Summary
このプロトコルは、マウスから単離された腸間膜動脈の貫壁性等角張力を評価するためのワイヤ myography の使用を説明し、内皮細胞および血管周囲脂肪組織から放出される因子による変調を特別に考慮する。
Abstract
病態生理学的刺激に対する血管の色調の反応性の変化は、広範囲の心血管および代謝疾患の発症に寄与する。内皮機能不全は、減少した血管拡張および動脈の血管収縮の亢進の主要な原因を表す。脂肪 (脂肪) 動脈を取り巻く組織は、内皮依存性弛緩および/または血管平滑筋細胞の収縮の調節において重要な役割を果たす。内皮と血管周囲脂肪組織との間のクロストークは、ワイヤー myography システムによって取り付けられた血管を使用して、ex vivo で評価することができる。しかし、最適な設定は、異なる種の動物、年齢、遺伝的背景および/または病態生理学的条件に由来する動脈について確立されるべきである。
Introduction
動脈の肥大および収縮は、それぞれ、血管平滑筋細胞のリラクゼーションおよび短縮によって達成される。小さな動脈の血管応答性の変化は、血液中に存在する自律神経およびホルモン (例えば、カテコールアミン、アンジオテンシン II、セロトニン、バソプレシン) によって動脈血圧の恒常性調節に寄与する。局所レベルでは、平滑筋細胞の血管応答は、内膜の内皮細胞と動脈を取り囲む脂肪組織の両方からのシグナルによって変調される (図 1)。
内皮は、受動的な障壁だけでなく、血液と下層の血管平滑筋細胞との間の信号を交換する表面としても機能する。様々な血管作動性物質を放出することにより、内皮は血管トーン応答1の局所制御において重要な役割を果たす。例えば、アセチルコリンに応答して、内皮一酸化窒素合成酵素 (エノス) は、一酸化窒素 (NO) を産生する内皮に活性化され、これは可溶性グアニリルシクラーゼ酸シクラーゼ (sGC)を活性化することによって下層の血管平滑筋の弛緩を誘発する2. その他の血管作動性物質としては、シクロオキシゲナーゼ (例えば、プロスタサイクリン及びトロンボキサン a2)、リポキシゲナーゼ (例えば、12-hydroxyeicosatetraenoic 酸、12-HETE)、およびシトクロム P450 monooxygenases (HETEs 及びepoxyeicosatrienoic 酸、EETs)、活性酸素種 (ROS)、および血管作動性ペプチド (例えば、エンドセリン-1 およびアンジオテンシン II)、および内皮由来 hyperpolarizing 因子 (EDHF)3。内皮由来の血管拡張薬と血管収縮剤の微妙なバランスは、局所血管運動トーン4,5を維持する。
内皮機能不全は、内皮依存性血管拡張6における障害を特徴とする、血管老化7の顕著な特徴である。年齢と共に、血管拡張を促進する内皮の能力は、主として、生物学的利用能の低下、ならびに血管平滑筋細胞における内皮および sGC におけるエノスの異常な発現および機能に起因して徐々に減少している8,9,10. バイオアベイラビリティを低下させることは、内皮依存性血管収縮剤の産生を増強する。高齢の動脈では、内皮機能不全が培地で過形成を引き起こし、壁厚の顕著な増加によって反射されるように、ヒトにおいて認められる高血圧およびアテローム性動脈硬化において血管肥厚を連想する中間核の数患者13、14。加えて、肥満、糖尿病または高血圧のような病態生理学的条件は、内皮機能障害の発症を加速する15,16.
血管周囲脂肪組織 (PVAT) は、血管構造および機能17を調節するために多数のアディポカインを放出する。PVAT の抗収縮効果は、アディポネクチン、NO、過酸化水素、硫化水素18、19、20などの弛緩因子によって媒介される。しかし、場所および病態生理学的条件に応じて、PVAT はまた、様々な動脈21における収縮反応を増強することができる。PVAT によって産生されるプロ収縮物質には、アンジオテンシン-II、レプチン、レジスチン、および ROS22,23が含まれる。 孤立した血管の研究のほとんどでは、PVAT は、血管系のための単純な構造的なサポートとして考えられているため、血管のリングセグメントの調製中に除去しました。脂肪機能障害は高血圧および関連した心血管合併症24のための独立した危険因子を表すので、血管の応答性を調査するとき、血管を取り巻く PVAT は考慮されるべきである異なる動脈。
多線 myograph システムは大動脈、腸間膜、腎臓、大腿骨、大脳および冠状動脈25,26を含むいろいろな血管の血管運動機能を調査するのに広く利用された。本明細書に記載されるプロトコールは、PVAT による変調に特に重点をおいて、遺伝子組み換えマウスモデルから単離された腸間膜動脈における血管応答性を評価するためにワイヤ myography を使用する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
以下の研究のために使用されるすべての動物は、医学の学部の実験動物ユニットによって提供されました, 香港大学.教育と研究のための実験動物の使用に関する部門委員会から倫理的な承認が得られました (CULATR, no.: 4085-16)。
1. 準備
- 薬の調製
- それらを受けた直後に、物質安全データシート (MSDS) に記載されているように適切に医薬品を保管してください。高濃度ストック溶液として溶媒中の粉末状の薬剤を溶解し、-20 ° c での貯蔵のためにアリコート。
注: ほとんどの薬物は、原液を調製するために蒸留水に溶解されます。加熱や超音波処理は、いくつかの薬のために必要な場合があります。薬物が完全に水に溶解しない場合は、1 M NaOH の滴を添加することができますが、基本的な薬物の場合は 1m HCl を使用することができます。疎水性薬物は、ジメチルスルホキシド (DMSO) または絶対エタノールに溶解することができる。後者の場合には、最終浴濃度 (M) が既知であり、溶媒の影響を排除するために適切な制御が行われるべきである。 - 実験に先立って、クレブス−リンガー重炭酸塩溶液 (クレブス) に 115 mM NaCl、4.6 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.17 mm MgSO4、1.17 mm KH2PO4, 25 mm NaHCO 3 を含有する薬剤アリコート (材料表) を溶解し、11.1 Mm D-グルコースおよび 0.01 MM EDTA、pH 7.4。
