Summary
Descriviamo le procedure per l'elaborazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici ad alta risoluzione per l'analisi morfolometrica della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali nervosi. I micrografi ottenuti con questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia di un certo numero di altri componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali.
Abstract
Il nostro laboratorio e molti altri hanno sfruttato l'alto potere risolutivo della microscopia elettronica di trasmissione per studiare la morfologia e l'organizzazione spaziale delle vescicole sinaptiche. Al fine di ottenere micrografi elettronici di alta qualità che possono produrre il grado di dettaglio morfologico necessario per l'analisi quantitativa della distribuzione della vescicola pre-sinaptica, la preparazione ottimale dei campioni è critica. La fissazione chimica è il primo passo nel processo di preparazione del provino, e della massima importanza per preservare l'ultrastruttura fine. La fissazione vascolare con una soluzione di glutaraldeide-formaldeide, seguita dal trattamento di esemplari sezionati con vibratoma con tetroxide di osmio, stabilizza il numero massimo di molecole, in particolare proteine e lipidi, e si traduce in una conservazione superiore di ultrastruttura. Il tessuto viene quindi elaborato con controcolorazione, disidratazione sequenziale e resina-incorporamento. La colorazione in blocco con l'acetato di uranile (cioè la colorazione del tessuto vibratoma-sezionato prima dell'incorporamento della resina) migliora il contrasto endogeno e stabilizza i componenti cellulari contro l'estrazione durante la lavorazione del campione. Il contrasto può essere ulteriormente aumentato applicando l'acetato di uranile come post-macchia su sezioni ultrasottile. La doppia colorazione delle sezioni ultrasottile con citrato di piombo dopo il trattamento con acetato di uranile migliora anche la risoluzione dell'immagine, intensificando l'opacità dell'elettrone delle strutture contenenti acido nucleico attraverso il legame selettivo del piombo all'acetato di uranile. La microscopia elettronica di trasmissione è un potente strumento per la caratterizzazione dei dettagli morfologici delle vescicole sinaptiche e la quantificazione delle loro dimensioni e organizzazione spaziale nel bouton terminale. Tuttavia, poiché utilizza il tessuto fisso, la microscopia elettronica di trasmissione può fornire solo informazioni indirette sui processi viventi o in evoluzione. Pertanto, altre tecniche dovrebbero essere prese in considerazione quando l'obiettivo principale è quello di studiare aspetti dinamici o funzionali del traffico di vescicole sinaptiche ed esocitosi.
Introduction
Descriviamo i metodi per la preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici di alta qualità per l'analisi morfolometrica approfondita della distribuzione spaziale della vescicola sinaptica ai terminali nervosi1,2. I micrografi ad alto contrasto che possono essere ottenuti elaborando campioni seguendo questi metodi possono anche essere utilizzati per studiare la morfologia dettagliata di un certo numero di componenti cellulari e le loro relazioni strutturali dimensionali3,4.
Il microscopio elettronico a trasmissione (TEM) è un potente strumento per studiare quantitativamente la morfologia degli organelli e di altre strutture cellulari. A partire da questo decennio, non ci sono altri metodi di indagine che possono fornire lo stesso grado di risoluzione delle membrane lipidiche e organelli senza immuno-tagging, ad eccezione della criofissazione da congelamento ad alta pressione. Tuttavia, le tecniche di sostituzione del congelamento non sono ampiamente utilizzate, e normalmente richiedono attrezzature costose e lunghi tempi di preparazione.
Al fine di sfruttare l'elevata potenza risolutivo di TEM, la preparazione ottimale dei campioni è di fondamentale importanza. Gli obiettivi principali della preparazione dei campioni sono di preservare la struttura tissutale con minime alterazioni dallo stato vivente, migliorare il contrasto dei campioni e stabilizzare il tessuto contro l'estrazione dei componenti cellulari durante la lavorazione e l'esposizione all'elettrone Raggio. Numerosi protocolli per la preparazione dei tessuti TEM sono stati introdotti e perfezionati da diversi laboratori nel corso degli anni. Molti di loro si sono concentrati sui metodi per una visualizzazione ottimale delle vescicole sinaptiche5,6,7,8,9,10,11. Tra una serie di metodi standard d'oro consolidati attualmente in uso, abbiamo scelto procedure per la fissazione chimica, la post-fissazione, la colorazione in blocco, la disidratazione sequenziale, l'incorporamento di resina e la colorazione post che mirano a preservare la struttura dei tessuti ottimale e ottenere un eccellente contrasto dell'immagine. Di nota, la conservazione di ultrastruttura fine può essere particolarmente impegnativo quando si lavora con il tessuto cerebrale del ratto neonato. Infatti, il sistema nervoso centrale di animali molto giovani è caratterizzato da un maggiore contenuto di acqua rispetto al cervello adulto, più prominente allargamento degli spazi extracellulari, e connessioni più allentati tra le cellule12. Questo rende il tessuto cerebrale del ratto neonato profondamente sensibile ai cambiamenti nell'osmolarità, e squisitamente incline al restringimento degli artefatti e/o gonfiore quando elaborato attraverso soluzioni sequenziali di diversa tonicità12. Pertanto, i nostri metodi impiegati soluzioni per la lavorazione dei campioni che sono di osmolarità il più vicino possibile a quella del cervello neonato ratto. Il nostro obiettivo era ottenere immagini di microscopia elettronica ad alta risoluzione di alta qualità per la valutazione quantitativa della distribuzione spaziale della vescicola sinaptica nei terminali nervosi. In particolare, abbiamo cercato di misurare il numero di vescicole all'interno del terminale nervoso, la distanza delle vescicole sinaptiche dalla membrana plasmatica pre-sinaptica, il numero di vescicole ancorate alla membrana pre-sinaptica, la dimensione delle vescicole sinaptiche e la Distanze intervescicole1.
