Summary
Protokollen beskriver bruk av wire myography å evaluere transmuralt isometrisk spenning av chrezbryzheechno arterier isolert fra mus, med spesiell vurdering av modulering av faktorer løslatt fra endothelial celler og inflammasjon fettvev.
Abstract
Endret vaskulær tone respons til patofysiologiske stimuli bidrar til utvikling av et bredt spekter av hjerte-og metabolske sykdommer. Endothelial dysfunksjon representerer en stor gjerningsmann for den reduserte vasodilatasjon og forbedret vasokonstriksjon av arterier. Fett (fett) vev rundt arteriene spille viktige roller i regulering av endotelet-avhengige avslapping og/eller sammentrekning av vaskulære glatte muskelceller. Korset-forhandlingene mellom endotelet og inflammasjon fettvev kan vurderes ex vivo bruke montert blodkar av en wire myography system. Imidlertid bør optimale innstillinger etableres for arterier avledet fra dyr av forskjellige arter, aldre, genetisk bakgrunn og/eller patofysiologiske forhold.
Introduction
Dilatations og constrictions av arterier oppnås ved relaxations og sammentrekninger, henholdsvis av deres vaskulære glatte muskelceller. Endringer i vaskulær respons av små arterier bidra til homøostatisk regulering av arteriell blodtrykk av autonome nerver og hormoner som finnes i blodet (f. eks, katekolaminer, angiotensin II, serotonin, vasopressin). På lokalt nivå, den vaskulære reaksjoner av glatte muskelceller er modulert av signaler fra både endothelial cellene i intima og fettvev rundt arteriene (figur 1).
Endotelet er ikke bare en passiv barriere, men fungerer også som en overflate for å utveksle signaler mellom blodet og de underliggende vaskulære glatte muskel cellene. Ved å slippe ulike vasoactive stoffer, spiller endotelet en avgjørende rolle i den lokale kontrollen av vaskulær tone svar1. For eksempel, som følge av acetylkolin, aktiveres endothelial nitrogenoksid syntase (eNOS) i endotelet for å produsere nitrogenoksid (NO), som induserer avslapping av underliggende vaskulær glatt muskel ved å aktivere løselig guanylyl cyclase (sGC) 2. andre vasoactive stoffer inkluderer produkter av cyclooxygenases (f. eks, prostasyklin og Thromboxane A2), lipoksygenase (f. eks, 12-hydroxyeicosatetraenoic syrer, 12-hete), og cytokrom P450 monooxygenases (HETEs og epoxyeicosatrienoic syrer, EETs), reaktive oksygen arter (ROS) og vasoactive peptider (f. eks endothelin-1 og angiotensin II), og endotelet-avledede hyperpolarizing faktorer (EDHF)3. En delikat balanse mellom endotelet-avledet vasodilatorer og vasoconstrictors opprettholde den lokale vasomotorisk tone4,5.
Endothelial dysfunksjon er karakterisert ved svekkelse i endotelet-avhengige vasodilatasjon6, et kjennetegn på vaskulær aldring7. Med alderen reduseres endotelet evne til å fremme vasodilatasjon gradvis, skyldes i stor grad en redusert NO biotilgjengelighet, samt unormal uttrykk og funksjon av eNOS i endotelet og sGC i vaskulære glatte muskelceller8 , 9 andre priser , 10. redusert ingen biotilgjengelighet potenserer produksjonen av endotelet-avhengige vasoconstrictors11,12. I alderen arterier, endothelial dysfunksjon forårsaker trykk i Media, som gjenspeiles av den markerte økningen i veggtykkelse, antall mellomliggende kjerner, som minner om arteriell tykkelse i hypertensjon og aterosklerose observert i humant pasienter13,14. I tillegg patofysiologiske forhold som fedme, diabetes eller hypertensjon akselerere utviklingen av endothelial dysfunksjon15,16.
Inflammasjon fettvev (PVAT) utgivelser mange adipokines å regulere Vaskulær struktur og funksjon17. Den anti-kontraktile effekten av PVAT er mediert av avslappende faktorer, slik som adiponectin, nei, hydrogenperoksid og hydrogensulfid18,19,20. Imidlertid, avhenger på plasseringen og patofysiologiske forfatning, PVAT likeledes kanne forsterke kontraktile svar inne forskjellige arterier21. De Pro-kontraktile stoffene som produseres av PVAT inkluderer angiotensin-II, leptin, resistin, og ros22,23. I de fleste studier på isolerte blodårer har PVAT blitt betraktet som en enkel strukturell støtte for blodkar og dermed fjernet under utarbeidelse av blod fartøy ring segmenter. Siden fett dysfunksjon representerer en uavhengig risikofaktor for hypertensjon og tilhørende kardiovaskulære komplikasjoner24, den PVAT rundt blodkarene bør vurderes ved undersøkelse av vaskulær respons på forskjellige arterier.
Multi wire myograph systemer har blitt mye brukt til å undersøke vasomotorisk funksjoner av en rekke blodkar, inkludert aorta, chrezbryzheechno, nyre, lår, cerebral og koronar arterier25,26. Protokollene beskrevet her vil bruke wire myography å evaluere vaskulær respons i chrezbryzheechno arterier isolert fra genmodifiserte mus modeller, med et spesielt fokus på modulering av PVAT.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyrene anvendt for det fulgte studere var forsynt av det laboratorium dyr enhet av det fakultet av medisin, det universitet av Hong Kong. Etisk godkjenning ble innhentet fra avdelings utvalget komité for bruk av Laboratoriedyr for undervisning og forskning (CULATR, nr.: 4085-16).
