Summary
Le protocole décrit l’utilisation de la myographie de fil pour évaluer la tension isométrique transmurale des artères mésentériques isolées des souris, avec une prise en considération spéciale de la modulation par des facteurs libérés des cellules endothéliales et des tissus adipeux périivasculaires.
Abstract
La réactivité des tonus vasculaires aux stimuli pathophysiologiques contribue au développement d’un large éventail de maladies cardiovasculaires et métaboliques. La dysfonction endothéliale représente un grand coupable pour la vasodilatation réduite et la vasoconstriction accrue des artères. Les tissus adipeux (gras) entourant les artères jouent un rôle important dans la régulation de la relaxation dépendante de l’endothélium et/ou de la contraction des cellules musculaires lisses vasculaires. Les pourparlers croisés entre l’endothélium et les tissus adipeux périvasculaires peuvent être évalués ex vivo à l’aide de vaisseaux sanguins montés par un système de myographie par fil. Cependant, des paramètres optimaux devraient être établis pour les artères dérivées d’animaux de différentes espèces, âges, origines génétiques et/ou conditions pathophysiologiques.
Introduction
Les dilatations et les constrictions des artères sont obtenues par des relaxations et des contractions, respectivement, de leurs cellules musculaires lisses vasculaires. Les changements dans la réactivité vasculaire des petites artères contribuent à la régulation homéostatique de la pression artérielle par les nerfs et les hormones autonomes présents dans le sang (p. ex. catécholamines, angiotensine II, sérotonine, vasopressine). Au niveau local, les réponses vasculaires des cellules musculaires lisses sont modulées par des signaux provenant des cellules endothéliales de l’intima et du tissu adipeux entourant les artères (figure 1).
L’endothélium n’est pas seulement une barrière passive, mais sert également de surface pour échanger des signaux entre le sang et les cellules musculaires lisses vasculaires sous-jacentes. En libérant diverses substances vasoactives, l’endothélium joue un rôle crucial dans le contrôle local des réponses des tonus vasculaires1. Par exemple, en réponse à l’acétylcholine, l’oxyde nitrique synthase endothélial (eNOS) est activé dans l’endothélium pour produire de l’oxyde nitrique (NO), ce qui induit la relaxation du muscle lisse vasculaire sous-jacent en activant la guanylyl cyclase soluble (sGC) 2. les autres substances vasoactives comprennent les produits des cyclooxygénases (p. ex., prostacycline et thromboxane A2), la lipoxygénase (p. ex., les acides 12-hydroxyeicosatetraénoïque, 12-HETE) et les monooxygénases du cytochrome P450 (hetes et les acides époxyyicosatriénoïques, les EETs), les espèces réactives de l’oxygène (ROS) et les peptides vasoactifs (p. ex., l’endothéline-1 et l’angiotensine II) et les facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF)3. Un équilibre délicat entre les vasodilatateurs et les vasoconstricteurs dérivés de l’endothélium maintient le ton vasomoteur local4,5.
La dysfonction endothéliale est caractérisée par l’altération de la vasodilatation dépendante de l’endothélium6, une caractéristique du vieillissement vasculaire7. Avec l’âge, la capacité de l’endothélium à favoriser la vasodilatation est progressivement réduite, due en grande partie à une diminution de la biodisponibilité non, ainsi que l’expression anormale et la fonction d’eNOS dans l’endothélium et sGC dans les cellules musculaires lisses vasculaires8 , le 9 , 10. réduction aucune biodisponibilité ne potentialise la production de vasoconstricteurs dépendants de l’endothélium11,12. Dans les artères âgées, la dysfonction endothéliale provoque une hyperplasie dans les milieux, comme le reflètent les augmentations marquées de l’épaisseur de paroi, le nombre de noyaux médiaux, qui rappellent l’épaississement artériel dans l’hypertension et l’athérosclérose observée dans les patients13,14. De plus, des affections pathophysiologiques telles que l’obésité, le diabète ou l’hypertension accélèrent le développement de la dysfonction endothéliale15,16.
Le tissu adipeux perivasculaire (PVAT) libère de nombreuses adipokines pour réguler la structure vasculaire et la fonction17. L’effet anti-contractile de la pvat est médié par des facteurs relaxants, tels que l’adiponectine, non, le peroxyde d’hydrogène et le sulfure d’hydrogène18,19,20. Cependant, en fonction de l’emplacement et de l’État pathophysiologique, la PVAT peut également améliorer les réponses contractiles dans diverses artères21. Les substances pro-contractiles produites par la pvat comprennent l’angiotensine-II, la leptine, la résistine et les ROS22,23. Dans la plupart des études sur les vaisseaux sanguins isolés, la pvat a été considérée comme un soutien structurel simple pour le système vasculaire et ainsi enlevée lors de la préparation des segments de l’anneau des vaisseaux sanguins. Étant donné que le dysfonctionnement adipeux représente un facteur de risque indépendant pour l’hypertension et les complications cardiovasculaires associées24, la pvat entourant les vaisseaux sanguins doit être envisagée lors de l’étude de la réactivité vasculaire de différentes artères.
Les systèmes de myographes multi-fils ont été largement utilisés pour étudier les fonctions vasomotrices d’une variété de vaisseaux sanguins, y compris l’aorte, les artères mésentériques, rénales, fémorales, cérébrales et coronaires25,26. Les protocoles décrits ici utiliseront la myographie de fil pour évaluer la réactivité vasculaire dans les artères mésentériques isolées des modèles de souris génétiquement modifiées, avec un accent particulier sur la modulation par la PVAT.