- 累積濃度-応答曲線のために、連続希釈によって異なる薬物の株および作業溶液を調製する (表 1)。
- それらを受けた直後に、物質安全データシート (MSDS) に記載されているように適切に医薬品を保管してください。高濃度ストック溶液として溶媒中の粉末状の薬剤を溶解し、-20 ° c での貯蔵のためにアリコート。
- 計測器の設定
- 毎日、またはシステムが移動されるたびに myograph システムを使用する前に、すべてのチャンネルの力トランスデューサをキャリブレーションします。
注: 詳細なキャリブレーション手順は、モデルによって異なります。一般に、2グラムの重量は顎に加えられ、対応する力は9.81 ± 0.1 mN でなければならない。読書が 0.1 mN 以上でオフの場合、トランスデューサは再較正されるべきです。本プロトコルで使用されるシステム (材料の表を参照) については、キャリブレーション中の力トランスデューサの動作値は、3000と3500の間でなければなりません。トランスデューサの値が高いか低い場合は、力トランスデューサを交換する必要があります。 - 各チャンバ内の取り付けサポートを調整し、位置合わせします。Myograph 室の連続的かつ繰り返し使用は、顎が適切に整列されていることを確認するために実験前に時折調整を必要とする取り付けサポートのいくつかのずれを引き起こす可能性があります。
注: 力のトランスデューサーが非常に敏感、壊れやすいように土台サポートを調節するとき特別な注意は必要である。 - ヒーターとガスのスイッチ (95% O2および 5% CO2) チャンバーとバッファーは、37±0.1 ° c に温め、ガス混合物で平衡化する実験の前に少なくとも30分。
- ヒーターの精度を確認するには、温度計の気温を確認してください。温度は、冷却または加温実験を実行するように変更することができます。温度が設定どおりに正しくない場合は、必要な温度に達するように設定を増減するために、マシンのオフセット機能を適用します。
- 実験の最後に、すべてのチャンバを清掃し、セットアップに実行されているガスだけでなく、ヒーターをオフにします。
- チャンバ内のすべての液体がシステムから吸い出される前にガスを止めないでください、さもなければ酸/蒸留水は逆流、次の使用の間に臓器室に到達するかもしれません。
- ワイヤー myograph の部屋をきれいにするために、最も有効な方法は希薄にされた酢酸の解決を使用して酸洗浄を行うことである。綿棒で部屋の端と内側をきれいにします。
- 洗浄後は、蒸留水でチャンバーを十分にすすいでください。湿った布で部屋の外側を拭き、乾燥した塩を除去します。エタノールは、疎水性薬物が実験中に使用された場合にも使用することができる。
- 洗浄手順の一例は以下の通りである。8% の酢酸溶液でチャンバーを充填し、2分間インキュベートします。スチールチャンバー表面を機械的に清浄にするために、綿でひっくり返されたアプリケータを使用してください。Myograph のアルミニウム部分との接触を避けてください。
- 酢酸を吸引し、myograph チャンバを洗浄し、蒸留水で数回をサポートし、吸収紙または綿チップアプリケータを使用して表面を乾燥させます。
- 毎日、またはシステムが移動されるたびに myograph システムを使用する前に、すべてのチャンネルの力トランスデューサをキャリブレーションします。
- 腸間膜動脈環の解剖
注: 現在の研究に使用された動物は、男性の Adipo-SIRT1 マウスと野生型同腹仔を対照として高脂肪飼料を摂食した。各動物は、実験の時点で約 45 g を秤量した。- Euthanize はペントバルビタールナトリウム (50 mg/kg) の腹腔内注入によりマウスを投与します。
- 手術用ハサミや鉗子を用いて、腹腔内開腹術を行い、腹部の中身を明らかにする。
- 腸間膜のアーケードをシリコンコーティングされたペトリ皿に集めます。
- ペトリ皿内の腸間膜ネットワークを広げてピン留めし、腸間膜および結合組織帯網の分岐を明らかにする。
- 顕微鏡 (10x) の下で、そして良いはさみおよび鉗子と、注意深く周囲の結合組織を解剖する。Adventitial 層を損傷しないようにしてください。あるいは、周囲の脂肪組織は、実験のために血管の周りに保持することができる (必要な場合)。
- 微細なはさみと鉗子を用いて、腸間膜動脈の二次枝を氷冷クレブス緩衝液で切除する。
注: 各研究者は、自分の解剖キット、弦、あぶみのセットを持っていなければなりません。これらのツールは、いくつかの薬物が洗い流されにくく、残留物がそれらに固執するので、実験の後のたびに適切に保管し、洗浄する必要があります。- PVAT を含む周囲の結合組織を分離しながら、低温クレブス緩衝液に血管を保管してください。血管の処理中に、内皮への不必要な損傷を防ぐために優しくしてください。
- 実験に PVAT の研究が含まれている場合は、血管の周りに PVAT の直径 2 mm の球を1.5 を保持してください。あるいは、脂肪組織の同量は、実験のために各チャンバ内に添加することができる。
- オプション切開した血管から内皮を除去し、応答の内皮依存性を評価する。腸間膜動脈については、ワイヤーあぶみまたは毛髪の上に静かにそれを転がして内皮を取り除く。
- 上記のように調製した血管を小環 (〜2mm 長さ) に切断し、そして通気の完全なプラスチック皿 (95% o2 および 5% CO2) にそれらを入れ、その後ワイヤ myograph27のチャンバ内に装着する。
