Summary
O protocolo descreve o uso de miografia de arame para avaliar a tensão isométrica transmural de artérias mesentéricas isoladas de camundongos, com especial consideração da modulação por fatores liberados das células endoteliais e dos tecidos adiposos perivasculares.
Abstract
A responsividade do tônus vascular alterada aos estímulos fisiopatológicos contribui para o desenvolvimento de uma ampla gama de doenças cardiovasculares e metabólicas. A disfunção endotelial representa um grande culpado para a redução da vasodilatação e aumento da vasoconstrição das artérias. Tecidos adiposo (gordura) que cercam as artérias desempenham papéis importantes na regulação do relaxamento dependente do endotélio e/ou contração das células musculares lisas vasculares. As conversações cruzadas entre o endotélio e os tecidos adiposos perivasculares podem ser avaliadas ex vivo usando vasos sanguíneos montados por um sistema de miografia de arame. No entanto, devem ser estabelecidas definições ideais para as artérias derivadas de animais de diferentes espécies, idades, origens genéticas e/ou condições fisiopatológicas.
Introduction
As dilatações e constrições das artérias são alcançadas por relaxações e contrações, respectivamente, de suas células musculares lisas vasculares. As alterações na responsividade vascular das pequenas artérias contribuem para a regulação homeostática da pressão arterial por nervos autonômicos e hormônios presentes no sangue (por exemplo, catecolaminas, angiotensina II, serotonina, vasopressina). No nível local, as respostas vasculares das células musculares lisas são moduladas por sinais de ambas as células endoteliais da íntima e do tecido adiposo em torno das artérias (Figura 1).
O endotélio não é apenas uma barreira passiva, mas também serve como uma superfície para trocar sinais entre o sangue e as células musculares lisas vasculares subjacentes. Ao liberar várias substâncias vasoativas, o endotélio desempenha um papel crítico no controle local das respostas do tônus vascular1. Por exemplo, em resposta à acetilcolina, o óxido nítrico sintase endotelial (Enos) é ativado no endotélio para produzir óxido nítrico (no), o que induz o relaxamento do músculo liso vascular subjacente ativando a guanil ciclase solúvel (SGC) 2. outras substâncias vasoativas incluem os produtos de ciclooxigenases (por exemplo, prostaciclina e tromboxano a2), lipoxigenase (por exemplo, ácidos 12-hidroxieticosatetraenoico, 12-Hete) e monooxigenases do citocromo P450 (hetes e ácidos epoxyeicosatrienoic, Eets), espécies reativas do oxigênio (ROS), e peptídeos vasoativas (por exemplo, endothelin-1 e angiotensina II), e fatores hiperpolarizante derivados do endothelium (edhf)3. Um delicado equilíbrio entre vasodilatadores derivados do endotélio e vasoconstritores mantém o Tom vasomotores local4,5.
A disfunção endotelial caracteriza-se pelo comprometimento da vasodilatação endotélio-dependente6, uma marca registrada do envelhecimento vascular7. Com a idade, a capacidade do endotélio de promover vasodilatação é progressivamente reduzida, devido em grande parte à diminuição da biodisponibilidade do no, bem como à expressão e função anormais de eNOS no endotélio e no sGC nas células musculares lisas vasculares8 , 9 anos de , 10. a redução da BIODISPONIBILIDADE não potenciou a produção de vasoconstritores dependentes do endotélio11,12. Nas artérias envelhecidas, a disfunção endotelial provoca hiperplasia nos meios de comunicação, como refletido pelos aumentos acentuados da espessura da parede, número de núcleos medial, que lembram o espessamento arterial na hipertensão e aterosclerose observada em humanos pacientes13,14. Além disso, condições fisiopatológicas como obesidade, diabetes ou hipertensão aceleram o desenvolvimento da disfunção endotelial15,16.
O tecido adiposo perivascular (PVAT) libera numerosas adipocinas para regular a estrutura vascular e a função17. O efeito anticontrátil do pvat é mediado por fatores relaxantes, como a adiponectina, não, o peróxido de hidrogênio e o sulfeto de hidrogênio18,19,20. No entanto, dependendo da localização e da condição fisiopatológica, o PVAT também pode aprimorar as respostas contráctil em várias artérias21. As substâncias pró-contrátil produzidas pelo pvat incluem a angiotensina II, a leptina, a resistina e as Ros22,23. Na maioria dos estudos sobre vasos sanguíneos isolados, o PVAT tem sido considerado como um simples suporte estrutural para a vasculatura e, assim, removido durante a preparação dos segmentos de anel de vasos sanguíneos. Uma vez que a disfunção adiposa representa um fator de risco independente para hipertensão e complicações cardiovasculares associadas24, o pvat em torno dos vasos sanguíneos deve ser considerado ao investigar a responsividade vascular de diferentes artérias.
Os sistemas de múltiplos fios miográficos têm sido amplamente utilizados para investigar as funções vasomotoras de uma variedade de vasos sanguíneos, incluindo as artérias aorta, mesentérica, renal, femoral, cerebral e coronária25,26. Os protocolos aqui descritos utilizarão a miografia de arame para avaliar a responsividade vascular em artérias mesentéricas isoladas de modelos de camundongo geneticamente modificados, com foco especial na modulação por PVAT.
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Protocol
Todos os animais utilizados para o estudo a seguir foram fornecidos pela unidade de laboratório de animais da faculdade de medicina da Universidade de Hong Kong. A aprovação ética foi obtida do Comitê departamental de uso de animais de laboratório para ensino e pesquisa (CULATR, no.: 4085-16).