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Protocol
Tous les animaux utilisés pour l’étude suivante ont été fournis par l’unité des animaux de laboratoire de la faculté de médecine de l’Université de Hong Kong. L’approbation éthique a été obtenue du Comité ministériel sur l’utilisation des animaux de laboratoire pour l’enseignement et la recherche (CULATR, no.: 4085-16).
1. les préparations
- Préparation des médicaments
- Stockez les médicaments de façon appropriée, comme indiqué dans la fiche signalétique (FDS) immédiatement après leur réception. Dissoudre les médicaments sous forme de poudre dans des solvants en tant que solutions d’actions à forte concentration, puis aliquote pour le stockage à-20 ° c.
Remarque: la plupart des médicaments sont dissous dans de l’eau distillée pour préparer les solutions en stock; le chauffage ou la sonication peut être nécessaire pour certains médicaments. Si les médicaments ne se dissolvent pas complètement dans l’eau, une goutte de NaOH de 1 M peut être ajoutée, tandis que pour les médicaments de base, une goutte de HCl 1 M peut être utilisée. Les médicaments hydrophobes peuvent être dissous dans le diméthylsulfoxyde (DMSO) ou dans l’éthanol absolu. Dans ces derniers cas, la concentration finale de bain (en M) doit être connue et des contrôles appropriés doivent être effectués pour exclure les effets des solvants. - Avant d’expérimenter, dissoudre les aliquotes de drogue (table des matières) dans la solution de bicarbonate de Krebs-Ringer (Krebs) contenant 115 mm de NaCl, 4,6 mm kcl, 2,5 mm CaCl2, 1,17 mm mgso4, 1,17 mm KH2po4, 25 mm NaHCO3, 11,1 mm D-glucose et 0,01 mm EDTA, pH 7,4.
- Pour les courbes de concentration-réponse cumulatives, préparez les stocks et les solutions de travail de différents médicaments par dilutions sérielles (tableau 1).
- Stockez les médicaments de façon appropriée, comme indiqué dans la fiche signalétique (FDS) immédiatement après leur réception. Dissoudre les médicaments sous forme de poudre dans des solvants en tant que solutions d’actions à forte concentration, puis aliquote pour le stockage à-20 ° c.
- Mise en place de l’instrument
- Calibrer le transducteur de force pour tous les canaux avant d’utiliser le système myographe chaque jour, ou chaque fois que le système a été déplacé.
Remarque: la procédure d’étalonnage détaillée varie en fonction du modèle. En général, un poids de deux grammes est appliqué sur les mâchoires et la force correspondante doit 9,81 ± 0,1 mN. Si la lecture est désactivée de plus de 0,1 mN, la sonde doit être réétalonnée. Pour le système utilisé dans le présent protocole (voir le tableau des matériaux), les valeurs de fonctionnement du transducteur de force pendant l’étalonnage doivent être comprises entre 3000 et 3500. Si la valeur du transducteur est supérieure ou inférieure, le transducteur de force doit être remplacé. - Ajustez et alignez les supports de montage dans chaque chambre. L’utilisation continue et répétée de la chambre de myographe peut entraîner un mauvais alignement du support de montage, qui nécessite un réglage occasionnel avant les expériences pour s’assurer que les mâchoires sont correctement alignées.
Remarque: une attention particulière est nécessaire lors du réglage des supports de montage car les transducteurs de force sont très sensibles et fragiles. - Allumer les chauffages et le gaz (95% O2 et 5% co2) au moins 30 min avant l’essai pour permettre aux chambres et aux tampons d’être réchauffés jusqu’à 37 ± 0,1 ° c et équilibré avec le mélange de gaz.
- Vérifiez la température sur le thermomètre pour assurer la précision du chauffe-eau. La température peut être modifiée pour exécuter des expériences de refroidissement ou de réchauffement. Si la température n’est pas correcte, appliquez la fonction offset de la machine pour augmenter ou diminuer les réglages pour atteindre la température souhaitée.
- À la fin de l’expérience, nettoyez toutes les chambres et éteignez le chauffe-eau ainsi que le gaz qui se dirige vers l’installation.
- Ne pas éteindre le gaz avant que tout le liquide dans la chambre ait été aspiré hors du système, sinon l’eau acide/distillée peut régurgiter et atteindre la chambre d’organe lors de la prochaine utilisation.
- Pour nettoyer les chambres du myographe en fil, le moyen le plus efficace est d’effectuer un lavage acide à l’aide d’une solution d’acide acétique diluée. Nettoyez le bord et l’intérieur des chambres avec un coton-tige.
- Après le lavage, rincez abondamment les chambres avec de l’eau distillée. Essuyez l’extérieur des chambres avec un chiffon humide pour enlever le sel séché. L’éthanol peut également être utilisé si des médicaments hydrophobes ont été utilisés pendant l’expérience.
- Un exemple de la procédure de lavage est le suivant. Remplir les chambres avec une solution d’acide acétique à 8% et incuber pendant 2 min. utiliser un applicateur à pointe de coton pour nettoyer mécaniquement la surface de la chambre d’acier. Évitez tout contact avec la partie en aluminium du myographe.
- Aspirer l’acide acétique et laver la chambre myographe et supporter plusieurs fois avec de l’eau distillée et sécher les surfaces à l’aide de papier absorbant ou d’applicateurs à pointe de coton.
- Calibrer le transducteur de force pour tous les canaux avant d’utiliser le système myographe chaque jour, ou chaque fois que le système a été déplacé.
- Dissection des anneaux artériels mésentériques
Remarque: les animaux utilisés pour l’étude actuelle étaient des souris Adipo-SIRT1 mâles à alimentation riche en graisses et des même portée de type sauvage comme témoins. Chaque animal pesait environ 45 g au moment des expériences.- Euthanasier la souris par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (50 mg/kg).
