Summary
Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül dağılımı morfometrik analizi için yüksek çözünürlüklü elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu işleme prosedürleri açıklanmaktadır. Bu yöntemlerle elde edilen mikrografikler, diğer hücresel bileşenlerin bir dizi morfolojisi ve boyutsal yapısal ilişkilerini incelemek için de kullanılabilir.
Abstract
Laboratuvarımız ve diğerleri sinaptik veziküller Morfoloji ve mekansal organizasyonu incelemek için iletim elektron mikroskobu yüksek çözme gücü sömürüyor. Ön sinaptik vezikül dağılımının nicel analizi için gerekli olan morfolojik ayrıntı derecesini verebileceğiniz yüksek kaliteli elektron mikrografileri elde etmek için optimum numune hazırlama önemlidir. Kimyasal sabitleme, numune hazırlama sürecinde ilk adımdır ve ince ultrastrasyon korumak için son derece önemlidir. Bir glutaraldehit-formaldehit çözeltisi ile vasküler fiktasyon, ardından osmiyum tetrokid ile vibratome-kesitli numunelerin tedavisinde, moleküllerin maksimum sayısını stabilize, özellikle protein ve lipidler, ve üstün koruma sonuçları . Doku daha sonra counterstaining, sıralı dehidrasyon ve reçine katıştırma ile işlenir. Uranyl asetat ile en blok boyama (yani, reçine gömme önce vibratome-kesitli doku boyama) endojen kontrast geliştirir ve numune işleme sırasında ekstraksiyon karşı hücre bileşenlerini stabilize. Ultra ince bölümlerinde bir post-leke olarak uranyl asetat uygulayarak kontrast daha da artırılabilir. Uranyl asetat tedavisi sonrasında kurşun sitrat ile ultra ince bölümlerin çift boyama da görüntü çözünürlüğü geliştirir, nüklik asit içeren yapıların elektron-opaklık yoğunlaştırarak uranyl asetat yol seçici bağlama yoluyla. İletim Elektron Mikroskopisi sinaptik veziküller morfolojik detayları ve Terminal Bouton kendi boyutu ve mekansal organizasyon Ölçüleme için güçlü bir araçtır. Ancak, sabit doku kullandığından, iletim elektron mikroskobu sadece yaşam veya gelişen süreçler ile ilgili dolaylı bilgiler sağlayabilir. Bu nedenle, ana amaç sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamik veya işlevsel yönlerini incelemek için olduğunda diğer teknikler dikkate alınmalıdır.
Introduction
Biz sinir terminallerinde sinaptik vezikül uzamsal dağılımı derinlemesine morfometrik analizi için yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu hazırlanması için yöntemleri tarif1,2. Bu yöntemlerden sonra numuneler işlenerek elde edilebilir yüksek karşıtlık MİKROGRAFİ Ayrıca hücresel bileşenlerin bir dizi ayrıntılı Morfoloji ve boyutsal yapısal ilişkileri incelemek için kullanılabilir3,4.
İletim elektron mikroskobu (TEM) kantitatif organelleri ve diğer hücresel yapıların morfolojisi incelemek için güçlü bir araçtır. Bu on yıl itibariyle, yüksek basınçlı donma ile cryofixation hariç, immüno-etiketleme olmadan lipid membranlarının ve organelleri aynı ölçüde çözünürlük sağlayabilir başka soruşturma yöntemleri vardır. Ancak, dondurma ikame teknikleri yaygın olarak kullanılmaz ve normalde pahalı ekipman ve uzun hazırlık süreleri gerektirir.