1. os preparativos
- Preparação de fármacos
- Armazene os medicamentos apropriadamente conforme indicado na ficha de dados de segurança de material (MSDS) imediatamente após recebê-los. Dissolver as drogas em pó em forma de solventes como soluções de alta concentração de ações e, em seguida, alíquota para armazenamento a-20 ° c.
Nota: a maioria das drogas são dissolvidas em água destilada para preparar as soluções de ações; aquecimento ou sonication pode ser necessário para algumas drogas. Se as drogas não se dissolverem completamente na água, uma gota de NaOH de 1 M pode ser adicionada, quando para drogas básicas uma gota do HCl de 1 M puder ser usada. As drogas hidrofóbicas podem ser dissolvidas em dimetilsulfóxido (DMSO) ou etanol absoluto. Nos últimos casos, a concentração final do banho (em M) deve ser sabida e os controles apropriados devem ser executados para governar para fora os efeitos dos solventes. - Antes do experimento, dissolva as alíquotas de medicamentos (tabela de materiais) na solução de bicarbonato de Krebs-Ringer (Krebs) contendo 115 mm de nacl, 4,6 mm kcl, 2,5 mm CAcl2, 1,17 mm mgso4, 1,17 mm KH2po4, 25 mm NaHCO3, 11,1 mm D-glicose e 0, 1 mm EDTA, pH 7,4.
- Para as curvas de concentração-resposta acumuladas, prepare as ações e soluções de trabalho de diferentes fármacos por diluições seriais (tabela 1).
- Armazene os medicamentos apropriadamente conforme indicado na ficha de dados de segurança de material (MSDS) imediatamente após recebê-los. Dissolver as drogas em pó em forma de solventes como soluções de alta concentração de ações e, em seguida, alíquota para armazenamento a-20 ° c.
- Configurando o instrumento
- Calibrar o transdutor de força para todos os canais antes de usar o sistema miográfico em cada dia, ou cada vez que o sistema foi movido.
Nota: o procedimento de calibração detalhado varia consoante o modelo. Em geral, um peso de dois gramas é aplicado às mandíbulas e a força correspondente deve 9,81 ± 0,1 mN. Se a leitura estiver desligada por mais de 0,1 mN, o transdutor deve ser re-calibrado. Para o sistema utilizado no presente protocolo (ver a tabela de materiais) os valores operacionais para o transdutor de força durante a calibração devem estar entre 3000 e 3500. Se o valor do transdutor for maior ou menor, o transdutor de força deve ser substituído. - Ajuste e alinhe os suportes de montagem em cada câmara. O uso contínuo e repetido da câmara do miógrafo pode causar algum desalinhamento do apoio da montagem, que precisa o ajuste ocasional antes dos experimentos para assegurar-se de que as maxilas estejam alinhadas corretamente.
Nota: é necessária uma atenção especial ao ajustar os suportes de montagem, pois os transdutores de força são muito sensíveis e frágeis. - Ligue os aquecedores e o gás (95% O2 e 5% co2) pelo menos 30 minutos antes do experimento para permitir que as câmaras e os amortecedores sejam aquecidos até 37 ± 0,1 ° c e equilibrados com a mistura de gás.
- Verifique a temperatura do termómetro para garantir a exactidão do aquecedor. A temperatura pode ser modificada para executar experimentos de resfriamento ou aquecimento. Se a temperatura não estiver correcta como definido, aplique a função offset da máquina para aumentar ou diminuir as definições para atingir a temperatura desejada.
- No final do experimento, limpe todas as câmaras e desligue o aquecedor, bem como o gás que corre para a instalação.
- Não desligue o gás antes de todo o líquido na câmara ter sido sugado para fora do sistema, caso contrário, o ácido/água destilada pode regurgitar e chegar ao órgão-câmara durante a próxima utilização.
- Para limpar as câmaras do myograph do fio, a maneira a mais eficaz é executar o ácido-lavagem usando uma solução diluída do ácido acético. Limpe a borda e o interior das câmaras com um cotonete de algodão.
- Após a lavagem, enxague cuidadosamente as câmaras com água destilada. Limpe o exterior das câmaras com um pano molhado para remover o sal seco. O etanol também pode ser usado se drogas hidrofóbicas tiverem sido usadas durante o experimento.
- Um exemplo do procedimento de lavagem é o seguinte. Encha as câmaras com uma solução de ácido acético a 8% e incubar durante 2 min. Use um aplicador com ponta de algodão para limpar mecanicamente a superfície da câmara de aço. Evite qualquer contato com a parte de alumínio do miografo.
- Aspirar o ácido acético e lavar a câmara miográfica e suporta várias vezes com água destilada e secar as superfícies usando papel absorvente ou aplicadores de ponta de algodão.
- Calibrar o transdutor de força para todos os canais antes de usar o sistema miográfico em cada dia, ou cada vez que o sistema foi movido.
- Dissecção dos anéis arteriais mesentéricos
Nota: os animais utilizados para o estudo atual foram dieta de alto teor de gordura alimentados com camundongos Adipo-SIRT1 masculinos e littermates tipo selvagem como controles. Cada animal pesava aproximadamente 45 g no momento dos experimentos.- Eutanizar o rato por injeção intraperitoneal de pentobarbital sódico (50 mg/kg).
