Summary
이 프로토콜은 마우스에서 분리 된 장 간 막 동맥의 경 벽 등각 장력을 평가 하는 와이어 묘 조 그래피의 사용을 설명 하며, 내 피 세포 및 혈관 주위 지방 조직에서 방출 되는 요인에의 한 변조를 특별히 고려 합니다.
Abstract
병 태 생리학적 자극에 대 한 변경 된 혈관 톤 반응성은 광범위 한 심혈 관 및 대사 성 질환의 발달에 기여 합니다. 내 피 세포 기능 장애는 동맥의 혈관 수축 감소와 혈관의 개선에 대 한 주요 범인을 나타낸다. 지방 (지방) 동맥을 둘러싼 조직은 혈관 평활 근 세포의 내 피 의존적 이완 및/또는 수축 조절에 중요 한 역할을 한다. 내 피와 혈관 주위 지방 조직 사이의 교차 회담은 와이어 myography 시스템에 의해 장착 된 혈관을 사용 하 여 ex 생체 내 평가 될 수 있다. 그러나, 다른 종, 나이, 유전 배경 및/또는 병 태 생리학적 조건의 동물에서 파생 된 동맥에 대 한 최적의 설정을 설정 해야 합니다.
Introduction
팽창과 동맥의 수축은 각각의 혈관 평활 근 세포의 이완 및 수축에 의해 달성 됩니다. 작은 동맥의 혈관 반응성의 변화는 혈액에 존재 하는 자율 신경 및 호르몬 (예: 카 테 콜 아민, 안 지 오 텐 신 II, 세로토닌, 바소)에 의해 동맥 혈압의 항상성 규칙에 기여 합니다. 지역 수준에서 평활 근 세포의 혈관 반응은 막의 내 피 세포와 동맥을 둘러싼 지방 조직의 신호에 의해 변조 됩니다 (그림 1).
내 피는 수 동적 장벽 뿐만 아니라 혈액과 기저 혈관 평활 근 세포 사이의 신호를 교환 하는 표면 역할도 한다. 다양 한 혈관 활성 물질을 방출 함으로써, 내 피는 혈관 톤 응답의 국부 제어에 중요 한 역할을 한다1. 예를 들어, 아 세 틸 콜린에 대 한 반응에서, 내 피 질 산화 질소 신 타제 (이 노스)는 산화 질소 (NO)를 생성 하는 내 피의 활성을 유발 하며,이는 용해성 guanylyl 사이 클론 (sGC) 을 활성화 시 킴으로써 기저 혈관 평활 근의 이완을 유도 한다 2. 다른 혈관 활성 물질에는 cyclooxygenases의 생성물 (예를 들어, 프로 스테이 시 클로 및 트 라 보네 아) 및 시 토 크롬 P450 모노 자 나아 제 (예: 12 hydroxyeicosatetraenoic 산, 12 hete) 및 epoxyeicosatrienoic 산, EETs) 및 혈관 활성 펩타이드 (예컨대, 엔도 텔 린 1 및 안 지 오 텐 신 II) 및 내 피 유래 하이퍼 편광 인자 (EDHF)3. 내 피 유래 혈관 확장 제와 혈관 수축 기 사이의 섬세 한 균형이 국부 혈관 운동 톤4,5를 유지 한다.
내 피 세포 기능 장애는 혈관 노화의 특징7인 내 피의 의존성의 혈관 확장6에서의 손상에 의해 특성화 된다. 나이가 들 수록 혈관 확장을 촉진 하는 내 피의 능력은 점진적으로 감소 하 게 되 고,이로 인해 혈 중 내 피 및 sGC에서의 비정상적인 발현 및 기능 뿐만 아니라 생체 이용률을 크게 감소 시 키 게 된다8 , 9 , 10. 감소 된 생체 이용률은 내 피 의존성 혈관 수축기의 생산을 증강 시킵니다. 나이 든 동맥에서, 내 피 세포 기능 장애는 벽 두께의 현저한 증가, 내측 핵의 수에 의해 반사 됨에 따라 배지에서 증식을 일으키고,이는 인간에서 관찰 되는 고혈압과 동맥 경화 증에서 동맥 농축을 연상 시키는 환자13,14. 또한, 비만, 당뇨병 또는 고혈압과 같은 병 리 생리학적 조건은 내 피 세포 기능 장애의 개발을 촉진 하는15,16.
혈관 주위 지방 조직 (PVAT)은 관 구조와 기능을 조절 하기 위해수많은 adipokines을 방출 합니다. Pvat의 항 수축 효과는 adiponectin, 과산화 수소 및 황화 수소18,20과 같은 이완 요인에 의해 매개 됩니다. 그러나, 위치 및 병 리 생리학적 조건에 따라, PVAT는 또한 다양 한 동맥 (21)에서 수축 반응을 향상 시킬 수 있다. Pvat가 생산 하는 수축 물질에는 안 지 오 텐 신 II, 렙 틴, 레 시 틴이 있으며 ROS22,23이 포함 되어 있습니다. 고립 된 혈관에 대 한 연구의 대부분에서, PVAT는 혈관 구조에 대 한 간단한 구조적 지원으로 간주 하 고 따라서 혈액 혈관 고리 세그먼트의 준비 동안 제거. 지방 기능 장애는 고혈압과 관련 된 심혈 관 합병증 (24)에 대 한 독립적 인 위험 인자를 나타내며, 혈관을 둘러싼 pvat의 관 반응성을 조사할 때 고려해 야 합니다. 다른 동맥.
상기 다중 와이어 myograph 시스템은 대동맥, 장 간 막, 신장, 대 퇴, 대뇌 및 관상 동맥 (25)을 포함 하는 다양 한 혈관의 혈관 운동 기능을 조사 하기 위해 널리 사용 되 고 있다. 여기에 설명 된 프로토콜은 와이어 myography를 사용 하 여 PVAT의 변조에 특별 한 초점을 맞춘 유전자 변형 마우스 모델에서 분리 된 장 간 막 동맥의 혈관 반응성을 평가 합니다.
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Protocol
다음 연구에 사용 되는 모든 동물은 의학 학부의 실험실 동물 단위에 의해 제공 되었다, 홍콩의 대학. 윤리 승인은 교육 및 연구를 위한 실험실 동물의 사용에 대 한 부서별 위원회에서 얻어 졌습니다 (CULATR, 4085-16).
