Summary
אנו מתארים הליכים לעיבוד רקמות המוח היילוד הנולד כדי להשיג מיקרוגרפים אלקטרונים ברזולוציה גבוהה עבור ניתוח מורמטרי של הפצת שלפוחית סינפטית במסופי העצבים. המיקרוגרפים שהושגו בשיטות אלה יכולים לשמש גם לחקר המבנה של מספר רכיבים סלולאריים אחרים ולמערכות היחסים המבדיות שלהם.
Abstract
המעבדה שלנו ורבים אחרים ניצלו את העוצמה הגבוהה ביותר של מיקרוסקופ אלקטרוני שידור לחקר המבנה והארגון המרחבי של שלפוחיות סינפטית. כדי להשיג מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה שיכולים להניב את מידת הפירוט המוורפולוגית הנחוצה לניתוח כמותי של התפלגות טרום-סינפטית, הכנת הדגימה האופטימלית היא קריטית. קיבעון כימי הוא הצעד הראשון בתהליך של הכנת הדגימה, ועל חשיבות עליונה כדי לשמור על מבנה בדיקת אולטרה. קיבוע כלי דם עם פתרון הגלוטאלדהיד-פורמלדהיד, ואחריו טיפול של דגימות הרטט מנות עם אוסמיום tetroxide, מייצב את המספר המרבי של מולקולות, בעיקר חלבונים ושומנים, ותוצאות שימור מעולה של מבנה האולטרה. הרקמה מעובדת לאחר מכן עם כתמים, התייבשות רציפה, שרף הטבעה. הגוש בלוקים עם אצטט uranyl (כלומר, כתמים של רקמת הרטט לפני הטבעה שרף) משפר את ניגודיות אנדוגניים ומייצב הרכיבים התא נגד החילוץ במהלך עיבוד הדגימה. ניגודיות יכולה להיות נוספת מוגברת על ידי החלת אצטט uranyl כמו כתם על מקטעים באולטראדקים. כתמים כפולים של סעיפים בודק עם עופרת ציטראט לאחר הטיפול uranyl אצטט גם משפר את רזולוציית התמונה, על ידי העצמת אלקטרון-אטימות של חומצות גרעין-המכיל מבנים באמצעות קשירה סלקטיבית של להוביל אצטט uranyl. מיקרוסקופ אלקטרוני שידור הוא כלי רב עוצמה לאפיון הפרטים המיורפולוגיים של שלפוחיות סינפטית וקוונפיקציה של גודל וארגון מרחבי בבוטון. עם זאת, כיוון שהיא משתמשת ברקמה קבועה, מיקרוסקופ אלקטרוני שידור יכול לספק מידע עקיף רק לגבי תהליכים חיים או מתפתחים. לכן, יש לשקול טכניקות אחרות כאשר המטרה העיקרית היא ללמוד היבטים דינמיים או פונקציונליים של סחר שלפוחית סינפטית ואקסוציטוציטוזה.
Introduction
אנו מתארים שיטות להכנת רקמת המוח היילוד הנולד כדי להשיג מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה עבור ניתוח שורמטרי מעמיק של התפלגות מרחבית סינפטית ושלפוחית במסופים עצביים1,2. מיקרוגרפים בעלי ניגודיות גבוהה הניתנים להשגה על-ידי עיבוד דגימות בעקבות שיטות אלה ניתן להשתמש גם כדי ללמוד את המבנה המפורט של מספר רכיבים סלולריים ויחסי מבניים תלת-ממדיים שלהם3,4.
מיקרוסקופ אלקטרוני שידור (TEM) הוא כלי רב עוצמה כדי ללמוד את המבנה של האורגלים ומבנים סלולריים אחרים כימות. נכון לעשור זה, אין שיטות חקירה אחרות שיכולות לספק את אותה מידת הרזולוציה של קרום השומנים והאורגלים ללא התיוג האנטי-אימונו, למעט הקריוקיבעון באמצעות קיפאון בלחץ גבוה. עם זאת, הקפאת טכניקות החלפה אינן בשימוש נרחב, ובדרך כלל דורשים ציוד יקר וזמני הכנה ארוכה.
כדי לנצל את הכוח לפתרון גבוה של TEM, הכנת הדגימה אופטימלית היא בעלת חשיבות עליונה. המטרות העיקריות של הכנת הדגימה הם לשמר מבנה רקמות עם שינוי מינימלי ממצב החיים, לשפר את הניגודיות הדגימה, ולייצב את הרקמה נגד הפקת רכיבים סלולריים במהלך עיבוד וחשיפה לאלקטרון קרן. פרוטוקולים רבים עבור הכנה רקמת TEM הוכנסו ושכללו על ידי מעבדות מספר במהלך השנים. רבים מהם התמקדו בשיטות להדמיה אופטימלית של שלפוחית הסינפטית5,6,7,8,9,10,11. בין מספר שיטות שנקבעו היטב, תקן זהב כיום בשימוש, בחרנו הליכי קיבוע כימיים, קיבוע קיבעון, בלוק כתמים, התייבשות סדרתית, שרף הטבעה ולאחר צביעת המטרה לשמר את מבנה הרקמה אופטימלית להשיג ניגודיות תמונה מעולה. של הערה, שימור של מבנה בדיקת אולטרה יכול להיות מאתגר במיוחד כאשר עובד עם רקמת המוח היילוד. למעשה, מערכת העצבים המרכזית של בעלי חיים צעירים מאוד מתאפיינת בתוכן מים גבוה יותר מאשר המוח המבוגר, התרחבות בולטת יותר של חללים מחלתיים, וקשרים משוחררים בין תאים12. זה הופך את רקמת המוח הנולד היילוד רגיש עמוקות לשינויים באוסמלתיים, ונוטה להפליא הצטמקות העובדתית ו/או נפיחות כאשר מעובד באמצעות פתרונות רציפים של גוונים שונים12. לכן, השיטות שלנו המועסקים פתרונות עבור עיבוד דגימה כי הם של האוסמלכי קרוב ככל האפשר זה של המוח הנולד החולדה. המטרה שלנו היתה להשיג תמונות באיכות גבוהה, ברזולוציה גבוהה אלקטרון מיקרוסקופ עבור הערכה כמותית של התפלגות סינפטית ושלפוחית מרחבית במסופי העצבים. במיוחד, ביקשו למדוד את מספר השלפוחיות בתוך מסוף העצבים, את המרחק של שלפוחיות סינפטית מקרום פלזמה טרום סינפטית, מספר שלפוחיות מעוגן בקרום טרום סינפטית, בגודל של שלפוחיות סינפטית וה מרחקים בין-שלפוחית1.