- Avec des ciseaux chirurgicaux et des pinces, effectuer une laparotomie de mi-ligne pour révéler le contenu abdominal.
- Collectez l’arcade mésentérique dans une boîte de Petri revêtue de silicium.
- Étaler et épingler le réseau mésentérique dans la boîte de Petri pour révéler la ramification du mésentérat et du tissu conjonctif.
- Sous un microscope (10x), et avec des ciseaux fins et des forceps, soigneusement disséquer les tissus conjonctifs environnants. Évitez d’endommager la couche adventitielle. Alternativement, le tissu adipeux environnant peut être conservé autour du vaisseau sanguin pour l’expérimentation (si nécessaire).
- En utilisant les ciseaux fins et les forceps, accises les branches secondaires des artères mésentériques dans le tampon de Krebs froid de glace.
NOTE: chaque chercheur doit avoir son propre ensemble de kit de dissection, cordes et étriers. Ces outils doivent être conservés correctement et nettoyés à chaque fois après l’expérience que certains médicaments sont difficiles à laver et les résidus peuvent s’en tenir à eux.- Gardez les vaisseaux sanguins dans le tampon Krebs froid tout en séparant les tissus conjonctifs environnants, y compris la PVAT. Pendant la manipulation du vaisseau sanguin, Soyez doux pour éviter des dommages inutiles à l’endothélium.
- Si l’expérience implique l’étude de la PVAT, conserver une sphère de 1,5 à 2 mm de diamètre de la PVAT autour du vaisseau sanguin. Alternativement, les mêmes quantités de tissus adipeux peuvent être ajoutées dans chaque chambre pour l’expérimentation.
- Facultatif Retirer l’endothélium du vaisseau sanguin disséqué comme un contrôle pour évaluer la dépendance de l’endothélium des réponses. Pour les artères mésentériques, enlevez l’endothélium en le glissant doucement sur un étrier de fil ou un cheveu.
- Coupez le vaisseau sanguin préparé comme ci-dessus en petits anneaux (~ 2 mm de longueur) et mettez-les dans un plat en plastique rempli de tampon de Krebs (95% O2 et 5% co2) pour le montage ultérieur dans les chambres d’un myographe27de fil.
- Transférer les bagues du vaisseau dans une chambre myographe placée sous le microscope. Les bagues doivent être placées uniformément, les étriers supérieurs et inférieurs étant parallèles. Le fil de fixation (40 μm) doit être nouvellement préparé car les médicaments peuvent se lier aux cordes.
- Visser la bague du vaisseau sanguin sur une longueur appropriée (2 cm) du fil et fixer à une mâchoire de la chambre de montage en vissant pour fixer la position.
- Passez un deuxième fil à travers l’anneau et l’ancre à la mâchoire opposée.
- Avec des bagues filetées et fixées aux mâchoires de chambre, montez la chambre sur la configuration du myographe et tournez la vis du micromètre dans le sens des aiguilles d’une montre pour déplacer les fils proches les uns des autres jusqu’à ce que la lecture de la force sur l’interface utilisateur correspondant à la chambre montée soit nulle ou juste sous.
Remarque: le fil attaché à la mâchoire supérieure doit être d’une longueur minimale pour s’assurer que la tension peut être entièrement transduit au détecteur. - Equilibrer les préparations à 37 ° c pendant au moins 30 min avant la première application de la force à l’aide du micromètre réglable.
- Evaluer la viabilité tissulaire en potassium élevé de 115 mM (NaCl remplacé par KCl sur une base moléculaire) Krebs contenant 4,6 mM NaCl, 115 mm KCl, 2,5 mm cacl2, 1,17 mM MGSO4, 1,17 mm KH2po4, 25 mm NaHCO3 et 11,1 mM D-glucose à pH 7,4.
NOTE: les vaisseaux isolés sont considérés comme viables si la force contractile transposée et enregistrée comme déflexion au-dessus de la ligne de base dans le logiciel d’enregistrement des données du système myographe est supérieure à 40% de leur tonalité de repos, en réponse à un agent contractile. Si l’artère ne se contracte pas de façon appropriée, alors soit la tension de base/la pression de la paroi optimale n’a pas été correctement ajustée ou l’artère peut avoir été endommagée pendant l’isolement ou le montage du récipient. - Facultatif Évaluer l’intégrité des cellules endothéliales en appliquant la phényléphrine pour induire la contraction du vaisseau à 50% de la réponse initiale à la KCl (telle que enregistrée par le transducteur de force dans le logiciel d’enregistrement de données), suivie d’ajouter 1 μM d’acétylcholine.
Remarque: une bonne préparation des vaisseaux sanguins est cruciale pour obtenir des résultats cohérents et précis. Une préparation ne doit pas être utilisée pour l’expérience, soit si le test d’intégrité endothéliale est insatisfaisante, soit qu’il ne répond pas à la KCl, ce qui indique que la fonction endothéliale ou la contractilité des muscles lisses vasculaires, respectivement, ne sont pas satisfaisantes. Dans ce cas, la préparation doit être remplacée par une nouvelle bague provenant du même vaisseau sanguin ou d’un nouveau vaisseau sanguin.
2. normalisation pour déterminer la tension initiale optimale
NOTE: la procédure de normalisation permet de déterminer le diamètre interne optimal (IC) des artères à laquelle le vaisseau sanguin subit une pression transmurale de repos appropriée (100 mmHg ou 13,3 kPa pour les artères mésentériques) et produit des forces en réponse à des agents vasoactifs.
- Allumez l’ordinateur et ouvrez le logiciel d’enregistrement des données (voir le tableau des matériaux).
- Enregistrez l’expérience en tant que «fichier de données LabChart» avec un nouveau nom pour éviter d’écraser le fichier de configuration d’origine.