- Com tesouras cirúrgicas e fórceps, realize uma laparotomia mid-line para revelar os índices abdominais.
- Colete a arcada mesentérica em um prato de Petri revestido de silício.
- Espalhe e fixe a rede mesentérica na placa de Petri para revelar a ramificação do mesenteria e da malha do tecido conjuntivo.
- um microscópio (10x), e com multa-tesouras e fórceps, dissecam com cuidado os tecidos conexivos circunvizinhos. Evite danificar a camada adventícia. Alternativamente, o tecido adiposo circundante pode ser mantido ao redor do vaso sanguíneo para experimento (se necessário).
- Usando as tesouras finas e fórceps, extirpar os ramos secundários das artérias mesentéricas no gelo-frio Krebs tampão.
Nota: cada pesquisador deve ter seu próprio conjunto de kit de dissecção, cordas e estribos. Estas ferramentas devem ser mantidas corretamente e limpas-up cada vez após o experimento como algumas drogas são difíceis de lavar afastado e resíduos podem furar a eles.- Mantenha os vasos sanguíneos no tampão frio de Krebs ao separar os tecidos conexivos circunvizinhos, incluindo PVAT. Durante o manuseio do vaso sanguíneo, seja gentil para evitar danos desnecessários ao endotélio.
- Se o experimento envolver o estudo do PVAT, mantenha uma esfera de 1,5 a 2 mm de diâmetro do PVAT ao redor do vaso sanguíneo. Alternativamente, as mesmas quantidades de tecidos adiposos podem ser adicionadas em cada câmara para o experimento.
- Opcional Retire o endotélio do vaso sanguíneo dissecado como controle para avaliar a dependência do endotélio das respostas. Para as artérias mesentéricas, retire o endotélio suavemente rolando-o sobre um estribo de arame ou um cabelo.
- Corte o vaso sanguíneo preparado como acima em pequenos anéis (~ 2 mm de comprimento) e colocá-los em um prato de plástico cheio de aerado (95% O2 e 5% co2) Krebs buffer para posterior montagem nas câmaras de um fio miografo27.
- Transfira os anéis da embarcação em uma câmara do miógrafo coloc o microscópio. Os anéis devem ser coloc uniformente, com os estribos superiores e mais baixos paralelos. O fio de fixação (40 μm) deve ser recém-preparado, pois as drogas podem se vincular às cordas.
- Rosqueie o anel do vaso sanguíneo em um comprimento apropriado (2 cm) do fio e fixe-o a uma maxila da câmara de montagem parafusando para fixar a posição.
- Passe um segundo fio através do anel e escora para a mandíbula oposta.
- Com os anéis rosqueados e fixados às maxilas da câmara, monte a câmara na instalação do miógrafo e gire o parafuso do micrômetro no sentido horário para mover os fios perto de se até que a leitura da força na relação de usuário que corresponde à câmara montada seja zero ou apenas Abaixo.
Nota: o fio anexado à mandíbula superior deve ser de comprimento mínimo para garantir que a tensão pode ser totalmente transada para o detector. - Equilibrar as preparações a 37 ° c durante pelo menos 30 minutos antes da primeira aplicação da força utilizando o micrômetro regulável.
- Avaliar a viabilidade tecidual em 115 mM de potássio elevado (NaCl substituído por KCl em uma base molar) Krebs contendo 4,6 mm NaCl, 115 mm KCl, 2,5 mm cacl2, 1,17 mM MGSO4, 1,17 mm KH2po4, 25 mm NaHCO3 e 11,1 mM D-glicose a pH 7,4.
Nota: vasos isolados são considerados viáveis se a força contrátil transposta e registrada como deflexão acima da linha de base no software de registro de dados do sistema miográfico for superior a 40% do seu tom de repouso, em resposta a um agente contrátil. Se a artéria não contrair apropriadamente, então a pressão basal óptima da tensão/parede não foi ajustada corretamente ou a artéria pode ter sido danificada durante a isolação ou a montagem da embarcação. - Opcional Avalie a integridade das células endoteliais aplicando a fenilefrina para induzir a contração do vaso a 50% da resposta inicial à KCl (conforme registrado pelo transdutor de força no software de gravação de dados), seguido pela adição de 1 μM de acetilcolina.
Nota: uma boa preparação dos vasos sanguíneos é crucial para obter resultados consistentes e precisos. Uma preparação não deve ser utilizada para o experimento, quer se o teste de integridade endotelial for insatisfatório ou não responde à KCl, indicando que a função endotelial ou a contratilidade vascular do músculo liso, respectivamente, não são satisfatórias. Neste caso, a preparação deve ser substituída por um novo anel do mesmo vaso sanguíneo ou um novo vaso sanguíneo.
2. normalização para determinar a tensão inicial ideal
Nota: o procedimento de normalização permite a determinação do diâmetro interno ideal (IC) das artérias em que o vaso sanguíneo experimenta uma pressão transmural de repouso adequada (100 mmHg ou 13,3 kPa para as artérias mesentéricas) e produz o máximo ativo forças em resposta a agentes vasoativos.
- Ligue o computador e abra o software de gravação de dados (consulte a tabela de materiais).
- Salve o experimento como um "arquivo de dados LabChart" com um novo nome para evitar sobrescrever o arquivo de configuração original.