קיבעון כימי משביע רצון הוא תנאי הכרחי להשגת מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה שיכולים לספק את הפרטים המיקרוורפולוגיים הנחוצים לחקר המבנה הסינפטית והארגון המרחבי. למרות מספר מצבים של קיבעון להתקיים, קיבעון של רקמת המוח על ידי זלוף כלי דם הוא בהחלט מעולה על שיטות אחרות. כיוון שקיבעון באמצעות פרזיה וסקולרית מתחיל מיד לאחר מעצרו של מחזור מערכתי, הוא מקצר את המרווח בין הדחמצן של רקמת המוח והקישור החוצה של חלבונים עם fixatives וכתוצאה מכך שינויים מינימליים בתא בנה. יתר על כן, זה משיגה חדירה מהירה ואחידה, בגלל הזרימה המהירה של הקיבעון מן המיטה כלי הדם אל המלושה תאים סלולריים12,13,14. הקיבעון הראשוני עם glutarאלדהיד, ואחריו קיבעון משני (פוסט קיבעון) עם אוסמיום tetroxide, תשואות מעולה של המבנה המשובח15,16,17. תערובת של גלוטרלדהיד ו פאראפורמלדהיד יש יתרון נוסף של חדירה מהירה יותר לתוך הרקמה12.
מאחר שרקמות ביולוגיות אינן נוקשות מספיק כדי לחתוך לחלקים דקים ללא תמיכה של מטריצה שרף, הם צריכים להיות מוטבע בתוך מדיום לפני דק. Immiscible מים שרפים אפוקסי משמשים בדרך כלל כמדיום הטבעה ב TEM. כאשר סוג זה של מטריצה משמש, כל המים חינם של הדגימה חייב להיות מוחלף ממס אורגני לפני הסתננות שרף. המים מוסרים על ידי העברת הדגימה דרך סדרה של פתרונות של ריכוזים עולים של אתנול ו/או אצטון12. בפרוטוקול זה, דגימות הן השטוח הראשון המוטבע בין גיליונות aclar גמישים, ולאחר מכן מוטבע בקפסולה. התוצאה הסופית היא רקמה ממוקמת בקצה של בלוק שרף גלילי, אשר יש את הגיאומטריה האידיאלית להיות מושפע לפחות על ידי תנודות הנובעות במהלך החסימה מיקרוטומה.
כתמים עם מתכות כבדות כדי לשפר את הניגודיות רקמת אנדוסוגני הוא היבט חשוב אחר של הכנת הדגימה. ניגודיות תמונה ב-TEM נובעת מפיזור אלקטרון על ידי האטומים ברקמה. עם זאת, חומרים ביולוגיים מורכבים ברובו מולקולות של משקל אטומי נמוך (כלומר, פחמן, מימן, חמצן וחנקן). לפיכך, הדור של ניגוד פיזור מספיק דורש התאגדות של אטומי משקל אטומי גבוה לתוך הרכיבים הסלולריים של הרקמה. זה מושג באמצעות כתמים של הדגימה עם מתכות כבדות12,18,19. Osmium tetroxide, אורניום ועופרת, אשר לאגד חזק לשומנים, הם המתכות הכבדות הנפוצות ביותר המשמשים כתמי אלקטרונים.
אוסמיום (מספר אטומי 76) הוא אחד מהמתכות הדפססט ביותר הקיימות. זה גם קבע וגם כתם, למרות תפקידה העיקרי ב TEM הוא כמו קבע אמינה12. בין פרוטוקולי קיבוע שונים בשימוש, השיטה של קיבעון כפול עם glutarאלדהיד ואחריו אוסמיום הוא היעיל ביותר בהפחתת החילוץ של המרכיבים התא במהלך הכנת הדגימה. שני התיקונים הללו משמשים לייצוב המספר המירבי של סוגים שונים של מולקולות, במיוחד חלבונים ושומנים, ולגרום לשימור מעולה של מבנה הרקמה12,14,15, מיכל בן 16 , . שבע עשרה
אורניום (מספר אטומי 92) הוא המתכת הכבדים ביותר המשמשת ככתם אלקטרוני, בדרך כלל בצורה של אצטט uranyl. בדומה לאוסמיום, היא משמשת ככתם ומfixative, למרות שתפקידה העיקרי ב-TEM הוא ככתם20,21. חומצות גרעין המכילים ו קרומי מבנים הם באופן מאוד ומהנה מוכתם עם מלחים uranyl ב אלדהיד-קבוע רקמות22,23. טיפול ברקמות עם אצטט uranyl לאחר osmication ולפני התייבשות תוצאות ייצוב של קרומי ו גרעין חומצות המכילות מבנים, כמו גם ניגודיות משופרת, והיתרי זיהוי של כמה פרטים מבניים שלא להיות מזוהה בקלות בדגימות ויטראז ' עם אוסמיום לבד12,24,25. הוא חשב כי אצטט uranyl יכול לייצב את המבנה המשובח על ידי שילוב עם אוסמיום מופחת כי כבר הופקד על ממברנות שומנים במהלך osmication24. הניגודיות המירבית מושגת כאשר אצטט uranyl מוחל לפני הטבעה כמו לאחר כתם בסעיפים דקים12.
עופרת (מספר אטומי 82) הוא הכתם השכיח ביותר המשמש עבור TEM והוא מועסק בעיקר עבור לאחר כתמי של סעיפים דקים. מלחי עופרת יש אטימות אלקטרון גבוהה ולהראות אהדה עבור מגוון רחב של מבנים סלולריים, כולל ממברנות, חלבון cytoplasmic חלבונים, חומצות גרעין וגליקוגן26,27. כאשר שיטת הצביעה כפול מועסק (כלומר, כתמים עם אצטט uranyl מלווה בטיפול עם העופרת), האחרון משמש כמפתח של כתמים אצטט uranyl. למשל, עופרת לאחר צביעת כרומטין קבוע עם glutarאלדהיד מגביר את uranyl אצטט ספיגה על ידי פקטור של שלושה28,29,30,31,32. עופרת גם מגביר את הצביעת הניתן על ידי מתכות אחרות כגון osmium. הוא חשב כי מלחים עופרת להכתים את הקרומים של אוסממיום רקמות קבוע על ידי הצמדת לקבוצת הקוטב של פוספהדים בנוכחות של אוסמיום מופחת33. חיסרון פוטנציאלי של הכתמים עם אצטט uranyl ולהוביל, במיוחד עבור משכים ממושכת, הוא כי רכיבים רבים שונים מבניים מוכתם באופן שווה ולא במיוחד, ולכן לא ניתן להבדיל בקלות אחד מהשני12 .