1. 준비
- 약물의 제조
- 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 명시 된 대로 약품을 수령한 직후에 보관 하십시오. 고 농도 원 액으로 용 매에 약물을 분말 형태로 녹여 서-20°c에서 보관 하십시오.
참고: 대부분의 약물은 증류수에 용 해 되어 스톡 솔루션을 준비 합니다. 일부 약물에는가 열 또는 초음파 처리가 필요할 수 있습니다. 약물이 물에 완전히 녹지 않으면 1m의 NaOH를 첨가 할 수 있으며 기본 약물의 경우 1m HCl을 사용할 수 있습니다. 소수 성 약물은 dimethylsulfoxide (DMSO) 또는 절대 에탄올에 용 해 될 수 있다. 후자의 경우, 최종 욕 농도 (M)를 알고 있어야 하 고 적절 한 제어는 용 매의 효과를 배제 하기 위해 수행 되어야 한다. - 실험 전에 크 렙 스 링거 중 탄산염 용액 (Krebs)에 약물을 용 해 하 여 약 액을 녹 인 후, 4.6 mm 115, 2.5 mM CaCl2, 1.17 mmmgso4, 1.17 φ2k2 포4,25mm 11.1 Mm D 글루코스 및 0.01의 EDTA, pH 7.4.
- 누적 농도-반응 곡선의 경우, 일련 희석을 통해 다양 한 약물의 주식 및 작업 용액을 준비 합니다 (표 1).
- 물질 안전 보건 자료 (MSDS)에 명시 된 대로 약품을 수령한 직후에 보관 하십시오. 고 농도 원 액으로 용 매에 약물을 분말 형태로 녹여 서-20°c에서 보관 하십시오.
- 계측기 설정
- 모든 채널의 힘 트랜스듀서를 매일 또는 시스템을 움직일 때마다 myograph 시스템을 사용 하기 전에 교정 합니다.
참고: 자세한 교정 절차는 모델에 따라 다릅니다. 일반적으로, 2 그램 무게는 턱에 적용 되 고 상응 하는 힘은 9.81 ± 0.1 mN 이어야 한다. 판독값이 0.1 mN 이상 꺼져 있으면 변환기를 다시 교정 해야 합니다. 본 프로토콜에서 사용 되는 시스템의 경우 ( 재료 표참조) 캘리브레이션 중에 포스 트랜스듀서에 대 한 작동 값은 3000과 3500 사이 여야 합니다. 트랜스듀서 값이 높거나 낮을 경우, 힘 트랜스듀서를 교체 해야 합니다. - 각 챔버에서 장착 지지대를 조정 하 고 정렬 합니다. Myograph 챔버의 지속적이 고 반복적인 사용은 장착 지지대의 부정합을 유발할 수 있으며,이는 턱이 제대로 정렬 되도록 하기 위해 실험 전에 때때로 조정이 필요 합니다.
주: 힘 트랜스듀서는 매우 민감하고 깨지기 쉽기 때문에 장착 지지대를 조정할 때 특별 한 주의가 필요 합니다. - 상기 실험 전에 30 분 이상의 히터 및 가스 (95% o2 및5% co2)를 사용 하 여 챔버 및 완충 액을 37 ± 0.1 ° c까지가 온 하 고 기체 혼합물과 평형 화 시킬 수 있도록 한다.
- 온도계의 온도를 확인 하 여 히터의 정확도를 확인 하십시오. 온도는 냉각 또는 온난화 실험을 실행 하도록 수정할 수 있습니다. 온도가 설정 된 대로 올바르지 않으면 기기의 오프셋 기능을 적용 하 여 필요한 온도에 도달 하도록 설정을 늘리거나 줄입니다.
- 실험이 끝날 때, 모든 챔버를 청소 하 고 히터 뿐만 아니라 설정에 실행 가스를 끄십시오.
- 챔버의 모든 액체가 시스템에서 빨려 들어가 전에 가스를 끄지 마십시오, 그렇지 않으면 산/증류수는 역류 하 고 다음 사용 중에 장기 챔버에 도달 할 수 있습니다.
- 와이어 묘 그래프의 챔버를 청소 하기 위해, 가장 효과적인 방법은 희석 아세트산 용액을 사용 하 여 산 세척을 수행 하는 것 이다. 면봉으로 챔버의 가장자리와 내부를 청소 하십시오.
- 세척 후, 챔버를 증류수로 철저히 헹 궈 냅니다. 젖은 천으로 챔버의 바깥을 닦아 말린 소금을 제거 하십시오. 에탄올은 또한 실험 중에 소수 성 약물이 사용 된 경우에도 사용 될 수 있다.
- 세척 절차의 예는 다음과 같다. 8% 아세트산 용액으로 챔버를 채우고 2 분 동안 배양 합니다. 코 튼 팁 어플리케이터를 사용 하 여 스틸 챔버 표면을 기계적으로 청소 합니다. Myograph의 알루미늄 부분과의 접촉을 피하십시오.
- 아세트산을 흡입 하 고 myograph 챔버를 세척 하 고 증류수로 여러 번 지원 하 고 흡수 성 종이 또는 면 팁 애플리 케이 터를 사용 하 여 표면을 건조 시킵니다.
- 모든 채널의 힘 트랜스듀서를 매일 또는 시스템을 움직일 때마다 myograph 시스템을 사용 하기 전에 교정 합니다.
- 장 간 막 동맥 고리의 해 부
참고: 현재 연구에 사용 된 동물은 고 지방 식이 요법으로 남성 Adipo-SIRT1 마우스와 야생 형 리 테 메이 트를 컨트롤로 공급 하였다. 각 동물은 실험 시 약 45 g을 무게.- Pentobarbital 나트륨 50)의 주입을 복 강 내 하 여 마우스를 안락사 시켰다.
- 외과가 위 및 집게로, 중간 라인 개복 술을 수행 하 여 복 부 내용물을 드러냅니다.
- 메 장 간 아케이드를 실리콘 코팅 된 페 트리 접시에 모으십시오.
