Мы описываем процедуры обработки ткани мозга новорожденных крыс для получения электронов высокого разрешения для морфометрического анализа синаптической везиклраспределения распределения на нервных терминалах. Микрографы, полученные с помощью этих методов, также могут быть использованы для изучения морфологии ряда других клеточных компонентов и их размерных структурных связей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка ткани мозга новорожденных крыс для ультраструктурного морфометрического анализа синаптической везикл распределения в нервных терминалах
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Наша лаборатория и многие другие использовали высокую разрешающую силу электронной микроскопии передачи для изучения морфологии и пространственной организации синапических пузырьков. Для получения высококачественных электронных микрографов, которые могут дать степень морфологических деталей, необходимых для количественного анализа досинаптической везикуловой дистрибутива, оптимальная подготовка образца имеет решающее значение. Химическая фиксация является первым шагом в процессе подготовки образца, и имеет первостепенное значение для сохранения тонкой ультраструктуры. Сосудистая фиксация раствором глутаральдегида-формальдегида, за которым следует обработка вибратообразных образцов с тетрокидом осмия, стабилизирует максимальное количество молекул, особенно белков и липидов, и приводит к превосходному сохранению ультраструктуры. Ткань затем обрабатывается с контрпятном, последовательным обезвоживанием и встраиванием мелины. En блок окрашивания с уранилом ацетата (т.е. окрашивание вибратообразной ткани до встраивания мелины) усиливает эндогенный контраст и стабилизирует компоненты клеток против добычи во время обработки образцов. Контраст может быть дополнительно увеличен путем применения уранила ацетата в качестве пост-пятна на ультратонких секциях. Двойное окрашивание ультратонких секций свинцом цитрата после лечения унанила ацетата также улучшает разрешение изображения, усиливая электронную непрозрачность нуклеиновой кислотно-содержащей структуры путем селективного связывания свинца с ацетатом уранил. Трансмиссия электронной микроскопии является мощным инструментом для характеристики морфологических деталей синаптической пузырьков и количественной оценки их размера и пространственной организации в терминале бутона. Однако, поскольку он использует фиксированную ткань, передача электронной микроскопии может предоставить только непрямую информацию о живых или эволюционных процессов. Поэтому следует учитывать другие методы, когда основной целью является изучение динамических или функциональных аспектов синаптической везикловой торговли и экзоцитоза.
Введение
Описываем методы подготовки ткани мозга новорожденных крыс для получения высококачественных электронных микрографов для углубленного морфометрического анализа синаптической везикулной пространственного распределения на нервных терминалах1,2. Высококонтрастные микрографы, которые могут быть получены путем обработки образцов после этих методов, также могут быть использованы для изучения детальной морфологии ряда клеточных компонентов и их мерных структурных связей3,4.
Электронный микроскоп передачи (TEM) является мощным инстру....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все исследования были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Университете Вирджинии (Шарлоттсвилл, Вирджиния) и проведены в соответствии с руководящими принципами Национальных институтов здравоохранения.
1. Фиксация сосудистой перфузией
ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Общее описание метода перфузии сосудов крысиного мозга уже подробно описано в этом журнале13 и выходит за рамки этого протокола. Тем не менее, следующие шаги специфичны для подготовки ткани мозга новорожденных крыс для получения высококачественных электронных микрографов для ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Установлены общие критерии, которые в основном признаются как показательудовлетворительного или дефектного сохранения образца для ТЭМ. Эти критерии иллюстрируются в четырех выбранных электронных микрографах (два примера оптимальной подготовки, два примера дефектной подготовки), которые были получены путем лечения тканей мозга молодых крыс в соответствии с методами, описанными в этом протоколе.
В общем, качественный электронный микрограф выглядит как упорядоченное, отчетливое и общее сероватое .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Обработка секций тканей во время подготовки образца к TEM требует значительной степени утонченности, концентрации и терпения. При использовании микропипетта для добавления и удаления растворов образцы могут быть всасывается в кончик пипетки поверхностным натяжением, поэтому следует провести большую осторожность, чтобы избежать повреждения тканей пипеткой. Кроме того, некоторые шаги последовательности обезвоживания может быть так быстро, как 1 мин, следовательно, оператор должен работать быстро, чтобы гарантировать, что с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Данная рукопись была поддержана NIH/NIGMS K08 123321 (в N.L.) и за счет средств кафедры анестезиологии Университета Вирджинии. Авторы хотели бы поблагодарить Алев Эрисир (департамент биологии, Университет Вирджинии, Шарлоттсвилл, Штат Вирджиния) за отличную подготовку и техническую помощь с TEM, и за ее бесценную критику рукописи. Авторы также благодарят Расширенный электрон микроскопии объекта в Университете Вирджинии за техническую помощь с образцом секции и после окрашивания.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 4% Тетраоксид осмия | Электронная микроскопия Sciences | 19170 | аковый |
| 50% глутаральдегид | Электронная микроскопия Sciences | 16310 | класс EM, акваторный |
| Aclar 33 C встраиваемая пленка | Электронная микроскопия Sciences | 50425-25 | толщина 7,8 мил, размер 8"x10" |
| держатель капсулы BEEM | Электронная микроскопия | Sciences 69916 | удерживает размер "00" капсулы |
| BEEM встраивание капсул | Электронная микроскопия Sciences | 70021 | "размер 00, плоский (срезанное дно)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Верблюжья шерсть кисть для рисования | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Дисковый дырокол | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 Набор | Электронная микроскопия Науки | 14120 | |
| Ацетат свинца | Электронная микроскопия Науки | 17600 | |
| Цитрат свинца | Электронная микроскопия Науки | 17800 | |
| Нитрат свинца | Электронная микроскопия | Науки 17900 | |
| Leica UC7 ультра микротом | Leica | ||
| Microscale | Электронная микроскопия | Науки 62091-23 | |
| Параформальдегид | Электронная микроскопия Науки | 19208 | Класс ЭМ, гранулированный |
| Прецизионный Лабораторная печь | Thelco | 51221159 | |
| Азид натрия | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark ручка | Электронная микроскопия Науки | 72109-01 | |
| Раствор Тайрода | Электронная микроскопия Науки | 11760-05 | |
| Уранилацетат | Электронная микроскопия Науки | 22400 | порошок |
Ссылки
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