המבוא האחרון של מקורות אור חלופיים, כגון במיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה של תמונה מופעלת, השתפרה באופן משמעותי ברזולוציה מיקרוסקופ אור34. עם זאת, משום שמיקרוסקופ האור מסתמך על שיטות היסטכימיות והחיסונית-ציטוכימיה להמחיש באופן אינדיבידואלי חלבונים או אנזימים, הכוח של TEM להציג את כל האלמנטים מבניים בו נשאר מתחרות למחקר מעמיק של ה מורפולוגיה ויחסים ממדיים של מבני רקמה. במיוחד, אין טכניקה אחרת יכול לספק את הפרטים מורפולוגיים הדרושים כדי לבצע ניתוח מורמטרי של הפצת שלפוחית סינפטית סינפטיות בתוך בלוני עצבים טרום סינפטית. עם זאת, חשוב לציין כי מיקרוגרפים אלקטרונים ללכוד את מבנה הרקמה לאחר האורגניזם מת, ולכן הם לא יכולים לספק מידע לגבי הדינמיקה של סחר טרום סינפטית והיא האקסוציטוזה. מכאן, כלים אחרים, כגון הדמיה לחיות צבע FM ו תיקון-קלאמפ מהדק, צריך להיחשב כאשר המטרה העיקרית היא ללמוד דינמי ו/או פונקציונלי היבטים של סחר שלפוחית סינפטית ואקסוציטוזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים והשימוש באוניברסיטת וירג (שרלוטסוויל, VA) ונערכו בהתאם להנחיות המוסדות הלאומיים לבריאות.
1. קיבעון של וסקולזיה
הערה: תיאור כללי של השיטה למוח עכברוש זלוף כלי כבר מפורט בכתב העת הזה13 והוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה. עם זאת, השלבים הבאים הם ספציפיים להכנת רקמת המוח היילוד התינוק כדי להשיג מיקרוגרפים אלקטרונים באיכות גבוהה עבור ניתוח כמותי של התפלגות סינפטית ושלפוחיות במסופים טרום סינפטית.
-
הכינו 4% פאראמפורמלדהיד
- מקום 800 mL של 0.1 M פוספט מאגר (PB) בגביע 2 L זכוכית על צלחת ערבוב תחת משקה. מחממים כ-60 ° c מבלי להרתיח את המאגר.
- הוסף 40 גרם של אבקת פאראפורמלדהיד. מערבבים ברציפות
- בזמן מדידת pH, להוסיף טיפות קטנות של 10 N NaOH עד הפתרון מנקה. . החומציות הסופית צריכה להיות 7.2-7.4
- הוסף את שאר 0.1 M PB לנפח הסופי של 1 L. בואו להתקרר, לסנן עם קרום 0.45 יקרומטר ולאחסן ב 4 ° c בלילה.
הערה: הכינו פאראפורמלדהיד טרי ביום לפני הפרזיה.
זהירות: שאיפת אדי אלדהיד יכולה לגרום. לתסמינים באף ולגירוי דרכי הנשימה מגע עם העור גורם דרמטיטיס. אלדדס צריך להיות מטופל בתוך מכסה המנוע בזמן שלובש כפפות, שמלת הגנה ומשקפי בטיחות
-
הכנת תמיסת טירודה
- מקום 1 L של מים מזוקקים בגביע זכוכית על צלחת ערבוב. הוסף הוספה (8 גר'), KCl (0.15 g), CaCl2 (0.1 g), MgCl2 (0.006 g), נה2פו4 (0.055 g), נחקו3 (1 גרם) ו דקסטרוז (1 g) בגביע.
- מערבבים ברציפות ומודדים pH. לשמור על ה-pH בין 7.2 ו 7.4.
הערה: הפתרון הוא גם מסחרית זמין.
- מערבבים 4% פראפורמלדהיד עם glutarאלדהיד בריכוז סופי של 2%. הוסף 40 mL של אלקטרון מיקרוסקופ-כיתה 50% גלוטארלדהיד ל 1 L של 4% פאראמפורמלדהיד. מערבבים היטב בצלחת ערבוב
הערה: כ 100 מ ל של פאראפורמלדהיד-הפתרון fixtarאלדזה צריך לבשם הגוף של עכברוש היילוד. לכן, לפחות 10 חולדות היילוד ניתן לטפל עם 1 L של הfixative. אין לערבב פאראפורמלדהיד ו גלוטרלדהיד עד לשימוש מיידי. הביאו את כל הפתרונות לטמפרטורת החדר לפני הפרזיה. - לאחר הגישה לחדר השמאלי הגיע (לראות את כל החיים הקצה פרוטוקול13), ריקון מערכת כלי הדם עם פתרון tyrode עבור 30 s בלחץ היתוך של 120 mmhg.
הערה: הצלחת הפרזיה תלויה בחלק מההדרה המוחלטת של דם ממיטת כלי הדם - פלאש עם פרפורמלדהיד הפתרון באותו לחץ במשך 10 דקות.
הערה: תחזוקה של לחץ הפרזיה קבוע חיוני כדי למנוע הקדמה של חפצים. בנוסף, הטמפרטורה של המבשם לא צריכה להיות מתחת לטמפרטורת הגוף של החולדה כדי למנוע הרעלה - הסר את המוח הקבוע מהגולגולת ומקום בפרפורמלדהיד טרי-גלוטראלדזה מתוקן ב -4 ° c לילה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
2. חיתוך מוח
- להטביע את המוח קבוע ב 4% מעלה ולהדביק את המוח-בלוק מוחי על הבמה הרטט
הערה: מעבדות אחרות השיגו חלקים באיכות טובה על ידי השגת חסימה יציבה על הרטט מבלי תמיכה אגר - פרוסות מקטע של עובי של 50 יקרומטר. הגדר את המיקרוטומה לתדר נמוך ולמהירות נמוכה.