- 容器のリングを顕微鏡の下に置かれた myograph の部屋に移す。リングは、上部と下部の帯筋が平行になるように均等に配置する必要があります。薬剤が弦に結合する可能性があるため、付着線 (40 μ m) を新たに調製する。
- ワイヤーの適当な長さ (2 cm) に血管リングをねじ込み、位置を固定するためにねじ込むことによって土台の部屋の1つの顎にしっかり止めなさい。
- リングと反対の顎にアンカーを通して第2ワイヤーを渡しなさい。
- リングは通され、部屋の顎に固定されると、部屋を myograph の組み立てに取付け、部屋に対応するユーザーインターフェイスの力の読書がゼロであるか、またはちょうどあるまでワイヤーを互いに近くに動かすためにマイクロメータねじを時計回りに回す以下に。
注: 上顎に取り付けられたワイヤは、検出器に張力を完全に導入できるように、最小の長さである必要があります。 - 平衡化は調節可能なマイクロメータを使用して力の最初の適用の前に少なくとも30分の間37° c で準備をする。
- 115 mM の高カリウムで組織の生存率を評価します (NaClはモルベースで置換) 4.6 mm NaCl を含有するクレブス、115 mM KCl、2.5 mm CaCl2、1.17 MM MgSO4、1.17 Mm KH2PO4, 25 mm NaHCO3そして、pH 7.4 で 11.1 mM D-グルコース。
注: 分離された血管は、myograph システムのデータ記録ソフトウェアにおいてベースラインより上の偏向として形質導入および記録された収縮力が、その休止トーンの 40% 以上である場合には、収縮剤に応答して生存可能と考えられる。動脈が適切に収縮しない場合は、最適な基底張力/壁圧が適切に調整されていないか、血管の分離または取り付け中に動脈が損傷している可能性があります。 - オプション血管の収縮を誘導するためにフェニレフリンを適用することによって、内皮細胞の完全性を評価し、KCl への初期応答 (データ記録ソフトウェアの力トランスデューサによって記録される) の 50% に、続いて1μ m アセチルコリンを添加する。
注: 良い血管の準備は一貫した、正確な結果を得るために重大である。血管内皮の完全性試験が不十分であるか、または KCl に反応しない場合、調製物は実験に使用してはならず、それぞれ内皮機能または血管平滑筋収縮性が満足できるものではないことを示す。この場合、調製物は、同じ血管または新しい血管からの新しい環で置換されるべきである。
2. 最適な初期張力を決定するための正規化
注: 正規化手順により、血管が適切な安静時貫壁性圧 (腸間膜動脈の 100 mmHg または 13.3 kPa) を経験し、最大活性のある動脈の最適内径 (IC) を測定することができます。血管作動性剤に応答して力。
- コンピュータのスイッチを切り、データ記録ソフトウェアを開きます (資料の表を参照してください)。
- 元の設定ファイルが上書きされないように、新しい名前で実験を「LabChart データファイル」として保存します。
- [正規化設定] ウィンドウを開き、 k係数を1に設定します。接眼レンズキャリブレーションのデフォルト値 (0.3、船舶の長さが不明な場合は1、または血管の長さがわかっている場合は「2」)、目標圧力 (13.3)、オンライン平均時間 (3)、および遅延時間 (60) を受け入れます。[ OK ] をクリックして設定を保存します。
- 目的のチャネルを選択し、線径 (40 μ m)、組織端部 (a1: 0; a2: 測定した組織の長さ)、正規化ウィンドウでの初期マイクロメータの読み取りを入力します。
- 最初の受動ストレッチを血管に適用することによって正規化の手順を開始します (マイクロメータスクリューを反時計回りに回します)。
- 容器が安定するのを待ち (3 分)、正規化ウィンドウで新しいマイクロメータの読み取りを入力します。壁の張力が自動的に計算され、グラフ上の点として示されます。
注: パッシブストレッチ中に使用されるマイクロメータの「ステップ」は、同じである必要はありません。最初のいくつかのストレッチは、20μ m ずつです。伸張が等圧線ラインに近づくとともに、ステップは10のμ m、5μ m、2μ m またはより小さいまで減らすことができる。マイクロメーターの設定を調整しながらメインチャートウィンドウを開いてください-長さ/張力グラフ (事前に決定された値に対応する圧力のポイントを示す) 上の等圧線線を超える大きなスパイクが現れる場合は、張力を軽減します。 - 各受動ストレッチの後、コントロールクレブスを 115 mM KCl を含む iso 浸透圧高カリウムクレブスと交換する。収縮がプラトー (約3分) に達すると、カリウム活性化力から各伸張で受動力を減算することにより活性力 (F) を記録する。壁の張力および内部円周 (IC) 値を計算します。
- ベースラインより上のたわみとしてアクティブテンションを測定します。活性張力 (T) は、式 F (mN) = T (mN/mm) x 2 x 血管長 (mm) に基づいて計算される。内部円周 (IC) 値は、マイクロメータデータ (IC = 205.6 μ m + 2 x 「ギャップ」) から計算されます。
- 新鮮なクレブスに置き換えることで高カリウム状態を除去します。5分以上3回の洗浄を繰り返します。
- アクティブなテンションが減少し始めるまで、ステップ2.5 を2.8 に繰り返します (パッシブストレッチを実行してから、交互回転のアクティブな収縮を誘導します)。
- 複数回の代替ストレッチの後、受動長/張力曲線は、等圧線線との交差点として、貫壁性の圧力で 100 mmHg の血管の内部円周 IC100 の値を与えます。
