Summary
我们描述了处理新生大鼠脑组织以获得高分辨率的电子显微镜的程序, 以进行神经末端突触囊分布的形态分析。用这些方法获得的显微图像也可用于研究许多其他细胞成分的形态及其尺寸结构关系。
Abstract
我们的实验室和其他许多实验室利用透射电子显微镜的高分辨能力来研究突触囊泡的形态和空间组织。为了获得高质量的电子显微镜, 从而获得对突触前囊泡分布进行定量分析所需的形态学细节程度, 最佳样品制备至关重要。化学固定是标本制备过程中的第一步, 对保持精细的超微结构至关重要。采用戊二醛-甲醛溶液固定血管, 然后用四氧化铬处理振动原子切片标本, 稳定分子的最大数量, 特别是蛋白质和脂类, 并取得优异的保护效果超微结构。然后用反染色、连续脱水和树脂包埋法对组织进行处理。在样品加工过程中, 用醋酸铀进行整体染色 (即在树脂包埋前对振荡器切片组织进行染色) 增强了内源性对比, 并稳定细胞成分的提取。通过将醋酸铀作为超薄切片上的染色后, 可以进一步增加对比度。醋酸铀处理后, 用柠檬酸铅双染色超薄切片, 通过选择性结合醋酸铀增强含核酸结构的电子不透明度, 提高图像分辨率。透射电子显微镜是一个强大的工具, 用于表征突触囊的形态细节, 并量化其大小和空间组织在终端 bouton。然而, 由于它使用固定组织, 透射电子显微镜只能提供有关生命或进化过程的间接信息。因此, 当主要目的是研究突触囊泡贩运和外分泌的动态或功能方面时, 应考虑其他技术。
Introduction
我们描述了制备新生大鼠脑组织以获得高质量电子显微镜的方法, 以便深入分析神经末端1,2的突触囊空间分布。通过这些方法处理样品可以获得的高对比度显微图也可以用来研究一些细胞成分的详细形态及其尺寸结构关系 3,4。
透射电子显微镜 (TEM) 是定量研究细胞器和其他细胞结构形态的有力工具。截至本十年, 除了高压冷冻冷冻冷冻固定外, 没有其他研究方法能够在没有免疫标记的情况下提供相同程度的脂质膜和细胞器的分辨率。然而, 冷冻替代技术并没有得到广泛使用, 通常需要昂贵的设备和较长的准备时间。
为了利用 TEM 的高分辨能力, 优化样品制备至关重要。标本制备的主要目标是保持组织结构, 使其与活状态发生最小的变化, 增强标本对比度, 并在加工和接触电子的过程中稳定组织对提取细胞成分的影响梁。多年来, 多个实验室推出并完善了许多 TEM 组织制备方案。他们中的许多人都专注于突触囊5、6、7、8、9、10、11的最佳可视化方法。在目前使用的一些成熟的金标准方法中, 我们选择了化学固定、固定后、整体染色、顺序脱水、树脂包埋和染色后的程序, 目的是保持最佳的组织结构和实现出色的图像对比度。值得注意的是, 在处理新生大鼠脑组织时, 保持良好的超微结构尤其具有挑战性。事实上, 非常幼小的动物的中枢神经系统的特点是含水量高于成人大脑, 细胞外空间的扩大更加突出, 细胞12细胞之间的连接更加松散。这使得新生大鼠脑组织对渗透率的变化非常敏感, 在通过不同色调的连续溶液处理时, 更容易发生人工收缩和肿胀.因此, 我们的方法采用了尽可能接近大鼠新生大脑的渗透性的标本处理解决方案。我们的目标是获得高质量的高分辨率电子显微镜图像, 用于神经末端突触囊泡空间分布的定量评估。具体而言, 我们试图测量神经末端的囊泡的数量、突触囊与突触前质膜的距离、固定在突触前膜上的囊泡的数量、突触泡的大小以及囊间距离 1。