הערה: מקטעים ניתן לאחסן 0.1 M PB עם 0.05% נתרן אזיד ב 4 ° c במשך כמה שנים. - מניחים את הסעיפים ב 0.1 M PB בצלחת פטרי, לבחון את הסעיפים תחת מיקרוסקופ לנתיחה ולבחור דגימות להטבעה
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
3. שטיפה
הערה: חשוב לשטוף את הדגימה לאחר קיבעון עם אלהידס ולפני הקיבעון לאחר קיבוע עם אוסמיום, מאז תיקונים שיורית עשוי לייצר אוסמיום מדגיש
- פיפטה 0.1 M PB לתוך בקבוקון קצר בפה רחב עם כובע. מניחים דגימה אחת לכל בקבוקון. כיסוי מלא של הדגימה כך שהוא לא יתייבש.
הערה: לשמור דגימות בבקבוקון אותו משלב זה דרך כל שינויי הפתרון של קיבעון, התייבשות הסתננות, עד שהם מוכנים הטבעה שטוח. - לשטוף את הדגימה ב 0.1 M PB עבור 3 דקות x 2, ולאחר מכן להסיר PB עם מיקרופיפטה.
הערה: מאז המוח של החולדה היילוד הוא רגיש עמוקות לשינויים ב-osmolarity12,35,36,37, לבצע את הוופות באותו רכב כמו בשימוש בתערובת הקבע
4. הפוסט-קיבוע עם אוסממיום
-
הכנת אוסממיום tetroxide (OsO4)
הערה: המעבדה של מחבר זה מנצל את OsO4 4% שסופקו בתמיסה מימית ב אמפולות זכוכית (5 מ ל של OsO4 4% H2O). מעבדות אחרות השתמשו ב-OsO4 קריסטלים בהצלחה. עם זאת, מספר שעות יש צורך לפזר את OsO4 קריסטלים ברכב.- לקחת 5 מ ל (שאיפה אחת) של 4% OsO4/H2O, לפתוח אותו ולמקם אותו בבקבוק זכוכית חום
הערה: OsO4 הוא סוכן חמצן חזק מופחת בקלות על ידי חשיפה לאור. ניתן למנוע הפחתה במהלך ההכנה על ידי הצבת OsO4 בבקבוק זכוכית חום - הוסף 5 מ ל של 0.2 M PB. זה יהיה להניב 10 mL של 2% OsO4/0.1 M PB.
הערה: מאז המוח של העכברוש היילוד הוא רגיש עמוקות לשינויים באוסמלתיים, השתמש באותו מאגר כדי להכין fixatives מטפל ו-OsO4 פתרון12,35,36,37 - הוסף 10 מ"ל נוספים של 0.1 M PB. זה יהיה להניב פתרון סופי של 20 מ ל של 1% OsO4 ב 0.1 m PB.
- השתמש במזרק 20 מ ל מצויד מחט ארוכה כדי לצייר 1% OsO4 ומניחים אותו בבקבוק זכוכית חום או בקבוקון scint מכוסה רדיד אלומיניום.
זהירות: OsO4 הוא נדיף מאוד אדים שלה רעילים לאף, העיניים והגרון. כל העבודה צריכה להתבצע בתוך מכסה המנוע באמצעות כפפות וביגוד מגן, ולא חלק גוף צריך להיחשף ל-OsO4. טיפול וסילוק פסולת צריך להיעשות לפי הנחיות המוסד שלך. לאחסן את ה-OsO שאינם בשימוש4 בבקבוק זכוכית חום היטב הפסיק עם טפלון אניה על פקק זכוכית, לעטוף את הבקבוק ברדיד אלומיניום כפול ולאחסן dessicator. בנוכחות של אדים דולף, OsO4 יכול לטשטש או משטחים פנימיים ותוכן של המקרר. תחת תנאי האחסון הנ ל הפתרון OsO4 יציב במשך מספר חודשים. כאשר הפתרונות מקבלים תחמוצת במהלך האחסון, הם הופכים אפור, ובמקרה זה הם צריכים להיות מסולק.
- לקחת 5 מ ל (שאיפה אחת) של 4% OsO4/H2O, לפתוח אותו ולמקם אותו בבקבוק זכוכית חום
- הוסף 1% OsO4 ב 0.1 M PB בבקבוקון הדגימה ולתת לשבת 1 h. חלץ OsO4 אחרי 1 h עם מיקרופיפטה.
הערה: לפני החלת OsO4 על המקטע, זה קריטי להתפתח ולשטח את הדגימה. הימנע יישום ישירות על גבי הדגימה, במקום זאת להשתמש בקירות של הבקבוקון כדי לטפטף בעדינות את OsO4 לחלק התחתון של הבקבוקון. הדגימה הופכת לחום נוקשה זמן קצר לאחר OsO4 יישום. לטפל בעדינות מעתה והלאה כדי למנוע נזק לרקמות
5. שטיפה
הערה: חשוב לשטוף את הדגימה לאחר פיקסציה עם OsO4 ולפני התייבשות, מאז תיקונים שיורית עלול להגיב עם סוכנים התייבשות37.
- לשטוף עם 0.1 M PB עבור 3 דקות x 3.
הערה: מכיוון שהמוח של החולדה היילוד הוא רגיש עמוקות לשינויים באוסמלטים, לבצע את הוופות באותו רכב כמו זה משמש בתערובת הקבע12,35,36,37. - מניחים את הפתרון אוסמיום ואת שני טיפות PB הראשון לתוך OsO4 פסולת ולהיפטר ממנו על פי הנחיות המוסד שלך.
6. התייבשות סדרתית וכתמים באמצעות Uranyl אצטט
הערה: מעבדה זו של המחבר משתמשת מים immiscible שרפים אפוקסי להטבעה. כאשר שרפים אפוקסי משמשים, כל המים החופשיים של הדגימה חייב להיות מוחלף עם הממס האורגני לפני הסתננות על ידי מדיום הטבעה. המים מוסרים על ידי העברת הדגימה דרך סדרה של פתרונות של ריכוזים עולים של אתנול ו אצטון12.
-
הכנת אצטט uranyl (UA)
- מקום בקבוקון זכוכית נפחי 200 mL המכיל 100 mL של אטוח 70% על צלחת ערבוב.
- הוסף 4 גרם של UA לבקבוקון. עטוף ברדיד אלומיניום (UA מזרז כאשר הם חשופים לאור) ומערבבים ברציפות.
הערה: UA מתמוסס לאט ומלא לגמרי ב 70% אטוה. אפשר לקריסטלים לא מומסים להתיישב לפני השימוש בפתרון. פתרון UA צריך להיות מסונן עם מסנן 0.45 יקרומטר לפני השימוש. UA ניתן להכין לפני הזמן ושמרו בבקבוק חום עטוף רדיד אלומיניום ב 4 ° צ' במשך חודשים.