- 장 간 망을 확산 하 고 핀으로 하 여 페 트리 디쉬의 분기를 표시 하 고 결합 조직의 메시 작업을 한다.
- 현미경 (10 배) 하에서,가 위 및 집게를 사용 하 여 주위의 결합 조직을 조심 스럽게 분해 합니다. 모험 층을 손상 시 키 지 마십시오. 대안적으로, 주변 지방 조직은 실험을 위해 혈관 주위에 유지 될 수 있다 (필요한 경우).
- 미세가 위 및 집게를 사용 하 여 얼음-차가운 Krebs 완충 액에서 장 간 막 동맥의 2 차 분 지를 소비 합니다.
참고: 각 연구원은 자신의 해 부 키트, 문자열 및 등 자 세트를가지고 있어야 합니다. 이 도구는 일부 약물이 떨어져 세척 하기 어렵고 잔류물이 그들에 게 충실 할 수 있기 때문에 실험 후 모든 시간을 올바르게 유지 하 고 청소 해야 합니다.- PVAT를 포함 한 주변 결합 조직을 분리 하면서 혈관을 차가운 Krebs 완충 액에 보관 하십시오. 혈관을 처리 하는 동안, 내 피에 불필요 한 손상을 방지 하기 위해 부드럽게.
- 실험은 PVAT의 연구를 포함 하는 경우, 혈관 주위 PVAT의 2mm 직경의 1.5을 유지 한다. 대안적으로, 동일한 양의 지방 조직이 실험을 위해 각 챔버에서 첨가 될 수 있다.
- 선택적 해 부 혈관 으로부터 내 피를 제거 하 여 대조 군으로 서 반응의 내 피의 의존성을 평가 하였다. 장 간 동맥의 경우, 와이어 등을 통해 부드럽게 롤링 하 여 내 피를 제거 또는 머리.
- 위와 같이 준비 된 혈관을 작은 고리 (~ 2mm 길이)로 자른 후 와이어의 챔버에 설치 하기 위해 (95% O2 및 5% CO2 ) 크 렙 스 완충액으로 가득 찬 플라스틱 접시에 넣습니다.
- 용기 링을 현미경으로 배치 된 myograph 챔버로 전달 합니다. 링은 상부 및 하 부 등 자 평행 하 게 고르게 배치 되어야 합니다. 부착 와이어 (40 µm)는 약물이 현에 결합할 수 있으므로 새로 준비 해야 합니다.
- 혈관 링을 와이어의 적당 한 길이 (2cm)에 놓고 나사에 의해 장착 챔버의 한 턱에 고정 하 여 위치를 고정 합니다.
- 링을 통해 두 번째 와이어를 전달 하 고 반대쪽 턱에 고정 합니다.
- 링을 스레드 하 고 챔버 턱에 고정 하 여 챔버를 myograph 설정에 마운트하고 마이크로미터 나사를 시계 방향으로 돌려 장착 된 챔버에 해당 하는 사용자 인터페이스에 대 한 힘 읽기가 0 이거나 그냥 있을 때까지 서로 가까이 와이어를 이동 합니다. 아래.
참고: 위쪽 턱에 부착 된 와이어는 장력이 검출기에 완전히 형질 도입 수 있도록 최소한의 길이로 해야 합니다. - 조정 가능한 마이크로미터를 사용 하 여 제 1 힘의 적용 이전에 적어도 30 분 동안 37 ° c에서 제제를 평형 화 한다.
- 115 mM의 조직 생존 율 평가 높은 칼륨 (염화 나트륨 은 몰 단위로 KCl 로 대체) 4.6 mm 염화 나트륨, 115 mm Kcl, 2.5 mm cacl 2, 1.17 mm pH 7.4에서 11.1 mM D-포도 당.
참고: 절연 용기는 수축 에이전트에 대 한 응답으로 수축 force 형질 도입 및 myograph 시스템의 데이터 기록 소프트웨어에서 기준선 이상의 편향으로 기록 된 경우 해당 휴식 톤의 40% 이상이 면 실행 가능한 것으로 간주 됩니다. 동맥이 적절 하 게 계약 하지 않는 경우, 최적의 기저 장력/벽 압력이 제대로 조정 되지 않았거나 혈관을 분리 하거나 장착 하는 동안 동맥이 손상 되었을 수 있습니다. - 선택적 혈관의 수 축을 유도 하기 위해 페 닐를 적용 하 여 내 피 세포의 완전성을 평가 하 여 KCl에 대 한 초기 반응의 50%로 (데이터 기록 소프트웨어에서 포스 트랜스듀서에 의해 기록 됨), 1 µ M 아 세 틸 콜린을 첨가 하였다.
참고: 좋은 혈관 준비는 일관 되 고 정확한 결과를 얻기 위해 중요 합니다. 내 피 성 무결성 검사가 불충분 하거나 KCl에 반응 하지 않으면 내 피 기능 또는 혈관 평활 근 수 축력을 나타내는 제제를 실험에 사용 하지 않아야 합니다. 이 경우, 제제는 동일한 혈관 또는 새로운 혈관 으로부터의 새로운 링으로 대체 되어야 한다.
2. 정규화는 최적의 초기 장력을 결정 하는
참고: 정규화 절차를 통해 혈관이 적절 한 휴식 mmHg (장 간 동맥에 대 한 100 또는 13.3 kPa)을 경험 하 고 최대 활성을 생성 하는 동맥의 최적의 내부 지름 (IC)을 결정할 수 있습니다. 혈관 활성 제에 반응 하 여 힘.
- 컴퓨터를 켜고 데이터 기록 소프트웨어를 엽니다 ( 재질 표참조).
- 원래 설정 파일을 덮어쓰지 않도록 새 이름을 사용 하 여 실험을 "LabChart 데이터 파일"로 저장 합니다.
- 정규화 설정 창을 열고 k 계수를 1로 설정 합니다. 접 안 렌즈 교정 (0.3 용기 길이를 알 수 없는 경우 또는 용기 길이를 알고 있는 경우 1)의 기본값을 적용 하 고, 목표 압력 (13.3), 온라인 평균 시간 (60) 및 지연 시간을 허용 합니다. 확인 을 클릭 하 여 설정을 저장 합니다.