满意的化学内固定是获得高质量电子显微镜的先决条件, 这些显微图像可以为研究突触囊形态和空间组织提供必要的形态学细节。虽然存在多种固定方式, 但血管灌注固定脑组织明显优于其他方法。由于通过血管灌注固定在全身循环停止后立即开始, 它缩短了脑组织脱氧和蛋白质与固定物交联之间的间隔, 导致细胞的最小改变结构。此外, 它完成快速和均匀的渗透, 因为固定剂从血管床快速流动到细胞外和细胞隔间12,13,14。初级戊二醛固定, 其次是四氧化铬的二次固定 (后固定), 使细结构保存良好 15,16,17。戊二醛和甲醛的混合物具有更快速渗透到组织中的额外优势12。
由于生物组织不够刚性, 无法在没有树脂基体支撑的情况下切割成薄片, 因此在薄片之前, 需要将其嵌入介质中。水不混溶环氧树脂在透射电镜中常用作嵌入介质。当使用这种类型的基质时, 在树脂渗透之前, 必须用有机溶剂代替所有样品的游离水。通过一系列乙醇和/或丙酮浓度上升的溶液将水通过一系列溶液将样品取出.在这个协议中, 标本首先是平面嵌入之间灵活的丙烯酸片, 然后嵌入在胶囊。最终的结果是组织位于圆柱形树脂块的尖端, 它具有理想的几何形状, 受微细胞切片过程中产生的振动的影响最小。
用重金属染色以增强内源性组织对比度是标本制备的另一个重要方面。透射电镜中的图像对比度是由于组织中的原子的电子散射造成的。然而, 生物材料主要由低原子量分子 (即碳、氢、氧和氮) 组成。因此, 产生足够的散射对比度需要将高原子量原子加入到组织的细胞成分中。这是通过用重金属染色12,18,19来实现的。四氧化二铵、铀和铅与脂质结合强烈, 是最常见的用作电子污渍的重金属。
( 原子序数 76 ) 是现存密度最高的金属之一。它既是固剂, 也是污渍, 尽管它在 TEM 中的主要作用是可靠的固定剂12。在使用的各种固定方案中, 戊二醛后的双固定方法是减少标本制备过程中细胞成分提取的最有效方法。这两种固定剂用于稳定不同类型分子的最大数量, 特别是蛋白质和脂质, 并导致组织超微结构的高级保存12,14, 15,16,17岁
铀 (原子序数 92) 是用作电子染色的最重的金属, 最典型的形式是醋酸铀。与铬类似, 它起到染色和固定剂的作用, 尽管它在 tem 中的主要作用是作为染色 20,21。含核酸和膜结构在醛固定组织 22,23 中被铀醇盐强烈和优先染色。在渗透后和脱水前使用醋酸铀对组织进行治疗, 可以稳定膜质和含核酸结构, 并增强对比度, 从而能够识别一些不需要识别的结构细节。仅在12、24、25染色的标本中就能很容易地检测到。据认为, 醋酸铀可以稳定精细结构, 结合减少铬已沉积在脂质膜在渗透24。当在嵌入前应用醋酸铀时, 并作为薄部分12中的染色后, 可实现最大对比度。
铅 (原子序数 82) 是透射电镜中最常见的染色, 主要用于薄片染色后。铅盐具有较高的电子不透明度, 并显示出广泛的细胞结构亲和力, 包括细胞膜, 核和细胞质蛋白,核酸和糖原 26, 27。当采用双重染色方法 (即用醋酸铀染色后, 用铅处理), 后者作为醋酸铀染色的显影剂。例如, 用戊二醛固定的染色质染色后, 醋酸铀的吸收增加了 3倍 28,29,30,31, 32.铅还能增强其他金属 (如铬) 的染色能力。据认为, 铅盐染色膜的渗透银固定组织通过附加到极性组的磷脂在减少的铬33存在.使用醋酸铀和铅染色的一个潜在缺点, 特别是在长时间内, 是许多不同的结构元素被均匀和非具体地染色, 因此可能不容易与彼此区分 12.