TEM 'in yüksek çözme gücünün avantajlarından yararlanmak için en uygun numune hazırlama işlemleri çok önemlidir. Numune preparatın ana hedefleri, yaşam durumundan minimum değişiklik ile doku yapısını korumak, numune kontrastı geliştirmek ve elektron işleme ve maruz kalma sırasında hücresel bileşenlerin çıkarılması karşı doku stabilize etmektir ışın. TEM doku hazırlığı için çok sayıda protokol, yıllarca çeşitli laboratuvarlar tarafından tanıtıldı ve mükemmelleştirilmiştir. Çoğu sinaptik veziküller5,6,7,8,9,10,11optimum görselleştirme için yöntemler üzerinde duruldu. Şu anda kullanılmakta olan bir dizi köklü, altın standart yöntem arasında, en iyi doku yapısını korumaya yönelik kimyasal fikmerasyon, sonrası fikmerasyon, özel blok boyama, sıralı dehidrasyon, reçine gömme ve sonrası boyama prosedürleri seçtik. mükemmel görüntü kontrastı elde edin. Dikkat, ince ultrastranın korunması özellikle yenidoğan sıçan beyin dokusu ile çalışırken zor olabilir. Aslında, çok genç hayvanların merkezi sinir sistemi yetişkin beyin daha yüksek bir su içeriği ile karakterize edilir, hücre dışı alanların daha belirgin genişlemesi, ve hücreler arasında daha gevşek bağlantılar12. Bu, yenidoğan sıçan beyin dokusunu Osmolarite değişikliklerine derinden hassas hale getirir ve farklı tonallık12' nin sıralı çözeltileri ile işlenen artifaktüel daralma ve/veya şişlik için zarif bir şekilde eğilimli olur. Bu nedenle, yöntemlerimiz, sıçan yenidoğan beynin mümkün olduğunca yakın Osmolarite olan numune işleme için çözümler istihdam. Amacımız, sinir terminallerinde sinaptik vezikül mekansal dağılımının nicel değerlendirilmesi için yüksek kalitede, yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu görüntüleri elde etmektir. Özellikle, biz sinir terminali içinde veziküllerin sayısını ölçmek için, ön sinaptik plazma membrandan sinaptik veziküllerin uzaklığı, ön sinaptik membranda yerleştirilmiş veziküllerin sayısı, sinaptik veziküller büyüklüğü ve inter-vezikül mesafeler1.
Tatmin edici kimyasal fiktasyon sinaptik vezikül Morfoloji ve mekansal organizasyon incelemek için gerekli morfolojik ayrıntı sağlayabilir yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için bir ön koşuldur. Çeşitli fikrasyon modları olmasına rağmen, vasküler perfüzyon ile beyin dokusunun fikreme yöntemi diğer yöntemlere göre çok daha üstün. Vasküler perfüzyon yoluyla fiksasyon, sistemik dolaşımın tutuklandıktan hemen sonra başladığı için, beyin dokusunun deoxygenasyonu ile proteinleri fiksasyonlarla çapraz bağlama arasındaki aralığı kısaltır ve hücrelimde asgari değişiklikler sonuçlanır Yapısı. Ayrıca, vasküler yataktan ekstraküler ve hücresel bölmeler12,13,14' e kadar olan fiktatif akışından dolayı hızlı ve Tekdüzen penetrasyon gerçekleştirir. , Osmiyum tetroksit ile ikincil fiktasyon (sonrası fikterasyon) ve ardından glutaraldehit ile primer fikfasyon, ince yapının mükemmel korunması sağlar15,16,17. Glutaraldehit ve paraformaldehit karışımı, dokuya daha hızlı nüfuz etmek için ek bir avantaj sunuyor12.
Biyolojik dokularda bir reçine matrisinin desteği olmadan ince bölümlere kesilecek kadar sert olmadığından, ince kesmeden önce bir ortama gömülmelidir. Su-immiscible Epoksi Reçineler genellikle TEM 'de gömme orta olarak kullanılır. Bu tür matris kullanıldığında, tüm numunenin serbest su reçine infiltrasyon önce organik bir çözücü ile değiştirilmesi gerekir. Su, numuneyi artan etanol ve/veya aseton12konsantrasyonlarının bir dizi çözeltisiyle geçirerek kaldırılır. Bu protokolde, numuneler ilk olarak esnek aclar çarşafları arasında gömülür ve sonra bir kapsülde gömülmüştür. Nihai sonuç, Mikrotom bölümleme sırasında kaynaklanan titreşimlerden en az etkilenecek ideal geometriye sahip silindirik reçine bloğunun ucunda yer alan dokudur.
Endojen doku kontrastı geliştirmek için ağır metaller ile boyama numune hazırlama başka önemli bir yönüdür. TEM 'de görüntü kontrastı, dokuda atomlar tarafından elektron saçılmadan kaynaklanmaktadır. Ancak, biyolojik malzemeler büyük ölçüde düşük Atomik ağırlık molekülleri (yani, karbon, hidrojen, oksijen ve azot) oluşur. Bu nedenle, yeterli saçılma kontrast nesil doku hücresel bileşenlerine yüksek Atomik ağırlık atomların eklenmesi gerektirir. Bu, ağır metaller12,18,19ile numunenin boyama yoluyla elde edilir. Lipid için güçlü bir bağ olan Osmium tetroksit, uranyum ve kurşun, elektron lekeleri olarak kullanılan en yaygın ağır metaller.