- 관심 채널을 선택 하 고 와이어 지름 (40 µm), 조직 엔드포인트를 입력 합니다. a2: 측정 된 조직 길이), 정규화 창에서 초기 마이크로미터 판독값입니다.
- 첫 번째 수동 스트레치를 혈관에 적용 하 여 정규화 절차를 시작 합니다 (마이크로미터 나사를 반시계 방향으로 돌립니다).
- 선박이 안정화 될 때까지 기다린 후 (3 분) 정규화 창에 새로운 마이크로미터 판독값을 입력 합니다. 벽 장력이 자동으로 계산 되 고 그래프에 점으로 표시 됩니다.
참고: 패시브 스트레치 중에 사용 되는 마이크로미터 "단계"는 동일할 필요가 없습니다. 처음 몇 뻗는 각각 20 µm 수 있습니다. 스트레치가 isobar 선에 가까워지면 단계를 10 µm, 5 µm, 2 µm 또는 더 작게 줄일 수 있습니다. 마이크로미터 설정을 조정 하는 동안 메인 차트 창을 열어 둘 수 있습니다-길이/장력 그래프 (사전 결정 된 값에 해당 하는 압력 점을 나타냄)에서 isobar 라인을 초과 하는 큰 스파이크가 나타나면 장력을 줄이십시오. - 각각의 패시브 스트레치 후에는 115의 KCl을 함유 하는이 소 삼 투 고 칼륨 크 렙 스로 조절 크 렙을 교체 하십시오. 수축이 고원 (약 3 분)에 도달할 때, 칼륨 활성화 힘에서 각 스트레칭에서의 패시브 힘을 빼서 활성 힘 (F)을 기록 합니다. 벽 장력 뿐만 아니라 내부 원주 (IC) 값을 계산 합니다.
- 활성 장력을 기준선 위의 편향으로 측정 합니다. 상기 활성 장력 (T)은 수학식에 기초 하 여 계산 되 고 Tm(mn/mm) x 2 x 용기 길이 (mm). 내부 둘레 (IC) 값은 마이크로미터 데이터에서 계산 됩니다 (IC = 205.6 µm + 2 간격).
- 신선한 크 렙 스로 교체 하 여 높은 칼륨 상태를 제거 하십시오. 5 분 이상 세 번 반복 세탁 하십시오.
- 활성 장력이 감소 하기 시작할 때까지 2.5 단계를 반복 하 여 (수동 스트레치 2.8를 유도 하 고 대체 회전에서 활성 수 축을 유발) 합니다 (그림 2).
- 여러 번의 대체 신축이 끝난 후 수동 길이/인장 곡선은 IC100 mmHg의 내부 원주 값을 isobar 선과 교차 지점으로 서 100의 압력으로 제공 합니다.
참고: 패시브 스트레치 중 각 마이크로미터 값은 소프트웨어 정규화 모듈에 수동으로 도입 됩니다. 프로그램은 자동으로 상응 하는 힘 측정을 기록 하 여 수동 길이/장력 곡선을 생성 하 여 IC100의 값을 isobar 선 (그림 2, 오른쪽 패널)과 함께 교차점으로 제공 합니다. 마지막 점은 isobar 라인에 가까울수록 더 나은 정상화 보다는 혈관을 손상 시 키 지 않고 있습니다. Isobar 선 보다 너무 멀리 있는 점은 장착 된 용기를 물리적으로 손상 시켜 실험 중에 신뢰할 수 없는 결과를 초래 합니다. - 활성 길이/장력 곡선을 작성 하 여 IC1 값을 결정 하 고, 이후 근 전도 실험에서이 유형의 혈관에 사용 되는 IC1/IC100의 비율로 정규화 k 계수를 계산 합니다.
주: 활성 길이/장력 곡선은 x 축의 마이크로미터 데이터에서 계산 된 IC 값과 y 축의 활성 장력을 플로팅하여 작성 됩니다. IC1 피크 플라토 영역 내에 있는 값입니다 ( 그림 2, 오른쪽 패널의 빨간색 트레이스). 활성 길이/장력 커브를 플로팅 하 고 IC1를 결정 한 후, 정규화 k 팩터는 IC1/IC100의 비율로 계산 됩니다. 정규화 k 계수를 기준으로, IC1로 표시 되는 기준선에 대 한 최적 IC는 수동 길이/장력 곡선에 나타납니다. 이 IC에 대 한 마이크로미터 설정은 곡선 아래에 나타나며 이후 근 전도 실험을 위해 마이크로 포지 셔 너를 설정 하는 데 사용 해야 합니다. 초기 장력 (T)은 목표 압력 (Pi) x IC/2 π와 동일 하 게 선박에 적용 되는 최적 힘 (F)이 T x 2 x 용기 길이와 동일 하다. - 높은 칼륨 크 렙 스를 철저히 씻어 내 고 준비를 30 ~ 45 분 정도 평형 화 시킵니다. 후속 실험 중에 활성 수축 응답만 기록 되도록 기저 장력을 "0"으로 재설정 합니다.
3. 페 닐 유도 수축
참고: 혈관 수축 반응을 유도 하기 위해 선택 될 수 있는 약물은 비 특이 적 아드레날린 수용 체 작용 제 노르, 선택적 α-1 아드레날린 수용 체 작용 제 페 닐, 안 지 오 텐 신 2 II, 및 모노 아민을 포함 한다 신경 전달 물질 5-트립토판. 페 닐는 시험 (재료 표)에 대 한 본 의정서에 사용 된다.
- 1.3 절에 설명 된 바와 같이 쌍을 이루는 동맥 고리를 준비 하 고 설치 합니다 (PVAT를 그대로 사용 하 고 다른 하나는 PVAT를 제거한 후 각 동맥의 인접 섹션에서 실험을 위해).
- 정규화 후 (2 절에서 설명) 크 렙 스를 포함 하는 챔버에 115 mM KCl 용액을 첨가 하 여 높은 칼륨 Krebs 완충 액으로 동맥 세그먼트를 사전 계약 합니다.
- (3 분), 고 칼륨을 세척 하 고 신선한 공기 크 렙 스 버퍼로 대체 하 여 수 축을 기다립니다. 5 분 이상 3 회 세탁을 반복 합니다.