最近引入的替代光源, 如光学超分辨率光激活定位显微镜, 显著提高了光学显微镜分辨率 34。然而, 由于光学显微镜依靠组织化学和免疫细胞化学方法来可视化单个标记的蛋白质或酶, TEM 同时显示所有结构元素的能力仍然是无与伦比的, 无法深入研究组织结构的形态和维度关系。特别是, 没有其他技术可以提供必要的形态学细节, 以执行形态分析突触囊分布在突触前神经布腾。然而, 重要的是要注意的是, 电子显微镜捕捉组织的结构后, 生物体死亡, 因此, 他们不能提供有关的动态突触前囊泡贩运和细胞增多的信息。因此, 当主要目的是研究突触囊泡贩运和外分泌的动态和功能方面时, 应考虑其他工具, 如 FM 染料活成像和膜片钳电生理学。
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Protocol
所有研究都得到了弗吉尼亚大学 (弗吉尼亚州夏洛特斯维尔) 动物护理和使用机构委员会的批准, 并按照国家卫生研究院的准则进行。
1. 血管灌注固定
请注意:本杂志13已详细介绍了大鼠脑血管灌注的方法, 超出了本方案的范围。然而, 以下步骤是专门为准备新生大鼠脑组织, 以获得高质量的电子显微镜定量分析突触前端子突触囊的分布。
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制备4% 的甲醛
- 将800毫升 0.1 M 磷酸盐缓冲器 (PB) 放入2升玻璃烧杯中, 放在熏蒸罩下的搅拌板上。加热至约 60°c, 而不将缓冲液煮沸。
- 加入40克的甲醛粉。持续搅拌
- 在测量 pH 值时, 加入 10 N NaOH 的小滴, 直到溶液清除。最终 pH 值应为 7.2-7.4。
- 将剩余的 0.1 M PB 添加到 1 L 的最终卷中。冷却后, 用0.45μm 膜过滤, 并在4°c 过夜。
请注意:在灌注前一天准备新鲜的甲醛。
注意事项:吸入醛蒸气会引起鼻腔症状和气道刺激。接触皮肤会导致皮炎。在戴手套、防护服和安全护目镜的同时, 应将醛放在熏蒸罩中处理
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准备泰罗德解决方案
- 将 1 L 蒸馏水放入玻璃烧杯搅拌板上。在烧杯中加入氯化钠 (8 克)、KCl (0.15 g)、 Ccl 2 (0.1 g)、MgCl 2 (0.006 g)、 nah2 po 4 (0.055 g)、nahco3 (1 g) 和 dextrose (1 g).
- 持续搅拌并测量 pH 值。保持 pH 值在7.2 到7.4 之间。
请注意:Tyrode 解决方案也可在商业上获得。
- 在最终浓度为2% 的情况下, 将4% 的甲醛与戊二醛混合。加入40毫升的电子显微镜级50% 戊二醛到1升的4% 甲醛。在搅拌板中搅拌均匀
请注意:在新生大鼠的体内灌水所需的对戊二醛-戊二醛固溶物约为100毫升。因此, 至少有10只新生大鼠可以灌注 1 L 的固定剂。使用前不要将甲醛和戊二醛混合。在灌注前将所有溶液都带到室温下。 - 一旦进入左心室 (见整个动物灌注协议13), 冲洗血管系统与 Tyrod 溶液 30秒, 在120毫米汞柱的灌注压力。
请注意:灌注的成功在一定程度上取决于血管床上完全排除血液 - 在相同的压力下, 用二甲氨基戊二醛溶液冲洗10分钟。
请注意:保持恒定的灌注压力是必不可少的, 以避免引入人工制品。此外, 乳霜的温度不应低于大鼠的体温, 以避免血管收缩 - 从头骨中取出固定的大脑, 并在4°c 下一夜放置在新鲜的对丁醛-戊二醛固定剂中。
注: 协议可以在此处暂停。
2. 脑切片
- 将固定的大脑嵌入4% 琼脂糖, 并将脑琼脂糖块粘在振动期
请注意:其他实验室通过在没有琼脂支撑的情况下在振动体上实现稳定的块, 获得了高质量的部分 - 50微米厚的截面片。将微胶卷设置为低频和低速。
请注意:在4°c 下, 切片可与0.05% 的氮化钠一起储存在 0.1 M PB 中, 时间长达数年。 - 将切片放入 0.1 m PB 的培养皿中, 在解剖显微镜下检查切片, 并选择标本进行嵌入