- Ouvrez la fenêtre des paramètres de normalisation et définissez le facteur k comme 1. Accepter les valeurs par défaut pour l’étalonnage des oculaires (0,3, si la longueur du navire est inconnue, ou 1 si la longueur du navire est connue), la pression cible (13,3), le temps de moyenne en ligne (2) et le temps de retard (60). Cliquez sur OK pour enregistrer les paramètres.
- Sélectionnez les canaux d’intérêt et entrez le diamètre du fil (40 μm), les extrémités tissulaires (a1:0; a2: longueur du tissu mesurée), la lecture du micromètre initial dans la fenêtre de normalisation.
- Commencez la procédure de normalisation en appliquant le premier étirement passif au vaisseau sanguin (tournez la vis micrométrique dans le sens antihoraire).
- Attendez que le vaisseau se stabilise (3 min) et entrez la nouvelle lecture du micromètre dans la fenêtre de normalisation. La tension du mur est automatiquement calculée et montrée comme un point sur le graphe.
Remarque: les "marches" du micromètre utilisées pendant l’étirement passif n’ont pas besoin d’être identiques. Les premiers tronçons peuvent être de 20 μM chacun. Au fur et à mesure que les tronçons se rapprochent de la ligne Isobar, les marches peuvent être réduites à 10 μM, 5 μm, 2 μm ou même plus petites. Faire ouvrir la fenêtre du graphique principal tout en ajustant les paramètres du micromètre — si un grand pic dépassant la ligne Isobar sur un graphe de longueur/tension (qui indique les points de pression correspondant à une valeur prédéterminée) apparaît, réduisez la tension. - Après chaque étirement passif, remplacez le contrôle Krebs par un Krebs de haute teneur en potassium ISO-osmotique contenant 115 mM KCl. Lorsque la contraction atteint un plateau (environ 3 min), enregistrer la force active (F) en soustrayant la force passive à chaque tronçon de la force activée par le potassium. Calculez la tension de la paroi ainsi que les valeurs de circonférence interne (IC).
- Mesurez la tension active comme flèche au-dessus de la ligne de base. La tension active (T) est calculée en fonction de l’équation F (mN) = T (mN/mm) x 2 x longueur du récipient (mm). Les valeurs de circonférence interne (IC) sont calculées à partir des données du micromètre (IC = 205,6 μM + 2 x "Gap").
- Enlever la haute condition de potassium en remplaçant avec des Krebs frais. Répéter le lavage trois fois plus de 5 min.
- Répétez les étapes 2,5 à 2,8 (en induisant des étirements passifs suivis d’une contraction active dans des virages alternatifs) jusqu’à ce que la tension active commence à diminuer (figure 2).
- Après plusieurs séries d’étirements alternatifs, les courbes de longueur/tension passive donnent la valeur de IC100, la circonférence interne du récipient à une pression transmurale de 100 mmHg, comme point de croisement avec la ligne Isobar.
Remarque: chaque valeur de micromètre pendant les étirements passifs est introduite manuellement dans le module de normalisationdu logiciel. Le programme enregistre automatiquement la mesure de force correspondante pour générer la courbe de longueur/tension passive, qui donne la valeur de IC100 comme point de croisement avec la ligne Isobar (figure 2, panneaux de droite). Plus le dernier point est proche de la ligne Isobar, mais juste au-dessus de la meilleure normalisation est sans endommager les vaisseaux. Un point trop au-dessus de la ligne Isobar peut endommager physiquement le vaisseau monté, causant des résultats peu fiables pendant l’expérience. - Créez les courbes de longueur/tension actives pour déterminer les valeurs de IC1 et calculez le facteur k de normalisation comme rapport de IC1/IC100, qui sera utilisé pour ce type de vaisseau sanguin dans les expériences ultérieures de myographie.
Remarque: les courbes de longueur/tension actives sont créées en traçant les valeurs IC calculées à partir des données du micromètre sur l’axe des abscisses et les tensions actives sur l’axe des y. Le IC1 est la valeur située dans la région du plateau de crête (traces rouges dans la figure 2, panneaux de droite). Après avoir tracé les courbes de longueur/tension actives et déterminant IC1, le facteur k de normalisation est calculé comme le rapport de IC1/IC100. Basé sur le facteur k de normalisation, l’IC optimal pour la ligne de base, notée comme IC1, s’affichera sur la courbe de longueur/tension passive. Le réglage du micromètre pour cet IC apparaît sous la courbe et doit être utilisé pour définir le micropositionneur pour les expériences de myographie ultérieures. La tension initiale (T) est égale à la pression cible (pi) x IC/2 π et la force optimale (F) appliquée au récipient est égale à T x 2 x longueur de navire. - Laver soigneusement les Krebs élevés de potassium et équilibrer les préparations pour un autre 30 à 45 min. réinitialisez les tensions basales à «zéro» de sorte que seules les réponses contractiles actives seront enregistrées au cours de l’expérience subséquente.
3. contractions induites par la phényléphrine
Remarque: les médicaments qui peuvent être sélectionnés pour induire les réponses vasoconstrictrices comprennent la norépinéphrine non spécifique de l’agoniste des adrénergiques, l’agoniste sélectif α-1 de la phényléphrine, l’hormone peptidique II et la monoamine neurotransmetteur 5-hydroxytryptamine. La phényléphrine est utilisée dans le présent protocole pour l’examen (tableau des matériaux).
- Préparez et montez les anneaux artériels appariés comme décrit dans la section 1,3, l’un avec le PVAT intact et l’autre avec la PVAT enlevée, à partir des sections adjacentes de chaque artère pour l’expérience.
