना के कारण तनाव से बेसलाइन तनाव घटाकर KCl करने के लिए अधिकतम सिकुड़ा प्रतिक्रिया/तनाव रिकॉर्ड ।
  5. पिछले संकुचन और धोने के बाद, गर्म, वातित krebs बफर के साथ चैंबर फिर से भरना और धमनी अगले कार्य करने से पहले के बारे में 30 मिनट के लिए ठीक करने की अनुमति ।
  6. प्रत्येक कक्ष के लिए, phenylephrine की संचयी मात्रा जोड़ें (10-10 से आधा लॉग वेतन वृद्धि 10-4 मीटर) शांत तैयारी के isometric तनाव में एकाग्रता निर्भर बढ़ जाती है प्रेरित करने के लिए ।
  7. एगनिस्ट की कम एकाग्रता को चैंबर में जोड़कर शुरू करें । एक स्थिर संकुचन (3-5 मिनट) के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के बाद, अगले एकाग्रता जोड़ें । Phenylephrine की सांद्रता में वृद्धि के साथ चरणों को दोहराएं ।
  8. एगोनिस्ट (phenylephrine) की अंतिम खुराक जोड़ने के बाद, दवा अच्छी तरह से धोने और ताजा Krebs बफर के साथ चैंबर फिर से भरना. केसीएल प्रेरित अधिकतम संकुचन (चित्रा 3) के प्रतिशत में वृद्धि के रूप में एकाग्रता पर निर्भर प्रतिक्रियाओं प्लॉट ।
  9. वैकल्पिक किसी के योगदान का आकलन करने के लिए, phenylephrine के अलावा करने से पहले 30 मिनट के लिए कोई सिंथेस अवरोध करनेवाला, एल नाम (10-4 मीटर), के साथ तैयारी सेते । L-नाम mesenteric धमनियों की शांत तैयारी में phenylephrine प्रेरित संकुचन को बढ़ाता है (चित्रा 4).
    नोट: अवरोधकों या विरोधी को समानता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त समय होना चाहिए, आमतौर पर 30-45 मिनट (प्रयोगों के किसी भी सेट के लिए संगत हो).
  10. एक दूसरे एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र क्रमिक रूप से करने के लिए, कक्ष को पूरी तरह से और बारबार धोने के लिए पिछले agonists के सभी हटा दें, जब तक टोन में कोई और परिवर्तन नहीं मनाया जाता है ।
    नोट: समानांतर प्रयोगों को उजागर करता है एक ही रक्त वाहिका से एगोनिस्ट, नियंत्रण शर्तों के तहत एक और अवरोध करनेवाला की उपस्थिति में एक से प्राप्त दो छल्ले (s); प्रत्येक वलय में एकाग्रता-अनुक्रिया वक्र केवल एक बार किया जाएगा । यह समानांतर प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए पसंद किया जाता है, क्योंकि यह दवा की कार्रवाई और रक्त वाहिका संवेदनशीलता के लिए एक बेहतर नियंत्रण प्रदान करता है. क्रमिक प्रयोग एक ही वलय में एक एगोनिस्ट के लिए एकाग्रता-अनुक्रिया वक्र प्राप्त करते हैं; यह धोने से बाहर, प्रायोगिक स्थितियों (जैसे, एक अवरोध करनेवाला जोड़ने), और फिर एक ही अंगूठी पर एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र दोहरा बदल रहा है । इस मामले में, समय नियंत्रण दिखाने के लिए कि दवा प्रतिक्रियाओं समय के साथ ऊतक के परिवर्तन के कारण नहीं कर रहे हैं की जरूरत है. एक निश्चित है कि ऊतक एक एकाग्रता-प्रतिक्रिया प्रयोग करने के लिए जोखिम के बाद बिल्कुल एक ही राज्य में है कभी नहीं किया जा सकता है । पर्याप्त समय (न्यूनतम 30-60 मिनट) के लिए पोत क्षेत्रों को अपने आराम करने के लिए लौटने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए (बेसल) तनाव हालांकि किसी मामले में, यह तुरंत रिसेप्टर्स से उच्च समानता एगोनिस्ट के वियोजन के बाद नहीं हो सकता है । इसके अलावा, उच्च पोटेशियम krebs संचयी एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता के बीच लागू किया जा सकता विसुग्राहीकरण28को कम करने के लिए. याद रखें कि सबसे विरोधी पूरी तरह से नहीं धोया जा सकता है, इस प्रकार यह प्रयोग के आराम के लिए जोड़ रखना ।