1. forberedelser
- Utarbeidelse av narkotika
- Oppbevar legemidler på riktig måte som angitt i sikkerhets data bladet (HMS) umiddelbart etter å ha mottatt dem. Løs opp stoffene i pulverform i løsemidler som høy konsentrasjons lager løsninger og deretter alikvot for lagring ved-20 ° c.
Merk: de fleste stoffene oppløses i destillert vann for å klargjøre lager løsningene; oppvarming eller sonikering kan være nødvendig for noen medikamenter. Hvis narkotika ikke helt oppløses i vann, en dråpe på 1 M NaOH kan legges til, mens for grunnleggende medikamenter en dråpe på 1 M HCl kan brukes. Hydrofobe medikamenter kan oppløses i dimetylsulfoksid (DMSO) eller absolutt etanol. I sistnevnte tilfeller bør den endelige bad konsentrasjonen (i M) være kjent og hensiktsmessige kontroller skal utføres for å utelukke virkningene av løsemidler. - Før eksperimentet, oppløse stoffet alikvoter (tabell av materialer) i Krebs-ringer bikarbonat løsning (Krebs) inneholder 115 mm NaCl, 4,6 mm KCl, 2,5 mm CaCl2, 1,17 mM MgSO4, 1,17 mm KH2PO4, 25 mm NaHCO3, 11,1 mm D-glukose og 0,01 mm EDTA, pH 7,4.
- For kumulativ konsentrasjon-respons kurver, forberede aksjer og arbeidsløsninger av ulike rusmidler ved seriell fortynninger (tabell 1).
- Oppbevar legemidler på riktig måte som angitt i sikkerhets data bladet (HMS) umiddelbart etter å ha mottatt dem. Løs opp stoffene i pulverform i løsemidler som høy konsentrasjons lager løsninger og deretter alikvot for lagring ved-20 ° c.
- Sette opp instrumentet
- Kalibrer kraft svingeren for alle kanaler før du bruker myograph systemet hver dag, eller hver gang systemet er flyttet.
Merk: den detaljerte kalibreringsprosedyren varierer avhengig av modell. Generelt, en to-gram vekt påføres kjever og tilsvarende kraft bør 9,81 ± 0,1 mN. Hvis målingen er slått av med mer enn 0,1 mN, bør svingeren kalibreres på nytt. For systemet som brukes i denne protokollen (se tabellen over materialer), skal drifts verdiene for kraft svingeren under kalibrering være mellom 3000 og 3500. Hvis verdien av svingeren er høyere eller lavere, må kraft svingeren skiftes ut. - Juster og Juster monterings støttene i hvert kammer. Kontinuerlig og gjentatt bruk av myograph kammeret kan føre til noen forskyvning av monterings støtten, som trenger sporadisk justering før eksperimenter for å sikre at kjeven er riktig justert.
Merk: spesiell oppmerksomhet er nødvendig når du justerer monterings støttene som kraft transdusere er svært følsomme og skjøre. - Slå på varmeovner og gass (95% O2 og 5% co2) minst 30 min før eksperimentet for å la kamrene og buffere varmes opp til 37 ± 0,1 ° c og equilibrated med gassblandingen.
- Kontroller temperaturen på termometeret for å sikre nøyaktigheten av ovnen. Temperaturen kan endres til å kjøre kjøling eller oppvarming eksperimenter. Hvis temperaturen ikke er riktig som angitt, bruker du Forskyvnings funksjonen på maskinen til å øke eller redusere innstillingene for å oppnå ønsket temperatur.
- På slutten av eksperimentet, Rengjør alle kamre og slå av ovnen samt gassen kjører til oppsettet.
- Ikke slå av gassen før all væsken i kammeret har blitt sugd ut av systemet, ellers syre/destillert vann kan regurgitate og nå organ-kammer under neste bruk.
- For å rense kamrene i wire myograph, er den mest effektive måten å utføre syre-vask ved hjelp av en fortynnet eddiksyreløsning. Rengjør kanten og innsiden av kamrene med en bomullspinne.
- Etter vask, skyll kamrene grundig med destillert vann. Tørk av utsiden av kamrene med en våt klut for å fjerne tørket salt. Etanol kan også brukes hvis hydrofobe medikamenter har blitt brukt under eksperimentet.
- Et eksempel på vaskeprosedyren er som følger. Fyll kamrene med 8% eddiksyreløsning og ruge i 2 min. Bruk en bomulls spiss applikator for å rengjøre stål kammer overflaten mekanisk. Unngå enhver kontakt med aluminiums delen av myograph.
- Aspirer eddiksyre og vask myograph kammeret og støtter flere ganger med destillert vann og Tørk overflatene ved hjelp av absorberende papir eller bomull-tip applikatorer.
- Kalibrer kraft svingeren for alle kanaler før du bruker myograph systemet hver dag, eller hver gang systemet er flyttet.
- Disseksjon av chrezbryzheechno arteriell ringer
Merk: dyr som brukes for den aktuelle studien var høy fett diett matet mannlige Adipo-SIRT1 mus og vill type littermates som kontroller. Hvert dyr veide ca 45 g på tidspunktet for eksperimentene.- Euthanize musen ved intraperitoneal injeksjon av pentobarbital natrium (50 mg/kg).
- Med kirurgisk saks og tang, utføre en mid-line laparotomy å avdekke abdominal innholdet.
- Samle chrezbryzheechno arkade i en silisium-belagt Petri parabolen.