请注意:协议可以在这里暂停。
3. 冲洗
请注意:在用醛固定后和用固定后冲洗标本是很重要的, 因为残留的固定物可能会产生铬沉淀物
- 移液器 0.1 M PB 变成一个短的, 宽口玻璃小瓶与帽。每个小瓶放置一个标本。将样品完全覆盖, 使其不干燥。
请注意:将标本保存在同一小瓶中, 通过固定、脱水和浸润的所有溶液变化, 直到它们准备好进行平面嵌入。 - 将样品在 0.1 M PB 中冲洗 3分钟 x2, 然后用微型移液器取出 PB。
请注意:由于新生大鼠的大脑对渗透率的变化非常敏感, 12、35、36、37 与固定混合物中使用的车辆相同, 因此进行清洗
4 . 与的固定后
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四氧化铬的制备 (Oo4)
请注意:本作者的实验室利用在玻璃安慰剂中的水溶液中提供 Oso4 4% (第5条 mL oso4 4% (H2o) ). 其他实验室已成功地使用了 OsO4晶体。然而, 需要几个小时才能将 OsO4晶体溶解在车辆中。- 取5毫升 (一个安培) 的 4% oso
请注意:OsO4是一种强氧化剂, 容易因暴露在光线下而减少。将 OsO4 放入棕色玻璃瓶中, 可避免在制备过程中减少 - 添加5毫升的 0.2 m PB。这将产生10毫升的 2% OsO 4/0.1m pb。
请注意:由于新生大鼠的大脑对渗透率的变化非常敏感, 因此使用相同的缓冲液制备醛固定剂和 osmolarity 溶液 12、35、36、37 - 添加 0.1 MPB 的额外10毫升。这将产生在 0.1 m PB 中的 20% OsO4的最终解。
- 使用装有长针的20毫升注射器绘制 1% OsO4 , 并将其放入棕色玻璃瓶或覆盖着铝箔的扫描小瓶中。
注意事项:OsO4极易挥发, 其烟雾对鼻子、眼睛和喉咙都有毒。所有的工作都应使用手套和防护服, 在熏蒸罩中进行, 任何身体部位都不应接触 OsO4。处理和废物处理应根据您所在机构的准则进行。将未使用的 OsO4存放在一个紧密堵塞的棕色玻璃瓶中, 在玻璃塞子上有特氟龙衬里, 将瓶子包裹在双铝箔中, 并存放在一个干燥器中。在存在泄漏烟雾的情况下, OsO4会使冰箱的内部表面和内容物变色。在上述存储条件下, OsO4解决方案在几个月内保持稳定。当溶液在储存过程中被氧化时, 它们会变成灰色, 在这种情况下, 它们需要被处理。
- 取5毫升 (一个安培) 的 4% oso
- 在样品小瓶中加入 1% OsO 4 0.1 m PB,让它坐 1小时. 用微型移液器在1小时后提取 oso4 。
请注意:在将 OsO4应用于该部分之前, 展开并使样品变平是至关重要的。避免直接在样品顶部涂抹, 而是使用小瓶壁轻轻地将 OsO4滴至小瓶底部。应用 OsO4后不久, 试样就会变成棕色和刚性.从现在开始轻轻处理, 以避免组织损伤
5. 冲洗
请注意:使用 OsO4固定后和脱水前冲洗标本是很重要的, 因为残留的固定物可能会与脱水剂发生反应37。
- 用 0.1 m PB 冲洗 3分钟 x 3。
请注意:由于新生大鼠的大脑对渗透率的变化非常敏感, 因此在固定混合物12、35、36、37中使用的相同车辆中进行清洗。 - 将铬溶液和前两个 PB 冲洗到 Osmium4 废物中, 并根据您所在机构的准则进行处理。
6. 醋酸铀的连续脱水和染色
请注意:本作者的实验室采用水不混溶环氧树脂进行嵌入。当使用环氧树脂时, 所有样品的游离水必须在被嵌入介质渗透之前替换为有机溶剂。通过一系列乙醇和丙酮12的上升浓度的溶液将水通过样品通过, 将水去除。
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醋酸铀的制备
- 将含有100毫升 EtOH 70% 的200毫升体积玻璃瓶放在搅拌板上。
- 在烧瓶中加入4克 ua。用铝箔包裹 (当暴露在光线下, ua 沉淀), 并不断搅拌。