4. endothelium पर निर्भर छूट/

  1. पूर्व अनुबंध एक हौसले से घुड़सवार धमनी खंड (के रूप में ३.२ से ३.५ के लिए कदम में वर्णित) । फिर से, kcl उत्तेजना के कारण तनाव से बेसलाइन तनाव घटाकर KCl करने के लिए अधिकतम सिकुड़ा प्रतिक्रिया/
  2. वैकल्पिक कोई सिंथेस अवरोध करनेवाला के साथ तैयारी को सेते, एल नाम (10-4 एम), 30 मिनट के लिए U46619 के अलावा करने से पहले ।
  3. कक्ष में U46619 की पूर्व-परिकलित सांद्रता जोड़ें और धमनी खंडों की स्थिर, निरंतर संकुचन की अनुमति दें ।
    नोट: mesenteric धमनियों में vasodilatory प्रतिक्रियाओं प्रेरित कर रहे है ११५ mM kcl करने के लिए अधिकतम प्रतिक्रियाओं के बारे में ८०% के लिए पूर्व अनुबंधित । विभिन्न एगोनिस्ट अपने विशिष्ट रिसेप्टर्स के सक्रियण के द्वारा संकुचन प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यहाँ, रक्त वाहिका खंडों के साथ या बिना PVAT U46619 (1 – 3 x 10-8 मीटर के साथ पूर्व अनुबंध कर रहे हैं; सामग्री की तालिका), एक thromboxane A2 रिसेप्टर agonist स्थिर और निरंतर चिकनी मांसपेशियों के संकुचन के लिए प्रेरित करने के लिए ।
  4. अंग कक्ष के लिए acetylcholine (10- 10 से 10-4 मीटर) की संचयी सांद्रता जोड़ें. धमनी क्षेत्रों की एकाग्रता पर निर्भर vasodilatory प्रतिक्रियाओं U46619 प्रेरित संकुचनशील प्रतिक्रियाओं के प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (चित्रा 5) ।
    नोट: प्रयोग के अधिकांश के लिए, आराम एगोनिस्ट के अगले एकाग्रता को तुरंत जोड़ा जाना चाहिए जब एक पठार तनाव में खुशहाली लौटने लगी को रोकने के लिए मनाया जाता है । धमनी क्षेत्रों की एकाग्रता पर निर्भर vasodilatory प्रतिक्रियाओं के प्रतिशत के रूप में सामान्यीकृत है U46619-प्रेरित सिकुड़नेवाला प्रतिक्रियाओं में मामूली अंतर के लिए इन्नेर्वतिओन और व्यास में धमनी क्षेत्रों के बीच (चित्रा 5) समायोजित करने के लिए । एक ही रक्त वाहिका से प्राप्त व्यक्तिगत छल्ले के बीच प्रतिक्रिया में छोटी परिवर्तनशीलता कम हो जब छह या अधिक प्रयोगों के एक समूह सांख्यिकीय विश्लेषण कर रहे हैं. जब व्यक्तिगत ऊतक के स्वयं के अधिकतम संकुचन के प्रतिशत के रूप में प्रतिक्रिया व्यक्त, यह एक बनती विश्लेषण (जैसे, युग्मित छात्र टी परीक्षण) का उपयोग करने के लिए के रूप में विभिन्न जानवरों से एक ही प्रकार के ऊतकों की प्रतिक्रियाओं की तुलना करने के लिए उपयुक्त है एक ऊतक से पहले और एक हस्तक्षेप के बाद की प्रतिक्रियाएं । PVAT के प्रभाव का विश्लेषण करते समय, दो-तरफा ANOVA एकाधिक-तुलना परीक्षण के बाद उपयोग किया जाता है ।
  5. आराम agonist के अंतिम खुराक जोड़ने के बाद, प्रत्येक कक्ष से दवा को हटाने और ताजा Krebs बफर के साथ फिर से भरना. चैंबर को अच्छी तरह से Krebs बफर के साथ धोने और दो धमनी किसी भी अतिरिक्त प्रयोगों के प्रदर्शन से पहले न्यूनतम ४५ मिनट के लिए स्थिर ।