- Abra a janela de configurações de normalização e defina o fator k como 1. Aceite os valores padrão para a calibração ocular (0,3, se o comprimento do vaso for desconhecido, ou 1 se o comprimento do vaso for conhecido), pressão alvo (13,3), tempo de média online (2) e tempo de atraso (60). Clique em OK para salvar as configurações.
- Selecione canais de interesse e insira o diâmetro do fio (40 μm), pontos de extremidade do tecido (a1:0; a2: comprimento do tecido conforme medido), leitura do micrômetro inicial na janela de normalização.
- Inicie o procedimento de normalização aplicando o primeiro estiramento passivo ao vaso sanguíneo (gire o parafuso do micrômetro no sentido anti-horário).
- Aguarde até que a embarcação se estabilize (3 min) e insira a nova leitura do micrômetro na janela de normalização. A tensão da parede é automaticamente calculada e mostrada como um ponto no gráfico.
Nota: o micrômetro "passos" usado durante o trecho passivo não precisa ser o mesmo. Os primeiros trechos podem ser de 20 μm cada. À medida que os trechos se aproximam da linha Isobar, as etapas podem ser reduzidas para 10 μm, 5 μm, 2 μm ou até menores. Tenha a janela principal do gráfico aberta enquanto ajusta as configurações do micrômetro — se um grande pico que excede a linha Isobar em um gráfico de comprimento/tensão (que indica pontos de pressão correspondentes a um valor pré-determinado) aparecer, reduza a tensão. - Após cada estiramento passivo, substitua o controle Krebs por um Krebs de alto potássio ISO-osmótico contendo 115 mM de KCl. Quando a contração atinge um planalto (cerca de 3 min), registre a força ativa (F) subtraindo a força passiva em cada trecho da força ativada por potássio. Calcule a tensão da parede assim como os valores da circunferência interna (CI).
- Medir a tensão ativa como a deflexão acima da linha de base. A tensão ativa (T) é calculada com base na equação F (mN) = T (mN/mm) x 2 x comprimento do vaso (mm). Os valores da circunferência interna (IC) são calculados a partir dos dados do micrômetro (IC = 205,6 μm + 2 x "Gap").
- Remova a condição elevada do potássio substituindo com Krebs frescos. Repita a lavagem por três vezes mais de 5 min.
- Repita os passos 2,5 a 2,8 (induzindo trechos passivos seguidos de contração ativa em turnos alternados) até que a tensão ativa comece a diminuir (Figura 2).
- Após múltiplas rodadas de trechos alternativos, as curvas de comprimento/tensão passiva dão o valor de IC100, a circunferência interna do vaso em uma pressão transmural de 100 mmHg, como o ponto de cruzamento com a linha Isobar.
Nota: cada valor do micrômetro durante os trechos passivos é introduzido manualmente no módulo de normalizaçãode software. O programa registra automaticamente a medida de força correspondente para gerar a curva de comprimento/tensão passiva, que dá o valor de IC100 como o ponto de cruzamento com a linha Isobar (Figura 2, painéis direito). Quanto mais próximo o último ponto é a linha Isobar, mas logo acima da melhor normalização é sem danificar os vasos. Um ponto muito acima da linha Isobar pode danificar fisicamente a embarcação montada, causando resultados não confiáveis durante o experimento. - Crie as curvas de comprimento/tensão ativas para determinar os valores de IC1 e calcule o fator de normalização k como a proporção de IC1/IC100, que será usada para este tipo de vaso sanguíneo em experimentos de miografia subsequentes.
Nota: as curvas de comprimento/tensão ativas são criadas traçando os valores de IC calculados a partir dos dados do micrômetro no eixo x e tensões ativas no eixo y. O IC1 é o valor deitado dentro da região de pico do Planalto (traços vermelhos na Figura 2, painéis direito). Depois de plotar as curvas de comprimento/tensão ativas e determinar IC1, o fator de normalização k é calculado como a proporção de IC1/IC100. Com base no fator de normalização k , o IC ideal para a linha de base, denotado como IC1, mostrará na curva de comprimento/tensão passiva. O ajuste do micrômetro para este IC aparece a curva e deve ser usado para ajustar o manual para experiências subseqüentes do miografia. A tensão inicial (T) é igual à pressão alvo (PI) x IC/2 π e a força ideal (F) aplicada à embarcação é igual a T x 2 x comprimento do vaso. - Lave completamente para fora os Krebs elevados do potássio e equilibram os preparativos para outro 30 a 45 min. redefinir as tensões basais para "zero" para que apenas as respostas contrátil ativo será gravado durante o experimento subseqüente.
3. contrações induzidas por fenilefrina
Nota: medicamentos que podem ser selecionados para induzir as respostas vasoconstritoras incluem a norepinefrina agonista inespecífica do adrenoceptores, a fenilefrina agonista α-1 adrenoceptora seletiva, a hormona peptídica angiotensina II e a monoamina neurotransmissor 5-hydroxytryptamine. A fenilefrina é utilizada no presente protocolo para exame (tabela de materiais).
- Prepare e monte anéis arteriais emparelhados como descrito na seção 1,3, um com PVAT intacto e outro com PVAT removido, das seções adjacentes de cada artéria para o experimento.
- Após a normalização (descrita na seção 2), pré-contrate os segmentos arteriais com tampão elevado de Krebs do potássio adicionando a solução de 115 milímetros KCl à câmara que contem Krebs.
- Espere a contração ao platô (3 minutos), lave para fora o potássio elevado e substitua-o com o amortecedor aerado fresco de Krebs. Repita a lavagem três vezes ao longo de 5 min.