- Spre og knappenål ned det chrezbryzheechno nettverk inne det Petri fat å avsløre det forgrening av mesenterium og forbinde tissue meshwork.
- Under et mikroskop (10x), og med fin-saks og pinsett, nøye analysere ut omkringliggende bindevev. Unngå å skade det adventitial laget. Alternativt kan rundt fettvev beholdes rundt blodkaret for eksperiment (hvis nødvendig).
- Bruke fine saks og pinsett, forbruksavgift den sekundære grener av chrezbryzheechno arterier i iskald Krebs buffer.
Merk: hver forsker bør ha sitt eget sett med disseksjon Kit, strenger og avskjeds. Disse verktøyene skal holdes riktig og renset opp hver gang etter eksperimentet som noen medikamenter er vanskelig å vaske bort og rester kan holde seg til dem.- Hold blodårene i kaldt Krebs buffer mens skille omkringliggende bindevev, inkludert PVAT. Under håndtering av blodkaret, vær forsiktig for å forhindre unødig skade på endotelet.
- Hvis eksperimentet omfatter studiet av PVAT, beholde en 1,5 til 2 mm diameter sfære av PVAT rundt blodkaret. Alternativt kan samme mengder fettvev legges i hvert kammer for eksperiment.
- Valgfritt Fjern endotelet fra dissekert blodkar som en kontroll for å evaluere endotelet-avhengigheten av svarene. For chrezbryzheechno arterier, Fjern endotelet ved å rulle den forsiktig over en wire stigbøylen eller et hår.
- Skjær blodkaret forberedt som ovenfor i små ringer (~ 2 mm lengde) og legg dem i en plast rett full av luftet (95% O2 og 5% co2) Krebs buffer for senere montering i kamrene av en wire myograph27.
- Overfør fartøyet ringene inn i et myograph kammer plassert under mikroskopet. Ringene bør plasseres jevnt, med den øvre og nedre avskjedsbeger parallelt. Feste vaieren (40 μm) bør være nylig forberedt som medikamenter kan binde til strengene.
- Tre blodkar ringen på en passende lengde (2 cm) av ledningen og fest til en kjeve av monterings kammeret ved å skru for å fikse posisjonen.
- Passere en ny ledning gjennom ringen og anker til motsatt kjeven.
- Med ringer gjenget og sikret til kammer kjever, montere kammeret på myograph oppsett og slå mikrometer skruen med klokken for å flytte ledningene nær hverandre til styrken lesing på brukergrensesnittet tilsvarer kammeret montert er null eller bare Nedenfor.
Merk: tråden som er festet til den øvre kjeven bør være av minimal lengde for å sikre at spenningen kan være fullt transduced til detektoren. - Likevekt forberedelsene ved 37 ° c i minst 30 min før den første anvendelsen av kraft ved hjelp av den justerbare mikrometer.
- Vurdere vev levedyktighet i 115 mM høy kalium (NaCl erstattet av KCl på en molar basis) Krebs inneholder 4,6 mM NaCl, 115 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1,17 mm MgSO4, 1,17 mm KH2PO4, 25 mm NaHCO3 og 11,1 mM D-glukose ved pH 7,4.
Merk: isolerte fartøy anses som levedyktige hvis kontraktile kraft transduced og registreres som utslag over grunnlinjen i data opptaksprogramvaren i myograph systemet, er mer enn 40% av hvile tonen, som svar på et kontraktile middel. Hvis arterien ikke kontrakt hensiktsmessig, da enten den optimale basal spenningen/vegg trykket ikke er riktig justert eller arterien kan ha blitt skadet under isolasjon eller montering av fartøyet. - Valgfritt Vurder integriteten til endothelial celler ved å påføre fenylefrin for å indusere sammentrekning av fartøyet til 50% av den første responsen til KCl (som registrert av kraft svingeren i data opptaksprogramvaren), etterfulgt av å legge til 1 μM-acetylkolin.
Merk: en god blodkar forberedelse er avgjørende for å oppnå konsistente og nøyaktige resultater. En forberedelse bør ikke brukes til eksperimentet enten hvis endothelial integritet testen er utilfredsstillende eller den ikke reagerer på KCl, indikerer at endothelial funksjon eller vaskulær glatte muskel contractility, henholdsvis, er ikke tilfredsstillende. I dette tilfellet bør preparatet byttes ut med en ny ring fra samme blodkar eller et nytt blodkar.
2. normalisering å bestemme den optimale innledende spenning
Merk: normalisering prosedyren gjør det mulig å bestemme den optimale indre diameter (IC) av arterier hvor blodkar opplever et egnet hvile transmuralt trykk (100 mmHg eller 13,3 kPa for chrezbryzheechno arterier) og produserer maksimal aktiv styrker som svar på vasoactive midler.
- Slå på datamaskinen og åpne programvaren for datainnspilling (se tabell over materialer).
- Lagre eksperimentet som en "LabChart datafil" med et nytt navn for å unngå å overskrive den opprinnelige innstillingsfilen.
- Åpne vinduet for normalisering-innstillinger , og angi k -faktoren som 1. Godta standardverdiene for okularet kalibrering (0,3 Hvis fartøy lengden er ukjent, eller 1 Hvis fartøyets lengde er kjent), mål trykk (13,3), nett snitt tid (2) og forsinkelsestid (60). Klikk OK for å lagre innstillingene.
- Velg kanaler av interesse og input ledningen diameter (40 μm), vev endepunkter (a1:0; a2: vev lengde som målt), første mikrometer lesing i normalisering vinduet.