- Après la normalisation (décrite dans la section 2), précontractent les segments artériels avec un tampon Krebs de potassium élevé en ajoutant la solution KCl de 115 mM à la chambre contenant Krebs.
- Attendre la contraction du plateau (3 min), laver le potassium élevé et le remplacer par un tampon de Krebs frais aéré. Répéter le lavage trois fois plus de 5 min.
- Répétez la stimulation et le lavage de KCl trois fois et enregistrez la réponse/tension contractile maximale au KCl en soustrayant la tension de base de la tension due à la stimulation KCl.
- Après la dernière contraction et le lavage, remplissez la chambre avec un tampon Krebs chaud et aéré et permettez à l’artère de récupérer pendant environ 30 min avant d’effectuer la tâche suivante.
- Pour chaque chambre, ajouter des quantités cumulatives de phényléphrine (incréments de demi-log de 10-10 à 10-4 M) pour induire les augmentations de la tension isométrique dépendante de la concentration des préparations quiescentes.
- Commencez par ajouter une faible concentration de l’agoniste à la chambre. Après avoir laissé suffisamment de temps pour une contraction stable (3 – 5 min), ajouter la concentration suivante. Répétez les étapes avec des concentrations croissantes de phényléphrine.
- Après avoir ajouté la dernière dose d’agoniste (phényléphrine), lavez le médicament à fond et remplissez la chambre avec un tampon Krebs frais. Tracer les réponses dépendantes de la concentration comme des pourcentages croissants des contractions maximales induites par la KCl (figure 3).
- Facultatif Pour évaluer la contribution du NO, incuber les préparations avec l’inhibiteur de la NO synthase, L-NAME (10-4 M), pendant 30 min avant l’addition de phényléphrine. L-NAME améliore les contractions induites par la phényléphrine dans les préparations quiescentes des artères mésentériques (figure 4).
NOTE: les inhibiteurs ou antagonistes doivent avoir suffisamment de temps pour parvenir à l’équilibration, habituellement 30 – 45 min (être cohérent pour tout ensemble d’expériences). - Pour effectuer une deuxième courbe concentration-réponse séquentiellement, lavez la chambre complètement et à plusieurs reprises pour éliminer tous les agonistes précédents, jusqu’à ce qu’aucun autre changement de tonalité ne soit observé.
NOTE: l’expérimentation parallèle expose au moins deux anneaux obtenus du même vaisseau sanguin à l’agoniste, l’un sous des conditions de contrôle et l’autre en présence de l’inhibiteur (s); dans chaque anneau, la courbe concentration-réponse ne sera exécutée qu’une seule fois. Il est préférable d’effectuer des expériences parallèles, car cela fournit un meilleur contrôle de l’action du médicament et la sensibilité des vaisseaux sanguins. Les expériences en série obtiennent une courbe concentration-réponse à un agoniste en un seul anneau; le laver, en changeant les conditions expérimentales (par exemple, en ajoutant un inhibiteur), puis en répétant la courbe de réponse de la concentration sur le même anneau. Dans ce cas, des contrôles de temps sont nécessaires pour montrer que les réponses médicamenteuses ne sont pas dues à des changements du tissu au fil du temps. On ne peut jamais être certain que le tissu est exactement le même état après l’exposition à une expérience de concentration-réponse. Un temps suffisant (au moins 30 – 60 min) doit être donné pour permettre aux segments du navire de revenir à leur tension de repos (basale), bien que dans certains cas, cela ne se produise pas immédiatement après la dissociation de l’agoniste de haute affinité des récepteurs. De plus, des Krebs élevés de potassium peuvent être appliqués entre les courbes de concentration-réponse cumulatives pour réduire la désensibilisation28. Rappelez-vous que la plupart des antagonistes ne peuvent pas être complètement lavés, ainsi continuez à l’ajouter pour le reste de l’expérience.
4. détentions/contractions dépendantes de l’endothélium
- Précontracter un segment artériel fraîchement monté (comme décrit aux étapes 3,2 à 3,5). Encore une fois, enregistrer la réponse contractile maximale/tension à KCl en soustrayant la tension de base de la tension due à la stimulation KCl.
- Facultatif Incuber les préparations avec l’inhibiteur de la NO synthase, L-NAME (10-4 M), pendant 30 min avant l’addition de U46619.
- Ajouter les concentrations précalculées de U46619 à la chambre et permettre une contraction stable et soutenue des segments de l’artère.
NOTE: les réponses vasodilatatrices sont induites dans les artères mésentériques pré-contractées à environ 80% des réponses maximales à 115 mM KCl. différents agonistes peuvent être utilisés pour induire la contraction par l’activation de leurs récepteurs spécifiques. Ici, les segments de vaisseaux sanguins avec ou sans PVAT sont pré-contractés avec U46619 (1 – 3 x 10-8 M; Table des matières), un agoniste du récepteur de la thromboxane A2, pour induire des contractions musculaires lisses stables et soutenues. - Ajouter des concentrations cumulatives d’acétylcholine (10- 10 à 10-4 M) à la chambre d’orgue. Les réponses vasodilatatrices dépendantes de la concentration des segments artériels sont présentées en pourcentage des réponses contractiles induites par le U46619 (figure 5).