- Repita a estimulação de KCl e lavando três vezes e registre a resposta/tensão contrátil máxima ao KCl subtraindo a tensão da linha de base da tensão devido à estimulação de KCl.
- Após a última contração e lavagem, reabasteça a câmara com o amortecedor Krebs morno, ventilado e permita que a artéria recupere por aproximadamente 30 minutos antes de executar a tarefa seguinte.
- Para cada câmara, adicione quantidades cumulativas de fenilefrina (incrementos de meio log de 10- 10 a 10-4 M) para induzir os aumentos dependentes da concentração na tensão isométrica das preparações quiescentes.
- Comece adicionando uma baixa concentração do agonista à câmara. Depois de permitir tempo suficiente para uma contração estável (3 – 5 min), adicione a próxima concentração. Repita as etapas com concentrações crescentes de phenylefrina.
- Depois de adicionar a última dose de agonista (Fenilefrina), lave a droga completamente e encher a câmara com tampão Krebs fresco. Traçar as respostas dependentes da concentração como porcentagens crescentes das contrações máximas induzidas por KCl (Figura 3).
- Opcional Para avaliar a contribuição do NO, incubar as preparações com o inibidor de NO sintase, L-NAME (10-4 M), por 30 min antes da adição de fenilefrina. O L-NAME aprimora as contrações induzidas por fenilefrina nas preparações quiescentes das artérias mesentéricas (Figura 4).
Nota: os inibidores ou antagonistas devem ter tempo suficiente para atingir a equilibração, geralmente 30 – 45 min (ser consistente para qualquer conjunto de experimentos). - Para executar uma segunda curva de concentração-resposta sequencialmente, lave a câmara completamente e repetidamente para remover todos os agonistas precedentes, até que nenhuma mudança mais adicional no Tom esteja observada.
Nota: a experimentação paralela expõe pelo menos dois anéis obtidos do mesmo vaso sanguíneo para o agonista, um condições de controle e um na presença do (s) inibidor (es); em cada anel, a curva de concentração-resposta será realizada apenas uma vez. É preferível realizar experimentos paralelos, uma vez que isso proporciona um melhor controle para a ação da droga e a sensibilidade dos vasos sanguíneos. Experimentos seriais obtêm uma curva de concentração-resposta a um agonista em um único anel; lavá-lo, alterando as condições experimentais (por exemplo, adicionando um inibidor) e, em seguida, repetindo a curva de resposta de concentração no mesmo anel. Neste caso, os controles de tempo são necessários para mostrar que as respostas da droga não são devidas a alterações do tecido ao longo do tempo. Nunca se pode ter certeza de que o tecido está exatamente no mesmo estado após a exposição a um experimento de concentração-resposta. Tempo suficiente (pelo menos 30 – 60 min) deve ser dado para permitir que os segmentos do navio para retornar à sua tensão de repouso (basal), embora em algum caso, isso pode não ocorrer imediatamente após a dissociação do agonista de alta afinidade dos receptores. Além disso, os Krebs de alto potássio podem ser aplicados entre as curvas de concentração-resposta acumuladas para reduzir a dessensibilização28. Lembre-se que a maioria dos antagonistas não pode ser lavado completamente, assim, manter a adicioná-lo para o resto do experimento.
4. relaxações/contrações dependentes do endotélio
- Pré-contrate um segmento arterial recém-montado (conforme descrito nas etapas 3,2 a 3,5). Mais uma vez, registre a resposta/tensão contrátil máxima ao KCl subtraindo a tensão da linha de base da tensão devido à estimulação de KCl.
- Opcional Incubar as preparações com o inibidor de NO sintase, L-NAME (10-4 M), por 30 min antes da adição de U46619.
- Acrescente as concentrações pré-calculadas de U46619 à câmara e permita uma contração estável e sustentada dos segmentos arteriais.
Nota: as respostas vasodilatadoras são induzidas em artérias mesentéricas pré-contratadas para cerca de 80% das respostas máximas a 115 mM KCl. os agonistas diferentes podem ser usados para induzir a contração pela ativação de seus receptores específicos. Aqui, os segmentos de vasos sanguíneos com ou sem PVAT são pré-contratados com U46619 (1 – 3 x 10-8 M; Tabela de materiais), um agonista do receptor do tromboxano a2, para induzir as contrações estáveis e sustentadas do músculo liso. - Adicionar concentrações cumulativas de acetilcolina (10- 10 a 10-4 M) para a câmara de órgãos. As respostas vasodilatadoras dependentes da concentração dos segmentos arteriais são apresentadas como porcentagem de respostas contrátil induzidas por U46619 (Figura 5).
Nota: para a maior parte do experimento, a próxima concentração do agonista relaxante deve ser adicionada imediatamente quando um planalto é observado para evitar a repercussão na tensão. As respostas vasodilatadoras dependentes da concentração dos segmentos arteriais são normalizadas como percentual de respostas contrátil induzidas por U46619 para ajustar para pequenas diferenças na inervação e diâmetro entre os segmentos arteriais (Figura 5). Pequenas variabilidades na responsividade entre os anéis individuais obtidos a partir do mesmo vaso sanguíneo tornam-se mínimas quando um grupo de seis ou mais experimentos são analisados estatisticamente. Ao expressar as respostas como uma porcentagem das contrações máximas do próprio tecido individual, é adequado usar uma análise pareada (por exemplo, teste t de Student pareado) para comparar as respostas do mesmo tipo de tecidos de diferentes animais para comparar respostas de um único tecido antes e depois de uma intervenção. Ao analisar os efeitos do PVAT, a ANOVA bidirecional é usada seguida pelo teste de múltiplas comparações. - Depois de adicionar a dose final do agonista relaxante, retire a droga de cada câmara e reabasteça com o tampão Krebs fresco. Lave a câmara cuidadosamente com o tampão Krebs e deixe a artéria estabilizar por pelo menos 45 min antes de realizar quaisquer experimentos adicionais.