- Start normalisering prosedyren ved å bruke den første passive strekningen til blodkaret (snu mikrometer skruen mot klokken).
- Vent til fartøyet for å stabilisere (3 min) og input den nye mikrometer lesing i normalisering vinduet. Vegg spenningen beregnes automatisk og vises som et punkt på grafen.
Merk: mikrometer "trinnene" som brukes under passiv strekk trenger ikke å være den samme. De første strekninger kan være 20 μm hver. Som strekker komme nærmere den isobar linjen, kan trinnene reduseres til 10 μm, 5 μm, 2 μm eller enda mindre. Har hovedvinduet åpne mens justere mikrometer innstillinger-hvis en stor pigg overstiger isobar linje på en lengde/spenning graf (som indikerer punkter av trykk tilsvarende en forhåndsbestemt verdi) vises, redusere spenningen. - Etter hver passiv strekning, erstatte kontroll Krebs med en ISO-osmotisk høy kalium Krebs inneholder 115 mM KCl. Når sammentrekning når et platå (ca 3 min), ta opp den aktive kraften (F) ved å trekke den passive kraft ved hver strekning fra kalium-aktiverte kraft. Beregn vegg spenningen samt interne omkrets (IC) verdier.
- Mål aktiv spenning som utslag over grunnlinjen. Den aktive spenningen (T) beregnes basert på ligningen F (mN) = T (mN/mm) x 2 x fartøy lengde (mm). Interne omkrets (IC) verdier beregnes fra mikrometer data (IC = 205,6 μm + 2 x "gap").
- Fjern den høye kalium tilstanden ved å erstatte med frisk Krebs. Gjenta vask i tre ganger over 5 min.
- Gjenta trinn 2,5 til 2,8 (ved å indusere passive strekninger etterfulgt av aktiv sammentrekning i vekslende svinger) til den aktive spenningen begynner å avta (figur 2).
- Etter flere runder med alternative strekninger, den passive lengde/spenning kurver gir verdien av IC100, den indre omkretsen av fartøyet ved et transmuralt Trykk på 100 mmHg, som krysset punkt med isobar linje.
Merk: hver mikrometer verdi under de passive strekninger er manuelt innført i programvaren normalisering Module. Programmet registrerer automatisk tilsvarende kraftmåling for å generere den passive lengde/spenning kurve, noe som gir verdien av IC100 som krysset punkt med isobar linje (figur 2, høyre panel). Jo nærmere det siste punktet er til isobar linjen, men like over bedre normalisering er uten å skade fartøyene. Et punkt for langt over isobar linjen kan fysisk skade montert fartøy, forårsaker upålitelige resultater under eksperimentet. - Opprette den aktive lengden/spenning kurver for å bestemme IC1 verdier og beregne normalisering k faktor som forholdet mellom IC1/IC100, som vil bli brukt for denne type blod fartøy i påfølgende myography eksperimenter.
Merk: de aktive kurvene for lengde/spenning opprettes ved å tegne inn KI-verdiene beregnet fra de mikrometer dataene på x-aksen og aktive spenninger på y-aksen. IC1 er verdien som ligger innenfor området for topp platået (røde spor i figur 2, høyre panel). Etter plotting den aktive lengde/spenning kurver og bestemme IC1, er normalisering k faktor beregnet som forholdet mellom IC1/IC100. Basert på normalisering k faktor, den optimale IC for Baseline, BETEGNET som IC1, vil vise på den passive lengde/spenning kurve. Mikrometer-innstillingen for denne IC-en vises under kurven, og bør brukes til å angi micropositioner for etterfølgende myography eksperimenter. Den innledende spenningen (T) er lik mål trykket (pi) x IC/2 π og den optimale kraften (F) som brukes på fartøyet er lik T x 2 x fartøy lengde. - Grundig vaske ut den høye kalium Krebs og likevekt forberedelsene til en annen 30 til 45 min. Tilbakestill basal spenningene til "null", slik at bare aktive kontraktile svar blir registrert under det påfølgende eksperimentet.
3. fenylefrin-indusert sammentrekninger
Merk: medikamenter som kan velges for å indusere de vasokonstriktive svarene inkluderer løs adrenoceptor Agonistiske noradrenalin, selektiv α-1 adrenoceptor Agonistiske fenylefrin, det peptid hormon angiotensin II, og monoamin signalstoff 5-hydroxytryptamine. Fenylefrin brukes i den foreliggende protokollen for undersøkelse (tabell over materialer).
- Forbered og Monter sammenkoblede arteriell ringer som beskrevet i Seksjon 1,3, en med PVAT intakt og den andre med PVAT fjernet, fra de tilstøtende delene av hver arterie for eksperimentet.
- Etter normalisering (beskrevet i avsnitt 2), pre-kontrakt på arteriell segmenter med høy kalium Krebs buffer ved å legge 115 mM KCl løsning til kammeret som inneholder Krebs.
- Vent til sammentrekning til platå (3 min), vaske ut det høye kalium og erstatte med friskt luftet Krebs buffer. Gjenta vask tre ganger over 5 min.
- Gjenta KCl stimulering og vask tre ganger og ta opp maksimal kontraktile respons/spenning til KCl ved å trekke den opprinnelige spenningen fra spenningen på grunn av KCl stimulering.
- Etter den siste sammentrekning og vasking, refill kammeret med varm, luftet Krebs buffer og la arterien å gjenopprette i ca 30 min før du utfører den neste oppgaven.
- Til hvert kammer, legge til kumulative mengder fenylefrin (halv-log trinn fra 10-10 til 10-4 M) for å indusere den konsentrasjon-avhengige økninger i isometrisk spenning av Quiescent preparater.