- Kcl 자극을 반복 하 고 세 번 세척 한 후 kcl 자극으로 인 한 장력에서 기준선 장력을 빼서 KCl에 최대 수축 응답/장력을 기록 합니다.
- 마지막 수축과 세척 후, 챔버를 따뜻하고 기포로 된 크 렙 스 버퍼로 리필 하 고 다음 작업을 수행 하기 전에 동맥이 약 30 분 동안 회복 되도록 합니다.
- 각 챔버에 페 닐의 누적 량 (10 ~ 10 ~ 10-4 미터 의 절반 로그 증분)을 추가 하 여 정 동작 제제의 등각 투영 장력의 농도 의존적 증가를 유도 한다.
- 먼저 챔버에 저 농도의 작용 제를 첨가 하 여 시작 한다. 안정 된 수축에 충분 한 시간을 허용한 후 (3 ~ 5 분) 다음 농도를 추가 하십시오. 페 닐 농도가 증가할수록 단계를 반복 합니다.
- 아 고 니스 트 (페 닐)의 마지막 복용량을 추가 한 후, 약물을 철저히 씻고 신선한 크 렙 스 버퍼로 챔버를 리필 하십시오. 농도 의존적 응답을 KCl로 유도 되는 최대 수축 률의 증가 비율로 플로팅합니다 (그림 3).
- 선택적 NO의 기여를 평가 하기 위해, 페 닐를 첨가 하기 전에 30 분 동안 NO 신 타제 억제제, L 이름 (104m)을 사용 하 여 제제를 배양 한다. L-이름은 장 간 막 동맥의 정 동작 준비에서 페 닐 유도 된 수축이 향상 됩니다 (그림 4).
참고: 억제제 또는 길 항 제는 평형 화를 달성 하기에 충분 한 시간을 가져야 합니다 (일반적으로 30 ~ 45 분). - 제 2 농도-응답 곡선을 순차적으로 수행 하는 경우, 톤의 더 이상 변화가 관찰 되지 않는 한 이전 작용 제의 모두를 제거 하기 위해 챔버를 완전히 반복적으로 세척 한다.
참고: 평행 실험은 동일한 혈관에서 주 작동 근에 게 서 얻은 적어도 2 개의 고리를 노출 하 고, 제어 조건 하에서 하나는 억제제 (들)의 존재 하에 하나; 각 링에서 농도-응답 곡선은 한 번만 수행 됩니다. 이는 약물의 작용 및 혈관 민감성에 대 한 더 나은 제어를 제공 하기 때문에 평행 실험을 수행 하는 것이 바람직하다. 시리얼 실험은 단일 고리에서 작용 제에 대 한 농도-응답 곡선을 얻는다; 세척 하 고 실험 조건 (예: 억제제 추가)을 변경한 다음 동일한 고리에서 농도 응답 곡선을 반복 합니다. 이 경우 시간 제어는 약물 응답이 시간이 지남에 따라 조직의 변화로 인 한 것이 아니라는 것을 보여주기 위해 필요 합니다. 하나는 조직이 농도 반응 실험에 노출 된 후에 정확히 동일한 상태에 있다는 것을 확신할 수 없다. 충분 한 시간 (최소 30 ~ 60 분)은 용기 세그먼트가 자신의 휴식 (기저) 장력으로 돌아갈 수 있도록 주어져야 합니다. 어떤 경우에는 수용 체에서 높은 친화도 작용 제의 해리 후 즉시 발생 하지 않을 수 있습니다. 또한, 높은 칼륨 크 렙 스는 탈 감 작28을 감소 시키기 위해 누적 농도 반응 곡선 사이에 적용 될 수 있다. 대부분의 길 항 제는 완전히 씻어 낼 수 없으므로 실험의 나머지 부분에 계속 추가 해야 합니다.
4. 내 피 의존성 이완/수축
- 새로 장착 된 동맥 세그먼트를 사전 계약 (3.2 단계에서 3.5에 설명 된 대로). 다시 말하지만, KCl 자극으로 인 한 장력의 기준선 장력을 빼서 KCl에 대 한 최대 수축 응답/장력을 기록 합니다.
- 선택적 U46619을 첨가 하기 전에 30 분 동안 NO 신 타제 억제제, L 이름 (104m)을 사용 하 여 제제를 배양 한다.
- U46619의 미리 계산 된 농도를 챔버에 추가 하 고 동맥 세그먼트의 안정적이 고 지속적인 수 축을 허용 합니다.
참고: 혈관 확장 반응은 115 mM KCl에 대 한 최대 응답의 약 80%로 사전 계약 된 장 간 동맥에서 유도 됩니다. 다른 촉진제는 그들의 특정 수용 체의 활성화에 의해 수 축을 유도 하는 데 사용 됩니다. 여기에서 PVAT가 있거나 없는 혈관 세그먼트는 U46619로 사전 계약 됩니다 (1 ~ 3 x 10-8m ; 물질의 표), 트로 코 박스 네 A2 수용 체 작용 제, 안정적이 고 지속적인 평활 근 수 축을 유도 한다. - 장기 실에 아 세 틸 콜린 (10 ~ 10 ~4m )의 누적 농도를 추가 합니다. 동맥 세그먼트의 농도 의존적 혈관 확장 반응은 U46619 유도 된 수축 반응의 백분율로 제시 됩니다 (그림 5).
참고: 대부분의 실험에서, 다음 농도의 이완 작용 제를 즉시 첨가 하 여 긴장이 긴장에 반동 하는 것을 방지 하는 것을 관찰 해야 합니다. 동맥 세그먼트의 농도 의존성 혈관 확장 반응은 U46619 유도 된 수축 반응의 백분율로 정상화 되어 신경 분포의 사소한 차이와 동맥 세그먼트 사이의 직경을 조정 합니다 (그림 5). 6 개 이상의 실험 그룹이 통계적으로 분석 될 때 동일한 혈관에서 얻은 개별 고리 사이의 응답성에 있는 작은 variabilities가 최소화 됩니다. 개별 조직의 최대 수 축의 백분율로 응답을 표현 하는 경우, 쌍을 이루는 분석 (예: 페어링된 학생의 t 검정)을 사용 하 여 서로 다른 동물에서 동일한 유형의 조직 반응을 비교 하는 것이 적절 합니다. 개입 전후 단일 조직의 반응. PVAT의 효과를 분석할 때 양방향 ANOVA를 사용 하 여 다중 비교 테스트를 수행 합니다. - 이완 작용 제의 최종 용량을 추가한 후, 각 챔버에서 약물을 제거 하 고 신선한 Krebs 완충 액으로 리필 하십시오. 크 렙 스 버퍼로 챔버를 깨끗이 씻고 추가 실험을 수행 하기 전에 적어도 45 분 동안 동맥을 안정화 시키십시오.