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Representative Results
Exame das relações comprimento/tensão para obtenção do fator de normalização k
A quantidade de estiramento aplicada a um segmento do vaso influencia a extensão da interação da actina-miosina e, consequentemente, a força ativa máxima desenvolvida. Assim, para cada tipo de vaso sanguíneo, é necessário determinar a quantidade de estiramento necessária para a força ativa máxima para estudos de miografia adequada. Aqui, a normalização da relação comprimento/tensão é realizada para as artérias mesentéricas isoladas de modelos de camundongo (Figura 2). Os segmentos arteriais foram suspensos em um sistema de miógrafo de arame de quatro câmaras (ver tabela de materiais) em pinos de aço inoxidável (40 μm de diâmetro). A tensão isométrica foi registrada usando um conversor analógico-digital conectado a um computador com um programa de gravação. As câmaras continham 5 mL de tampão de Krebs, mantidos a 37 ° c e Aerados com 95% O2 e 5% co2 para manter o pH em 7,4 durante todo o experimento. Um relacionamento passivo do comprimento/tensão foi estabelecido pelo esticão incremental dos segmentos da artéria até que a circunferência interna que corresponde à pressão transmural de 100 mmHg (IC100) estêve obtida. Após cada trecho (setas azuis), 115 mM KCl foi aplicado para estimular as contrações (setas verdes). As curvas de comprimento/tensão ativas (vermelho) foram plotadas extraindo os dados da força ativa (subtraindo a força passiva em cada trecho da força ativada pelo KCl) no eixo Y e, em seguida, um gráfico foi criado manualmente com os valores de IC calculados a partir do micrômetro dados no eixo X. Um valor do CI que encontra-se dentro do platô máximo é IC1 (linhas vermelhas tracejadas). O fator de normalização k foi calculado como proporções de IC1/IC100, o que poderia ser aplicado a amostras do mesmo tipo de vaso no experimento subsequente.
Apresentação e cálculo das curvas de concentração-resposta
A maioria das curvas de concentração-resposta são executadas de forma cumulativa. Uma baixa concentração do agonista é adicionada ao banho (preferencialmente começando com uma concentração abaixo do limiar para a resposta). Depois de permitir tempo suficiente para uma possível resposta (3-5 min), a próxima concentração é adicionada. Quando uma resposta é observada, é permitido alcançar um platô antes que a próxima resposta máxima seja obtida. Os incrementos de Half-log (média de 3,16 vezes) na concentração de fenilefrina são aplicados aqui para estudar contrações induzidas pelo agonista (Figura 3 e Figura 4).
Na maioria dos casos, as curvas de contração-resposta não são expressas como os valores brutos de tensão/força, mas como uma porcentagem da resposta de referência à KCl obtida no ponto ideal da curva de comprimento/tensão do segmento de vasos sanguíneos individuais. Isto ajusta para a variabilidade no tamanho ou no índice do músculo liso do vaso sanguíneo assim como corrige para remodelar mudanças devido ao envelhecimento ou à patologia. Aqui, as contrações máximas induzidas por KCl de 115 mM são obtidas no início do experimento e utilizadas para o cálculo de contrações estimuladas por fenilefrina de artérias mesentéricas com ou sem PVAT, na ausência ou presença de L-NAME (Figura 3 e Figura 4).
Para estudar agonistas produzindo relaxamento, os vasos são geralmente contratados para um nível uniforme — cerca de 50-80% da resposta contrátil máxima desse tecido. Desde que as respostas às contrações phenylefrina-induzidas são diferentes entre os grupos experimentais, o protocolo atual usa U46619 para estimular contrações estáveis antes de aplicar as concentrações cumulativas de acetilcolina. O relaxamento do músculo liso é expresso como uma porcentagem da contração inicial induzida por U46619 (Figura 5).
As curvas de concentração-resposta podem ser comparadas como a presença de um turno de esquerda ou de direita (por exemplo, entre uma curva de controle e uma obtida na presença de um antagonista), determinando as concentrações produzindo respostas iguais, por exemplo, 30% ou 50% do Máximo. Estes são denominados EC30 e EC50, respectivamente (Figura 3B). A comparação estatística dos valores médios da EC50 deve ser realizada no logaritmo de seus valores. A depressão das curvas é examinada comparando suas respectivas respostas máximas (Emax) (Figura 3B). Nos exemplos mostrados, as contrações induzidas por fenilefrina nas artérias mesentéricas foram aprimoradas pelo L-NAME e as curvas de concentração-resposta mostraram uma mudança de esquerda, bem como uma elevação nas contrações máximas (Figura 4B). Os relaxamentos acetilcholine-induzidos em artérias mesentérica foram inibidos pelo L-nome, e a curva da concentração-resposta mostrou um deslocamento rightward assim como a redução nos relaxamentos máximos (Figura 5b).