- Start ved å legge en lav konsentrasjon av Agonistiske til kammeret. Når du har tillatt nok tid til en stabil sammentrekning (3 – 5 min), legger du til neste konsentrasjon. Gjenta trinnene med økende konsentrasjoner av fenylefrin.
- Etter å legge den siste dosen av Agonistiske (fenylefrin), vaske ut stoffet grundig og fyll kammeret med friske Krebs buffer. Plot konsentrasjonen-avhengige svar som økende prosenter av KCl-indusert maksimal sammentrekninger (Figur 3).
- Valgfritt For å vurdere bidraget av NO, ruge forberedelsene med NO syntase inhibitor, L-NAME (10-4 M), i 30 minutter før tilsetning av fenylefrin. L-NAME forbedrer fenylefrin-indusert sammentrekninger i Quiescent preparater av chrezbryzheechno arterier (Figur 4).
Merk: hemmere eller motstandere må ha tilstrekkelig tid til å oppnå likevekts, vanligvis 30 – 45 min (være konsekvent for alle sett av eksperimenter). - For å utføre en ny konsentrasjon-respons kurve sekvensielt, vask kammeret helt og gjentatte ganger for å fjerne alle de tidligere agonister, inntil ingen ytterligere endringer i tonen er observert.
Merk: parallell eksperimentering eksponerer minst to ringene innhentet fra samme blodkar til Agonistiske, en under kontroll forhold og en i nærvær av inhibitor (s); i hver ring vil konsentrasjonen-respons kurven bare utføres én gang. Det foretrekkes å utføre parallelle eksperimenter, siden dette gir en bedre kontroll for stoffets handling og blodkar følsomhet. Serielle eksperimenter får en konsentrasjon-respons kurve til en Agonistiske i en enkelt ring; vaske den ut, endre eksperimentelle forhold (f. eks, legge til en inhibitor), og deretter gjenta konsentrasjonen respons kurven på samme ring. I dette tilfellet, tid kontroller er nødvendig for å vise at stoffet svarene er ikke på grunn av endringer i vevet over tid. Man kan aldri være sikker på at vevet er i nøyaktig samme tilstand etter eksponering for en konsentrasjon-respons eksperiment. Tilstrekkelig tid (minst 30 – 60 min) må gis for å la fartøyet segmenter for å returnere til hvile (basal) spenning selv i noen tilfelle, kan dette ikke skje umiddelbart etter dissosiasjon av høy affinitet Agonistiske fra reseptorene. I tillegg kan høy kalium Krebs brukes mellom den kumulative konsentrasjon-respons kurver for å redusere desensitization28. Husk at de fleste motstanderne ikke kan vaskes helt ut, og dermed fortsette å legge det for resten av eksperimentet.
4. endotelet-avhengige relaxations/sammentrekninger
- Pre-kontrakt en fersk montert arteriell segment (som beskrevet i trinn 3,2 til 3,5). Igjen, ta opp maksimal kontraktile respons/spenning til KCl ved å trekke den opprinnelige spenningen fra spenningen på grunn av KCl stimulering.
- Valgfritt Ruge forberedelsene med NO syntase inhibitor, L-NAME (10-4 M), i 30 minutter før tilsetning av U46619.
- Tilsett pre-beregnet konsentrasjoner av U46619 til kammeret og la en stabil, vedvarende sammentrekning av arterien segmenter.
Merk: vasodilaterende svar er indusert i chrezbryzheechno arterier pre-kontrakt til ca 80% av maksimal respons på 115 mM KCl. forskjellige agonister kan brukes til å indusere sammentrekning ved aktivering av deres spesifikke reseptorer. Her er blodkar segmentene med eller uten PVAT pre-kontrakt med U46619 (1 – 3 x 10-8 M; Tabell av materialer), en thromboxane a2 reseptor Agonistiske, for å indusere stabile og vedvarende glatte muskelsammentrekninger. - Legg til kumulative konsentrasjoner av acetylkolin (10-10 til 10-4 M) til organ Chamber. Konsentrasjon-avhengige vasodilaterende reaksjoner av arterien segmenter presenteres som prosentandel av U46619-indusert kontraktile responser (figur 5).