请注意:UA 在 70% EtOH 中缓慢而不完全地溶解。在使用溶液之前, 让未溶解的晶体沉淀下来。UA 溶液在使用前应使用0.45μm 的过滤器进行过滤。UA 可以提前准备, 并保存在一个棕色的瓶子包裹在铝箔在4°c 的几个月。
注意事项:UA 具有轻度放射性和剧毒性。吸入 UA 粉可导致上呼吸道疾病和肺部、肝脏和肾脏疾病。UA 是危险的, 当摄入或当它涉及到直接接触皮肤和粘膜。所有工作都应使用手套和防护服在熏蒸罩中进行。处理和废物处理应根据您所在机构的准则进行。
- 在 50% EtOH 中脱水 1分钟, 在加入 UA 之前去除 50% EtOH。
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在 70% EtOH 中添加 4% ua。让我们坐1小时或过夜。如果过夜, 则放置在冰箱中的4°C。
注:盖, 以避免 EtOH 蒸发和覆盖与铝箔, 以避免暴露在光线。协议可以在这里暂停。- 根据贵机构的准则处理 ua 废物和以下两种冲洗
- 在 70% EtOH 中脱水1分钟。
- 在 90% EtOH 中脱水5分钟。
- 在 100% EtOH 中脱水 5分钟 x2。
- 用丙酮冲洗标本 2分钟 x3。
7. 渗透和嵌入
请注意:如果没有树脂基体的额外支撑, 组织就不够刚性, 无法切割成薄片。因此, 渗透和嵌入必须在 12节之前。
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EPON 树脂的制备
- 使用60毫升的灌胃注射器。取出注射器柱塞, 用安全针封住注射器。
- 将打开的侧的注射器向上放置, 并以增量方式添加树脂混合物的每个成分的体积。加入22毫升的嵌入式 812 (树脂)。将 DDSA (硬化剂) 添加到37毫升的总体积中。将 NMA (固化剂) 添加到 50.5 mL 的总体积。用移液器加入525μl 的 DMP-30 (加速器)。由于 DMP 非常粘稠, 因此非常缓慢地移动移液器的柱塞。
注:按照列出的顺序添加嵌入试剂非常重要。必须最后添加加速器 (DMP-30)。要获得具有所需特性的固化块, 必须使用硬化剂和加速器的确切数量。新鲜制备的嵌入混合物是首选。 - 将柱塞放回原处, 将注射器放在摇杆上, 连续晃动至少 3 0分钟, 颜色会从黄色变成黄色。
请注意:所有成分必须非常彻底地混合。如果做不到这一点, 组织标本的浸渍就会不均匀, 硬度也会不均匀
- 将1体积的 EPON 树脂与1体积丙酮混合在一个扫描小瓶中, 搅拌均匀。取出最后一次丙酮冲洗后, 将丙酮混合物应用于组织上。保持覆盖, 以避免丙酮蒸发。2-4 后取出树脂和丙酮的1:1 混合物, 或保持一夜。
注:协议可以在此处暂停。 - 将树脂和丙酮的混合物更换为完整的树脂。让我们坐4小时或过夜。将所有 EPON 废物放入引擎盖下的收集容器中, 以便在以后进行聚合和处理。
注:协议可以在此处暂停。
8. 平面嵌入
请注意:样品是平嵌入之间的两个丙烯酸电影在一个三明治般的方式。
- 切成两片长方形的透明的板料。用 EtOH 70% 擦拭薄膜干净。修剪板材, 使部分两侧至少有1.5 厘米的无组织塑料。顶部的缩板应与底部的宽度相同, 其高度应约为底部板材的三分之二。
- 慢慢地倾斜小瓶与标本, 轻轻地将组织从小瓶底部抬起。
- 使用微型柔性铲子和精细的刷子, 沿着小瓶壁仔细移动部分, 并转移到丙烯酸片上。
请注意:小心处理截面, 以免损坏试样。 - 轻轻地将果片放在标本的顶部。
请注意:确保两片之间有足够的树脂来密封三明治 - 轻轻推出任何被困的气泡, 而不会对该部分施加直接压力。擦掉多余的 EPON。
请注意:消除气泡是很重要的, 因为它们的存在使样品的可视化变得困难, 并削弱了树脂粘结的稳定性。 - 用耐溶剂的笔给床单贴上标签, 然后在烤箱中放置60ͦC 聚合2-3天。
注:协议可以在此处暂停。
9. 胶囊嵌入
请注意:超微管配有夹头, 以固定从胶囊中嵌入标本中获得的圆柱形块。圆柱形块具有理想的几何形状, 受切片过程中产生的振动的影响最小。