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Representative Results
정규화 인자 k 를 구하는 길이/인장 관계의 시험
혈관 세그먼트에 적용 되는 스트레칭의 양은 액 틴의 상호 작용의 정도에 영향을 미치며, 따라서 최대의 활성 력이 개발 되었습니다. 따라서, 모든 유형의 혈관에 대해, 최대 활성 력에 필요한 스트레칭 양을 결정 하는 것은 적절 한 근 전도 연구에 필요 합니다. 여기서, 길이/장력 관계의 정상화는 마우스 모델 로부터 분리 된 장 간 막 동맥에 대해 수행 된다 (도 2). 동맥 세그먼트는 스테인리스 핀 (40 μ m 직경)에 있는 4 개의 약 실 철사 myograph 체계 ( 물자 표참조)에서 중단 되었습니다. 등각 투영 장력은 기록 프로그램으로 컴퓨터에 연결 된 아날로그-디지털 컨버터를 사용 하 여 기록 하였다. 챔버에는 크 렙 스 완충 액 5Ml가 포함 되어 있으며, 실험 전체에서 7.4에서 pH 를 유지 하기 위해 37 ° c로 유지 하 고 95% O2 및 5% co2로 포 르 화 시켰다. 수 동적 길이/인장 관계는 100 mmHg 트랜스 뮤 럴 압력 (IC100)에 상응 하는 내부 둘레가 얻어 질 때까지 동맥 세그먼트의 증분 연신에 의해 확립 되었다. 각 스트레칭 (파란색 화살표) 후에는 수축 (녹색 화살표)을 자극 하는 115 mM KCl을 적용 했습니다. 상기 활성 길이/장력 곡선 (red)은 Y 축에서 활성 힘 데이터 (각각의 스트레칭에서의 패시브 힘을 빼서)를 추출 하 여 플롯 한 다음 마이크로미터에서 계산한 IC 값을 사용 하 여 수동으로 그래프를 작성 하였다 X 축의 데이터입니다. 피크 고원 내에 놓여 있는 IC 값은 IC1 (빨간색 파선)입니다. 정규화 인자 k 는 IC1/IC100 비율로 계산 되었고, 이어서 후속 실험에서 동일한 용기 타입의 샘플에 적용 될 수 있었다.
농도 응답 곡선의 프리젠테이션 및 계산
대부분의 농도-응답 곡선은 누적 방식으로 수행 됩니다. 저 농도의 작용 제는 욕에 첨가 된다 (바람직하게는 반응에 대 한 임계치 이하의 농도로 시작). 가능한 응답 (3-5 분) 동안 충분 한 시간을 허용한 후에 다음 농도가 추가 됩니다. 응답이 관찰 되 면 다음 최대 응답을 획득 하기 전에 고원에 도달할 수 있습니다. 페 닐의 농도에 있는 반 로그 (평균 3.16 겹) 증가는 작용 제 유도 한 수 축을 연구 하기 위하여 여기에 적용 됩니다 (그림 3 와 그림 4).
대부분의 경우, 수축-응답 곡선은 개별 혈관 세그먼트의 길이/장력 곡선의 최적 지점에서 얻어진 KCl에 대 한 기준 응답의 백분율로 서 인장/힘의 원시 값으로 표현 되지 않는다. 이는 혈관의 크기 또는 평활 근 함량의 가변성을 조정 하 고 노화 또는 병리학으로 인 한 리 모델링 변화를 교정 합니다. 여기에서, 115 mM KCl에 의해 유도 되는 최대 수축은 실험의 시작 부분에서 얻어 지 고 또는 PVAT의 유무에 상관 없이 장 간 막 동맥의 페 닐 자극 된 수축 계산에 사용 됩니다 (그림 3 및 그림 4).
이완을 일으키는 촉진제를 연구 하기 위해, 혈관은 일반적으로 균일 한 수준으로 수축 됩니다-그 조직의 최대 수축 반응의 약 50-80%. 페 닐 유도 된 수축에 대 한 반응이 실험 그룹 간에 다르기 때문에, 본 프로토콜은 아 세 틸 콜린의 누적 농도를 적용 하기 전에 안정한 수 축을 자극 하는 U46619를 사용 한다. 평활 근 이완은 U46619에 의해 유도 된 초기 수축에 대 한 백분율로 표현 된다 (도 5).
농도-응답 곡선은 같은 반응을 생성 하는 농도를 결정 하 여 왼손잡이 또는 오른쪽 시프트 (예를 들어, 제어 곡선과 길 항의 존재에서 얻은 것 들 사이)의 존재와 비교 될 수 있다, 예를 들어, 30% 또는 50%의 최대. 이들은 각각 EC (30 ) 및 ec50이라고 불린다 (도 3b). 평균 EC50 값의 통계적 비교는 해당 값의 로그에 대해 수행 되어야 합니다. 커브의 우울증은 각각의 최대 응답 (그림 3b)을 비교 하 여 검사 합니다. 도시 된 예 들에서, 장 간 동맥에서의 페 닐 유도 된 수축은 L-이름 및 농도 응답 곡선에 의해 강화 되었고 최대 수축에 대 한 고도 뿐만 아니라 왼손잡이 시프트를 보였다 (도 4b). 장 간 동맥에서 아 세 틸 콜린 유도 이완은 L-이름에 의해 억제 되었고, 농도-응답 곡선은 최대 이완에 대 한 감소 뿐만 아니라 오른쪽 위를 보였다 (도 5b).