Merk: for de fleste av eksperimentet, den neste konsentrasjonen av den avslappende Agonistiske bør tilsettes umiddelbart når et platå er observert for å hindre rebound i spenning. Konsentrasjon-avhengige vasodilaterende reaksjoner av arterien segmenter er normalisert som prosentandel av U46619-indusert kontraktile tiltak for å justere for mindre forskjeller i innervasjon og diameter mellom arterien segmenter (figur 5). Små variabilitet i respons mellom individuelle ringer innhentet fra samme blodkar blir minimal når en gruppe på seks eller flere eksperimenter analyseres statistisk. Når du uttrykker svar som en prosentandel av den enkelte vev egen maksimal sammentrekninger, er det som hensiktsmessig å bruke en sammenkoblet analyse (f. eks, sammenkoblet student t-test) for å sammenligne svar av samme type vev fra forskjellige dyr som å sammenligne reaksjoner av en enkelt vev før og etter en intervensjon. Når analysere virkningene av PVAT, to-veis ANOVA brukes etterfulgt av multiple-sammenligning test. - Etter å legge den endelige dosen av den avslappende Agonistiske, fjerne stoffet fra hvert kammer og refill med fersk Krebs buffer. Vask kammeret grundig med Krebs buffer og la arterien stabilisere i minst 45 min før du utfører noen ekstra eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Undersøkelse av lengde/spenning relasjoner for å oppnå normalisering faktor k
Mengden strekk som påføres et fartøy segment påvirker omfanget av utgangen-myosin interaksjon og dermed maksimal aktiv kraft utviklet. Således, for enhver type av blod fartøy, avgjør beløpet av strekke behøvde for maksimal aktiv Force er krevde for lated myography studier. Her er normalisering av lengde/spenning forholdet utføres for chrezbryzheechno arterier isolert fra musemodeller (figur 2). Arteriell segmenter ble suspendert i en fire-kammer wire myograph system (se tabell over materialer) på rustfritt stål pinner (40 μm diameter). Isometrisk spenning ble registrert ved hjelp av en analog-til-digital omformer koblet til en datamaskin med et opptaks program. Chambers inneholdt 5 mL Krebs buffer, holdt ved 37 ° c og luftet med 95% O2 og 5% co2 for å opprettholde pH på 7,4 gjennom hele eksperimentet. En passiv lengde/spenning forholdet ble etablert ved trinnvis strekking av arterien segmenter til den interne omkretsen tilsvarende 100 mmHg transmuralt trykk (IC100) ble innhentet. Etter hver strekning (blå piler), 115 mM KCl ble brukt for å stimulere sammentrekninger (grønne piler). De aktive kurvene for lengde/spenning (rød) ble plottet ved å trekke ut de aktive kraft dataene (trekke den passive kraften ved hver strekning fra den KCl-aktiverte styrken) på Y-aksen, og deretter ble en graf opprettet manuelt med KI-verdiene beregnet fra mikrometer data på X-aksen. En IC-verdi som ligger innenfor topp platået er IC1 (stiplede røde linjer). Normalisering faktor k ble beregnet som IC1/IC100 prosenter, som deretter kan brukes på prøver av samme fartøy type i det etterfølgende eksperimentet.
Presentasjon og beregning av konsentrasjon-respons kurver
De fleste konsentrasjon-respons kurver utføres på en kumulativ måte. En lav konsentrasjon av Agonistiske legges til badet (fortrinnsvis starter med en konsentrasjon under terskelen for respons). Når du har tillatt nok tid til et mulig svar (3-5 min.), legges den neste konsentrasjonen til. Når et svar er observert, er det tillatt å nå et platå før neste maksimal respons oppnås. Halv-log (gjennomsnittlig 3,16-fold) trinn i konsentrasjonen av fenylefrin brukes her for å studere Agonistiske-indusert sammentrekninger (Figur 3 og Figur 4).
I de fleste tilfeller, sammentrekning-respons kurver er ikke uttrykt som den rå verdier av spenning/kraft, men som en prosentandel av referanse responsen til KCl innhentet på det optimale punktet av lengden/spenning kurve av den enkelte blod fartøy segmentet. Dette justerer for variasjon i størrelse eller glatt muskel innholdet i blodkaret, samt korrigerer for remodeling endringer på grunn av aldring eller patologi. Her oppnås den maksimale sammentrekninger indusert av 115 mM KCl i begynnelsen av eksperimentet og brukes til å beregne fenylefrin sammentrekninger av chrezbryzheechno arterier med eller uten PVAT, i fravær eller tilstedeværelsen av L-NAME (Figur 3 og Figur 4).
Å studere agonister produserende avslapning, fartøyene er vanligvis kontrakt til et enhetlig nivå-rundt 50-80% av maksimal kontraktile respons av det vevet. Siden svarene på fenylefrin sammentrekninger er forskjellige fra de eksperimentelle gruppene, bruker den nåværende protokollen U46619 til å stimulere stabile sammentrekninger før de kumulative konsentrasjonene av acetylkolin. Den glatte muskel avslapning uttrykkes som en prosentandel av den første sammentrekning indusert av U46619 (figur 5).
Den konsentrasjon-respons kurver kan sammenlignes som tilstedeværelsen av en venstre eller høyre SKIFT (f. eks, mellom en kontroll kurve og en innhentet i nærvær av en motstander) ved å bestemme konsentrasjonene produsere like svar, for eksempel 30% eller 50% av Maksimal. Dette kalles EC30 og EC50, henholdsvis (figur 3b). Statistisk sammenligning av gjennomsnittet EC50 verdier bør utføres på logaritmen for sine verdier. Depresjon av kurver er undersøkt ved å sammenligne sine respektive maksimal respons (Emax) (figur 3b). I eksemplene vist, fenylefrin-indusert sammentrekninger i chrezbryzheechno arterier ble forsterket av L-NAME og konsentrasjon-respons kurvene viste en venstre SKIFT samt en høyde i maksimal sammentrekninger (figur 4b). Den acetylkolin-indusert relaxations i chrezbryzheechno arterier ble hemmet av L-NAME, og konsentrasjonen-respons kurven viste et høyre SKIFT samt reduksjon i maksimal relaxations (figur 5B).
Vaskulær svar på ulike farmakologiske midler kan beregnes som området-under-den-sammentrekning-kurve (AUCC) for sammentrekninger og areal-over-The-avslapping-kurve (AARC) for relaxations, henholdsvis ved hjelp av ikke-lineær logistikk regresjon analyse for sammenligning10 (figur 3C, figur 4c og figur 5c). Effekten av L-NAME kan sammenlignes med verdiene til AUCC/AARC for å fastslå nei-biotilgjengeligheten (figur 6). Den basale og stimulert utgivelsen av NO i chrezbryzheechno arterier med eller uten PVAT kan uttrykkes som forskjellene i konsentrasjon-respons kurver av fenylefrin-stimulert sammentrekning (DAUCC) og acetylkolin-indusert avslapping (DAARC), i nærvær eller fravær av L-NAME (figur 6a og figur 6b). I eksempelet vist, redusert tilstedeværelsen av PVAT NO biotilgjengelighet i chrezbryzheechno arterier samlet fra mus matet med høyt fett kosthold (figur 6C).