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Representative Results

सामांयीकरण फ़ैक्टर k को प्राप्त करने के लिए लंबाई/

किसी वाहिका खंड पर लागू किए गए खिंचाव की मात्रा एक्टिन-मायोसिन अन्योन्यक्रिया की सीमा को प्रभावित करती है और इसलिए अधिकतम सक्रिय बल विकसित होता है । इस प्रकार, रक्त वाहिका के हर प्रकार के लिए, अधिक से अधिक सक्रिय बल के लिए आवश्यक खिंचाव की मात्रा का निर्धारण उचित मायोग्राफी अध्ययन के लिए आवश्यक है । यहाँ, लंबाई/तनाव संबंध के सामान्यीकरण माउस मॉडल से अलग mesenteric धमनियों के लिए किया जाता है (चित्रा 2). धमनी खंड एक चार चैंबर तार myograph प्रणाली में निलंबित कर दिया गया ( सामग्री तालिकादेखें) स्टेनलेस स्टील पिंस (४० μm व्यास) पर । सममितीय तनाव एक एनालॉग के लिए डिजिटल एक रिकॉर्डिंग कार्यक्रम के साथ एक कंप्यूटर से जुड़े कनवर्टर का उपयोग कर दर्ज किया गया था । कक्षों krebs बफर के 5 मिलीलीटर निहित, ३७ डिग्री सेल्सियस पर रखा और ९५% O2 और 5% सीओ2 के साथ वातित के लिए प्रयोग भर में ७.४ पर पीएच बनाए रखने के । एक निष्क्रिय लंबाई/तनाव संबंध धमनी खंडों की वृद्धिशील खींच द्वारा स्थापित किया गया था जब तक आंतरिक परिधि १०० mmHg संप्रेषण दबाव (IC100) के लिए इसी प्राप्त किया गया था । प्रत्येक खंड (नीले तीर) के बाद, ११५ मिमी KCl संकुचन (हरे तीर) को उत्तेजित करने के लिए लागू किया गया था । सक्रिय लंबाई/तनाव वक्रों (लाल) को Y-अक्ष पर सक्रिय बल डेटा (kcl-सक्रियित बल से प्रत्येक खंड पर निष्क्रिय बल को घटाकर) निकाल कर प्लॉट किया गया था और फिर एक ग्राफ़ को मैन्युअल रूप से सूक्ष्ममापी से परिकलित आईसी मानों के साथ बनाया गया था X-अक्ष पर डेटा । एक आईसी मान पीक पठार के भीतर झूठ बोल रही है IC1 हटाना (डैश्ड लाल लाइनों) है । सामान्यीकरण कारक k IC1 हटाना/IC100 अनुपात के रूप में परिकलित किया गया था, जो तब बाद के प्रयोग में एक ही पोत प्रकार के नमूनों के लिए लागू किया जा सका ।

प्रस्तुति और एकाग्रता की गणना-प्रतिक्रिया घटता

अधिकांश एकाग्रता-प्रतिक्रिया वक्र एक संचई तरीके से किया जाता है । एगोनिस्ट की एक कम एकाग्रता स्नान करने के लिए जोड़ा जाता है (अधिमानतः प्रतिक्रिया के लिए सीमा के नीचे एक एकाग्रता के साथ शुरू) । एक संभावित प्रतिक्रिया (3-5 मिनट) के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के बाद, अगले एकाग्रता जोड़ा जाता है । जब कोई प्रतिक्रिया देखी जाती है, तो उसे अगले अधिकतम प्रत्युत्तर प्राप्त होने से पहले किसी पठार तक पहुंचने की अनुमति दी जाती है । Phenylephrine की एकाग्रता में आधा लॉग (औसत ३.१६-गुना) वेतन वृद्धि के लिए यहां लागू कर रहे है agonist प्रेरित संकुचन अध्ययन (चित्रा 3 और 4 चित्रा) ।