Osmium (Atom numarası 76) varoluşun en yoğun metallerden biridir. TEM 'deki birincil rolü güvenilir bir fikreatif12olmakla birlikte, hem bir fikilatif hem de bir lekedir. Kullanımda olan çeşitli fiktasyon protokolleri arasında, numunenin hazırlanması sırasında hücre bileşenlerinin ekstraksiyonu azaltmada en etkili olan glutaraldehit ile çift fikreme yöntemi. Bu iki fiksatifler moleküllerin, özellikle protein ve lipidler farklı türde maksimum sayısını stabilize etmek için kullanılır, ve doku ultrastrture üstün korunması sonucu12,14,15, 16 , 17 yaşında.
Uranyl asetat şeklinde en yaygın elektron lekesi olarak kullanılan büyük metal (Atom numarası 92). Benzer şekilde Osmium 'a göre, bir leke ve fikilatif olarak davranır, ancak Tem 'deki birincil rolü bir leke olarak20,21. Nüklenli asit içeren ve membranöz yapılar aldehit-sabit dokularda uranyl tuzları ile şiddetle ve tercihen lekelenmiştir22,23. Osmikasyon sonrası uranyl asetat ile dokuların tedavisi ve dehidratasyon önce membranöz ve nüklik asit içeren yapıların stabilizasyonu, yanı sıra gelişmiş kontrast, ve izin vermez bazı yapısal detaylar tanımlaması tek başına osmiyum ile lekelenmiş numunelerde kolayca tespit edilebilir12,24,25. Uranyl asetat, osmikasyon sırasında lipid membranlarına yatırılmış olan azaltılmış osmiyum ile birleştirerek ince yapıyı stabilize edebilir düşünülmüştür24. En yüksek kontrast, uranyl asetat yerleştirilmeden önce ve ince bölümlerde12' de bir sonrası leke olarak uygulandığında elde edilir.
Lead (Atom numarası 82), TEM için kullanılan en sık görülen lekedir ve özellikle ince bölümlerin sonrası boyama için kullanılmaktadır. Kurşun tuzları yüksek elektron opaklığı ve membranlar, nükleer ve sitoplazmik proteinler, nükleik asitler ve glikojen dahil olmak üzere geniş bir hücre yapıları yelpazesi için benzeşimi göstermek26,27. Çift boyama yöntemi kullanıldığında (yani, uranyl asetat ile boyama kurşun ile tedavi takip edilir), ikinci bir uranyl asetat boyama geliştiricisi olarak davranır. Örneğin, glutaraldehit ile sabit kromatin kurşun sonrası boya üç28,29,30,31,32bir faktör tarafından uranyl asetat alımı artar. Lead de Osmium gibi diğer metaller tarafından öğretilir boyama geliştirir. Bu kurşun tuzları azalmış osmiyum33varlığında fosfatidler kutup grubuna iliştirerek osmiyum-sabit dokuların membranlarının leke düşünülmektedir. Hem uranyl asetat ve kurşun ile boyama potansiyel bir dezavantajı, özellikle uzun süreli süreleri için, birçok farklı yapısal elemanlar eşit ve non-özellikle lekelenmiş olduğunu ve böylece kolayca diğerine ayırt edilmeyebilir12 .
Optik süper çözünürlüklü fotoğraf aktive yerelleştirme mikroskobu gibi alternatif ışık kaynaklarının son giriş, önemli ölçüde ışık mikroskobu çözünürlüğü34geliştirdi. Ancak, ışık mikroskopisi tek etiketli proteinlerin veya enzimlerin görselleştirilmesi için histokimyasal ve bağışıklık-sitokimyasal yöntemlerle bağlı olduğundan, TEM 'in tüm yapısal elemanları bir kerede görüntülemeleri, derinlemesine çalışma için benzersiz kalır doku yapılarının Morfoloji ve boyutsal ilişkileri. Özellikle, başka hiçbir tekniği önceden sinaptik sinir Boutons sinaptik vezikül dağılımı morfometrik analizi gerçekleştirmek için gerekli morfolojik ayrıntı sağlayabilir. Yine de, elektronik mikrografinin organizma öldükten sonra dokusunun yapısını yakalamasını ve bu nedenle ön sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamiklerine ilişkin bilgi veremiyor olması önemlidir. Bu nedenle, FM boya-canlı görüntüleme ve yama-kelepçe elektrofizyolojisi gibi diğer araçlar, ana amaç sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamik ve/veya işlevsel yönlerini incelemek için olduğunda dikkate alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm çalışmalar, Virginia Üniversitesi 'nde (Charlottesville, VA) Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun olarak yürütülmüştür.