Figur 1: en skjematisk diagram av veggen struktur av arterier. Endothelial celler i tunika intima megle endotelet-avhengige avslapping/sammentrekning av vaskulære glatt muskel, mens signaler løslatt fra inflammasjon fettvev modulerer korset-forhandlingene mellom ulike lag av arterieveggen . Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representative spor som illustrerer et eksperiment for å bestemme den optimale innledende spenninger for mus chrezbryzheechno arterier. Blod fartøy segmenter ble utarbeidet fra chrezbryzheechno arterier samlet inn fra 16-ukers gamle mus matet med standard Chow (A) eller høy fett diett (B). Etter montering, den passive og aktive lengde/spenning kurvene ble innhentet av trinnvise strekk og sekvensiell stimulering med 115 mM KCl (venstre paneler). Den aktive sammentrekning som genereres med hver stimulering bør øke etter hvert som fartøyet gradvis strekkes, til det når et platå på den optimale lengden. Videre strekk vil føre til en nedgang i den aktive sammentrekning. Den IC100 og IC1 ble bestemt ved å plotte den passive og aktive lengde/spenninger kurver, henholdsvis (høyre panel). Legg merke til at den passive lengde/spenning kurven ble generert av normalisering Module etter manuelt legge inn mikrometer verdier, mens den aktive lengden/spenninger kurver tegnes manuelt etter beregning av spenning og KI-verdier på hvert trinn i KCl Stimulering. Den IC1/IC100 prosenter ble beregnet som normalisering k Factor (høyre panel). ). Merk også at bare de siste fire punktene i den aktive lengde/spenning kurve ble vist i tallene i panelet (B). STC: standard Chow matet mus arterien; HFD: høy-fett diett matet mus arterien. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: output innspillinger av vasokonstriktor svar på fenylefrin i chrezbryzheechno arterier med eller uten omkringliggende PVAT. Contractility studier utføres på preparater av chrezbryzheechno arterier fra 16-ukers-gamle Adipo-SIRT1 transgene mus, der den menneskelige SIRT1 er overexpressed selektivt i fettvev29. Kumulative konsentrasjoner av fenylefrin ble brukt for å stimulere sammentrekninger av chrezbryzheechno arterier uten (-PVAT) eller med (+ PVAT), (A). Kontraktile svar ble registrert og beregnet som prosentandel av 115 mM KCl-indusert maksimal sammentrekning (B). Området-under-den sammentrekning kurver (AUCC) ble plottet for sammenligning (C). Merk at PVAT fra Adipo-SIRT1 mus elicited en anti-kontraktile effekt på responsen til fenylefrin. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: output innspillinger av vasokonstriktor svar på fenylefrin i chrezbryzheechno arterier med eller uten de omkringliggende PVAT, og i fravær eller tilstedeværelsen av L-Name. Chrezbryzheechno arterier ble samlet inn fra 16-ukers-gamle Wild type mus matet med høyt fett kosthold. Tretti min etter å ha lagt til 10-4 M L-navn eller kjøretøy kontroll, kumulative konsentrasjoner av fenylefrin ble brukt for å stimulere sammentrekninger av chrezbryzheechno arterier (A). Kontraktile svar ble registrert og beregnet som prosentandel av 115 mM KCl-indusert maksimal sammentrekning (B). Området-under-den sammentrekning kurver (AUCC) ble plottet for sammenligning (C). Merk at PVAT fra kosten obese mus ikke framprovosere anti-kontraktile effekter på responsen til fenylefrin. – PVAT: arteriell ringer fremstilt uten PVAT; + PVAT: arteriell ringer tilberedt med de omkringliggende PVAT; -L-navn: arteriell ringer ikke inkubert med L-NAME; + L-navn: arteriell ringer inkubert med L-NAME. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: output innspillinger av vasodilator svar på acetylkolin i chrezbryzheechno arterier med eller uten de omkringliggende PVAT, og i fravær eller tilstedeværelsen av L-Name. Chrezbryzheechno arterier ble samlet inn fra 16-ukers-gamle mus matet med høy fett diett. Ved 30 min etter å ha lagt 10-4 M L-Name eller kjøretøy kontroll, blod fartøy segmenter med eller uten PVAT er pre-kontrakt med U46619 (1-3 x 10-8 M; Tabell av materialer), en thromboxane a2 reseptor Agonistiske, for å indusere stabile og vedvarende glatte muskelsammentrekninger. Kumulative konsentrasjoner av acetylkolin ble deretter brukt for å stimulere relaxations av chrezbryzheechno arterier med eller uten de omkringliggende PVAT (A). De avslapping responser ble registrert og beregnet som prosentandel av U46619-indusert sammentrekning (B). Området-over-avslapning kurvene (AARC) ble plottet for sammenligning (C). Merk at bare arteriell segmentet med omkringliggende PVAT vises i panel A. – PVAT: arteriell ringer fremstilt uten PVAT; + PVAT: arteriell ringer tilberedt med de omkringliggende PVAT; -L-navn: arteriell ringer ikke inkubert med L-NAME; + L-navn: arteriell ringer inkubert med L-NAME. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: illustrasjon av prosedyren for å beregne no biotilgjengelighet. Området-under-The-sammentrekning-kurver (AUCC) og området-over-The-avslapping-kurver (AARC) ble beregnet basert på responsen til kumulative konsentrasjoner av fenylefrin (A) og acetylkolin (B), henholdsvis. Forskjellene mellom forberedelsene pre-behandlet uten og med L-NAME ble definert som ∆ AUCC (A) og ∆ AARC (B) for å representere basal ingen bidrag og stimulert ingen utgivelse, henholdsvis. Følgelig ble ∆ AUCC (beregnet fra figur 4c), ∆ AARC (beregnet fra figur 5c), og summen av begge (total no biotilgjengelighet) ble PRESENTERT for sammenligning av no biotilgjengelighet i chrezbryzheechno arterier uten og med de omkringliggende PVAT (C). – PVAT: arteriell ringer fremstilt uten PVAT; + PVAT: arteriell ringer tilberedt med de omkringliggende PVAT; -L-navn: arteriell ringer ikke inkubert med L-NAME; + L-navn: arteriell ringer inkubert med L-NAME. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bortsett fra de endothelial cellene, signaler avledet fra PVAT spille en viktig rolle i regulering av glatt muskeltonus reaktivitet30. Sunn PVAT utgivelser nei og anti-inflammatorisk adiponectin å utøve en anti-kontraktile effekt på arterier, som er tapt under patologiske tilstander som fedme og Metabolsk syndrom31,32. I sykdomstilstander, PVAT bidrar til utvikling av endothelial dysfunksjon og andre kardiovaskulære unormalt33,34. Unormal eNOS uttrykk og funksjon har blitt rapportert i PVAT av arterier fra overvektige dyr35,36. Siden både endothelial og PVAT dysfunksjoner bidrar til utviklingen av hjerte-og metabolske forandringer23,37, når du utfører ex vivo vaskulær eksperiment, bør deres rolle vurderes ved å inkludere i eller fjerne dem fra forberedelsene.