As respostas vasculares a diversos agentes farmacológicos podem ser computadas como a área-sob--contração-curva (AUCC) para contrações e área-acima---relaxamento-curva (AARC) para relaxations, respectivamente, usando a regressão logística não-linear análise para comparação10 (figura3C, figura 4C e Figura 5C). O efeito do L-NAME pode ser comparado pelos valores do AUCC/AARC para determinar a biodisponibilidade do NO (Figura 6). A liberação basal e estimulada do no nas artérias mesentéricas com ou sem PVAT pode ser expressa como as diferenças nas curvas de concentração-resposta da contração estimulada por fenilefrina (DAUCC) e relaxamento induzido pela acetilcolina (DAARC), respectivamente, na presença ou ausência de L-NAME (Figura 6a e Figura 6B). No exemplo mostrado, a presença de PVAT reduziu a biodisponibilidade no nas artérias mesentéricas coletadas de camundongos alimentados com dieta de alto teor de gordura (Figura 6C).
Figura 1: diagrama esquemático da estrutura da parede das artérias. As células endoteliais na túnica íntima mediam o relaxamento/contração dependente do endotélio do músculo liso vascular, enquanto os sinais liberados do tecido adiposo perivascular modulam as conversações cruzadas entre diferentes camadas da parede arterial . Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: traços representativos ilustrando um experimento para determinar as tensões iniciais ideais para as artérias mesentéricas do camundongo. Os segmentos de vasos sanguíneos foram preparados a partir de artérias mesentéricas coletadas dos camundongos de 16 semanas de idade alimentados com ração padrão (a) ou dieta de alto teor de gordura (B). Após a montagem, as curvas de comprimento/tensão passiva e ativa foram obtidas por alongamento passo-sábio e estimulação sequencial com 115 mM KCl (painéis esquerdos). A contração ativa gerada com cada estimulação deve aumentar à medida que o vaso é progressivamente esticado, até atingir um planalto com o comprimento ideal. O estiramento mais adicional conduzirá a uma diminuição na contração ativa. Os IC100 e IC1 foram determinados traçando as curvas de comprimento/tensões passiva e ativa, respectivamente (painéis direito). Observe que a curva de comprimento/tensão passiva foi gerada pelo módulo de normalização após a colocação manual dos valores do micrômetro, enquanto as curvas de comprimento/tensões ativas plotadas manualmente após o cálculo da tensão e dos valores de IC em cada etapa da KCl Estimulação. As relações IC1/IC100 foram calculadas como fator de normalização k (painéis direito). ). Note-se também que apenas os últimos quatro pontos da curva de comprimento/tensão ativa foram mostrados nas figuras no painel (B). STC: ração padrão alimentados com a artéria do rato; HFD: dieta high-fat alimentou a artéria do rato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: gravações de saída das respostas vasoconstritoras à fenilefrina em artérias mesentéricas com ou sem PVAT circundante. Estudos de contratilidade são realizados em preparações de artérias mesentéricas de camundongos transgênicos Adipo-SIRT1 de 16 semanas de idade, nos quais o SIRT1 humano é superexpresso seletivamente em tecidos adiposos29. As concentrações cumulativas de fenilefrina foram aplicadas para estimular as contrações das artérias mesentéricas sem (-PVAT) ou com (+ PVAT), (a). As respostas contráctil foram registradas e calculadas como percentual de 115 mM de contração máxima induzida por KCl (B). As curvas de área a contração (AUCC) foram plotadas para comparação (C). Note-se que o PVAT de camundongos Adipo-SIRT1 provocou um efeito anticontrátil na resposta à fenilefrina. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: gravações de saída das respostas vasoconstritoras à fenilefrina em artérias mesentéricas com ou sem o PVAT circundante, e na ausência ou presença de L-Name. As artérias mesenteric foram coletadas dos ratos selvagens do tipo 16 week-old alimentados com a dieta gorda elevada. Trinta minutos após a adição de 10-4 M L-Name ou controle do veículo, foram aplicadas concentrações cumulativas de fenilefrina para estimular as contrações das artérias mesentéricas (a). As respostas contráctil foram registradas e calculadas como percentual de 115 mM de contração máxima induzida por KCl (B). As curvas de área a contração (AUCC) foram plotadas para comparação (C). Observe que o PVAT de camundongos obesos dietéticos não provocou efeitos anticontrátil na resposta à fenilefrina. – PVAT: anéis arteriais preparados sem PVAT; + PVAT: anéis arteriais preparados com o PVAT circundante; -L-nome: anéis arteriais não incubados com L-NAME; + L-nome: anéis arteriais incubados com L-NAME. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: gravações de saída das respostas vasodilatadoras à acetilcolina em artérias mesentéricas com ou sem o PVAT circunvizinho, e na ausência ou na presença de L-Name. As artérias mesenteric foram coletadas dos ratos 16 week-old alimentados com a dieta gorda elevada. Aos 30 min após a adição de 10-4 M L-Name ou controle do veículo, os segmentos de vasos sanguíneos com ou sem pvat são pré-contratados com U46619 (1-3 x 10-8 M; Tabela de materiais), um agonista do receptor do tromboxano a2, para induzir as contrações estáveis e sustentadas do músculo liso. As concentrações cumulativas de acetilcolina foram então aplicadas para estimular as relaxações das artérias mesentéricas com ou sem o PVAT circundante (a). As respostas de relaxamento foram registradas e calculadas como percentual de contração induzida por U46619 (B). A área-acima-as curvas de relaxamento (AARC) foram plotadas para comparação (c). Note-se que apenas o segmento arterial com PVAT circundante é mostrado no painel A. – PVAT: anéis arteriais preparados sem PVAT; + PVAT: anéis arteriais preparados com o PVAT circundante; -L-nome: anéis arteriais não incubados com L-NAME; + L-nome: anéis arteriais incubados com L-NAME. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: ilustração do procedimento para calcular a biodisponibilidade. As curvas de área a contração (AUCC) e as curvas de área acima do relaxamento (AARC) foram calculadas com base nas respostas às concentrações cumulativas de fenilefrina (a) e acetilcolina (B), respectivamente. As diferenças entre preparações pré-tratadas sem e com L-NAME foram definidas como ∆ AUCC (a) e ∆ Aarc (B) para representar a contribuição basal no e não estimulou a liberação, respectivamente. Assim, o ∆ AUCC (calculado a partir da Figura 4C), ∆ aarc (calculado a partir da Figura 5C), e a soma de ambos (biodisponibilidade total no) foram apresentados para comparar a biodisponibilidade de no em artérias mesentéricas sem e com o entorno PVAT (C). – PVAT: anéis arteriais preparados sem PVAT; + PVAT: anéis arteriais preparados com o PVAT circundante; -L-nome: anéis arteriais não incubados com L-NAME; + L-nome: anéis arteriais incubados com L-NAME. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aparte das pilhas endothelial, os sinais derivados do PVAT jogam um papel importante na regulação da reactividade do Tom de músculo liso30. O pvat saudável libera o não e o Adiponectina anti-inflammatory para exercer um efeito anticontractile nas artérias, que é perdida circunstâncias patológicas tais como a obesidade e a síndrome metabólica31,32. Nos Estados de doença, o pvat contribui para o desenvolvimento da disfunção endotelial e outras anormalidades cardiovasculares33,34. A expressão e a função anormais de Enos foram relatadas no pvat das artérias dos animais obesos35,36. Como as disfunções endoteliais e pvat contribuem para o desenvolvimento de anormalidades cardiovasculares e metabólicas23,37, ao realizar experimento vascular ex vivo, seu papel deve ser considerado por inclusão em ou removê-los das preparações.
O sistema do miografia do fio fornece uma plataforma conveniente para dissecar os sinais vasoativas liberados do pvat usando sondas farmacológicas diferentes10,38. No entanto, as composições em PVAT de diferentes tipos de artérias, ou as mesmas artérias de animais de diferentes antecedentes genéticos, não são iguais39. Conseqüentemente, os resultados do miografia do fio que envolvem pvat não devem ser comparados através dos tipos diferentes de artérias ou do mesmo tipo de artérias dos ratos de tensões diferentes. A idade e os Estados de doença subjacente também afetam as composições celulares no PVAT. Aqui, camundongos do mesmo fundo genético, mas com diferentes modificações genéticas em seu tecido adiposo, foram utilizados para comparar a atividade vasomoduladora do PVAT.
Como principal fonte de resistência ao fluxo sanguíneo, as artérias mesentéricas são escolhidas para o presente estudo. A tensão de repouso determina a quantidade de responsividade vasomotora40. A tensão inicial ideal do vaso sanguíneo é afetada pelo tipo de artéria, idade, dieta, tratamento e fundo genético dos animais, portanto, deve ser determinada individualmente antes de examinar curvas de relaxamento/contração-resposta. Para a demonstração atual, as artérias mesentérica superiores foram coletadas dos ratos 16 week-old alimentados com o Chow padrão ou a dieta gorda elevada que partem da idade de quatro semanas. O presente protocolo enfatiza o estabelecimento de ajustes ideais para a produção de força ativa máxima dos segmentos arteriais antes de avaliar as respostas farmacológicas. As relações de comprimento/tensão passiva e ativa são estudadas para as artérias mesentéricas coletadas de modelos de mouse em casa. Um fator de normalização k de 1 foi estabelecido para preparações dos animais de 16 semanas de idade, que é diferente do valor padrão de 0,9 ou aqueles usados por publicações anteriores41. É necessário cautela ao comparar as razões de normalização na literatura devido a possíveis diferenças na técnica, composição do tampão e modelos de instrumentos, etc. Em particular, a idade, a dieta e outras condições fisiopatológicas afetam a tensão passiva e ativa, bem como as características farmacodinâmicas das artérias42.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financeiramente apoio pelas subvenções do Conselho de subvenção de investigação de Hong Kong [17124718 e 17121714], Hong Kong Health and Medical Research Fund [13142651 e 13142641], fundo de investigação colaborativa de Hong Kong [C7055-14G], e o National Basic Programa de pesquisa da China [973 Program 2015CB553603].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) | Sigma-Aldrich | N5751 | Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M |
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 | Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α) | Enzo | BML-PG023-0001 | Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M |
| Multiwire myograph | Danish MyoTechnology (DMT) | 620M | |
| PowerLab 4/26 | ADInstruments | ML848 | |
| Labchart7 | ADInstruments | - | |
| Adipo-SIRT1 wild type mice | Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong | CULATR NO.: 4085-16 | |
| Silicon-coated Petri dishes | Danish MyoTechnology (DMT) | ||
| Tungsten wires | Danish MyoTechnology (DMT) | 300331 | |
| Surgical tools |
References
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