- 轻轻打开夹在一起的果场电影。标本将粘附在两个 aclar 片中的一个上。
- 使用耐溶剂的笔标记包含该部分的 aclar 工作表的一侧。在纸巾附近做标记。
请注意:在打出感兴趣的组织之前, 执行这一步骤是至关重要的。 - 使用圆盘冲床获取截面的圆样本。笔标记应该是打出来的组织的一部分。
- 在胶囊支架上准备嵌入胶囊侧的盖。在瓶盖上放一滴树脂。
- 将打孔的圆盘放在瓶盖内, 组织部分朝上。当光线照在标本上时, 笔印会发光。
- 将胶囊插入瓶盖, 然后使用精细的推子插入标签。将打印出2厘米长的纸张卷入胶囊中。使标签适合胶囊的侧壁的曲率。等待聚合完成, 使标签永久嵌入到树脂中。
- 将嵌入树脂倒在胶囊内, 灌满至胶囊边缘。
- 借助尖木棒将组织标本推至胶囊底部, 并在60°c 的烤箱中放置2-3天。
请注意:注意不要把组织压得太紧, 而是让它松散地躺着, 这样在组织和胶囊表面之间就会出现一层薄薄的嵌入介质。协议可以在这里暂停。
10. 块面的修剪
请注意:小尺寸和适当形状的块面是令人满意的切片的先决条件。因此, 修剪试样块是必要的。
- 使用锋利的单刃剃须刀片。使用前立即用丙酮清洗。
- 将胶囊块安装在块支架中, 并将块支架放置在立体显微镜的舞台上。
请注意:修剪过程应在显微镜双筒望远镜和斜照明下进行。 - 用剃须刀片从胶囊的尖端取下耳板。在解剖范围的光线下, 机舱板料显示为闪亮的层。
- 将剃须刀片保持在45度的角度, 并将胶囊块的四边切下来。
请注意:如果用双手固定刀片, 可以更好地控制修剪。 - 进行短切, 使块采取一个短金字塔的形式, 墙角约45°。
请注意:如果导致标本面的侧面保持较短, 则可更好地支撑样品面。如果块尖端太薄和太长, 它将在薄切片过程中振动。理想情况下, 感兴趣的区域应集中在块面。 - 修剪胶囊的尖端, 丢弃多余的组织, 只保留感兴趣的区域。
请注意:截面的任何部分都不应该没有组织, 因为块面密度的变化是切片困难的主要原因。理想情况下, 胶囊面的表面积不应超过1毫米 2. - 将胶囊面修剪成鳞片梯形。因为在鳞片梯形中没有任何一侧是相等的, 所以这个形状最好相对于标本的其他部分来定位感兴趣的区域。
请注意:在切片过程中, 梯形面的支撑比任何其他形状都要好得多。
11. 微孔分离
请注意:大多数生物标本的自然状态太厚, 无法被电子束穿透。因此, 材料必须切割成可以被电子束穿透的薄片。
- 在与表面平行的平面上 , 在超微胶卷上切割薄薄的部分 ( 银干涉色 , 600 - 900 ) 。
- 将节放在网格上。作者的实验室使用外径3.05 毫米的铜网。
请注意:协议可以在这里暂停。
12. 醋酸铀染色后
- 在蒸馏水中制备2% 的 UA。将含有100毫升蒸馏水的200毫升体积玻璃瓶放在搅拌板上。在烧瓶中加入2克 ua。用铝箔包裹 (当暴露在光线下, ua 沉淀), 并不断搅拌。
请注意:有关普遍获得服务准备的详细信息, 请参见本协议第6节。 - 将几个 2% ua 的单独滴放在培养皿中的一张干净的牙科蜡上。
- 将栅格与样品 (部分侧向下) 漂浮在 UA 的一滴上25分钟。
请注意:将每个网格浮动在一个单独的 UA 上。 - 用钳子将网格放在边缘, 在室温下从塑料洗涤瓶中轻轻冲洗两次。
请注意:在用铅染色之前, 不要让网格干燥。
13. 铅染色后
- 准备一个二氧化碳自由室 (空气中的二氧化碳是铅沉淀的主要来源)。将一张浸泡在 1 N NaOH 的滤纸放入培养皿中。在滤纸上放置一小块干净的牙科蜡, 并在盘子的一侧放置几个 NaOH 颗粒。盖上盘子。
请注意:准备此设置之前, 网格被弄脏, 使大气中的空气中的二氧化碳是免费的 , 并准备铅染色的时候 ua 染色完成。 - 做出4% 的氢氧化钠。在5毫升的蒸馏水中加入0.2 克的 NaOH。
- 准备佐藤的三重铅解决方案。制备10毫升, 在玻璃瓶中加入0.1 克硝酸盐铅、0.1 克柠檬酸铅、0.1 克醋酸铅和0.2 克柠檬酸钠。加入8.2 毫升蒸馏水, 用力摇晃 5分钟, 加入1.8 毫升新鲜制作的 4% NaOH。