Remarque: pour la majeure partie de l’expérience, la concentration suivante de l’agoniste relaxant doit être ajoutée immédiatement lorsqu’un plateau est observé pour éviter le rebond de la tension. Les réponses vasodilatatrices dépendantes de la concentration des segments artériels sont normalisées en pourcentage des réponses contractiles induites par le U46619 pour ajuster les différences mineures d’innervation et de diamètre entre les segments de l’artère (figure 5). Les petites variabilités de réactivité entre les bagues individuelles obtenues à partir du même vaisseau sanguin deviennent minimes lorsqu’un groupe de six expériences ou plus sont analysés statistiquement. Lors de l’expression des réponses en pourcentage des contractions maximales du tissu individuel, il est approprié d’utiliser une analyse appariée (p. ex., le test t de Student apparié) pour comparer les réponses du même type de tissus de différents animaux pour comparer les réponses d’un seul tissu avant et après une intervention. Lors de l’analyse des effets de la PVAT, l’ANOVA à deux voies est utilisée suivie d’un test de comparaison multiple. - Après avoir ajouté la dose finale de l’agoniste relaxant, retirez le médicament de chaque chambre et remplissez-le avec un tampon Krebs frais. Lavez soigneusement la chambre avec le tampon Krebs et laissez l’artère se stabiliser pendant au moins 45 min avant d’effectuer des expériences supplémentaires.
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Representative Results
Examen des relations longueur/tension pour obtenir le facteur de normalisation k
La quantité d’étirement appliquée à un segment de vaisseaux influe sur l’étendue de l’interaction actine-myosin et donc sur la force active maximale développée. Ainsi, pour chaque type de vaisseau sanguin, il faut déterminer la quantité d’étirement nécessaire à la force active maximale pour des études de myographie adéquates. Ici, la normalisation de la relation longueur/tension est effectuée pour les artères mésentériques isolées des modèles de souris (figure 2). Les segments artériels ont été suspendus dans un système de myographes à quatre chambres (voir tableau des matériaux) sur des goupilles en acier inoxydable (diamètre de 40 μm). La tension isométrique a été enregistrée à l’aide d’un convertisseur analogique-numérique connecté à un ordinateur avec un programme d’enregistrement. Les chambres contenaient 5 mL de tampon de Krebs, conservés à 37 ° c et aété avec 95% O2 et 5% co2 pour maintenir le pH à 7,4 tout au long de l’expérience. Une relation de longueur/tension passive a été établie par étirement progressif des segments de l’artère jusqu’à ce que la circonférence interne correspondant à la pression transmurale de 100 mmHg (IC100) ait été obtenue. Après chaque étirement (flèches bleues), 115 mM KCl a été appliqué pour stimuler les contractions (flèches vertes). Les courbes de longueur/tension actives (rouge) ont été tracées en extrayant les données de force active (soustrayant la force passive à chaque tronçon de la force activée par la KCl) sur l’axe Y, puis un graphe a été créé manuellement avec les valeurs IC calculées à partir du micromètre données sur l’axe X. Une valeur IC située dans le plateau de crête est IC1 (lignes rouges pointillées). Le facteur de normalisation k a été calculé sous la forme de ratios IC1/IC100, qui pourraient ensuite être appliqués à des échantillons du même type de vaisseaux dans l’expérience subséquente.
Présentation et calcul des courbes concentration-réponse
La plupart des courbes de concentration-réponse sont exécutées de manière cumulative. Une faible concentration de l’agoniste est ajoutée au bain (de préférence en commençant par une concentration en dessous du seuil de réponse). Après avoir laissé suffisamment de temps pour une réponse possible (3-5 min), la concentration suivante est ajoutée. Lorsqu’une réponse est observée, il est permis d’atteindre un plateau avant la prochaine réponse maximale est obtenue. Les augmentations de demi-log (moyenne de 3,16) de la concentration de phényléphrine sont appliquées ici pour étudier les contractions induites par les agonistes (figure 3 et figure 4).
Dans la plupart des cas, les courbes contraction-réponse ne sont pas exprimées en valeurs brutes de tension/force, mais en pourcentage de la réponse de référence à la KCl obtenue au point optimal de la courbe longueur/tension du segment de vaisseaux sanguins individuels. Cela ajuste la variabilité dans la taille ou la teneur en muscle lisse du vaisseau sanguin, ainsi que corrige pour remodeler les changements dus au vieillissement ou à la pathologie. Ici, les contractions maximales induites par le KCl de 115 mM sont obtenues au début de l’expérience et utilisées pour calculer les contractions stimulées par la phényléphrine des artères mésentériques avec ou sans PVAT, en l’absence ou en présence de L-NAME (figure 3 et figure 4).
Pour étudier les agonistes produisant la relaxation, les vaisseaux sont habituellement contractés à un niveau uniforme — environ 50-80% de la réponse contractile maximale de ce tissu. Étant donné que les réponses aux contractions induites par la phényléphrine sont différentes entre les groupes expérimentaux, le présent protocole utilise U46619 pour stimuler des contractions stables avant d’appliquer les concentrations cumulatives d’acétylcholine. La relaxation musculaire lisse est exprimée en pourcentage de la contraction initiale induite par U46619 (figure 5).
Les courbes concentration-réponse peuvent être comparées à la présence d’un déplacement vers la gauche ou vers la droite (par exemple, entre une courbe de contrôle et l’autre obtenue en présence d’un antagoniste) en déterminant les concentrations produisant des réponses égales, p. ex. 30% ou 50% de la maximum. Ces chiffres sont appelés EC30 et EC50, respectivement (figure 3b). La comparaison statistique des valeurs moyennes des EC50 doit être effectuée sur le logarithme de leurs valeurs. La dépression des courbes est examinée en comparant leurs réponses maximales respectives (Emax) (figure 3b). Dans les exemples illustrés, les contractions induites par la phényléphrine dans les artères mésentériques ont été améliorées par L-NAME et les courbes concentration-réponse ont montré un déplacement vers la gauche ainsi qu’une élévation des contractions maximales (figure 4b). Les relaxations induites par l’acétylcholine dans les artères mésentériques ont été inhibées par L-NAME, et la courbe concentration-réponse a montré un déplacement vers la droite ainsi qu’une réduction des relaxations maximales (figure 5B).