זהירות: UA הוא רדיואקטיבי במקצת ורעיל מאוד. האינהלציה של אבקת UA יכולה לגרום להפרעות במערכת הנשימה העליונה ולמחלות של הריאות, הכבד והכליות. UA הוא מסוכן כאשר הוא בלע או כאשר הוא מגיע במגע ישיר עם עור וקרום רירי. יש לבצע את כל העבודה בתוך מכסה המנוע באמצעות כפפות וביגוד מגן. טיפול וסילוק פסולת צריך להיעשות לפי הנחיות המוסד שלך.
- הסרת הנוזלים ב-50% אטוח במשך 1 דקות. הסר 50% אטוח לפני הוספת UA.
-
הוסף 4% UA ב 70% אטוח. . בואו נשב ללילה אחד או לילה אם הלילה, מניחים במקרר ב -4 ° c.
הערה: Cap בקבוקון כדי למנוע אידוי אטוח ולכסות עם רדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.- היפטר מפסולת UA ושני הכללים הבאים לפי הנחיות המוסד שלך
- מייבשים ב 70% אטואה במשך 1 דקות.
- מייבשים ב 90% אטוח עבור 5 דקות.
- מייבשים ב 100% אטוח עבור 5 דקות x 2.
- לשטוף את הדגימה באצטון עבור 2 דקות x 3.
7. הסתננות והטבעה
הערה: הרקמות אינן נוקשות מספיק כדי לחתוך לחלקים דקים ללא תמיכה נוספת של מטריצה שרף. לכן, הסתננות והטבעה חייבים להקדים את12.
-
הכנת שרף-EPON
- השתמש 60 mL gavage מזרק. הסר את המזרק וכסה את המזרק במחט בטיחות.
- מניחים את המזרק עם הצד הפתוח למעלה ולהוסיף את עוצמת הקול של כל מרכיב של שרף ערבוב בהדרגה. הוסף 22 מ ל של הטבעה-812 (שרף). הוסף DDSA (הרדן) לנפח כולל של 37 mL. הוסף NMA (הארמר) לנפח כולל של 50.5 mL. הוסף 525 μL של DMP-30 (מאיץ) עם פיפטה. להזיז את הבוכנה של הפיפטה לאט מאוד כמו DMP הוא מאוד צמיגה.
הערה: חשוב להוסיף את ריאגנטים להטבעה בסדר המפורט. המאיץ (DMP-30) חייב להתווסף אחרון. כדי להשיג בלוק נרפא כי יש את התכונות הרצויות, זה קריטי כדי להשתמש בסכום המדויק של הררפאר ואת דוושת. תערובות הטבעה טריות הינן מועדפות. - לשים את הבוכנה בחזרה ולמקם את המזרק על הנדנדה עם טלטול מתמשך לפחות 30 דקות. צבע ישתנה מצהוב לענבר.
הערה: כל החומרים חייב להיות מעורב ביסודיות רבה. אי לעשות זאת התוצאות הספגה אחיד של הדגימה הרקמה בלוק של קשיות אחיד
- מערבבים 1 כרך של שרף EPON עם 1 נפח של אצטון בבקבוקון scint ולנענע לערבב. החל את 1:1 EPON: אצטון תערובת על הרקמה לאחר הסרת האצטון האחרון לשטוף. להמשיך לכסות כדי למנוע התאיידות אצטון. הסר את התערובת 1:1 של שרף ואצטון לאחר 2-4 h או לשמור על הלילה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. - להחליף את התערובת של שרף ואצטון עם שרף מלא. בואו לשבת 4 שעות או לילה. שים את כל הפסולת EPON במיכל אוסף מתחת למכסה המנוע כדי להיות פולימולט ונפטר מאוחר יותר.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
8. שטוח הטבעה
הערה: דגימות הן שטוחות בין שני סרטים aclar באופנה כמו סנדוויץ '.
- חותכים שני חלקים מלבניים של גיליון aclar ברור. נגב את הסרטים נקי עם ה70. קצץ את הסדינים כך שיש לפחות 1.5 ס מ של פלסטיק ללא רקמה בכל צד של החלק. הגיליון aclar על גבי צריך להיות ברוחב זהה לתחתית, ואת הגובה שלה צריך להיות בערך שני שלישים של הגיליון התחתון.
- לאט להטות את המבחנה עם הדגימה בעדינות להרים את הרקמה מהחלק התחתון של הבקבוקון.
- השתמשו במרית גמישה מיקרו ומברשת נאה כדי להעביר בזהירות את הקטע לאורך קירות הבקבוקון ולהעביר אל הגיליון aclar.
הערה: טפל במקטעים עם זהירות כדי למנוע נזק לדגימה. - מניחים בעדינות את גיליון aclar על גבי הדגימה.
הערה: ודא שיש מספיק שרף בין שני הסדינים כדי לאטום את הכריך - בעדינות לדחוף את כל בועות אוויר לכוד מבלי להפעיל לחץ ישיר על המקטע. למחוק את העודף EPON.
הערה: חיסול בועות אוויר חשוב, כמו נוכחותם עושה ויזואליזציה של הדגימה קשה מחליש את היציבות של הקשרים שרף. - לתייג את הסדינים עם עט עמיד ממס ומניחים בתנור ב-60 ͦC עבור 2-3 ימים לפולימלזציה.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן.
9. הטמעת כמוסה
הערה: Ultramicrotomes מסופקים עם כמוסות להחזיק בלוקים גליליים המתקבלים מהטבעת דגימות בקפסולות. גושי גליל יש הגיאומטריה האידיאלית להיות מושפע לפחות על ידי תנודות הנובעות במהלך הזמן.
- פתחו בעדינות את. הסרטים הדחוקה הדגימה תהיה תואמת. לאחד משני הסדינים
- השתמש בעט עמיד ממס כדי לסמן את הצד של גיליון aclar המכיל את המקטע. . מארק ליד הרקמה
הערה: זה קריטי לבצע צעד זה לפני היציאה מרקמת הריבית. - השתמש בניקוב דיסק כדי לקבל דגימת עיגול של המקטע. מארק העט צריך להיות חלק מרקמת מנוקב.
- הכן את כובעו של כמוסת הטבעה בצד על מחזיק כמוסה. מניחים טיפה של שרף על הכובע.