अधिकांश मामलों में, संकुचन-अनुक्रिया वक्र, तनाव/बल के कच्चे मानों के रूप में अभिव्यक्त नहीं होते हैं, परंतु केसीएल के संदर्भ प्रत्युत्तर के प्रतिशत के रूप में व्यक्तिगत रक्त वाहिका खंड की लंबाई/तनाव वक्र के इष्टतम बिंदु पर प्राप्त होते हैं । यह रक्त वाहिका के आकार या चिकनी मांसपेशियों की सामग्री में परिवर्तनशीलता के लिए समायोजित कर देता है और साथ ही उम्र बढ़ने या विकृति के कारण परिवर्तन remodeling के लिए सही हो जाता है । यहाँ, प्रयोग की शुरुआत में ११५ मिमी केसीएल द्वारा उत्प्रेरित अधिकतम संकुचन प्राप्त किया जाता है और यह एल-नाम की अनुपस्थिति या उपस्थिति में, PVAT के साथ या उसके बिना, mesenteric धमनियों के संकुचन को उत्तेजित करने के लिए उपयोग में लिया जाता है (चित्र 3 और चित्रा 4) ।

विश्राम का उत्पादन एगोनिस्ट अध्ययन करने के लिए, जहाजों आमतौर पर एक समान स्तर के लिए अनुबंधित कर रहे हैं-कि ऊतक के अधिकतम सिकुड़ा प्रतिक्रिया के लगभग 50-80%. चूंकि phenylephrine प्रेरित संकुचन के लिए प्रतिक्रियाओं प्रयोगात्मक समूहों के बीच अलग कर रहे हैं, वर्तमान प्रोटोकॉल acetylcholine की संचयी सांद्रता लागू करने से पहले स्थिर संकुचन को उत्तेजित करने के लिए U46619 का उपयोग करता है. चिकनी मांसपेशी छूट प्रारंभिक U46619 द्वारा प्रेरित संकुचन के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की है (चित्रा 5) ।

एकाग्रता-प्रतिक्रिया घटता एक शिफ्रट या शिफ्रट बदलाव की उपस्थिति के रूप में तुलना की जा सकती है (जैसे, एक नियंत्रण वक्र के बीच और एक एक विरोधी की उपस्थिति में प्राप्त) बराबर प्रतिक्रियाओं का उत्पादन सांद्रता निर्धारित करके, उदाहरण के लिए, 30% या ५०% अधिकतम. इन्हें EC30 और ec५०, क्रमशः (चित्रा 3b) कहा जाता है । मतलब चुनाव आयोग५० मूल्यों की सांख्यिकीय तुलना उनके मूल्यों के लघुगणक पर किया जाना चाहिए । वक्रों के अवसाद की उनके संबंधित अधिकतम प्रतिक्रियाओं (Emax) की तुलना करके जांच की जाती है (चित्र 3बी) । दिखाए गए उदाहरणों में, mesenteric धमनियों में phenylephrine प्रेरित संकुचन एल नाम से बढ़ाया गया था और एकाग्रता प्रतिक्रिया घटता एक शिफ्रट बदलाव के रूप में अच्छी तरह से अधिक संकुचन में एक ऊंचाई से पता चला (चित्र 4b). Mesenteric धमनियों में acetylcholine प्रेरित छूट एल नाम से हिचकते थे, और एकाग्रता प्रतिक्रिया वक्र एक दाहिनी ओर बदलाव के रूप में अच्छी तरह से अधिक से अधिक छूट में कटौती दिखाया (चित्रा 5 बी).