- 将几滴佐藤的铅放在培养皿中的蜡上。
- 将涂有 UA (部分向下) 的网格放在铅的掉落处。
请注意:每个网格都应浮动在单独的引线上。每个落差都应该足够小, 让网格漂浮在落差的圆顶上, 而不是从两侧滑落。 - 盖上盘子, 让污渍5分钟。
- 用钳子将网格固定在边缘, 并在室温下从塑料洗涤瓶中轻轻喷水彻底清洗。
- 将滤纸上的网格擦干并存储网格。
请注意:确保该部分不会与滤纸直接接触。
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Representative Results
已确定了主要被接受为表示 TEM 样品保存令人满意或有缺陷的一般标准。这些标准在四个选定的电子显微镜 (两个最佳制备例子, 两个有缺陷的制备例子) 中得到了通过按照本协议所述的方法治疗年轻的大鼠脑组织。
一般来说, 高质量的电子显微镜显示为有序、清晰和整体的灰度图像。在令人满意的样品中, 膜之间的空间应充满颗粒状材料, 并且不应该是空的。同样, 在细胞质地面物质或细胞器内也不应有空位 (将图 1A和图 2A与图 3和图 4进行比较)。然而, 需要注意的是, 与成人大脑相比, 非常幼小的动物的中枢神经系统显示出一定程度的细胞外空间扩大, 细胞与整体白细胞之间的联系较松散, 较少电子密集的外观。膜应该是连续的, 没有变形或破损 (图 1 a 和图 2 a)。线粒体的间质应该显得均匀而致密, 没有空位。Cristae 应该是完整的, 不肿胀, 并且线粒体外双膜应该是不破的 (比较图 1A与图 3)。为了便于突触前囊泡组织的形态分析, 突触前和突触后膜需要完整且本质上彼此平行 (参见图 1)。突触囊泡应该是可追踪的, 并由一个连续的单膜约束 (见图 2)。
重要的是, 即使遵循最佳实践, 使用固定剂、污渍和树脂处理样品也会带来伪影。由于文物无法消除, 了解它们的来源是什么过程至关重要, 这样就可以根据它所经历的治疗来解释标本的外观。一个文物的例子--在 TEM 标本制备过程中可以产生的几个例子--是一个髓鞘图, 一种类似于髓鞘的膜层状夹杂物。虽然髓鞘的数字可以在病理条件12 中看到, 但它们最常见的结果是在与醛固定过程中提取膜脂质 (见图 4)。
图 1: 电子显微镜代表满意的保存细胞结构 (示例 1).(A) 神经细胞膜是分层的, 没有断裂。细胞质是细粒状的, 没有空位。线粒体既不膨胀也不缩小。它们的外双膜是保守的, 内部的犯罪是完整的。(B) a 面板的详细信息, 举例说明一种测量突触囊泡与突触前膜距离的方法。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 电子显微镜代表满意的保存细胞结构 (示例 2).(A) 突触囊是独特的和内衬一个完整的单膜。为了能够对突触囊的分布进行形态分析, 突触前和突触后膜需要平行, 并保持其连续性。(B) a 面板的详细信息, 说明在突触前末端内突触囊泡的计数。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 电子显微镜代表组织结构保存有缺陷的问题 (示例 1).注意神经元细胞膜的畸变和断裂, 以及明显扩大的细胞外空间的存在 (标记为 *)。线粒体出现扩张, 并有肿胀的犯罪 (用箭头标记)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 电子显微镜代表组织结构保存有缺陷的问题 (示例 2).注意细胞质中存在较大的白色空白空间 (用ǂ标记), 以代替细粒细胞质物质。细胞外空间显示为放大。一个人工膜轮 (髓鞘图), 很可能是由于在与戊二醛固定过程中的脂质动员而产生的, 上面有首字母缩写 MF。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在 TEM 标本制备过程中处理组织切片需要相当程度的技巧、注意力和耐心。