注: パッシブストレッチ中の各マイクロメータの値は、ソフトウェアの正規化モジュールで手動で導入されます。このプログラムは、対応する力の測定値を自動的に記録して受動的な長さ/張力曲線を生成し、等圧線線 (図 2、右パネル) との交差点として IC100 を設定します。最後のポイントが等圧線ラインに近いほど、より良い正規化のすぐ上には、血管を損傷することはありません。等圧線ラインよりも遠くにあるポイントは、取り付けられた容器に物理的に損傷を与え、実験中に信頼性のない結果を引き起こす可能性があります。 - アクティブな長さ/張力曲線を作成して IC1 値を決定し、その後の myography 実験でこのタイプの血管に使用される IC1/IC100 の比率として正規化k係数を計算します。
注: アクティブな長さ/テンションカーブは、x 軸上のマイクロメータデータと y 軸上のアクティブテンションから計算された IC 値をプロットすることによって作成します。IC1 は、ピークプラトー領域内にある値です (図 2の赤いトレース、右パネル)。アクティブな長さ/張力曲線をプロットし、IC1 を決定した後、正規化k係数は IC1/IC100 の比率として計算されます。正規化k係数に基づいて、IC1 として表されるベースラインに最適な IC は、パッシブ長/テンション曲線上に表示されます。この IC のマイクロメータ設定はカーブの下に表示され、後続の myography 実験のために micropositioner を設定するために使用する必要があります。初期張力 (T) は、目標圧力 (Pi) x IC/2 πに等しく、容器に適用される最適な力 (F) は、T x 2 x 容器の長さに等しくなります。 - 高カリウムクレブスを十分に洗い流し、さらに 30 ~ 45 分の準備をして、後の実験で能動的な収縮反応だけが記録されるように、基礎緊張を「ゼロ」に平衡化。
3. フェニレフリン誘発性収縮
注: 血管収縮応答を誘導するために選択することができる薬物は、非特異的アドレナリン受容体アゴニストノルエピネフリン、選択的α1アドレナリン受容体アゴニストフェニレフリン、ペプチドホルモンアンジオテンシン II、およびモノアミン神経伝達物質 5-ヒドロキシトリプタミン。フェニレフリンは、検査のために本プロトコール (物質表) に用いられる。
- 1.3 セクションで説明されているように、一対の動脈リングを準備して取り付け、1つは PVAT に無傷で、もう一方は PVAT を除去し、各動脈の隣接する切片から実験を行う。
- 正常化後 (第2項に記載)、クレブスを含むチャンバに 115 mM KCl 溶液を添加することにより高カリウムクレブス緩衝液を用いて動脈セグメントを事前に収縮させる。
- 収縮がプラトー (3 分) になるのを待って、高カリウムを洗い流し、新鮮な通気クレブス緩衝液で置換する。洗浄は5分間で3回繰り返します。
- KCl 刺激と洗浄を3回繰り返し、KCl 刺激による張力からベースライン張力を差し引いて、最大収縮応答/張力を KCl に記録します。
- 最後の収縮および洗浄の後、暖かく、気泡のクレブス緩衝液でチャンバを補充し、次のタスクを実行する前に約30分間、動脈を回復させる。
- 各チャンバに対して、フェニレフリンの累積量 (ハーフログ増分 10 〜10〜4 M) を加え、休止調製物の等角張力の濃度依存性増加を誘導する。
- チャンバにアゴニストの低濃度を追加することによって開始します.安定した収縮 (3 〜5分) のために十分な時間を許可した後、次の濃度を追加します。フェニレフリンの濃度を増加させながら手順を繰り返します。
- 最後の用量のアゴニスト (フェニレフリン) を加えた後、薬物を徹底的に洗い流し、チャンバを新鮮なクレブス緩衝液で補充する。濃度依存性の応答を、KCl によって誘発される最大収縮率の割合の増加としてプロットします (図 3)。
- オプションNO の寄与を評価するために、フェニレフリンを添加する前に NO 合成酵素阻害剤、L 名 (10-4 M)、30分間の調製物をインキュベートします。L-名は、腸間膜動脈の休止調製におけるフェニレフリン誘発性収縮を増強する (図 4)。
注: 阻害剤またはアンタゴニストは、平衡を達成するのに十分な時間を有していなければならず、通常は30〜45分 (任意の実験のセットに対して一貫している)。 - 第2の濃度-応答曲線を順次実行するために、完全に繰り返してチャンバーを洗浄し、前のアゴニストの全てを除去し、さらに色調の変化が観察されないまで行う。
注: 平行実験では、同じ血管からアゴニストに少なくとも2つの環が得られ、1つは制御条件下にあり、1つはインヒビター (s) の存在である。各リングでは、濃度-応答曲線は1回だけ実行されます。これは、薬物の作用および血管感受性のためのより良好な制御を提供するので、並列実験を行うことが好ましい。連続実験は、単一の環におけるアゴニストに対する濃度応答曲線を得る。それを洗い流し、実験条件を変え (例えば、阻害剤を加える)、次いで同じ環上で濃度応答曲線を繰り返す。この場合、薬物応答が時間の経過に伴う組織の変化によるものではないことを示すために、時間制御が必要である。濃度-応答実験にさらされた後、組織が正確に同じ状態にあることを確信することはできません。血管セグメントが安静時 (基底) 張力に戻ることができるように十分な時間 (少なくとも30〜60分) を与えなければならないが、場合によっては、これは受容体からの高親和性アゴニストの解離の後すぐには起こらないかもしれない。さらに、高カリウムクレブスを累積濃度応答曲線の間に適用し、脱感作28を低減することができる。ほとんどのアンタゴニストは完全に洗い流すことができないため、実験の残りの部分に追加し続けることを覚えておいてください。
4. 内皮依存性リラクゼーション/収縮
- 新規に取り付けられた動脈セグメントを事前に契約する (手順 3.2 ~ 3.5 に記載)。ここでも、KCl 刺激による張力からベースライン張力を減算して KCl に対する最大収縮応答/張力を記録する。
- オプションU46619 を添加する前に、NO 合成酵素阻害剤、L-NAME (10-4 M) を使用して調製物を30分間インキュベートします。
- U46619 の事前に計算された濃度をチャンバに追加し、動脈セグメントの安定した持続的な収縮を可能にする。