विभिन्न औषधीय एजेंटों के लिए नाड़ी प्रतिक्रियाओं क्षेत्र के तहत संकुचन-वक्र (aucc) संकुचन और छूट के लिए क्षेत्र के ऊपर-शिथिलता वक्र (aarc) क्रमशः के रूप में, अरैखिक रसद प्रतिगमन का उपयोग करके परिकलित किया जा सकता तुलना के लिए विश्लेषण10 (चित्रा 3C, चित्रा 4c और चित्रा 5 सी). L-नाम के प्रभाव की तुलना AUCC/AARC के मूल्यों द्वारा नहीं की जा सकती है, यह निर्धारित करने के लिए कि कोई जैव उपलब्धता नहीं है (चित्र 6). PVAT के साथ या इसके बिना mesenteric धमनियों में कोई नहीं की बेसल और उत्तेजित रिहाई phenylephrine-उत्तेजित संकुचन (DAUCC) और acetylcholine प्रेरित छूट (DAARC) के एकाग्रता प्रतिक्रिया curves में मतभेद के रूप में व्यक्त किया जा सकता है, क्रमशः L-नाम की उपस्थिति या अनुपस्थिति में (चित्र 6a और अंक 6b) । दिखाया उदाहरण में, PVAT की उपस्थिति उच्च वसा वाले आहार के साथ खिलाया चूहों से एकत्र mesenteric धमनियों में कोई जैव उपलब्धता कम (चित्रा 6c).