Una fissazione chimica soddisfacente è un prerequisito per ottenere micrografi elettronici di alta qualità in grado di fornire il dettaglio morfologico necessario per studiare la morfologia e l'organizzazione spaziale della vescicola sinaptica. Sebbene esistano diverse modalità di fissazione, la fissazione del tessuto cerebrale mediante perfusione vascolare è decisamente superiore ad altri metodi. Poiché la fissazione tramite perfusione vascolare inizia immediatamente dopo l'arresto della circolazione sistemica, accorcia l'intervallo tra la deossigenazione del tessuto cerebrale e il cross-linking delle proteine con fissativi, con conseguente alterazioni minime nelle cellule struttura. Inoltre, realizza una penetrazione veloce e uniforme, a causa del rapido flusso del fissativo dal letto vascolare ai compartimenti extracellulari e cellulari12,13,14. La fissazione primaria con glutaraldeide, seguita da fissazione secondaria (post-fissazione) con tetroxide di osmio, produce un'eccellente preservazione della struttura fine15,16,17. Una miscela di glutaraldeide e paraformaldeide ha il vantaggio aggiuntivo di una penetrazione più rapida nel tessuto12.
Poiché i tessuti biologici non sono sufficientemente rigidi per essere tagliati in sezioni sottili senza il supporto di una matrice di resina, devono essere incorporati in un mezzo prima del sezionamento sottile. Le resine epossidiche immiscibili in acqua sono comunemente utilizzate come mezzo di incorporamento in TEM. Quando si utilizza questo tipo di matrice, l'acqua libera del campione deve essere sostituita con un solvente organico prima dell'infiltrazione di resina. L'acqua viene rimossa passando il provino attraverso una serie di soluzioni di concentrazioni ascendenti di etanolo e/o acetone12. In questo protocollo, i campioni sono primi piatti incorporati tra fogli di Aclar flessibili, quindi incorporati in una capsula. Il risultato finale è il tessuto situato sulla punta di un blocco di resina cilindrica, che ha la geometria ideale per essere meno influenzato dalle vibrazioni derivanti durante il sezionamento del microtomo.
La colorazione con metalli pesanti per migliorare il contrasto del tessuto endogeno è un altro aspetto importante della preparazione dei campioni. Il contrasto dell'immagine in TEM è dovuto alla dispersione di elettroni da parte degli atomi nel tessuto. Tuttavia, i materiali biologici consistono in gran parte di molecole a basso peso atomico (cioè carbonio, idrogeno, ossigeno e azoto). Pertanto, la generazione di un contrasto di dispersione sufficiente richiede l'incorporazione di atomi di peso atomico elevato nei componenti cellulari del tessuto. Ciò si ottiene attraverso la colorazione del campione con metalli pesanti12,18,19. Tetroxide di osmio, uranio e piombo, che si legano fortemente ai lipidi, sono i metalli pesanti più comuni utilizzati come macchie di elettroni.
L'osmio (numero atomico 76) è uno dei metalli più densi esistenti. È sia un fissativo che una macchia, anche se il suo ruolo primario in TEM è come un fissativo affidabile12. Tra i vari protocolli di fissazione in uso, il metodo di doppia fissazione con glutaraldeide seguita da osmio è il più efficace nel ridurre l'estrazione dei costituenti delle cellule durante la preparazione del provino. Questi due fissativi sono utilizzati per stabilizzare il numero massimo di diversi tipi di molecole, in particolare proteine e lipidi, e si traducono in una preservazione superiore dell'ultrastruttura tissutale12,14,15, 16 anni di , 17. la
L'uranio (numero atomico 92) è il metallo più pesante utilizzato come macchia elettronica, più tipicamente sotto forma di acetato di uranile. Analogamente all'osmio, agisce come una macchia e fissativo, anche se il suo ruolo primario in tem è come una macchia20,21. Le strutture contenenti acido nucleico e membranose sono fortemente e preferenzialmente macchiate con sali di uranile in tessuti fissi aldeidi22,23. Il trattamento dei tessuti con acetato di uranile dopo l'osmicazione e prima della disidratazione provoca la stabilizzazione di strutture membranose e contenenti acido nucleico, nonché un maggiore contrasto, e consente l'identificazione di alcuni dettagli strutturali che non essere facilmente rilevati in esemplari macchiati con osmio da solo12,24,25. Si pensa che l'acetato di uranile possa stabilizzare la struttura fine combinando con l'osmio ridotto che è stato depositato sulle membrane lipidiche durante l'osmicazione24. Il contrasto massimo si ottiene quando l'acetato di uranile viene applicato prima dell'incorporamento e come post-macchia nelle sezioni sottili12.
Piombo (numero atomico 82) è la macchia più comune utilizzata per TEM ed è principalmente impiegata per la post-colorazione di sezioni sottili. I sali di piombo hanno un'elevata opacità degli elettroni e mostrano affinità per una vasta gamma di strutture cellulari, tra cui membrane, proteine nucleari e citoplasmatiche, acidi nucleici e glicogeno26,27. Quando il metodo della doppia colorazione è impiegato (cioè, la colorazione con l'acetato di uranile è seguita dal trattamento con piombo), quest'ultimo agisce come sviluppatore di colorazione di acetato di uranile. Per esempio, il piombo post-colorazione della cromatina fissa con glutaraldeide aumenta l'assorbimento di uranile acetato di un fattore di tre28,29, 30,31,32. Il piombo migliora anche la colorazione impartita da altri metalli come l'osmio. Si ritiene che i sali di piombo macchiavano le membrane dei tessuti fissi di osmio attaccando al gruppo polare di fosfatidi in presenza di un ridotto Osmio33. Un potenziale svantaggio della colorazione sia con l'acetato di uranile che con il piombo, soprattutto per le durate prolungate, è che molti elementi strutturali diversi sono macchiati ugualmente e non specificamente, e quindi non possono essere facilmente distinti l'uno dall'altro12 .