Les réponses vasculaires à divers agents pharmacologiques peuvent être calculées comme la courbe de zone-sous-la-contraction (AUCC) pour les contractions et la zone-au-dessus-la-relaxation-courbe (AARC) pour les relaxations, respectivement, en utilisant la régression logistique non linéaire analyse pour la comparaison10 (figure 3C, figure 4C et Figure 5C). L’effet de L-NAME peut être comparé aux valeurs de l’AUCC/AARC pour déterminer la biodisponibilité NO (figure 6). La libération basale et stimulée du NO dans les artères mésentériques avec ou sans PVAT peut être exprimée comme les différences dans les courbes concentration-réponse de la contraction stimulé par la phényléphrine (DAUCC) et la relaxation induite par l’acétylcholine (DAARC), respectivement, en présence ou en absence de L-NAME (figure 6A et figure 6B). Dans l’exemple illustré, la présence de PVAT a réduit la biodisponibilité du NO dans les artères mésentériques recueillies chez des souris nourries d’un régime alimentaire riche en graisses (figure 6C).
Figure 1: schéma schématique de la structure des parois des artères. Les cellules endothéliales de la tunica intima médient la relaxation/contraction dépendante de l’endothélium du muscle lisse vasculaire, tandis que les signaux libérés du tissu adipeux perivasculaire module les pourparlers croisés entre les différentes couches de la paroi artérielle . S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: traces représentatives illustrant une expérience pour déterminer les tensions initiales optimales pour les artères mésentériques de la souris. Les segments de vaisseaux sanguins ont été préparés à partir d’artères mésentériques recueillies chez les souris âgées de 16 semaines nourries de Chow (A) standard ou d'unrégime alimentaire riche en graisses (B). Après le montage, les courbes de longueur/tension passive et active ont été obtenues par étirement progressif et par stimulation séquentielle avec 115 mM KCl (panneaux de gauche). La contraction active générée avec chaque stimulation devrait augmenter au fur et à mesure que le vaisseau est étiré progressivement, jusqu’à atteindre un plateau à la longueur optimale. Un étirement supplémentaire entraînera une diminution de la contraction active. Les IC100 et IC1 ont été déterminés en complotant les courbes de longueur/tension passive et active, respectivement (panneaux de droite). Notez que la courbe de longueur/tension passive a été générée par le module de normalisation après la saisie manuelle des valeurs du micromètre, tandis que les courbes de longueur/tensions actives tracées manuellement après le calcul de la tension et des valeurs IC à chaque étape de KCl stimulation. Les ratios IC1/IC100 ont été calculés en tant que facteur k de normalisation (panneaux de droite). ). Notez également que seuls les quatre derniers points de la courbe de longueur/tension active ont été montrés dans les figures du panneau (B). STC: artère de souris nourrie standard; HFD: alimentation riche en graisses alimenté artère de la souris. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: enregistrements de sortie des réponses vasoconstrictrices à la phényléphrine dans les artères mésentériques avec ou sans la PVAT environnante. Des études de contractilité sont effectuées sur des préparations d’artères mésentériques de souris transgéniques Adipo-SIRT1 âgées de 16 semaines, dans lesquelles le SIRT1 humain est surexposé sélectivement dans les tissus adipeux29. Des concentrations cumulatives de phényléphrine ont été appliquées pour stimuler les contractions des artères mésentériques sans (-PVAT) ou avec (+ PVAT), (A). Les réponses contractiles ont été enregistrées et calculées en pourcentage de la contraction maximale induite par KCl de 115 mM (B). Les courbes de la zone sous la contraction (AUCC) ont été tracées pour comparaison (C). Notez que la PVAT des souris Adipo-SIRT1 a provoqué un effet anticontractile sur la réponse à la phényléphrine. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4: enregistrements de sortie des réponses vasoconstrictrices à la phényléphrine dans les artères mésentériques avec ou sans la PVAT environnante, et en l’absence ou la présence de L-Name. Des artères mésentériques ont été recueillies chez des souris de type sauvage de 16 semaines nourries d’un régime alimentaire riche en graisses. Trente minutes après l’addition de 10-4 M L-Name ou le contrôle du véhicule, des concentrations cumulatives de phényléphrine ont été appliquées pour stimuler les contractions des artères mésentériques (A). Les réponses contractiles ont été enregistrées et calculées en pourcentage de la contraction maximale induite par KCl de 115 mM (B). Les courbes de la zone sous la contraction (AUCC) ont été tracées pour comparaison (C). Notez que la PVAT des souris alimentaires obèses n’a pas provoqué d’effets anticontractiles sur la réponse à la phényléphrine. – PVAT: anneaux artériels préparés sans PVAT; + PVAT: anneaux artériels préparés avec la PVAT environnante; -L-NAME: anneaux artériels non incubés avec L-NAME; + L-NAME: anneaux artériels incubés avec L-NAME. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5: enregistrements de sortie des réponses vasodilatateurs à l’acétylcholine dans les artères mésentériques avec ou sans la PVAT environnante, et en l’absence ou la présence de l-Name. Des artères mésentériques ont été recueillies chez des souris âgées de 16 semaines nourries d’un régime alimentaire riche en graisses. À 30 min après l’addition de 10-4 M L-Name ou du contrôle du véhicule, les segments de vaisseaux sanguins avec ou sans pvat sont pré-contractés avec U46619 (1-3 x 10-8 m; Table des matières), un agoniste du récepteur de la thromboxane A2, pour induire des contractions musculaires lisses stables et soutenues. Les concentrations cumulatives d’acétylcholine ont ensuite été appliquées pour stimuler les relaxations des artères mésentériques avec ou sans la PVAT environnante (A). Les réponses de relaxation ont été enregistrées et calculées en pourcentage de la contraction induite par le U46619 (B). La zone-au-dessus-les courbes de relaxation (AARC) ont été tracées pour la comparaison (C). Notez que seul le segment artériel avec la PVAT environnante est indiqué dans le panneau A. – PVAT: anneaux artériels préparés sans PVAT; + PVAT: anneaux artériels préparés avec la PVAT environnante; -L-NAME: anneaux artériels non incubés avec L-NAME; + L-NAME: anneaux artériels incubés avec L-NAME. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6: illustration de la procédure de calcul de la non-biodisponibilité. Les courbes zone-sous-contraction (AUCC) et la zone-au-dessus-les-courbes de relaxation (AARC) ont été calculées sur la base des réponses aux concentrations cumulatives de phényléphrine (A) et d’acétylcholine (B), respectivement. Les différences entre les préparations prétraitées sans et avec L-NAME ont été définies comme ∆ AUCC (A) et ∆ AARC (B) pour représenter la contribution de no basal et ont stimulé la libération de no, respectivement. En conséquence, le ∆ AUCC (calculé à partir de la figure 4C), ∆ AARC (calculé à partir de la Figure 5C), et la somme des deux (non biodisponibilité totale) ont été présentés pour comparer la biodisponibilité no dans les artères mésentériques sans et avec les environs PVAT (C). – PVAT: anneaux artériels préparés sans PVAT; + PVAT: anneaux artériels préparés avec la PVAT environnante; -L-NAME: anneaux artériels non incubés avec L-NAME; + L-NAME: anneaux artériels incubés avec L-NAME. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Outre les cellules endothéliales, les signaux dérivés de la PVAT jouent un rôle important dans la régulation de la réactivité de la tonalité musculaire lisse30. La pvat saine libère non et l’adiponectine anti-inflammatoire pour exercer un effet anti-contractile sur les artères, qui est perdue dans des conditions pathologiques telles que l’obésité et le syndrome métabolique31,32. Dans les États de la maladie, la pvat contribue au développement de la dysfonction endothéliale et d’autres anomalies cardiovasculaires33,34. L’expression et la fonction anormales d’Enos ont été rapportées dans la pvat des artères des animaux obèses35,36. Étant donné que les dysfonctions endothéliales et pvat contribuent au développement d’anomalies cardiovasculaires et métaboliques23,37, lors de l’exécution d’expériences vasculaires ex vivo, leur rôle devrait être pris en compte en incluant dans ou de les retirer des préparations.
Le système de myographie de fil fournit une plate-forme commode pour disséquer les signaux vasoactifs libérés de pvat utilisant différentes sondes pharmacologiques10,38. Cependant, les compositions en PVAT de différents types d’artères, ou les mêmes artères d’animaux de fond génétique différent, ne sont pas les mêmes39. Par conséquent, les résultats de la myographie de fil impliquant la PVAT ne doivent pas être comparés entre différents types d’artères ou le même type d’artères de souris de différentes souches. L’âge et les États de la maladie sous-jacente affectent également les compositions cellulaires dans la PVAT. Ici, les souris du même fond génétique mais avec des modifications génétiques différentes dans leur tissu adipeux ont été utilisées pour comparer l’activité vasomodulatrice de la PVAT.
En tant que principale source de résistance au flux sanguin, les artères mésentériques sont choisies pour la présente étude. La tension de repos détermine la quantité de réactivité vasomotrice40. La tension initiale optimale du vaisseau sanguin est affectée par le type d’artère, l’âge, l’alimentation, le traitement et le fond génétique des animaux, doit donc être déterminée individuellement avant d’examiner les courbes de relaxation/contraction-réponse. Pour la présente démonstration, les artères mésentériques supérieures ont été recueillies chez des souris de 16 semaines nourries de Chow standard ou d’un régime alimentaire riche en graisses à partir de l’âge de quatre semaines. Le présent protocole met l’accent sur l’établissement de paramètres optimaux pour la production de force active maximale des segments artériels avant d’évaluer les réponses pharmacologiques. Les relations de longueur/tension passive et active sont étudiées pour les artères mésentériques recueillies à partir de modèles de souris internes. Un facteur k de normalisation de 1 a été établi pour les préparations des animaux âgés de 16 semaines, ce qui diffère de la valeur par défaut de 0,9 ou de celles utilisées par les publications précédentes41. La prudence est nécessaire lors de la comparaison des ratios de normalisation dans la littérature en raison des différences possibles dans la technique, la composition du tampon et les modèles d’instruments, etc. En particulier, l’âge, l’alimentation et d’autres conditions pathophysiologiques affectent la tension passive et active ainsi que les caractéristiques pharmacodynamiques des artères42.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus financièrement par les subventions du Research Grant Council de Hong Kong [17124718 et 17121714], le Fonds de recherche en santé et en médecine de Hong Kong [13142651 et 13142641], le Fonds de recherche collaborative de Hong Kong [C7055-14G], et le national Basic Programme de recherche de la Chine [973 programme 2015CB553603].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) | Sigma-Aldrich | N5751 | Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M |
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 | Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α) | Enzo | BML-PG023-0001 | Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M |
| Multiwire myograph | Danish MyoTechnology (DMT) | 620M | |
| PowerLab 4/26 | ADInstruments | ML848 | |
| Labchart7 | ADInstruments | - | |
| Adipo-SIRT1 wild type mice | Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong | CULATR NO.: 4085-16 | |
| Silicon-coated Petri dishes | Danish MyoTechnology (DMT) | ||
| Tungsten wires | Danish MyoTechnology (DMT) | 300331 | |
| Surgical tools |
References
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