Figure 1
चित्रा 1: धमनियों की दीवार संरचना का एक योजनाबद्ध आरेख. अंतश् लेष् क कोशिका में अन् नस्थ कोशिकाएं अंतस् थाणु के अन् दर होती हैं जो संवहनी चिकनी माँसपेशियों पर निर्भर करती हैं . इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: माउस mesenteric धमनियों के लिए इष्टतम प्रारंभिक तनाव निर्धारित करने के लिए एक प्रयोग illustrating प्रतिनिधि निशान. रक्त वाहिका खंडों mesenteric धमनियों से तैयार किया गया था 16 सप्ताह पुराने मानक चाउ (ए) या उच्च वसा वाले आहार (ख) के साथ खिलाया चूहों से एकत्र. बढ़ते के बाद, निष्क्रिय और सक्रिय लंबाई/तनाव घटता ११५ mM KCl (बाएं पैनलों) के साथ चरण वार खींच और अनुक्रमिक उत्तेजना द्वारा प्राप्त किया गया । सक्रिय संकुचन प्रत्येक उत्तेजना के साथ उत्पन्न वृद्धि करनी चाहिए के रूप में पोत उत्तरोत्तर फैला है, जब तक यह इष्टतम लंबाई में एक पठार तक पहुँच जाता है. इसके अलावा खिंचाव सक्रिय संकुचन में कमी करने के लिए नेतृत्व करेंगे । IC100 और IC1 हटाना निष्क्रिय और सक्रिय लंबाई/तनाव घटता है, क्रमशः (सही पैनलों) की साजिश रचने से निर्धारित किया गया । ध्यान दें कि निष्क्रिय लंबाई/तनाव वक्र सामांयीकरण मॉड्यूल द्वारा मैंयुअल रूप से सूक्ष्ममापी मूल्यों inputting के बाद उत्पंन किया गया था, जबकि सक्रिय लंबाई/ उत्तेजना. IC1 हटाना/IC100 अनुपात सामांयीकरण k कारक के रूप में (सही पैनलों) की गणना की गई । ). यह भी ध्यान दें कि केवल अंतिम चार बिंदुओं के सक्रिय लंबाई/तनाव वक्र के आंकड़ों में दिखाया गया था पैनल (बी) । एसटीसी: स्टैंडर्ड चाउ फेड माउस धमनी; HFD: उच्च वसा आहार खिलाया माउस धमनी । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: के साथ या PVAT आसपास के बिना mesenteric धमनियों में phenylephrine करने के लिए vasoconstrictor प्रतिक्रियाओं के उत्पादन रिकॉर्डिंग. संकुचन अध्ययन mesenteric धमनियों की तैयारी पर किया जाता है 16-सप्ताह पुराने Adipo-SIRT1 ट्रांसजेनिक चूहों, जिसमें मानव SIRT1 वसा ऊतकों में चुनिंदा overexpressed है29. (-PVAT) के बिना या (PVAT), (A) के साथ mesenteric धमनियों के संकुचन को प्रोत्साहित करने के लिए phenylephrine की संचयी सांद्रता लागू किया गया था । संकुचनशील प्रतिक्रियाएं दर्ज की गई और ११५ मिमी KCl-प्रेरित उच्चिष् ठ संकुचन (बी) के प्रतिशत के रूप में गणना की गई । क्षेत्र के तहत संकुचन curves (AUCC) की तुलना के लिए साजिश रची गई (ग) । ध्यान दें कि Adipo-SIRT1 चूहों से PVAT phenylephrine करने के लिए प्रतिक्रिया पर एक विरोधी संकुचनशील प्रभाव elicited । इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: के साथ या बिना आसपास के PVAT mesenteric धमनियों में, और एल-नाम की अनुपस्थिति या उपस्थिति में phenylephrine करने के लिए vasoconstrictor प्रतिक्रियाओं के उत्पादन रिकॉर्डिंग. Mesenteric धमनियों 16 सप्ताह पुराने जंगली प्रकार उच्च वसा वाले आहार के साथ खिलाया चूहों से एकत्र किए गए । दस-चार एम एल-नाम या वाहन नियंत्रण जोड़ने के बाद, mesenteric धमनियों (ए) के संकुचन को प्रोत्साहित करने के लिए phenylephrine के संचयी सांद्रता लागू किया गया । संकुचनशील प्रतिक्रियाएं दर्ज की गई और ११५ मिमी KCl-प्रेरित उच्चिष् ठ संकुचन (बी) के प्रतिशत के रूप में गणना की गई । क्षेत्र के तहत संकुचन curves (AUCC) की तुलना के लिए साजिश रची गई (ग) । ध्यान दें कि आहार मोटापे से ग्रस्त चूहों से PVAT phenylephrine करने के लिए प्रतिक्रिया पर विरोधी सिकुड़ा हुआ प्रभाव प्रकाश में लाना नहीं था. – PVAT: PVAT के बिना तैयार धमनी के छल्ले; + PVAT: आसपास के PVAT के साथ तैयार धमनी के छल्ले; -L-नाम: धमनी के छल्ले एल नाम के साथ नहीं इनक्यूबिटेड; + L-नाम: धमनी के छल्ले एल नाम के साथ इनक्यूबेटेड. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: mesenteric धमनियों में acetylcholine के लिए वाहिकाविस्फारक प्रतिक्रियाओं के उत्पादन रिकॉर्डिंग के साथ या आसपास के PVAT के बिना, और अनुपस्थिति या एल-नाम की उपस्थिति में । आंत्रयोजनिक धमनियों को उच्च वसा वाले आहार से पोषित 16 सप्ताह पुराने चूहों से एकत्र किया गया था । 10-4 एम एल नाम या वाहन नियंत्रण जोड़ने के बाद 30 मिनट में, pvat के साथ या बिना रक्त वाहिका क्षेत्रों U46619 (1-3 x 10-8 मीटर के साथ पूर्व अनुबंध कर रहे हैं; सामग्री की तालिका), एक thromboxane A2 रिसेप्टर agonist स्थिर और निरंतर चिकनी मांसपेशियों के संकुचन के लिए प्रेरित करने के लिए । Acetylcholine की संचयी सांद्रता तो के साथ या आसपास के PVAT (एक) के बिना mesenteric धमनियों की छूट को उत्तेजित करने के लिए लागू किया गया. छूट प्रतिक्रियाओं को रिकॉर्ड किया गया और U46619-प्रेरित संकुचन (ख) के प्रतिशत के रूप में गणना की गई । क्षेत्र के ऊपर-छूट घटता (AARC) तुलना के लिए साजिश रची गई (ग) । ध्यान दें कि केवल आसपास के PVAT के साथ धमनी खंड पैनल A में दिखाया गया है – PVAT: धमनी के छल्ले PVAT के बिना तैयार; + PVAT: आसपास के PVAT के साथ तैयार धमनी के छल्ले; -L-नाम: धमनी के छल्ले एल नाम के साथ नहीं इनक्यूबिटेड; + L-नाम: धमनी के छल्ले एल नाम के साथ इनक्यूबेटेड. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: प्रक्रिया का चित्रण कोई जैव उपलब्धता की गणना करने के लिए । क्षेत्र के अंतर्गत-संकुचन-घटता (AUCC) और क्षेत्र के ऊपर-छूट-घटता (AARC) phenylephrine (एक) और acetylcholine (बी), क्रमशः की संचयी सांद्रता के जवाब के आधार पर गणना की गई. पूर्व की तैयारी के बीच के अंतर को बिना और एल-नाम के साथ परिभाषित किया गया, ∆ यूसीसी (ए) और ∆ आआरसी (इ) के आधार पर बेसल का प्रतिनिधित्व करने के लिए कोई अंशदान नहीं दिया गया और न ही कोई रिहाई, क्रमशः उत्तेजित । तदनुसार, ∆ आसीसी ( चित्र 4Cसे परिकलित) ∆ आरआरसी ( चित्र 5cसे परिकलित) तथा दोनों (कुल कोई जैव-उपलब्धता) का योग बिना और आस-पास के मध्यांत्र धमनियों में जैव-उपलब्धता की तुलना के लिए प्रस्तुत किया गया था । PVAT (C). – PVAT: PVAT के बिना तैयार धमनी के छल्ले; + PVAT: आसपास के PVAT के साथ तैयार धमनी के छल्ले; -L-नाम: धमनी के छल्ले एल नाम के साथ नहीं इनक्यूबिटेड; + L-नाम: धमनी के छल्ले एल नाम के साथ इनक्यूबेटेड. इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इसके अलावा endothelial कोशिकाओं से, PVAT से व्युत्पंन संकेतों चिकनी मांसपेशी टोन जेट30के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । स्वस्थ pvat कोई और विरोधी भड़काऊ adiponectin विज्ञप्ति धमनियों, जो मोटापे और मेटाबोलिक सिंड्रोम जैसे रोग की स्थिति के तहत खो दिया है पर एक विरोधी सिकुड़ा प्रभाव डालती है31,३२. रोग राज्यों में, pvat endothelial रोग और अन्य हृदय असामान्यताएं३३,३४के विकास के लिए योगदान देता है । मोटापे से ग्रस्त पशुओं से धमनियों के pvat में असामान्य enos अभिव्यक्ति और समारोह में सूचित किया गया है३५,३६. के बाद से दोनों endothelial और pvat डिस्फंक्शन हृदय और चयापचय असामान्यताएं के विकास में योगदान23,३७, जब पूर्व vivo संवहनी प्रयोग प्रदर्शन, उनकी भूमिका में शामिल द्वारा विचार किया जाना चाहिए या उन्हें तैयारियों से निकाल रहे हैं ।