La recente introduzione di fonti di luce alternative, come nella microscopia di localizzazione fotografica a Super risoluzione ottica, ha migliorato significativamente la risoluzione della microscopia della luce34. Tuttavia, poiché la microscopia leggera si basa su metodi istochimici e immunocicaminici per visualizzare proteine o enzimi etichettati individualmente, la potenza di TEM per visualizzare tutti gli elementi strutturali in una sola volta rimane insuperata per uno studio approfondito del morfologia e le relazioni dimensionali delle strutture tissutali. In particolare, nessun'altra tecnica può fornire il dettaglio morfologico necessario per eseguire l'analisi morfologica della distribuzione delle vescicole sinaptiche a attacchi nervosi pre-sinaptici. Tuttavia, è importante notare che i micrografi elettronici catturano la struttura del tessuto dopo che l'organismo muore, e quindi non possono fornire informazioni sulle dinamiche del traffico di vescicole pre-sinaptiche ed esocitosi. Pertanto, altri strumenti, come ad esempio il colorante FM-Live Imaging e l'elettrofisiologia patch-clamp, dovrebbero essere presi in considerazione quando l'obiettivo principale è quello di studiare gli aspetti dinamici e/o funzionali del traffico di vescicole sinaptiche e dell'esocitosi.
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Protocol
Tutti gli studi sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Virginia (Charlottesville, VA) e condotti in conformità con le linee guida degli istituti nazionali di sanità.
1. fissazione per perfusione vascolare
Nota: Una descrizione generale del metodo per la perfusione vascolare del cervello del ratto è stata già dettagliata in questa rivista13 ed è oltre l'ambito di questo protocollo. Tuttavia, i seguenti passaggi sono specifici per la preparazione del tessuto cerebrale del ratto neonato per ottenere micrografi elettronici di alta qualità per l'analisi quantitativa della distribuzione delle vescicole sinaptiche nei terminali pre-sinaptici.
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Prepara il 4% di paraformaldeide
- Posizionare 800 mL di 0,1 M fosfato tampone (PB) in un bicchiere di vetro da 2 L su una piastra di agitazione sotto una cappa aspirante. Riscaldare a circa 60 ° c senza bollire il tampone.
- Aggiungere 40 g di polvere di paraformaldeide. Mescolare continuamente
- Durante la misurazione del pH, aggiungere piccole gocce di 10 N NaOH fino a quando la soluzione non viene cancellata. Il pH finale deve essere 7,2-7,4.
- Aggiungere il restante 0,1 M PB a un volume finale di 1 L. Lasciare raffreddare, filtrare con una membrana di 0,45 μm e conservare a 4 ° c durante la notte.
Nota: Preparare la paraformaldeide fresca il giorno prima della perfusione.
Attenzione: L'inalazione di vapori di aldeide può causare sintomi nasali e irritazione delle vie respiratorie. Il contatto con la pelle provoca dermatiti. Le aldeidi devono essere trattate in una cappa aspirante indossando guanti, un abito protettivo e occhiali di sicurezza
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Preparare la soluzione Tyrode
- Mettere 1 L di acqua distillata in un bicchiere di vetro su una piastra di agitazione. Aggiungere NaCl (8 g), KCl (0,15 g), CaCl2 (0,1 g), MgCl2 (0,006 g), nah2po4 (0,055 g), NaHCO3 (1 g) e destrosio (1 g) nel beaker.
- Mescolare continuamente e misurare il pH. Mantenere il pH tra 7,2 e 7,4.
Nota: La soluzione Tyrode è disponibile anche in commercio.
- Miscelare il 4% di paraformaldeide con glutaraldeide ad una concentrazione finale del 2%. Aggiungere 40 mL di microscopia elettronica-grado 50% glutaraldeide a 1 L di 4% paraformaldeide. Mescolare bene in una piastra di agitazione
Nota: Circa 100 ml della soluzione fissativa paraformaldeide-glutaraldeide è necessario per profumi il corpo di un ratto neonato. Pertanto, almeno 10 ratti neonati possono essere perfusati con 1 L di fissativo. Non mescolare paraformaldeide e glutaraldeide fino a quando non immediatamente prima dell'uso. Portare tutte le soluzioni a temperatura ambiente prima della perfusione. - Una volta che l'accesso al ventricolo sinistro è stato acquisito (vedere il protocollo di perfusione animale intero13), lavare il sistema vascolare con soluzione Tyrode per 30 s ad una pressione di perfusione di 120 mmHg.
Nota: Il successo della perfusione dipende in parte dalla completa esclusione del sangue dal letto vascolare - Lavare con la soluzione di paraformaldeide-glutaraldeide alla stessa pressione per 10 min.
Nota: Il mantenimento della pressione di perfusione costante è essenziale per evitare l'introduzione di artefatti. Inoltre, la temperatura del perfusato non deve essere inferiore alla temperatura corporea del ratto per evitare la vasocostrizione - Rimuovere il cervello fisso dal cranio e posizionarlo nel fissativo paraformaldeide-glutaraldeide fresco a 4 ° c durante la notte.
Nota: il protocollo può essere messo in pausa qui.
2. il cervello affettare
- Incorporare il cervello fisso in 4% agarosio e incollare il cervello-blocco di agarosio su uno stadio vibratoma
Nota: Altri laboratori hanno ottenuto sezioni di buona qualità ottenendo un blocco stabile sul VIBRATOME senza supporto agar - Sezioni di spessore 50 μm. Impostare il microtomo a bassa frequenza e velocità.
Nota: Le sezioni possono essere conservate in 0,1 M PB con 0,05% di sodio azide a 4 ° c per diversi anni. - Posizionare le sezioni in 0,1 M PB in una capsula di Petri, esaminare le sezioni sotto un microscopio di dissezione e selezionare i campioni per l'incorporamento
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
3. risciacquo
Nota: È importante risciacquare il campione dopo la fissazione con aldeidi e prima del post-fissazione con osmio, poiché i fissativi residui possono produrre precipitati di osmio
- Pipettare 0,1 M PB in un flaconcino di vetro corto a bocca larga con tappo. Inserire un campione per ogni flaconcino. Coprire completamente il provino in modo che non si asciughi.