注: 血管拡張の応答は、腸間膜動脈において、115 mM KCl に対する最大応答の約 80% まで事前契約して誘導されます。異なるアゴニストは、それらの特異的受容体の活性化によって収縮を誘導するために使用することができる。ここでは、PVAT の有無にかかわらず、血管セグメントは U46619 (1-3 x 10-8 M と事前に収縮されます。物質表) は、トロンボキサン A2 受容体アゴニストであり、安定かつ持続的な平滑筋収縮を誘導する。 - 臓器室にアセチルコリン (10 〜 10 〜4メートル) の累積濃度を追加します。動脈セグメントの濃度依存性血管拡張応答は、U46619 誘導収縮反応のパーセンテージとして提示される (図 5)。
注: 実験のほとんどのために、弛緩アゴニストの次の濃度は、緊張のリバウンドを防ぐためにプラトーが観察されるときすぐに加えられるべきである。動脈セグメントの濃度依存性血管拡張応答は、動脈セグメント間の神経支配および直径のわずかな差のために調整する U46619 誘導収縮応答の百分率として正規化される (図 5)。6つ以上の実験のグループが統計的に分析されるとき同じ血管から得られる個々のリング間の応答の小さい変動は最低になる。応答を個々の組織自身の最大収縮のパーセンテージとして表す場合、対応する分析 (例えば、一組のスチューデントの t 検定) を使用して、異なる動物の同種の組織の応答を比較することが適切である。介入前後の単一組織の応答。PVAT の効果を分析する際には、双方向 ANOVA が使用され、その後に複数比較検定が続きます。 - リラックスしたアゴニストの最終用量を追加した後、各チャンバから薬物を除去し、新鮮なクレブス緩衝液で補充する。クレブスバッファーでチャンバを十分に洗浄し、追加の実験を行う前に、少なくとも45分間は動脈を安定させます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
正規化係数kを得るための長さ/張力関係の検討
血管セグメントに適用される伸張の量は、アクチン-ミオシン相互作用の程度に影響を与え、したがって最大の活性力が発達した。したがって、血管のすべてのタイプのために、最大の活性力に必要なストレッチ量を決定することは、適切な myography 研究のために必要です。ここで、マウスモデルから単離された腸間膜動脈について長さ/張力関係の正常化が行われる (図 2)。動脈セグメントは、ステンレス鋼ピン (40 μ m 直径) の4チャンバーワイヤ myograph システム (材料表参照) に懸濁していた。また、記録プログラムを用いてコンピュータに接続されたアナログ-デジタルコンバータを用いて等角張力を記録した。チャンバは、5 mL のクレブス緩衝液を含有し、37° c で保持し、95% o2および 5% co2 で曝気し、実験を通して7.4 で pH を維持した。100 mmHg 貫壁性圧力 (IC100) に対応する内部周が得られるまで、動脈セグメントの漸増延伸によって受動長/張力関係が確立された。各ストレッチ (青い矢印) の後、収縮を刺激するために 115 mM の KCl が適用されました (緑の矢印)。アクティブな長さ/テンション曲線 (赤) は、有効な力データを抽出し (各伸張の受動力を、KCl 活性化力から引いた) Y 軸上にプロットした後、マイクロメータから計算した IC 値を使用して手動でグラフを作成しました。X 軸上のデータ。ピークプラトー内にある IC 値は IC1 (赤い破線) です。正規化係数kは IC1/IC100 比として計算され、その後の実験で同じ容器タイプのサンプルに適用することができます。
濃度-応答曲線の提示と計算
ほとんどの濃度応答曲線は、累積的な方法で実行されます。低濃度のアゴニストが浴に加えられる (好ましくは応答のための閾値以下の濃度で始まる)。可能な応答 (3-5 分) のために十分な時間を許可した後、次の濃度が追加されます。応答が観察されると、次の最大応答が得られる前にプラトーに達することが許される。フェニレフリン濃度のハーフログ (平均3.16 倍) の増分をここで適用し、アゴニストによる収縮を研究した (図 3および図 4)。
ほとんどの場合、収縮応答曲線は、引張/力の生の値としてではなく、個々の血管セグメントの長さ/張力曲線の最適点で得られた KCl に対する参照応答の割合として表される。これは、血管のサイズまたは平滑筋含量の変動性を調整するだけでなく、老化または病理によるリモデリングの変化を補正する。ここでは、115 mM の KCl によって誘発される最大の収縮は、実験の開始時に得られ、PVAT の有無にかかわらず、腸間膜動脈のフェニレフリン刺激収縮を計算するために使用される (図3と図 4)。
アゴニスト産生緩和を研究するために、血管は、通常、その組織の最大収縮応答の約 50-80% の均一なレベルに収縮する。フェニレフリン誘発性収縮に対する応答は実験群間で異なるので、本プロトコールは、アセチルコリンの累積濃度を適用する前に安定した収縮を刺激するために U46619 を使用する。平滑筋弛緩は、U46619 によって誘発された初期収縮のパーセンテージとして表される (図 5)。
濃度−応答曲線は、等しい応答を産生する濃度を決定することによって (例えば、対照曲線とアンタゴニストの存在下で得られた1つのコントロールカーブの間の) 左方向または右方向シフトの存在として比較することができ、例えば、30% または 50% の最大。これらはそれぞれ EC30および ec50と称される (図 3b)。EC50の平均値の統計的比較は、その値の対数で実行する必要があります。曲線のくぼみは、それぞれの最大応答 (Emax) を比較することによって調べられる (図 3b)。示された例では、腸間膜動脈におけるフェニレフリン誘発性収縮は L 名によって増強され、濃度-応答曲線は最大収縮の上昇と同様に左シフトを示した (図 4b)。腸間膜動脈におけるアセチルコリン誘導リラクゼーションは L 名によって抑制され, 濃度-応答曲線は最大リラクゼーションの減少と同様に右シフトを示した (図 5b).