Ledningen myography system skaffer en bekvem plattform å analysere det vasoactive signaler befridd fra PVAT benytter annerledes farmakologisk sonder10,38. Men komposisjoner i PVAT av ulike typer arterier, eller samme arterier fra dyr av ulik genetisk bakgrunn, er ikke samme39. Derfor bør wire myography resultater som involverer PVAT ikke sammenlignes på tvers av ulike typer arterier eller samme type arterier fra mus av forskjellige stammer. Alder og den underliggende sykdomstilstander også påvirke cellulære komposisjoner i PVAT. Her ble mus fra samme genetiske bakgrunn, men med forskjellige genetiske modifikasjoner i fettvevet, brukt til å sammenlikne vasomodulating aktivitet i PVAT.
Som en viktigste kilde til resistens mot blodstrøm, chrezbryzheechno arterier er valgt for den nåværende studien. Hvile spenningen bestemmer hvor mye vasomotorisk respons40. Den optimale innledende spenning av blodkaret er påvirket av den type arterie, alder, diett, behandling og genetisk bakgrunn av dyrene, og dermed bør fastsettes individuelt før undersøke avslapping/sammentrekning-respons kurver. For denne demonstrasjonen, den overlegne chrezbryzheechno arteriene ble samlet inn fra 16-ukers-gamle mus matet med standard Chow eller høy fett diett starter fra en alder av fire uker. Den nåværende protokollen understreker opprettelsen av optimale innstillinger for maksimal aktiv kraftproduksjon av arterie segmentene før man vurderer farmakologiske reaksjoner. Både passive og aktive lengde/spenning relasjoner er studert for chrezbryzheechno arterier samlet inn fra interne mus modeller. En normalisering k faktor på 1 er etablert for preparater fra 16-ukers-gamle dyr, som er forskjellig fra standardverdien av 0,9 eller de som brukes av tidligere publikasjoner41. Forsiktighet er nødvendig når man sammenligner normalisering prosenter i litteraturen på grunn av mulige forskjeller i teknikken, buffer sammensetning og instrument modeller, etc. Spesielt, alder, kosthold og andre patofysiologiske forhold påvirker passiv og aktiv spenning samt farmakodynamikk karakteristikker av arterier42.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfattere har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble økonomisk støtte av tilskudd fra Research Grant Council of Hong Kong [17124718 og 17121714], Hong Kong Health and Medical Research Fund [13142651 og 13142641], Collaborative Research Fund of Hong Kong [C7055-14G], og National Basic Forskningsprogrammet i Kina [973 program 2015CB553603].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) | Sigma-Aldrich | N5751 | Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M |
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 | Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α) | Enzo | BML-PG023-0001 | Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M |
| Multiwire myograph | Danish MyoTechnology (DMT) | 620M | |
| PowerLab 4/26 | ADInstruments | ML848 | |
| Labchart7 | ADInstruments | - | |
| Adipo-SIRT1 wild type mice | Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong | CULATR NO.: 4085-16 | |
| Silicon-coated Petri dishes | Danish MyoTechnology (DMT) | ||
| Tungsten wires | Danish MyoTechnology (DMT) | 300331 | |
| Surgical tools |
References
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
- Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
- Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
- Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
- Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
- Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153 (1997).
- Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
- Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
- Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
- Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
- Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
- Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
- Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
- Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
- Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
- Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3 (2018).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
- Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415 (2008).
- Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
- Gao, Y. -J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
- Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
- Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
- Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
- Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
- Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
- Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
- Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
- Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
- Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
- Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
- Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
- Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
- Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
- Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
- Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
- Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
- Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200 (2015).
- Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).