Nota: Tenere i campioni nello stesso flaconcino da questo passaggio attraverso tutti i cambiamenti di soluzione di fissazione, disidratazione e infiltrazione, fino a quando non sono pronti per l'incorporamento piatto. - Sciacquare il campione in 0,1 M PB per 3 min x 2, quindi rimuovere il PB con una micropipetta.
Nota: Poiché il cervello del ratto neonato è profondamente sensibile ai cambiamenti nell'osmolarità12,35,36,37, eseguire i lavaggi nello stesso veicolo utilizzato nella miscela fissativa
4. post-fissazione con osmio
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Preparazione di tetrossido di osmio (OSO4)
Nota: Il laboratorio di questo autore utilizza OsO4 4% fornito in una soluzione acquosa in fiale di vetro (5 ml di OSO4 4% in H2O). Altri laboratori hanno usato OsO4 cristalli con successo. Tuttavia, diverse ore sono necessarie per sciogliere OsO4 cristalli in un veicolo.- Prendere 5 mL (una fiala) di 4% OsO4/H2O, aprirlo e posizionarlo in una bottiglia di vetro marrone
Nota: OsO4 è un forte agente ossidante e prontamente ridotto dall'esposizione alla luce. La riduzione può essere evitata durante la preparazione mettendo OsO4 in una bottiglia di vetro marrone - Aggiungere 5 mL di 0,2 M PB. Questo produrrà 10 mL di 2% OsO4/0,1 M PB.
Nota: Poiché il cervello del ratto neonato è profondamente sensibile ai cambiamenti nell'osmolarità, utilizzare lo stesso tampone per preparare i fissativi aldeidi e oso4 soluzione12,35,36,37 - Aggiungere ulteriori 10 mL di 0,1 M PB. Questo produrrà una soluzione finale di 20 mL di 1% OsO4 in 0,1 m PB.
- Utilizzare una siringa da 20 mL dotata di un ago lungo per aspirare 1% OsO4 e posizionarla in una bottiglia di vetro marrone o in una fiala di scint ricoperta di foglio di alluminio.
Attenzione: OsO4 è estremamente volatile e i suoi fumi sono tossici per naso, occhi e gola. Tutti i lavori devono essere eseguiti in una cappa con guanti e indumenti protettivi, e nessuna parte del corpo deve essere esposta a OsO4. La manipolazione e lo smaltimento dei rifiuti devono essere effettuati secondo le linee guida dell'Istituto. Conservare l'inutilizzato OsO4 in una bottiglia di vetro marrone ben tappata con fodera in teflon sul tappo di vetro, avvolgere la bottiglia in doppio foglio di alluminio e conservare in un essiccatore. In presenza di fumi fuoriuscite, OsO4 può scolorare le superfici interne e il contenuto del frigorifero. Nelle condizioni di conservazione di cui sopra, la soluzione OsO4 è stabile per diversi mesi. Quando le soluzioni vengono ossidate durante lo stoccaggio, si trasformano in grigio, nel qual caso devono essere smaltite.
- Prendere 5 mL (una fiala) di 4% OsO4/H2O, aprirlo e posizionarlo in una bottiglia di vetro marrone
- Aggiungere 1% OsO4 in 0,1 M PB nel flaconcino del campione e lasciar riposare 1 h. Estrarre OSO4 dopo 1 h con una micropipetta.
Nota: Prima di applicare OsO4 alla sezione, è fondamentale aprire e appiattire il provino. Evitare l'applicazione direttamente sulla parte superiore del provino, invece utilizzare le pareti del flaconcino per gocciolare delicatamente OsO4 sul fondo del flaconcino. Il provino diventa marrone e rigido poco dopo l'applicazione OsO4 . Maneggiare delicatamente da ora in poi per evitare danni ai tessuti
5. risciacquo del
Nota: È importante sciacquare il campione dopo la post-fissazione con OsO4 e prima della disidratazione, poiché i fissativi residui possono reagire con agenti disidratanti37.
- Risciacquare con 0,1 M PB per 3 min x 3.
Nota: Poiché il cervello del ratto neonato è profondamente sensibile ai cambiamenti nell'osmolarità, eseguire i lavaggi nello stesso veicolo utilizzato nella miscela fissativa12,35,36,37. - Collocare la soluzione di osmio e i primi due PB risciacqui in OsO4 rifiuti e smaltirli secondo le linee guida dell'Istituto.
6. disidratazione e colorazione sequenziale con l'acetato di Uranyl
Nota: Il laboratorio di questo autore utilizza resine epossidiche immiscibili in acqua per l'incorporamento. Quando si utilizzano resine epossidiche, l'acqua libera di tutti i campioni deve essere sostituita con un solvente organico prima dell'infiltrazione da parte del mezzo di incorporamento. L'acqua viene rimossa passando il provino attraverso una serie di soluzioni di concentrazioni ascendenti di etanolo e acetone12.
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Preparazione di uranile acetato (UA)
- Collocare un pallone di vetro volumetrico da 200 mL contenente 100 mL di EtOH 70% su una piastra di agitazione.
- Aggiungere 4 g di UA al pallone. Avvolgere in foglio di alluminio (UA precipitati quando esposto alla luce) e mescolare continuamente.
Nota: UA si dissolve lentamente e in modo incompleto in 70% EtOH. Consentire ai cristalli non disciolti di stabilirsi prima di utilizzare la soluzione. La soluzione UA deve essere filtrata con un filtro da 0,45 μm prima dell'uso. UA può essere preparata in anticipo e conservata in una bottiglia marrone avvolta in lamina di alluminio a 4 ° c per mesi.