種々の薬理学的薬剤に対する血管応答は、それぞれ非線形ロジスティック回帰を用いて、リラクゼーションに対する収縮および領域上の緩和曲線 (AARC) についての領域の収縮曲線 (AUCC) として計算することができる比較10の分析 (図 3C、図 4cおよび図 5c)。L 名の効果は AUCC/AARC の値によって比較でき、生物学的利用能がないことを決定する (図 6)。PVAT を有するまたは伴わない腸間膜動脈における NO の基底および刺激された放出は、フェニレフリン刺激収縮 (DAUCC) およびアセチルコリン誘発弛緩 (DAARC) の濃度−応答曲線の相違として表すことができる、それぞれ、L 名の有無 (図 6aおよび図 6b) にある。示された例において、PVAT の存在は、高脂肪食餌を与えられたマウスから採取した腸間膜動脈における生物学的利用能を低下させた (図 6c)。
図 1: 動脈の壁構造の模式図。中膜内膜の内皮細胞は血管平滑筋の内皮依存性弛緩/収縮を媒介するが、血管周囲脂肪組織から放出されたシグナルは動脈壁の異なる層間のクロストークを調節する。.この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: マウスの腸間膜動脈の最適な初期張力を決定する実験を示す代表的なトレース。血管セグメントは、標準的なチョウ (A) または高脂肪食 (B) を与えられた16週齢マウスから採取した腸間膜動脈から調製した。取り付け後、パッシブおよびアクティブ長/張力曲線は、115 mM KCl (左パネル) によるステップワイズストレッチおよびシーケンシャル刺激によって得られました。各刺激で生成されるアクティブな収縮は、血管が徐々に引き伸ばされ、最適な長さでプラトーに達するまで増加します。さらに伸張すると、活性収縮の減少につながる。IC100 および IC1 は、それぞれパッシブおよびアクティブ長/張力曲線 (右パネル) をプロットすることによって決定された。受動長/張力曲線は、マイクロメートル値を手動で入力した後に正規化モジュールによって生成されたのに対して、アクティブ長/テンションカーブは KCl の各ステップでテンションと IC 値を計算した後に手動でプロットしたことに注意してください。刺激。IC1/IC100 比は、正規化k因子 (右パネル) として計算されました。).また、アクティブな長さ/張力曲線の最後の4つの点だけがパネル (B) の図に示されていることにも注意してください。STC: 標準的なチョウの供給マウスの動脈;HFD: 高脂肪食マウス動脈を与えた。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: 周囲の PVAT の有無にかかわらず腸間膜動脈におけるフェニレフリンへの血管収縮薬応答の記録を出力する。収縮研究は、16週齢の Adipo トランスジェニックマウスからの腸間膜動脈の調製に対して行われ、ヒト SIRT1 が脂肪組織29に選択的に過剰発現されるものである。フェニレフリンの累積濃度は、腸間膜動脈の収縮を刺激するために適用された (-PVAT) または (+ PVAT) で、(A)。収縮反応を記録し、115 mM KCl 誘導最大収縮 (B) の割合として計算した。収縮曲線 (AUCC) は、比較のためにプロットされました (C)。なお、Adipo マウスからの PVAT はフェニレフリンに対する応答に対して抗収縮効果を惹起した。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 周囲の PVAT の有無にかかわらず、腸間膜におけるフェニレフリンへの血管収縮薬応答の記録を出力し、L 名の不在または存在下にある。腸間膜動脈は、高脂肪食を与えられた16週齢の野生型マウスから採取した。10− 4 M L 名またはビヒクル制御を加えた後30分、腸間膜動脈の収縮を刺激するためにフェニレフリンの累積濃度が適用された (A)。収縮反応を記録し、115 mM KCl 誘導最大収縮 (B) の割合として計算した。収縮曲線 (AUCC) は、比較のためにプロットされました (C)。食物肥満マウスからの PVAT はフェニレフリンに対する応答に対する抗収縮効果を惹起しなかったことに注意。– PVAT: PVAT なしで調製された動脈リング;+ PVAT: 周囲の PVAT で調製された動脈リング。L-名前: L-名前でインキュベートされない動脈リング;+ L-NAME: L-名前を付けた動脈リング。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5: 腸間膜動脈におけるアセチルコリンの血管拡張反応の出力記録周囲の PVAT の有無にかかわらず、および L 名の不在または存在下で。腸間膜動脈は高脂肪食を与えられた16週齢のマウスから採取した。10-4 M L 名または車両制御を追加した後30分で、PVAT の有無にかかわらず、血管セグメントは U46619 (1-3 x 10-8 M と事前に収縮されます。物質表) は、トロンボキサン A2 受容体アゴニストであり、安定かつ持続的な平滑筋収縮を誘導する。その後、周囲の PVAT (A) の有無にかかわらず腸間膜動脈のリラクゼーションを刺激するためにアセチルコリンの累積濃度が適用された。緩和反応を記録し、U46619 による収縮 (B) の割合として計算した。上記の領域-緩和曲線 (AARC) を比較のためにプロットした (C)。パネル A には、周囲の PVAT を持つ動脈セグメントのみが示されていることに注意してください。– PVAT: PVAT なしで調製される動脈リング;+ PVAT: 周囲の PVAT で調製された動脈リング。L-名前: L-名前でインキュベートされない動脈リング;+ L-NAME: L-名前を付けた動脈リング。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6: バイオアベイラビリティを計算しない手順の図。収縮曲線 (AUCC) および領域-緩和曲線 (AARC) の面積はそれぞれ、フェニレフリン (A) とアセチルコリン (B) の累積濃度に対する応答に基づいて計算した。L 名を用いずに事前に処理した製剤間の相違はδ AUCC (A) とδ AARC (B) と定義し、それぞれ基底の寄与を表さず、刺激を受けなかった。したがって、δ AUCC (図 4cから計算された)、δ AARC (図 5cから計算された)、およびその両方の合計 (合計生物学的利用率なし) は、腸間膜動脈における生物学的利用能なしを比較するために提示した。PVAT (C)。– PVAT: PVAT なしで調製された動脈リング;+ PVAT: 周囲の PVAT で調製された動脈リング。L-名前: L-名前でインキュベートされない動脈リング;+ L-NAME: L-名前を付けた動脈リング。この図の大規模なバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
内皮細胞とは別に、PVAT 由来のシグナルは、平滑筋緊張反応性30の調節において重要な役割を果たす。健康な PVAT は、肥満およびメタボリックシンドローム31,32などの病的状態下で失われる動脈に対する抗収縮効果を発揮する NO および抗炎症性アディポネクチンを放出する。疾患状態において、PVAT は、内皮機能不全および他の心血管異常33、34の発症に寄与する。肥満動物35、36からの動脈の PVAT において、異常なエノス発現および機能が報告されている。内皮および PVAT の両方の機能不全は、心臓血管および代謝異常の発症に寄与するので、23,37は、ex vivo 血管実験を行う際に、それらの役割を含むことによって考慮されるべきであるまたは準備からそれらを削除します。