1. vasküler perfüzyon ile fikrasyon
Not: Sıçan beyin vasküler perfüzyon yönteminin genel bir açıklaması bu Journal13 ' te zaten ayrıntılı olarak saptandı ve bu protokol kapsamı dışındadır. Ancak, aşağıdaki adımlar ön sinaptik terminallerde sinaptik veziküller dağılımının nicel analizi için yüksek kaliteli elektron MİKROGRAFİ elde etmek için yenidoğan sıçan beyin dokusu hazırlanması için özeldir.
-
Hazırlamak 4% civarında formaldehite
- Yer 800 ml 0,1 M fosfat tampon (Pb) bir duman-kaput altında bir karıştırma plaka üzerinde 2 L cam kabı. Tampon kaynatmadan yaklaşık 60 °C ' ye kadar ısı.
- Civarında formaldehite tozu 40 g ekleyin. Sürekli karıştırın
- PH ölçümü sırasında, çözüm temizleninceye kadar küçük damla 10 N NaOH ekleyin. Son pH 7.2-7.4 olmalıdır.
- 1 L son hacmine M PB kalan 0,1 ekleyin. Serin, 0,45 μm membran ile filtre ve gece 4 °C ' de saklayın.
Not: Perfüzyon önceki gün taze civarında formaldehite hazırlayın.
Dikkat: Aldehit buharlarının solunması burun semptomlarına ve hava yolu tahrişine neden olabilir. Cilt ile temas dermatit nedenleri. Aldehydes eldiven, koruyucu elbise ve güvenlik gözlükleri takarken bir duman kaputu içinde ele alınması gerekir
-
Tyrode çözümünü hazırlayın
- 1 L damıtılmış su bir karıştırma plaka üzerinde bir cam kabı yerleştirin. NaCl ekleyin (8 g), KCl (0,15 g), CaCl2 (0,1 g), MgCl2 (0,006 g), nah2Po4 (0,055 g), NaHCO3 (1 g) ve Dekstroz (1 g) Beaker.
- Sürekli karıştırın ve pH ölçmek. 7,2 ve 7,4 arasında pH tutun.
Not: Tyrode çözümü de ticari olarak mevcuttur.
- % 2 son konsantrasyonda glutaraldehit ile% 4 civarında formaldehite karıştırın. 40 mL elektron mikroskobu-sınıf 50% glutaraldehit 1 L% 4 paraformaldehyde ekleyin. Mix iyi bir karıştırma plaka içinde
Not: Yaklaşık 100 mL paraformaldehyde-glutaraldehit fiktatif çözelti yeni doğmuş bir sıçan vücudu perfkullanmak için gereklidir. Bu nedenle, en az 10 yenidoğan fareler perfatif 1 L ile Mükemmelleştirici olabilir. Kullanmadan hemen önce civarında formaldehite ve glutaraldehit karıştırmayın. Perfüzyon öncesinde tüm çözümleri oda sıcaklığına getirin. - Bir kez sol ventrikül erişim elde edilmiştir (tüm hayvan perfüzyon Protokolü13bakın), bir perfüzyon basıncında 30 s Için tyrode çözeltisi ile damar sistemi Flush 120 mmHg.
Not: Perfüzyon başarısı vasküler yataktaki kanın tam dışlanmasına bağlıdır. - 10 dakika aynı basınçta paraformaldehyde-glutaraldehit çözeltisi ile Flush.
Not: Sürekli perfüzyon basıncı Bakımı eserler giriş önlemek için esastır. Buna ek olarak, perfuzatta sıcaklık vazokonstriksiyon önlemek için sıçan vücut sıcaklığının altında olmamalıdır - Sabit beyin kafatasından çıkarın ve taze paraformaldehyde-glutaraldehit fiktatif yer 4 °C gece.
Not: protokol burada duraklatılmış olabilir.