Attenzione: UA è moderatamente radioattivo e altamente tossico. L'inalazione di UA polvere può causare disturbi del tratto respiratorio superiore e la malattia dei polmoni, fegato e reni. UA è pericoloso quando ingerito o quando viene a contatto diretto con la pelle e le membrane mucose. Tutti i lavori devono essere eseguiti in una cappa con guanti e indumenti protettivi. La manipolazione e lo smaltimento dei rifiuti devono essere effettuati secondo le linee guida dell'Istituto.
- Deidratare in 50% EtOH per 1 min. rimuovere 50% EtOH prima di aggiungere UA.
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Aggiungere 4% UA in 70% EtOH. Lasciate riposare per 1 h o durante la notte. In caso di pernottamento, mettere in frigorifero a 4 ° c.
Nota: tappo flaconcino per evitare l'evaporazione EtOH e coprire con foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Il protocollo può essere messo in pausa qui.- Smaltire i rifiuti UA e le due seguenti risciacqui secondo le linee guida dell'Istituto
- Deidratare in 70% EtOH per 1 min.
- Deidratare in 90% EtOH per 5 min.
- Deidratare in 100% EtOH per 5 min x 2.
- Sciacquare il campione in acetone per 2 min x 3.
7. infiltrazione e incorporamento
Nota: I tessuti non sono sufficientemente rigidi per essere tagliati in sezioni sottili senza il supporto aggiuntivo di una matrice di resina. Pertanto, l'infiltrazione e l'incorporamento devono precedere il sezionamento12.
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Preparazione della resina EPON
- Usare una siringa da 60 ml di sonda gastrica. Rimuovere lo stantuffo della siringa e tappare la siringa con un ago di sicurezza.
- Posizionare la siringa con il lato aperto verso l'alto e aggiungere il volume di ogni ingrediente della miscela di resina in modo incrementale. Aggiungere 22 mL di embed-812 (resina). Aggiungere DDSA (indurente) a un volume totale di 37 mL. Aggiungere NMA (indurente) a un volume totale di 50,5 mL. Aggiungere 525 μL di DMP-30 (Acceleratore) con una pipetta. Spostare lo stantuffo della pipetta molto lentamente poiché DMP è molto viscose.
Nota: è importante aggiungere i reagenti di incorporamento nell'ordine elencato. L'acceleratore (DMP-30) deve essere aggiunto per ultimo. Per ottenere un blocco polimerizzato che ha le caratteristiche desiderate, è fondamentale utilizzare l'esatta quantità di catalizzatore e l'acceleratore. Sono preferibili miscele di incorporamento preparate al momento. - Riposiziona lo stantuffo e posiziona la siringa su un rocker con agitazione continua per almeno 30 minuti. il colore cambierà da giallo a ambra.
Nota: Tutti gli ingredienti devono essere miscelati molto accuratamente. In caso contrario si traduce in impregnazione irregolare del campione di tessuto e un blocco di durezza irregolare
- Mescolare 1 volume di resina EPON con 1 volume di acetone in una fiala di scint e agitare per mescolare. Applicare la miscela di 1:1 EPON: acetone sul tessuto dopo aver rimosso l'ultimo risciacquo con acetone. Tenere coperto per evitare l'evaporazione dell'acetone. Rimuovere la miscela 1:1 di resina e acetone dopo 2-4 h o tenerla durante la notte.
Nota: il protocollo può essere messo in pausa qui. - Sostituire la miscela di resina e acetone con resina integrale. Lasciate riposare per 4 ore o durante la notte. Mettere tutti i rifiuti EPON in un contenitore di raccolta sotto il cofano per essere polimerizzato e smaltito in seguito.
Nota: il protocollo può essere messo in pausa qui.
8. incorporamento piatto
Nota: I campioni sono incastonati tra due pellicole Aclar in una moda a sandwich.
- Tagliare due pezzi rettangolari di lamiera di Aclar chiaro. Pulire i film puliti con EtOH 70%. Tagliare i fogli in modo che vi sia almeno 1,5 cm di plastica priva di tessuto su ogni lato della sezione. Il foglio di Aclar sulla parte superiore dovrebbe avere la stessa larghezza del fondo, e la sua altezza dovrebbe essere di circa due terzi del foglio inferiore.
- Inclinare lentamente il flaconcino con il provino e sollevare delicatamente il tessuto dal fondo del flaconcino.
- Utilizzare una spatola micro flessibile e un pennello fine per spostare con cautela la sezione lungo le pareti del flaconcino e trasferire sul foglio di Aclar.
Nota: Maneggiare le sezioni con cautela per evitare danni ai campioni. - Posizionare delicatamente il foglio di Aclar sulla parte superiore del provino.
Nota: Assicurarsi che ci sia abbastanza resina tra i due fogli per sigillare il panino - Spingere delicatamente le bolle d'aria intrappolate senza esercitare pressione diretta sulla sezione. Spazzare via l'eccesso di EPON.
Nota: L'eliminazione delle bolle d'aria è importante, in quanto la loro presenza rende difficile la visualizzazione del provino e indebolisce la stabilità dei legami di resina. - Etichettare i fogli con una penna resistente ai solventi e posizionarlo in forno a 60 ͦC per 2-3 giorni per polimerizzare.
Nota: il protocollo può essere messo in pausa qui.
9. incorporamento della capsula
Nota: Gli ultramicrotomi sono forniti con mandrini per contenere blocchi cilindrici ottenuti da incorporamento di campioni in capsule. I blocchi cilindrici hanno la geometria ideale per essere meno influenzati dalle vibrazioni che emergono durante il sezionamento.
- Aprire delicatamente i film Aclar schiacciati. Il campione aderirà a uno dei due fogli di Aclar.
- Utilizzare una penna resistente ai solventi per contrassegnare il lato del foglio di Aclar che contiene la sezione. Segna vicino al tessuto.
Nota: È fondamentale eseguire questo passaggio prima di perforare il tessuto di interesse. - Utilizzare un punzone disco per ottenere un campione circolare della sezione. Il segno della penna deve essere parte del tessuto perforato.