当使用微移液器添加和去除溶液时, 可以通过表面张力将样品吸进移液器尖端, 因此应非常小心, 以避免移液器对组织造成损伤。此外, 脱水顺序的某些步骤可以快速达 1分钟, 因此操作人员需要快速工作, 以确保下一个脱水步骤按时开始, 并且样品不会干燥或起皱。需要特别注意的一个程序是与的固定后。经过处理后, 截面变得坚硬, 很容易损坏。在添加之前, 必须将部分压平在小瓶的底部, 否则任何褶皱都会导致组织骨折。当将切片转移到囊膜上进行平面嵌入时, 渗透组织的处理尤其具有挑战性。从小瓶底部提起标本时, 需要特别小心, 以避免碎裂, 并将气泡从薄膜夹层中推出。虽然将任何被困的空气推出都很重要, 因为这使得样品的可视化变得困难, 并削弱了树脂粘结的稳定性, 但直接压力到渗透组织上很容易造成伤害。另一个需要格外小心的步骤是制备树脂混合物, 用于样品浸润和嵌入。EPON 是最广泛使用的嵌入树脂, 可以通过添加固化剂和加速器来硬化。为了获得具有所需特性的固化块, 必须使用硬化剂和加速器的确切数量。描述了用于测量粘性树脂的重量和体积方法。虽然重量法传统上被认为更精确 12,这个作者的实验室已经取得了良好的成功, 体积模式 (即, 增加的体积混合树脂的每一个成分的体积, 通过灌胃注射器增量).在仔细测定树脂组分后, 必须非常彻底地混合, 以实现均匀浸渍, 因为它们具有不同的粘度和聚合速率。如果不能实现完全混合, 将导致块不均匀的硬度, 不适合薄切片。
用于处理幼小大鼠大脑切片的溶液的色调变化会导致细胞外空间和细胞成分12、35、36、37的萎缩和肿胀.在固定过程中, 当乳液的渗透压力尽可能与所研究的组织相似时, 就会得到最好的结果。大鼠脑渗透性约为 330 mOsm。0.1 m PB 溶液中2% 的戊二醛只是轻微的高渗 (400-450 mOsm), 最大限度地减少血管外空间的扩张 12.值得注意的是, 膜对与醛固定后的漂洗和脱水溶液的渗透压变化保持敏感。因此, 最大限度地减少固定剂的渗透性与随后使用的溶液 12、35、36、37之间的差异也很重要。因此, 同一车辆 (0.1 m PB, 近似渗透性 440 mOsM) 被用作本协议中所有溶液的溶剂。但是, 应当指出的是, 在 TEM 样品制备过程中成功地使用了几种不同的缓冲器, 没有一个缓冲器可以声称比其他缓冲器具有普遍优势。当首选的低色调的缓冲液, 其他实验室选择增加渗透度与电解质或非电解质 12.
该议定书中的几个步骤要求使用如果处理不当可能有毒的化学品。在处理醛、铬、铀和铅化合物时, 在熏蒸罩下工作和佩戴个人防护设备的重要性怎么强调也不为过。虽然自动对比系统可以帮助减轻一些风险, 而且在商业上可以获得, 但它们可能相当昂贵, 不经常使用 TEM 的实验室可能负担不起。虽然电子显微镜实验室可能是一个危险的地方, TEM 样品处理是整体安全的, 当严格执行。
最近, 超分辨率光显微镜的引入使光学成像的分辨率提高到约15纳米34。然而, 当目标是在突触前终端对突触囊泡空间组织进行形态分析时, 没有任何技术能提供相同程度的形态学细节。重要的是, TEM 是有限的需要, 样品是死的, 然后才能对其进行处理和可视化。因此, 当研究的目的是研究突触囊贩运和外渗的动态或功能方面时, 应考虑 TEM 以外的工具。
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Disclosures
作者们没有什么可透露的。
Acknowledgments
这份手稿得到了 nihms08123321 (至 n. l.) 和弗吉尼亚大学麻醉学系的资助。作者们要感谢弗吉尼亚州夏洛特斯维尔弗吉尼亚大学生物系在 TEM 方面提供的出色培训和技术援助, 以及她对手稿的宝贵批评。作者们还感谢弗吉尼亚大学的先进电子显微镜设施在标本切片和染色后提供的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
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