다양 한 약리학 적 제제에 대 한 혈관 반응은 비선형 로지스틱 회귀 분석을 사용 하 여 각각 완화를 위한 수축 및 영역-이완 곡선 (AARC)에 대 한 수축 곡선 (AUCC)으로 계산 될 수 있다 비교 분석10 (도 3C, 도 4c 및 도 5c). L-이름의 효과는 생물학적 이용 가능성을 결정 하기 위해 AUCC/AARC의 값에 의해 비교 될 수 있다 (그림 6). PVAT 유무에 관계 없이 장 간 동맥에서 NO의 기저 및 자극 된 방출은 페 닐 수축 (DAUCC) 및 아 세 틸 콜린 유도 이완 (DAARC)의 농도 반응 곡선의 차이로 표현할 수 있습니다. 각각의 L-이름 (도 6a 및 도 6b)의 존재 또는 부재 하에. 도시 된 예에서, PVAT의 존재는 고 지방 식이로 공급 된 쥐에서 채취한 장 간 동맥에서의 생체 이용률을 감소 시켰다 (도 6c).
그림 1: 동맥 벽 구조의 개략도. 내 피 세포는 혈관 평활 근의 내 피의 의존적 이완/수축을 매개 하는 반면, 혈관 주위 지방 조직 으로부터 방출 된 신호는 동맥 벽의 상이한 층 들 사이의 교차 회담을 변조 한다 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 2: 마우스 장 간 막 동맥에 대 한 최적의 초기 장력을 결정 하기 위한 실험을 나타낸 대표적인 트레이스. 상기 혈관 세그먼트는 표준 차 우 (A) 또는 고 지방 식이 (B)로 공급 된 16 주 오래 된 마우스에서 채취한 장 간 동맥 으로부터 제조 되었다. 장착 후, 수동 및 능동 길이/인장 곡선은 115의 KCl (좌측 패널)을 이용한 단계별 스트레칭 및 순차 자극에 의해 얻어진 다. 각 자극과 함께 생성 된 활성 수축은 혈관이 최적의 길이로 고원에 도달할 때까지 점진적으로 뻗어 서 증가 해야 합니다. 또한 스트레칭은 활성 수 축의 감소로 이어질 것입니다. IC100 및 IC1는 수동 및 활성 길이/장력 곡선을 각각 (오른쪽 패널)으로 플로팅하여 결정 되었습니다. 패시브 길이/장력 곡선은 마이크로미터 값을 수동으로 입력 한 후에 정규화 모듈에 의해 생성 되었으며 KCl의 각 단계에서 장력 및 IC 값을 계산한 후 수동으로 플롯 된 활성 길이/긴장 곡선 자극. IC1/IC100 비율은 정규화 k 계수 (오른쪽 패널)로 계산 되었습니다. ). 또한 활성 길이/장력 곡선의 마지막 네 점만 패널 (B)의 그림에 표시 되었습니다. STC: 표준 차 우 먹이 마우스 동맥; HFD: 고 지방 다이어트 먹이 마우스 동맥. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 주변 PVAT 유무에 관계 없이 장 간 동맥에서 페 닐 하는 혈관 수축 반응의 출력 기록. 수축 성 연구는 16 주 오래 된 Adipo-SIRT1 형질 전환 마우스에서 장 간 막 동맥의 준비에 수행 되며, 여기서 인간 SIRT1은 지방 조직에서 선택적으로과 발현 된다29. 페 닐의 누적 농도는 (-PVAT) 또는 (+ PVAT) 없이 장 간 막 동맥의 수 축을 자극 하기 위해 적용 되었다. 수축 응답은 115 mM KCl로 유도 된 최대 수축 (B)의 백분율로 기록 되 고 계산 되었다. 비교 (C)를 위해 수축 곡선 (aucc)의 면적이 플롯 되었습니다. Adipo-SIRT1 마우스에서 PVAT는 페 닐에 대 한 응답에 대 한 수축 효과를 나타내어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 혈관 수축 반응의 출력 기록은 주변 PVAT가 있거나 없는 장 간 동맥에서 페 닐, 그리고 L-이름의 부재 또는 존재 하에. 장 간 동맥은 고 지방 식이로 공급 된 16 주 된 야생 형 마우스에서 채취 하였다. 10- 4m L-이름 또는 차량 제어를 추가한 후 30 분, 페 닐의 누적 농도는 장 간 막 동맥 (A)의 수 축을 자극 하기 위해 적용 되었다. 수축 응답은 115 mM KCl로 유도 된 최대 수축 (B)의 백분율로 기록 되 고 계산 되었다. 비교 (C)를 위해 수축 곡선 (aucc)의 면적이 플롯 되었습니다. 식이 비만 마우스에서 PVAT는 페 닐에 대 한 응답에 안티 수축 효과를 유도 하지 않았다. – PVAT: 동맥 링 PVAT 없이 준비; + PVAT: 동맥 링 주변 PVAT와 함께 준비; L-이름: 동맥 고리 L-이름으로 인큐베이션 되지; + L 이름: 동맥 고리 L-이름으로 인큐베이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 장 간 동맥에서 아 세 틸 콜린에 대 한 혈관 확장 반응의 출력 기록 주변 PVAT가 있거나 없는, 그리고 L-이름의 부재 또는 존재. 장 간 동맥은 고 지방 식이로 공급 된 16 주 오래 된 쥐에서 수집 되었다. 10-4m L 이름 또는 차량 제어를 추가한 후 30 분 후에 pvat가 있거나 없는 혈관 세그먼트는 U46619 (1-3 x 10-8m 로 사전 계약 됩니다. 물질의 표), 트로 코 박스 네 A2 수용 체 작용 제, 안정적이 고 지속적인 평활 근 수 축을 유도 한다. 아 세 틸 콜린의 누적 농도는 주변 PVAT (A) 없이 장 간 막 동맥의 이완을 자극 하기 위해 적용 되었다. 이완 반응은 U46619 유도 된 수축 (B)의 백분율로 기록 되 고 계산 되었다. 위의 영역-이완 곡선 (C) 비교를 위해 플롯 되었습니다. 주변 PVAT가 있는 동맥 세그먼트만 패널 A에 표시 됩니다. – PVAT: 내 동맥 고리는 PVAT 없이 준비; + PVAT: 동맥 링 주변 PVAT와 함께 준비; L-이름: 동맥 고리 L-이름으로 인큐베이션 되지; + L 이름: 동맥 고리 L-이름으로 인큐베이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