- Preparare il tappo di una capsula di incorporamento sul supporto della capsula. Posizionare una goccia di resina sul tappo.
- Posizionare il disco perforato all'interno del tappo con la sezione tissutale rivolta verso l'alto. Il segno della penna brilla quando la luce viene brillata sul provino.
- Inserire una capsula nel tappo e utilizzare pinzette sottili per inserire l'etichettatura. Arrotolare e abbassare un pezzo di carta stampato di 2 cm di lunghezza nella capsula. Rendere l'etichetta adatta alla curvatura delle pareti laterali della capsula. Attendere che la polimerizzazione sia completa, in modo che l'etichetta diventi permanentemente incorporata nella resina.
- Versare la resina incorporando all'interno della capsula e riempire fino al bordo della capsula.
- Spingere il campione di tessuto fino al fondo della capsula con l'ausilio di un bastone di legno appuntito e posizionarlo in forno a 60 ° c per 2-3 giorni.
Nota: Fare attenzione a non premere il tessuto troppo duro, invece lasciarlo sdraiarsi liberamente in modo che uno strato sottile del mezzo di incorporamento è presente tra il tessuto e la superficie della capsula. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
10. taglio della faccia del blocco
Nota: Le dimensioni ridotte e la forma appropriata della faccia del blocco sono prerequisiti per un sezionamento soddisfacente. Pertanto, la rifilatura del blocco del campione è una necessità.
- Usare una lama affilata a tagliente singolo. Pulire con acetone immediatamente prima dell'uso.
- Montare il blocco capsula in un supporto per blocchi e posizionare il supporto del blocco sullo stage di uno stereomicroscopio.
Nota: La procedura di taglio deve essere effettuata sotto binocolo del microscopio e illuminazione obliqua. - Rimuovere il foglio di Aclar dalla punta della capsula utilizzando una lama di rasoio. Il foglio di Aclar appare come uno strato lucido sotto la luce dell'ambito di dissezione.
- Tenere la lama di rasoio con un angolo di 45 gradi e fare tagli verso il basso quattro lati del blocco capsula.
Nota: Un migliore controllo del taglio si ottiene se la lama è tenuta con entrambe le mani. - Fare tagli corti in modo che il blocco assume la forma di una piramide corta con angoli di parete di circa 45 °.
Nota: La faccia del provino è supportata molto meglio se i lati che conducono ad esso sono mantenuti corti. Se la punta del blocco è troppo sottile e lunga, vibrerà durante il sezionamento sottile. Idealmente, l'area di interesse deve essere centrata nella faccia del blocco. - Tagliare la punta della capsula per scartare il tessuto superfluo e preservare solo l'area di interesse.
Nota: Nessuna parte della sezione deve essere priva di tessuto, poiché le variazioni nella densità della faccia del blocco sono una delle principali cause di difficoltà nel sezionamento. Idealmente, l'area superficiale della faccia della capsula non deve essere superiore a 1 mm2. - Tagliare la faccia della capsula a forma di trapezoidale triangolo scaleno. Poiché in un trapezoide triangolo scaleno nessun lato è uguale, questa forma è meglio orientare l'area di interesse rispetto al resto del provino.
Nota: Durante il sezionamento, la faccia a forma trapezoidale è supportata molto meglio di quella di qualsiasi altra forma.
11. sezionamento del microtomo
Nota: La maggior parte dei campioni biologici sono troppo spesse nel loro stato naturale per essere penetrati da un fascio di elettroni. Pertanto, il materiale deve essere tagliato in sezioni sottili che possono essere penetrati dal fascio di elettroni.
- Tagliare le sezioni sottili (colore di interferenza argento, 600-900 Å) su un ultramicrotoma su piani paralleli alla superficie.
- Posizionare le sezioni sulle griglie. Il laboratorio di questo autore utilizza griglie in rame di 3,05 mm di diametro esterno.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
12. post-colorazione con Uranyl acetato
- Preparare 2% UA in acqua distillata. Collocare un pallone di vetro volumetrico da 200 mL contenente 100 mL di acqua distillata su una piastra di agitazione. Aggiungere 2 g di UA al pallone. Avvolgere in foglio di alluminio (UA precipitati quando esposto alla luce) e mescolare continuamente.
Nota: Per i dettagli della preparazione UA, vedere la sezione 6 di questo protocollo. - Posizionare diverse gocce individuali del 2% UA su un foglio pulito di cera dentale in una capsula di Petri.
- Far galleggiare la griglia con il provino (lato sezione verso il basso) su una goccia di UA per 25 min.
Nota: Float ogni griglia su una goccia separata di UA. - Tenere la griglia al suo bordo con pinze e risciacquare due volte sotto un getto delicato di acqua distillata bollita a temperatura ambiente da una bottiglia di lavaggio in plastica.
Nota: Non lasciare asciugare la griglia prima della colorazione con il piombo.
13. post-colorazione con piombo
- Preparare una camera priva di CO2(Co2 nell'aria è la fonte primaria di precipitazioni di piombo). Collocare un pezzo di carta filtrante imbevuto di 1 N NaOH in una capsula di Petri. Posizionare un piccolo foglio di cera dentale pulita sulla parte superiore della carta filtrante e posizionare diversi pellet NaOH su un lato del piatto. Coprite il piatto.
Nota: Preparare questa configurazione prima che le griglie siano macchiate di UA, in modo che l'atmosfera nella camera sia priva di CO2 e pronta per la colorazione del piombo dal momento che la colorazione UA è completa. - Fai il 4% di NaOH. Aggiungere 0,2 g di NaOH a 5 mL di acqua distillata.