- הניחו את הדיסק הנוקב בתוך המכסה עם החלק של הרקמה הפונה כלפי מעלה. סימן העט יהיה להאיר כאשר אור הוא האיר על הדגימה.
- הכנס כמוסה לתוך הכיפה והשתמש בפינצטה עדינה כדי להוסיף תוויות. התגלגל והנמך פיסת נייר מודפסת באורך 2 ס מ לתוך הקפסולה. הפוך את התווית כדי להתאים את העקמומיות של הקירות הצדדיים של הקפסולה. המתן להשלמת הפילמור, כך שהתווית תהפוך להיות מוטבעת לצמיתות בשרף.
- יוצקים את שרף ההטבעה בתוך הקפסולה ולמלא עד קצה הקפסולה.
- דחף את הדגימה למטה לתחתית הקפסולה בעזרת מקל עץ מחודד ומקום בתנור ב 60 ° c עבור 2-3 ימים.
הערה: לדאוג לא ללחוץ על הרקמה קשה מדי, במקום לתת לו לשקר באופן רופף, כך שכבה דקה של מדיום הטבעה נוכחת בין הרקמה לבין משטח קפסולה. הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
10. זמירה של פני בלוק
הערה: גודל קטן וצורה מתאימה של פני הבלוק הם תנאי מוקדמות לקבלת הסבר משביע רצון. לכן, זמירה של בלוק הדגימה הוא הכרח.
- . תשתמש בלהב חד עם קצה אחד לנקות עם אצטון מיד לפני השימוש.
- הר הקפסולה בלוק במחזיק בלוק ומניחים את מחזיק הבלוק על הבמה של stereomicroscope.
הערה: הליך הגיזום צריך להתבצע תחת משקפת מיקרוסקופ ותאורה אלכסונית. - הסר את גיליון aclar מקצה הקפסולה באמצעות להב תער. הגיליון הaclar מופיע כשכבה מבריקה תחת האור של היקף הבתר.
- להחזיק את להב תער בזווית של 45 מעלות ולעשות חתכים למטה ארבעה צדדים של בלוק קפסולה.
הערה: שליטה טובה יותר על הקיצוץ מושגת אם הלהב מוחזק בשתי הידיים. - לעשות קיצוצים קצרים כך הבלוק לוקח את הצורה של פירמידה קצרה עם זוויות הקיר של כ 45 °.
הערה: הפנים הדגימה נתמכת הרבה יותר אם הצדדים המובילים אליו נשמרים בקיצור. אם קצה הבלוק דק וארוך מדי, הוא רטט במהלך החסימה הדקה. באופן אידיאלי, אזור העניין צריך להיות ממורכז בפנים הבלוק. - חתוך את קצה הקפסולה כדי להשליך את הרקמה המיותר ורק לשמר את אזור הריבית.
הערה: אין כל חלק בסעיף צריך להיות ללא רקמה, כיוון שווריאציות הצפיפות של הפנים החוסמות הן גורם משמעותי לקושי בחסימה. באופן אידיאלי, שטח פני השטח של הקפסולה צריך להיות לא יותר מ-1 מ"מ2. - חתוך את פני הקפסולה בצורה של טרפז scalene. כי בטרפז scalene אין צד שווה, צורה זו היא הטובה ביותר לכוון את אזור הריבית ביחס לשאר הדגימה.
הערה: במהלך הזמן, הפנים בצורת טרפז נתמך הרבה יותר טוב מזה של כל צורה אחרת.
11. הסימתי מיקרוטום
הערה: רוב הדגימות הביולוגי עבות מדי במצבם הטבעי כדי להיכנס לחדר האלקטרונים. לכן יש לגזור את החומר בחלקים דקים שניתן לחדר באמצעות קרן האלקטרונים.
- חתך מקטעים דקים (צבע הפרעות כסף, 600-900 Å) על מטוסים בעלי אולטרה-מיקרו, במקביל לפני השטח.
- מקם את המקטעים ברשתות. מעבדה של מחבר זה משתמשת ברשתות נחושת של 3.05 מ"מ בקוטר החיצוני.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה כאן.
12. לאחר צביעת עם Uranyl אצטט
- הכן 2% UA במים מזוקקים. מקום בקבוקון זכוכית נפחי 200 mL המכיל 100 מ ל של מים מזוקקים על צלחת ערבוב. הוסף 2 גר' של UA לבקבוקון. עטוף ברדיד אלומיניום (UA מזרז כאשר הם חשופים לאור) ומערבבים ברציפות.
הערה: לפרטים על הכנות UA, ראה סעיף 6 של פרוטוקול זה. - מניחים כמה טיפות בודדות של 2% UA על גיליון נקי של שעווה שיניים בצלחת פטרי.
- הגבר את הרשת עם הדגימה (החלק בצד למטה) על טיפה של UA עבור 25 דקות.
הערה: הצף כל רשת בירידה נפרדת של UA. - להחזיק את הרשת בקצהו עם מלקחיים ולשטוף פעמיים תחת סילון עדין של מים מזוקקים מבושלים בטמפרטורת החדר מבקבוק שטיפת פלסטיק.
הערה: אל תאפשר לרשת להתייבש לפני הצביעת עם העופרת.
13. לאחר כתמים עם עופרת
- הכינו חדרשכונתיות (2 ) באוויר הוא המקור העיקרי למשקעים. מניחים פיסת נייר מסנן ספוגה ב 1 N NaOH בצלחת פטרי. מניחים סדין קטן של שעווה נקייה שיניים על גבי נייר מסנן ומניחים כמה NaOH כדורי בצד אחד של המנה. . תכסה את הצלחת
הערה: הכינו הגדרה זו לפני הרשתות מוכתמות עם UA, כך האווירה בחדר הוא חופשי של CO2 ומוכן להכתמים העופרת בזמן UA כתמים הושלמה. - הפוך 4% NaOH. הוסף 0.2 g של NaOH ל 5 מ ל של מים מזוקקים.
- הכינו את פתרון ההובלה המשולשת של סאטו. כדי להכין 10 מ ל, להוסיף 0.1 g של העופרת חנקתי, 0.1 g של עופרת ציטראט, 0.1 g של אצטט עופרת ו0.2 g של נתרן ציטראט לתוך בקבוק זכוכית. להוסיף 8.2 mL של מים מזוקקים ולנער במרץ עבור 5 דקות Sonicate עבור 30 s, ואז להוסיף 1.8 mL של התוצרת הטרייה 4% NaOH.