तार पेशीलेखन प्रणाली एक सुविधाजनक को vasoactive pvat से जारी संकेतों टुकड़े टुकड़े करना प्रदान करता है विभिंन औषधीय जांच10,३८का उपयोग कर । हालांकि, विभिंन प्रकार की धमनियों, या विभिंन आनुवंशिक पृष्ठभूमि के पशुओं से एक ही धमनियों के PVAT में रचनाएं एक ही३९नहीं हैं । इसलिए, PVAT शामिल तार मायोग्राफी परिणामों की धमनियों के विभिन्न प्रकार या विभिन्न उपभेदों के चूहों से एक ही प्रकार की धमनियों में तुलना नहीं की जानी चाहिए. उम्र और अंतर्निहित रोग राज्यों भी PVAT में सेलुलर रचनाओं को प्रभावित. यहां, एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि से चूहों लेकिन उनके वसा ऊतक में विभिंन आनुवंशिक संशोधनों के साथ PVAT के vasomodulating गतिविधि की तुलना के लिए इस्तेमाल किया गया ।

रक्त प्रवाह के लिए प्रतिरोध का एक मुख्य स्रोत के रूप में, mesenteric धमनियों वर्तमान अध्ययन के लिए चुना जाता है । आराम तनाव रक्तनली का संचालक प्रतिसादिता४०की राशि निर्धारित करता है । रक्त वाहिका के इष्टतम प्रारंभिक तनाव धमनी, आयु, आहार, उपचार और पशुओं की आनुवंशिक पृष्ठभूमि के प्रकार से प्रभावित है, इस प्रकार की जांच करने से पहले व्यक्तिगत रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए छूट/ वर्तमान प्रदर्शन के लिए, सुपीरियर mesenteric धमनियों 16 सप्ताह की उंर के चार सप्ताह से शुरू मानक चाउ या उच्च वसा आहार के साथ खिलाया चूहों से एकत्र किए गए । वर्तमान प्रोटोकॉल में औषधीय प्रतिक्रियाओं का आकलन करने से पहले धमनी खंडों के अधिकतम सक्रिय बल उत्पादन के लिए इष्टतम सेटिंग्स की स्थापना पर जोर दिया गया है । इन-हाउस माउस मॉडलों से एकत्रित आंत्रयोजनिक धमनियों के लिए निष्क्रिय और सक्रिय लंबाई/तनाव संबंधों का अध्ययन किया जाता है । 1 के एक सामांयीकरण k फैक्टर 16 से तैयारी के लिए स्थापित किया गया है सप्ताह पुराने पशुओं, जो ०.९ के डिफ़ॉल्ट मूल्य या४१पिछले प्रकाशनों द्वारा इस्तेमाल से अलग है । तकनीक, बफर कम्पोजिशन और इंस्ट्रूमेंट मॉडल्स आदि में संभावित मतभेदों के कारण साहित्य में सामान्यीकरण अनुपात की तुलना करते समय सावधानी बरतने की जरूरत है ।  विशेष रूप से, उंर, आहार और अंय pathophysiological स्थितियों को प्रभावित निष्क्रिय और सक्रिय तनाव के रूप में के रूप में अच्छी तरह से धमनियों की फार्माकोडायनेमिक्स विशेषताओं४२।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम हांगकांग के अनुसंधान अनुदान परिषद [१७१२४७१८ और १७१२१७१४], हांगकांग स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान कोष [१३१४२६५१ और १३१४२६४१], हांगकांग के सहयोगात्मक अनुसंधान निधि [C7055-14G] से अनुदान द्वारा वित्तीय सहायता, और राष्ट्रीय बुनियादी चीन के अनुसंधान कार्यक्रम [९७३ कार्यक्रम 2015CB553603] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetylcholine Sigma-Aldrich A6625 Stock concentration: 10-1 M
Working concentration: 10-10 to 10-5 M
L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) Sigma-Aldrich N5751 Stock concentration: 3 x 10-2 M
Working concentration: 10-4 M
Phenylephrine Sigma-Aldrich P6126 Stock concentration: 10-2 M
Working concentration: 10-10 to 10-5 M
U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α) Enzo BML-PG023-0001 Stock concentration: 10-5 M
Working concentration: 1-3 x 10-8 M
Multiwire myograph Danish MyoTechnology (DMT) 620M
PowerLab 4/26 ADInstruments ML848
Labchart7 ADInstruments -
Adipo-SIRT1 wild type mice Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong CULATR NO.: 4085-16
Silicon-coated Petri dishes Danish MyoTechnology (DMT)
Tungsten wires Danish MyoTechnology (DMT) 300331
Surgical tools

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References

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जीवविज्ञान अंक १४८ Endothelium संवहनी चिकनी मांसपेशियों vasodilation वाहिकासंकीर्णन पेरिवस्कुलर वसा ऊतक
पेरिवस्कुलर वसा ऊतकों द्वारा मॉडुलन पर ध्यान केंद्रित के साथ अलग Mesenteric धमनियों का उपयोग संवहनी टोन प्रतिक्रिया का मूल्यांकन
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Konja, D., Luo, C., Sun, W. Y.,… More

Konja, D., Luo, C., Sun, W. Y., Yang, K., Man, A. W. C., Xu, A., Vanhoutte, P. M., Wang, Y. Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues. J. Vis. Exp. (148), e59688, doi:10.3791/59688 (2019).

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