- Preparate la soluzione di triplo piombo di Sato. Per preparare 10 mL, aggiungere 0,1 g di nitrato di piombo, 0,1 g di citrato di piombo, 0,1 g di acetato di piombo e 0,2 g di citrato di sodio in una bottiglia di vetro. Aggiungere 8,2 mL di acqua distillata e agitare vigorosamente per 5 minuti Sonicare per 30 s, quindi aggiungere 1,8 mL di NaOH appena fatto al 4%.
- Posizionare diverse gocce di piombo di Sato sulla cera nella capsula di Petri.
- Posizionare la griglia macchiata con UA (sezione laterale verso il basso) sulla goccia di piombo.
Nota: Ogni griglia dovrebbe essere galleggiata su una goccia separata di piombo. Ogni goccia dovrebbe essere abbastanza piccola da permettere alla griglia di galleggiare sulla sommità della cupola della goccia invece di scivolare verso il basso sui lati. - Coprire il piatto e lasciare macchia per 5 min.
- Tenere la griglia al suo bordo con pinze e lavare accuratamente sotto un getto delicato di acqua distillata bollita a temperatura ambiente da una bottiglia di plastica di lavaggio.
- Asciugare la griglia sulla carta filtrante e conservare la griglia.
Nota: Accertarsi che la sezione non venga a contatto diretto con la carta filtrante.
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Representative Results
Sono stati stabiliti criteri generali che sono per lo più accettati come indicativi di una conservazione soddisfacente o difettosa del campione per TEM. Questi criteri sono esemplificati in quattro micrografi elettronici selezionati (due esempi di preparazione ottimale, due esempi di preparazione difettosa) che sono stati ottenuti trattando il tessuto cerebrale del ratto giovane seguendo i metodi descritti in questo protocollo.
In generale, un Micrografo elettronico di buona qualità appare come un'immagine grigiastra ordinata, distinta e complessiva. In un esemplare preparato in modo soddisfacente, gli spazi tra le membrane devono essere riempiti con materiale granulare e non devono essere vuoti. Analogamente, non si devono trovare spazi vuoti nella sostanza del suolo citoplasmatico o all'interno di organelli (confrontare la Figura 1a e la Figura 2a con la Figura 3 e la Figura 4). Tuttavia, è importante notare che il sistema nervoso centrale di animali molto giovani Mostra un certo grado di allargamento degli spazi extracellulari rispetto al cervello adulto, con connessioni più allentate tra le cellule e un bianco generale, meno aspetto denso di elettroni. Le membrane devono essere continue, senza distorsioni o rotture (Figura 1a e Figura 2a). Lo stroma dei mitocondri dovrebbe apparire uniforme e denso, senza spazi vuoti. Cristae deve essere intatto e non gonfio, e la membrana doppia esterna mitocondriale deve essere ininterrotta (confrontare la Figura 1a con la Figura 3). Per facilitare l'analisi morfolometrica dell'organizzazione delle vescicole pre-sinaptiche, le membrane pre-e post-sinaptiche devono essere intatte e sostanzialmente parallele tra loro (vedere Figura 1). Le vescicole sinaptiche devono essere tracciabili e vincolate da una singola membrana continua (vedere Figura 2).
È importante sottolineare che, anche quando si seguono le migliori pratiche, il trattamento del campione con fissativi, macchie e resine introduce artefatti. Poiché gli artefatti non possono essere eliminati, è fondamentale capire quale processo li origina, in modo che l'aspetto del provino possa essere interpretato rispetto al trattamento che ha subito12. Un esempio di un artefatto, tra diversi che possono essere generati durante la preparazione del campione per TEM, è una figura di mielina, un'inclusione lamellare membranosa che assomiglia a guaine di mielina. Sebbene le figure di mielina possano essere osservate in condizioni patologiche12, più spesso derivano dall'estrazione dei lipidi della membrana durante la fissazione con aldeidi (vedere Figura 4).
Figura 1: Micrografo elettronico rappresentativo della conservazione soddisfacente della struttura cellulare (esempio 1). (A) le membrane cellulari neuronali sono stratificate e senza interruzioni. Il citoplasma è finemente granulare e senza spazi vuoti. I mitocondri non sono né gonfi né ridotti. La loro doppia membrana esterna è conservata e le creste interne sono intatte. B) dettaglio del pannello A, esemplificando un metodo per misurare la distanza delle vescicole sinaptiche dalla membrana pre-sinaptica. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 2: Micrografo elettronico rappresentativo della conservazione soddisfacente della struttura cellulare (esempio 2). (A) le vescicole sinaptiche sono distinte e rivestite da una singola membrana ininterrotta. Per consentire l'analisi morfolometrica della distribuzione delle vescicole sinaptiche, le membrane pre-sinaptiche e post-sinaptiche devono essere parallele e la loro continuità mantenuta. B) dettaglio del pannello A, esemplificando il conteggio delle vescicole sinaptiche all'interno del terminale pre-sinaptico. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 3: Micrografo elettronico rappresentativo della conservazione difettosa della struttura tissutale (esempio 1). Si noti la distorsione e la rottura delle membrane cellulari neuronali e la presenza di spazi extracellulari marcatamente ingranditi (contrassegnati con *). I mitocondri appaiono disteso e hanno una creste gonfia (segnato con la freccia). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
Figura 4: Micrografo elettronico rappresentativo della conservazione difettosa della struttura tissutale (esempio 2). Si noti la presenza di grandi spazi vuoti bianchi all'interno del citoplasma (contrassegnati con ǂ), al posto della sostanza citoplasmatica finemente granulare. Gli spazi extracellulari appaiono ingranditi. Il whorl membranoso (figura di mielina), probabilmente risultante dalla mobilitazione dei lipidi durante la fissazione con glutaraldeide, è contrassegnato con l'acronimo MF. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.