도 6: 생체 이용률을 계산 하지 않는 절차의 예시. 수축-언더-커브 (AUCC)와 영역-이완-커브 (AARC)는 각각 페 닐 및 아 세 틸 콜린의 누적 농도에 대 한 반응에 기초 하 여 계산 하였다. L-이름 없이 사전 처리 된 제제 간의 차이는 ∆ AUCC (A) 및 ∆ Aarc (B)로 정의 되어 기저 없이 기여를 나타내고 각각의 방출을 자극 하지 않습니다. 이에 따라, ∆ AUCC ( 도 4c로부터 계산 된), ∆ Aarc ( 도 5c에서 계산) 및 주변을 포함 하지 않고 장 간 막 동맥에서의 생체 이용률을 비교 하기 위한 양자 (총 생체 이용률 없음)의 합계가 제시 되었다 PVAT (C). – PVAT: 동맥 링 PVAT 없이 준비; + PVAT: 동맥 링 주변 PVAT와 함께 준비; L-이름: 동맥 고리 L-이름으로 인큐베이션 되지; + L 이름: 동맥 고리 L-이름으로 인큐베이션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
내 피 세포 외에 PVAT에서 유래한 신호는 평활 근 톤 반응성의 조절에 중요 한 역할을 한다 (30). 건강 한 pvat는 비만 및 대사 증후군31,32와 같은 병리학 적 상태에서 손실 되는 동맥에 대 한 항 수축 효과를 발휘 하는 NO 및 항 염증 adiponectin을 방출 합니다. 질병 상태에서 pvat는 내 피 세포 기능 장애 및 기타 심혈 관 이상33,34의 발달에 기여 합니다. 비정상적인이 노스의 표현과 기능은 비만 동물35,36에서 동맥의 pvat에서 보고 되었습니다. 혈관 내 피 및 pvat 장애는 심혈 관 및 대사 이상 (23)의 발달에 기여 하기 때문에,37, 전 생체 혈관 실험을 수행 하는 경우, 그들의 역할을 포함 하 여 고려 되어야 한다 또는 준비에서 제거 합니다.
와이어 myography 시스템은 다양 한 약리학 적 프로브10,38을 사용 하 여 pvat에서 방출 되는 혈관 활성 신호를 분석할 수 있는 편리한 플랫폼을 제공 합니다. 그러나 다른 유형의 동맥, 또는 다른 유전 배경의 동물에서 같은 동맥의 PVAT에 있는 조성 물은 동일 하지 않습니다39. 따라서, PVAT를 포함 하는 철사 myography 결과는 다른 긴장의 쥐에 게 서 동맥의 다른 모형 또는 동일한 종류에 걸쳐 비교 되어서는 안됩니다. 나 이와 기저 질환 상태는 PVAT의 세포 조성 물에도 영향을 미친다. 여기서, 동일한 유전 적 배경에서의 마우스는 그들의 지방 조직에서 상이한 유전적 변형을 가지 며 PVAT의 혈관 변조 활성을 비교 하기 위해 사용 되었다.
혈액 흐름에 대 한 저항의 주요 근원으로, 장 간 동맥은 현재 연구를 위해 선택 됩니다. 휴식 장력은 혈관 운동 반응40의 양을 결정 합니다. 혈관의 최적의 초기 장력은 동물의 동맥, 나이, 식이 요법, 치료 및 유전 적 배경의 유형에 영향을 받으며 이완/수축-응답 곡선을 검사 하기 전에 개별적으로 결정 해야 합니다. 본 데모를 위해, 우수한 장 간 동맥은 4 주의 나이부터 시작 하는 표준 차 우 또는 고 지방 규정식에 공급 된 16 주 오래 된 쥐에서 수집 되었습니다. 본 프로토콜은 약리학 적 반응을 평가 하기 전에 동맥 세그먼트의 최대 활성 힘 생산을 위한 최적 설정의 확립을 강조 합니다. 사내 마우스 모델에서 수집 된 장 간 동맥에 대해 수동 및 활성 길이/인장 관계를 모두 연구 합니다. 기본 값 0.9 또는 이전 출판41에서 사용 하는 것과 다른 16 주 오래 된 동물의 준비를 위해 정규화 k 계수가 1로 설정 되었습니다. 기술, 버퍼 구성 및 계기 모델 등의 가능한 차이로 인해 문헌에 있는 정규화 비율을 비교할 때 주의가 필요 합니다. 특히, 나이, 규정식 및 그밖 병 리 생리학적 조건은 동맥42의 약물 역학 특성 뿐 아니라 수동적인 활동적인 긴장에 영향을 미칩니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
홍콩 연구 보조금 위원회 (17124718 및 17121714), 홍콩 건강 및 의료 연구 기금 [13142651 및 13142641], 홍콩 공동 연구 기금 [C7055-14G] 및 국가 기본 보조금을 통해 재정적으로 지원을 받았습니다. 중국의 연구 프로그램 [973 프로그램 2015CB553603].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetylcholine | Sigma-Aldrich | A6625 | Stock concentration: 10-1 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| L-NAME (Nω-nitro-L-arginine methyl ester) | Sigma-Aldrich | N5751 | Stock concentration: 3 x 10-2 M Working concentration: 10-4 M |
| Phenylephrine | Sigma-Aldrich | P6126 | Stock concentration: 10-2 M Working concentration: 10-10 to 10-5 M |
| U46619 (9,11-dideoxy-9α,11αmethanoepoxy prostaglandin F2α) | Enzo | BML-PG023-0001 | Stock concentration: 10-5 M Working concentration: 1-3 x 10-8 M |
| Multiwire myograph | Danish MyoTechnology (DMT) | 620M | |
| PowerLab 4/26 | ADInstruments | ML848 | |
| Labchart7 | ADInstruments | - | |
| Adipo-SIRT1 wild type mice | Laboratory Animal Unit, The University of Hong Kong | CULATR NO.: 4085-16 | |
| Silicon-coated Petri dishes | Danish MyoTechnology (DMT) | ||
| Tungsten wires | Danish MyoTechnology (DMT) | 300331 | |
| Surgical tools |
References
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