- מניחים כמה טיפות של הקצה המוביל של סאטו על השעווה בצלחת פטרי.
- מניחים את הרשת מוכתמת עם UA (סעיף בצד למטה) על טיפת עופרת.
הערה: כל רשת צריכה להיות צפה. בטיפת עופרת נפרדת כל טיפה צריכה להיות קטנה מספיק כדי לאפשר לרשת לצוף על גבי כיפת הירידה במקום להחליק על הצדדים. - לכסות את הצלחת ולתת כתם 5 דקות.
- להחזיק את הרשת בקצהו עם מלקחיים ולשטוף ביסודיות תחת סילון עדין של מים מזוקקים מבושלים בטמפרטורת החדר מבקבוק שטיפת פלסטיק.
- כתמי את הרשת מייבשים על נייר סינון ומאחסנים את הרשת.
הערה: ודא שהמקטע לא מגיע במגע ישיר עם נייר הסינון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
קריטריונים כלליים מקובלים בעיקר כרמז על שימור משביע רצון או פגום של הדגימה עבור TEM הוקמו. קריטריונים אלה מתוארים בארבעה מיקרוגרפים אלקטרונים נבחרים (שתי דוגמאות להכנה אופטימלית, שתי דוגמאות של הכנה פגומה) שהושגו על ידי טיפול ברקמת המוח הצעירה בעקבות השיטות המתוארות בפרוטוקול זה.
באופן כללי, מיקרוגרף אלקטרוני באיכות טובה מופיע כדימוי אפרפר מסודר, ברור וכולל. בדגימה מוכנה משביע רצון, החללים בין הקרומים צריכים להיות מלאים בחומר גרגרים, ואין לרוקן אותם. באופן דומה, אין חללים ריקים צריך להימצא חומר הקרקע cytoplasmic או בתוך אורגלים (להשוות איור 1a ואיור 2a עם איור 3 ואיור 4). עם זאת, חשוב לציין כי מערכת העצבים המרכזית של בעלי חיים מאוד צעירים מראה מידה מסוימת של התרחבות של חללים מתוך מערות בהשוואה למוח המבוגר, עם קשרים משוחררים בין תאים לבן כולל, פחות מראה באלקטרון-צפוף. ממברנות צריכים להיות רציפה, ללא עיוות אושבירה (איור 1a ואיור 2a). הסטרומה של המיטוסים צריך להיראות אחיד וצפוף, ללא חללים ריקים. כריסטין צריכה להיות שלמה ולא נפוחה, והקרום כפול החיצוני המיטוכונדריאלי צריך להיות שנשבר (להשוות את הדמות 1A עם איור 3). כדי להקל על ניתוח מורמטרי של ארגון שלפוחית הסינפטית מראש, הקרומים הטרום והפוסט-סינפטית צריכים להיות שלמים ולמעשה מקבילים זה לזה (ראו איור 1). יש לבדוק את השלפוחית הסינפטית ולאגד ממברנה אחת רציפה (ראה איור 2).
חשוב מכך, גם כאשר השיטות הטובות ביותר מאחריהן, הטיפול של הדגימה עם התיקונים, כתמים ושרפים מציג חפצים. כיוון שלא ניתן לבטל את הממצאים, חשוב להבין איזה תהליך מקורו בהם, כך שניתן יהיה לפרש את מראה הדגימה ביחס לטיפול שעבר12. דוגמה אחת לחפץ-בין כמה שניתן להפיק במהלך הכנת הדגימה ל-TEM-היא דמות מיאלין, הכללה קרומי לצ'יני הדומה לנרתיקים למיאלין. למרות דמויות מיאלין ניתן לראות בתנאים פתולוגית12, הם בדרך כלל תוצאה של הפקת שומנים ממברנה במהלך קיבעון עם aldehydes (ראה איור 4).
איור 1: נציג המיקרוגרף האלקטרוני של שימור משביע רצון של מבנה התא (לדוגמה 1). (א) קרום התאים העצבי מרובד וללא הפסקות. הציטופלסמה היא מאוד גרעינית וללא חללים ריקים. מיטוכונמיטוא לא נפוחים ולא התכווצו. הממברנה הכפולה החיצונית שלהם שלמה, וכתמים פנימיים לא נפגעו. (ב) פירוט של פאנל A, המהווה שיטה אחת למדידת המרחק של שלפוחיות סינפטית מקרום טרום-סינפטית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הנציג המיקרוגרף האלקטרוני של שימור משביע רצון של מבנה התא (לדוגמה 2). (א) שלפוחיות סינפטית הן ברורות ומסודרות באמצעות קרום יחיד שנשבר. כדי לאפשר ניתוח מורמטרי של הפצת שלפוחית סינפטית, טרום סינפטית וממברנות פוסט-סינפטית צריך להיות מקביל ואת ההמשכיות שלהם נשמר. (ב) פרט לפאנל A, מסמל את ספירת השלפוחיות הסינפטית בתוך מסוף טרום הסינפטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: נציג המיקרוגרף האלקטרוני של שימור פגום של מבנה הרקמה (לדוגמה 1). שימו לב לעיוות ושבירת קרום התאים העצבי והנוכחות של מרחבים מוגדלים במידה ניכרת (מסומנים ב-*). מיטוכונמיטוa להופיע מנופח יש cristae נפוח (מסומן חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: נציג מיקרוגרף אלקטרוני של שימור פגום של מבנה הרקמה (לדוגמה 2). שימו לב לנוכחות של חללים גדולים וריקים לבנים בתוך הציטופלסמה (מסומנים עם ǂ), במקום חומר הסייטוסמטי הגרגרים דק. חללים מוחלתאיים מופיעים מוגדלים. קרומי (דמות מיאלין), כנראה כתוצאה הגיוס של שומנים במהלך קיבעון עם glutarאלדהיד, מסומן עם ראשי תיבות MF. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טיפול בחתכי רקמה במהלך הכנת הדגימה עבור TEM דורש מידה ניכרת של עידון, ריכוז וסבלנות. כאשר משתמשים במיקרופיפטה כדי להוסיף ולהסיר פתרונות, ניתן למצוץ דגימות לתוך העצה מפני פני השטח, ולכן יש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע נזק לרקמות על ידי הצנרת. גם, צעדים מסוימים של רצף התייבשות יכול להיות מהיר כמו 1 דקות, ומכאן המפעיל צריך לעבוד במהירות כדי להבטיח כי צעד התייבשות הבא הוא התחיל בזמן הדגימה לא יבש או קמט. הליך אחד שדורש תשומת לב מיוחדת הוא לאחר קיבעון עם אוסממיום. מקטעים נעשים נוקשים לאחר הטיפול עם אוסמיום יכול להיות ניזוק בקלות. לפני הוספת osmium, זה הכרחי כי סעיפים משוטחים בתחתית הבקבוקון, אחרת כל קיפול יגרום שבר ברקמה. טיפול של רקמת osmicated מאתגרת במיוחד בעת העברת מקטעים על סרטים aclar להטבעה שטוח. טיפול מיוחד נדרש בעת הרמת הדגימה מהחלק התחתון של המבחנה כדי למנוע פיצול, וכאשר דוחפים בועות אוויר מתוך כריך הסרט. אמנם חשוב לדחוף את כל אוויר לכוד, כפי שהוא עושה ויזואליזציה של הדגימה קשה מחליש את היציבות של הקשרים שרף, לחץ ישיר על רקמת osmicated יכול בקלות לגרום נזק. צעד נוסף הדורשת טיפול נוסף הוא הכנת תערובת שרף עבור הסתננות הדגימה והטבעה. EPON, שרף הטבעה הנפוץ ביותר, יכול להיות מוקשח עם תוספת של הרארמר ומאיץ. זה הכרחי להשתמש בסכום המדויק של הררפאר ומאיץ כדי לקבל לחסום נרפא עם המאפיינים הרצויים. שיטות הגראבימטריה ונפחי המשקל תוארו למדידת שרפים צמיגה. למרות שיטות גרווימטריה נחשבו באופן מדויק יותר12, המעבדה של מחבר זה היה הצלחה טובה עם מצבי נפחי (כלומר, הוספת נפח של כל מרכיב של שרף ערבוב הצטבר באמצעות מזרק gavage) . לאחר שמרכיבי השרף נמדדו בקפידה, עליהם להיות מעורבים ביסודיות רבה כדי להשיג הספגה אחידה, שכן הם בעלי עוצמות ושיעורי פולימוניזציה שונים. כישלון בהשגת ערבוב מוחלט יגרום לבלוק של קשיות לא אחיד שאינו מתאים לחסימה דקה.
שינויים מסומנים בטונגניות של הפתרונות המשמשים לעיבוד מקטעים של מוח עכברוש צעיר יכול לגרום הצטמקות ו/או נפיחות של החלל ורכיבים סלולריים12,35,36,37 . במהלך הקיבעון, את התוצאות הטובות ביותר מתקבלים כאשר הלחץ האוסמוטי של המכונה נשמרת דומה ככל האפשר של הרקמה תחת לימוד. האוסמאליות של המוח העכברוש היא כ 330 mOsm. 2% glutarאלדהיד ב 0.1 הפתרון M PB הוא רק מעט קילו (400-450 mosm) וממזער התרחבות של החלל הextravascular12. בעיקר, ממברנות נשארים רגישים לשינויים בלחץ האוסמוטי של פתרונות שטיפה והתייבשות לאחר קיבעון עם aldehydes. לפיכך, חשוב גם למזער את ההבדלים בין הסוסמטים של הקבע והפתרונות המשמשים לאחר מכן12,35,36,37. מסיבה זו, אותו רכב (0.1 M PB, משוער osmolarity 440 mOsM) משמש כממס עבור כל הפתרונות בפרוטוקול זה. עם זאת, יש לציין כי מספר מאגרים שונים שימשו בהצלחה במהלך הכנת הדגימה עבור TEM ולא מאגר יחיד יכול לתבוע עליונות אוניברסלית על האחרים. כאשר מאגרי הגוונים הנמוכים עדיפים, מעבדות אחרות בחרו להגדיל את מגוון האוסמונים באלקטרוליטים או בלתי-אלקטרוליטים12.
מספר שלבים בפרוטוקול זה דורשים שימוש בכימיקלים שעלולים להיות רעילים כאשר לא טופלו כראוי. החשיבות של עבודה תחת מכסה המנוע ולבישת ציוד הגנה אישי בעת טיפול אלדנדס, osmium, אורניום ותרכובות עופרת לא ניתן לציין יתר. בעוד מערכות מנוגדים אוטומטי יכול לעזור להחליש חלק מהסיכון הם זמינים מסחרית, הם יכולים להיות די יקר ולא יכול להיות במחיר סביר על ידי מעבדות שאינם עושים שימוש שגרתי של TEM. למרות המעבדה מיקרוסקופ אלקטרון יכול להיות מקום מסוכן, עיבוד דגימה עבור TEM הוא בטוח הכולל כאשר מבוצעת בקפדנות.
לאחרונה, המבוא של מיקרוסקופ אור סופר ברזולוציה גדל הדמיה אופטית בפתרון החשמל על 15 ננומטר34. עם זאת, כאשר המטרה היא לבצע ניתוח מורמטרי של ארגון מרחבית ושלפוחית סינפטית במסופים טרום סינפטית, אין טכניקה מספקת את אותה מידה של פירוט מורפולוגית. חשוב מכך, TEM מוגבל על ידי הצורך הדגימה להיות מת לפני שהוא יכול להיות מעובד ודמיינו. לכן, כאשר מטרת המחקר היא לחקור היבטים דינמיים או פונקציונליים של סחר שלפוחית סינפטית ואקסוציטוזה, כלים אחרים מאשר TEM צריך להיחשב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
כתב יד זה נתמך על ידי NIH/כK08 MS 123321 (כדי N.L.) ועל ידי כספים של המחלקה למהרדמה באוניברסיטת וירג. המחברים רוצים להודות לאלייב ריסיר (מחלקת הביולוגיה, אוניברסיטת וירג, שרלוטסוויל, VA) להכשרה מעולה וסיוע טכני עם TEM, וביקורת על כתב היד שלה לא יסולא בפז. המחברים מודים גם בפני מתקן אלקטרון מתקדם באוניברסיטת וירג לקבלת סיוע טכני באמצעות דגימה ולאחר כתמים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. Santini, M. , Raven Press. NY. 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. Hayat, M. A. , Cambridge University Press. 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. Hayat, M. A. , Academic Press. San Diego. (1981).
- Behrman, E. J., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. Revel, J. P., et al. , Scanning Electron microscopy Inc, AMF. O’Hare, Chicago. 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. Heyn, C., Forssmann, W. G. , Springer. Berlin. 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