2. beyin Dilimleme
- % 4 agaroz içinde sabit beyin embed ve vibratome aşamasında beyin-agaroz bloğu tutkal
Not: Diğer laboratuvarlar agar desteği olmadan vibratome üzerinde istikrarlı bir blok elde ederek kaliteli bölümler elde ettik - 50 μm kalınlığında kesit dilimleri. Mikrotom düşük frekans ve hız ayarlayın.
Not: Bölümler, birkaç yıl boyunca 4 °C ' de% 0,05 sodyum azid ile 0,1 M PB cinsinden depolanabilir. - Bir petri çanak 0,1 M PB bölümler yerleştirin, bir diseksiyon mikroskop altında bölümlerini incelemek ve katıştırmak için örnekleri seçin
Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir.
3. durulama
Not: Numuneyi aldehylar ile fiksasyon sonrası ve osmiyum ile refikasyon işleminden önce durulamak önemlidir, çünkü kalıntı fiksatifler osmiyum çökeltecisi üretebilir
- Pipet 0,1 M PB, kısa, geniş ağız cam şişe içine kap. Her şişenin başına bir numune yerleştirin. Tamamen kuru değil böylece numune kapağı.
Not: Numuneleri, düz gömme için hazır olana kadar, sabitleme, dehidrasyon ve infiltrasyon tüm çözüm değişikliklerinden Bu adımda aynı şişede tutun. - Numuneyi 3 dk x 2 için 0,1 M PB cinsinden durulayın ve ardından bir mikropipet ile PB 'yi çıkarın.
Not: Yeni doğmuş sıçan beyni Osmolarite değişikliklerine derinden duyarlı olduğundan12,35,36,37, sabitleme karışımı kullanılan aynı araç içinde yıkanmaları yürütmek
4. Osmium ile sonrası fikreme
-
Osmiyum tetroksit hazırlanması (OsO4)
Not: Bu yazarın laboratuarı OsO4 4% cam ampul bir sulu çözelti (5 ml oso4 4% H2O) sağlanan kullanır. Diğer Labs, OsO4 kristalleri başarıyla kullandı. Ancak, bir araç içinde OsO4 kristalleri çözmek için birkaç saat gereklidir.- 5 mL (bir ampul) alın 4% OsO4/H2o, açık ve kahverengi cam şişe içine yerleştirin
Not: OsO4 güçlü bir oksitleyici ajan ve kolayca ışığa maruz kalma azalır. Bir kahverengi cam şişede OsO4 yerleştirerek hazırlama sırasında azaltma önlenebilir - 5 mL 0,2 M PB ekleyin. Bu 10 mL% 2 OsO4/0,1 M PB verecektir.
Not: Yenidoğan sıçan beyin derin Osmolarite değişikliklere duyarlı olduğundan, aldehit fiksatifler ve oso hazırlamak için aynı tampon kullanın4 çözüm12,35,36,37 - Ek 10 mL 0,1 M PB ekleyin. Bu, 0,1 m PB 'de 20 mL% 1 OsO4 ' ün son çözümünü verecektir.
- % 1 OsO4 çizmek için uzun bir iğne ile donatılmış 20 ml şırınga kullanın ve kahverengi bir cam şişe veya alüminyum folyo ile kaplı bir scint şişe yerleştirin.
Dikkat: OsO4 son derece uçucu ve dumanı burun, gözler ve boğaz için toksik. Tüm çalışma eldiven ve koruyucu giysiler kullanarak bir duman-Hood yapılmalıdır, ve hiçbir vücut parçası OsO maruz olmamalıdır4. Taşıma ve atık imha kurumunuzun yönergelerine göre yapılmalıdır. Kullanılmayan oso4 ' ü, cam stoper Teflon liner ile sıkıca dindiğini kahverengi cam şişe içinde saklayın, çift alüminyum folyo ve mağaza bir dessicator içinde şişe sarın. Duman sızıntının varlığında, OsO4 iç yüzeyleri ve buzdolabında içeriğini discolor olabilir. Yukarıda belirtilen depolama koşullarında OsO4 çözeltisi birkaç ay boyunca kararlı. Depolama sırasında çözümler oksitlenmiş olduğunda, onlar, bu durumda onlar bertaraf edilmesi gerekir gri açın.
- 5 mL (bir ampul) alın 4% OsO4/H2o, açık ve kahverengi cam şişe içine yerleştirin
- Ekleme 1% OsO4 ın 0,1 M PB numune şişesine ve otur 1 saat. özü oso4 sonra 1 h bir mikropipet ile.