ワイヤー myography システムは異なった薬理学的な調査10,38を使用して PVAT から解放される血管作動性信号を分析するために便利なプラットホームを提供する。しかし、異なる種類の動脈の PVAT、または異なる遺伝的背景の動物からの同一の動脈の組成物は、39と同じではない。したがって、PVAT を含むワイヤ myography 結果は、異なる菌株のマウスからの異なる種類の動脈または同じタイプの動脈間で比較されるべきではない。年齢と基礎疾患の状態も PVAT の細胞組成物に影響を与えます。ここで、同じ遺伝的背景からのマウスは、脂肪組織において異なる遺伝子修飾を用いて、PVAT の vasomodulating 活性を比較するために使用した。
血流に対する抵抗の主な供給源として、本研究のために腸間膜動脈が選ばれる。安静時張力は、血管運動応答性40の量を決定する。血管の最適な初期張力は、動脈の種類、年齢、食事、処置および動物の遺伝的背景によって影響されるので、弛緩/収縮反応曲線を調べる前に個別に決定されるべきである。本デモでは、4週間から始まる標準のチョウまたは高脂肪食を与えられた16週齢マウスから、上腸間膜動脈を採取した。本プロトコールは、薬理学的応答を評価する前に動脈セグメントの最大能動的力生産のための最適設定の確立を強調する。受動および活動的な長さ/張力関係は両方の社内マウスモデルから集められる腸間膜の動脈のために調査される。デフォルト値の0.9 または以前のパブリケーション41で使用されているものとは異なる16週齢の動物からの準備については、正規化kファクター1が確立されています。技術の違い、バッファーの構成、器具のモデルなどにより、文献の正規化率を比較する際には注意が必要です。 特に、年齢、食事および他の病態生理学的条件は、動脈42の薬力学特性と同様に、受動的および能動的緊張に影響する。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示することはありません。
Acknowledgments
この作品は、香港の研究助成金評議会 [17124718 と 17121714]、香港の健康・医療研究基金 [13142651 と 13142641]、香港の共同研究資金 [C7055-14G]、および国家の基本的な助成金によって財政的支援を受けました中国研究プログラム [973 プログラム 2015CB553603].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) | Sigma-Aldrich | N5751 | Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M |
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 | Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α) | Enzo | BML-PG023-0001 | Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M |
| Multiwire myograph | Danish MyoTechnology (DMT) | 620M | |
| PowerLab 4/26 | ADInstruments | ML848 | |
| Labchart7 | ADInstruments | - | |
| Adipo-SIRT1 wild type mice | Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong | CULATR NO.: 4085-16 | |
| Silicon-coated Petri dishes | Danish MyoTechnology (DMT) | ||
| Tungsten wires | Danish MyoTechnology (DMT) | 300331 | |
| Surgical tools |
References
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
- Furchgott, R. F., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived relaxing and contracting factors. The FASEB Journal. 3 (9), 2007-2018 (1989).
- Feletou, M., Kohler, R., Vanhoutte, P. M. Endothelium-derived vasoactive factors and hypertension: possible roles in pathogenesis and as treatment targets. Current Hypertension Reports. 12 (4), 267-275 (2010).
- Vanhoutte, P. M. Endothelial dysfunction: the first step toward coronary arteriosclerosis. Circulation Journal. 73 (4), 595-601 (2009).
- Feletou, M., Huang, Y., Vanhoutte, P. M. Endothelium-mediated control of vascular tone: COX-1 and COX-2 products. British Journal of Pharmacology. 164 (3), 894-912 (2011).
- Harrison, D. G. Cellular and molecular mechanisms of endothelial cell dysfunction. Journal of Clinical Investigation. 100 (9), 2153 (1997).
- Vanhoutte, P. M., Shimokawa, H., Tang, E. H., Feletou, M. Endothelial dysfunction and vascular disease. Acta physiologica. 196 (2), 193-222 (2009).
- Klöß, S., Bouloumié, A., Mülsch, A. Aging and chronic hypertension decrease expression of rat aortic soluble guanylyl cyclase. Hypertension. 35 (1), 43-47 (2000).
- Csiszar, A., et al. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. Circulation Research. 90 (11), 1159-1166 (2002).