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Discussion
La manipolazione delle sezioni tissutali durante la preparazione del campione per TEM richiede un notevole grado di finezza, concentrazione e pazienza. Quando si utilizza una micropipetta per aggiungere e rimuovere soluzioni, i campioni possono essere aspirati nella punta della pipetta dalla tensione superficiale, pertanto è necessario prestare molta attenzione per evitare danni ai tessuti da parte della pipetta. Inoltre, alcuni passaggi della sequenza di disidratazione possono essere rapidi come 1 min, quindi l'operatore deve lavorare rapidamente per garantire che la successiva fase di disidratazione venga avviata in tempo e che il provino non asciughi o Ruchi. Una procedura che richiede particolare attenzione è post-fissazione con osmio. Le sezioni diventano rigide dopo il trattamento con osmio e possono essere facilmente danneggiate. Prima di aggiungere l'osmio, è imperativo che le sezioni siano appiattite nella parte inferiore del flaconcino, altrimenti qualsiasi piega si tradurrà in frattura tissutale. La manipolazione del tessuto osmicato è particolarmente impegnativa quando si trasferiscono sezioni su pellicole Aclar per l'incorporamento piatto. È necessario prestare particolare attenzione quando si solleva il campione dal fondo del flaconcino per evitare la frammentazione e quando si spingono le bolle d'aria fuori dal sandwich del film. Mentre è importante spingere fuori qualsiasi aria intrappolata, in quanto rende difficile la visualizzazione del provino e indebolisce la stabilità dei legami di resina, la pressione diretta su tessuto osmicato può facilmente infliggere danni. Un altro passo che necessita di cure extra è la preparazione della miscela di resina per l'infiltrazione del campione e l'incorporamento. EPON, la resina incorporante più diffusa, può essere indurita con l'aggiunta di un indurente e di un acceleratore. È imperativo utilizzare la quantità esatta di catalizzatore e acceleratore per ottenere un blocco indurito con le caratteristiche desiderate. Sono stati descritti metodi sia gravimetrici che volumetrici per la misurazione di resine viscosi. Anche se i metodi gravimetrici sono stati tradizionalmente considerati più precisi12, il laboratorio di questo autore ha avuto un buon successo con le modalità volumetriche (ad esempio, aggiungendo il volume di ogni ingrediente della miscela di resina in modo incrementale per mezzo di una siringa a sonda gastrica) . Dopo che i componenti della resina sono stati accuratamente misurati, devono essere miscelati molto accuratamente per realizzare un'impregnazione uniforme, poiché possiedono diverse viscosità e tassi di polimerizzazione. Il mancato raggiungimento della miscelazione completa comporterà un blocco di durezza irregolare che non è adatto per il sezionamento sottile.
Cambiamenti marcati nella tonicità delle soluzioni utilizzate per elaborare sezioni di cervello giovane ratto possono causare restringimento e/o gonfiore dello spazio extracellulare e componenti cellulari12,35,36,37 . Durante la fissazione, i migliori risultati si ottengono quando la pressione osmotica del perfusato è mantenuta il più simile possibile a quella del tessuto in studio. L'osmolarità cerebrale del ratto è di circa 330 mOsm. Un 2% di glutaraldeide in 0,1 M di soluzione di PB è solo leggermente ipertonico (400-450 mOsm) e minimizza l'espansione dello spazio extravascolare12. In particolare, le membrane restano sensibili ai cambiamenti nella pressione osmotica delle soluzioni di risciacquo e disidratazione dopo la fissazione con aldeidi. Pertanto, è anche importante minimizzare le differenze tra l'osmolarità del fissativo e le soluzioni utilizzate successivamente12,35,36,37. Per questo motivo, lo stesso veicolo (0,1 M PB, osmolarità approssimativa 440 mOsM) viene utilizzato come solvente per tutte le soluzioni in questo protocollo. Tuttavia, va notato che diversi buffer diversi sono stati utilizzati con successo durante la preparazione del campione per TEM e nessun singolo buffer può rivendicare la superiorità universale sugli altri. Quando sono preferiti i tamponi di tonicità inferiore, altri laboratori hanno scelto di aumentare l'osmolarità con elettroliti o non elettroliti12.
Diversi passaggi in questo protocollo richiedono l'uso di sostanze chimiche che possono essere tossiche quando non manipolate correttamente. L'importanza di lavorare sotto una cappa aspirante e di indossare dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione di aldeidi, osmio, uranio e composti di piombo non può essere sopravvalutato. Mentre i sistemi automatizzati a contrasto possono aiutare ad attenuare alcuni dei rischi e sono disponibili in commercio, possono essere piuttosto costosi e potrebbero non essere accessibili da laboratori che non fanno uso sistematico di TEM. Anche se il laboratorio del microscopio elettronico può potenzialmente essere un luogo pericoloso, il trattamento dei campioni per TEM è complessivamente sicuro quando viene eseguito rigorosamente.
Recentemente, l'introduzione della microscopia luminosa a Super risoluzione ha aumentato la potenza di risoluzione dell'imaging ottico a circa 15 Nm34. Tuttavia, quando l'obiettivo è quello di eseguire l'analisi morfologica dell'organizzazione spaziale delle vescicole sinaptiche a terminali pre-sinaptici, nessuna tecnica fornisce lo stesso grado di dettaglio morfologico. È importante sottolineare che TEM è limitato dalla necessità che il campione sia morto prima che possa essere elaborato e visualizzato. Pertanto, quando l'obiettivo dello studio è quello di indagare gli aspetti dinamici o funzionali del traffico di vescicole sinaptiche ed esocitosi, devono essere presi in considerazione strumenti diversi da TEM.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo manoscritto è stato supportato da NIH/NIGMS K08 123321 (a N.L.) e dai fondi del dipartimento di anestesiologia presso l'Università della Virginia. Gli autori desiderano ringraziare Alev Erisir (dipartimento di biologia, Università della Virginia, Charlottesville, VA) per un'eccellente formazione e assistenza tecnica con TEM, e per la sua preziosa critica manoscritta. Gli autori ringraziano inoltre la struttura avanzata di microscopia elettronica presso l'Università della Virginia per l'assistenza tecnica con sezionamento e post-colorazione dei campioni.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
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