- Guo, Y., et al. Endothelial SIRT1 prevents age-induced impairment of vasodilator responses by enhancing the expression and activity of soluble guanylyl cyclase in smooth muscle cells. Cardiovascular Research. , (2018).
- Auch-Schwelk, W., Katusic, Z. S., Vanhoutte, P. M. Nitric oxide inactivates endothelium-derived contracting factor in the rat aorta. Hypertension. 19 (5), 442-445 (1992).
- Tang, E. H., Feletou, M., Huang, Y., Man, R. Y., Vanhoutte, P. M. Acetylcholine and sodium nitroprusside cause long-term inhibition of EDCF-mediated contractions. American Journal of Physiology - Heart and Circulation Physiology. 289 (6), H2434-H2440 (2005).
- Ghiadoni, L., et al. Endothelial function and common carotid artery wall thickening in patients with essential hypertension. Hypertension. 32 (1), 25-32 (1998).
- Xu, X., et al. Age-related Impairment of Vascular Structure and Functions. Aging and Disease. 8 (5), 590-610 (2017).
- Tabit, C. E., Chung, W. B., Hamburg, N. M., Vita, J. A. Endothelial dysfunction in diabetes mellitus: Molecular mechanisms and clinical implications. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 11 (1), 61-74 (2010).
- Tanaka, K., Sata, M. Roles of perivascular adipose tissue in the pathogenesis of atherosclerosis. Frontiers in Physiology. 9, 3 (2018).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. The FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
- Gálvez-Prieto, B., et al. A reduction in the amount and anti-contractile effect of periadventitial mesenteric adipose tissue precedes hypertension development in spontaneously hypertensive rats. Hypertension research. 31 (7), 1415 (2008).
- Gao, Y. J., Lu, C., Su, L. Y., Sharma, A., Lee, R. Modulation of vascular function by perivascular adipose tissue: the role of endothelium and hydrogen peroxide. British Journal of Pharmacology. 151 (3), 323-331 (2007).
- Gao, Y. -J., et al. Perivascular adipose tissue promotes vasoconstriction: the role of superoxide anion. Cardiovascular Research. 71 (2), 363-373 (2006).
- Szasz, T., Webb, R. C. Perivascular adipose tissue: more than just structural support. Clinical Science (London). 122 (1), 1-12 (2012).
- Ramirez, J. G., O'Malley, E. J., Ho, W. S. V. Pro-contractile effects of perivascular fat in health and disease. Brish Journal of Pharmacology. 174 (20), 3482-3495 (2017).
- Hajer, G. R., van Haeften, T. W., Visseren, F. L. Adipose tissue dysfunction in obesity, diabetes, and vascular diseases. European Heart Journal. 29 (24), 2959-2971 (2008).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circulation Research. 41 (1), 19-26 (1977).
- Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
- del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods in Molecular Biology. 1339, 255-276 (2015).
- Dobrin, P. B. Influence of initial length on length-tension relationship of vascular smooth muscle. American Journal of Physiology. 225 (3), 664-670 (1973).
- Xu, C., et al. Calorie restriction prevents metabolic aging caused by abnormal SIRT1 function in adipose tissues. Diabetes. 64 (5), 1576-1590 (2015).
- Sheykhzade, M., Nyborg, N. C. Caliber dependent calcitonin gene-related peptide-induced relaxation in rat coronary arteries: effect of K+ on the tachyphylaxis. European Journal of Pharmacology. 351 (1), 53-59 (1998).
- Soltis, E. E., Cassis, L. A. Influence of perivascular adipose tissue on rat aortic smooth muscle responsiveness. Clinical and Experimental Hypertension A. 13 (2), 277-296 (1991).
- Lohn, M., et al. Periadventitial fat releases a vascular relaxing factor. FASEB Journal. 16 (9), 1057-1063 (2002).
- Fesus, G., et al. Adiponectin is a novel humoral vasodilator. Cardiovascular Research. 75 (4), 719-727 (2007).
- Greenstein, A. S., et al. Local inflammation and hypoxia abolish the protective anticontractile properties of perivascular fat in obese patients. Circulation. 119 (12), 1661-1670 (2009).
- Yudkin, J. S., Eringa, E., Stehouwer, C. D. "Vasocrine" signalling from perivascular fat: a mechanism linking insulin resistance to vascular disease. Lancet. 365 (9473), 1817-1820 (2005).
- Xia, N., et al. Uncoupling of endothelial nitric oxide synthase in perivascular adipose tissue of diet-induced obese mice. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 36 (1), 78-85 (2016).
- Xia, N., Forstermann, U., Li, H. Effects of resveratrol on eNOS in the endothelium and the perivascular adipose tissue. Annals of the New York Academy of Sciences. 1403 (1), 132-141 (2017).
- Schinzari, F., Tesauro, M., Cardillo, C. Endothelial and perivascular adipose tissue abnormalities in obesity-related vascular dysfunction: novel targets for treatment. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 69 (6), 360-368 (2017).
- Liu, J. T., et al. Lipocalin-2 deficiency prevents endothelial dysfunction associated with dietary obesity: role of cytochrome P450 2C inhibition. British Journal of Pharmacology. 165 (2), 520-531 (2012).
- Martinez-Quinones, P., et al. Hypertension induced morphological and physiological changes in cells of the arterial wall. American Journal of Hypertension. 31 (10), 1067-1078 (2018).
- Outzen, E. M., et al. Translational value of mechanical and vasomotor properties of mouse isolated mesenteric resistance-sized arteries. Pharmacology Research and Perspectives. 3 (6), e00200 (2015).
- Sheykhzade, M., Simonsen, A. H., Boonen, H. C., Outzen, E. M., Nyborg, N. C. Effect of ageing on the passive and active tension and pharmacodynamic characteristics of rat coronary arteries: age-dependent increase in sensitivity to 5-HT and K+. Pharmacology. 90 (3-4), 160-168 (2012).