Not: OsO4 ' ü bölüme uygulamadan önce, numuneyi açığa atmak ve yassılaştırmak önemlidir. Doğrudan numunenin üstünde uygulama kaçının, bunun yerine yavaşça şişenin altına OsO4 damla şişe duvarları kullanın. Numune, OsO4 uygulamasından kısa bir süre sonra kahverengi ve rijit hale gelir. Doku hasarını önlemek için şu andan itibaren yavaşça kolu
5. durulama
Not: Numuneyi OsO4 ve önce dehidrasyon ile sonrası fiksasyon yaptıktan sonra durulamak önemlidir, çünkü kalıntı fiksasyon maddeleri dehidrasyon ajanları37ile reaksiyona gelebilir.
- 3 dk x 3 için 0,1 M PB ile durulayın.
Not: Yeni doğmuş sıçan beyni Osmolarite değişikliklerine derinden duyarlı olduğundan, bu fikşatif karışımı kullanılan aynı araç içinde yıkanmaları yürütmek12,35,36,37. - Osmiyum çözümünü ve ilk iki PB durulama değerini OsO4 atığa yerleştirin ve kurumunuzun yönergelerine göre atın.
6. Uranyl asetat ile sıralı dehidrasyon ve boyama
Not: Bu yazarın Laboratuvarı gömme için su-immiscible Epoksi Reçineler kullanır. Epoksi Reçineler kullanıldığında, tüm numunenin serbest su gömme ortamı tarafından infiltrasyon önce organik bir çözücü ile değiştirilmesi gerekir. Su, etanol ve aseton12artan konsantrasyonlarda bir dizi çözeltiler aracılığıyla numune geçirerek kaldırılır.
-
Uranyl asetat hazırlanması (UA)
- Bir 200 ml hacimsel cam Flask 100 ml EtOH% 70 içeren bir karıştırma plakasına yerleştirin.
- Flask 4 g UA ekleyin. Alüminyum folyo sarın (UA ışığa maruz kaldığında çökelir) ve sürekli karıştırın.
Not: UA% 70 EtOH 'da yavaşça ve tamamen çözülür. Çözelti kullanmadan önce çözülmemiş kristallerin yerleşmesine izin verin. UA çözeltisi kullanmadan önce 0,45 μm filtre ile filtrelenmelidir. UA zamandan önce hazırlanabilir ve ay boyunca 4 °C ' de alüminyum folyo sarılmış kahverengi bir şişe içinde tutulur.
Dikkat: UA hafif radyoaktif ve son derece zehirlidir. UA tozu inhalasyonu üst solunum yolu bozuklukları ve akciğer, karaciğer ve böbrekler hastalığı neden olabilir. UA, yutulması veya cilt ve Mukoza zarları ile doğrudan temas ettiğinde tehlikelidir. Tüm çalışma eldiven ve koruyucu giysiler kullanarak bir duman-Hood yapılmalıdır. Taşıma ve atık imha kurumunuzun yönergelerine göre yapılmalıdır.
- 1 dk için% 50 EtOH içinde dehydrate. UA eklemeden önce 50% EtOH kaldır.
-
Ekle 4% UA içinde 70% EtOH. 1 saat ya da bir gecede oturalım. Eğer bir gecede, buzdolabında 4 °C yer.
Not: Cap Vial EtOH buharlaşma önlemek ve ışık maruz önlemek için alüminyum folyo ile kapak. Protokol burada duraklatılmış olabilir.- UA atık ve iki aşağıdaki durulama kurumunuzun yönergelerine göre bertaraf
- 1 dakika için 70% EtOH içinde dehydrate
- 5 dk için% 90 EtOH içinde dehydrate
- 5 dk x 2 için 100% EtOH içinde dehydrate.
- Numuneyi 2 dk x 3 için aseton halinde durulayın.
7. infiltrasyon ve gömme
Not: Dokular, reçine matrisinin ek desteği olmadan ince bölümlere kesilecek kadar katı değildir. Bu nedenle, infiltrasyon ve katıştırma12bölümlenme öncesinde gerekir.
-
EPON reçinesinin hazırlanması
- 60 ml gavaj şırınga kullanın. Şırınga pistonu çıkarın ve şırınga bir emniyet iğnesi ile kap.
- Açık tarafı yukarı ile şırınga yerleştirin ve artımlı olarak reçine karışımı her maddenin hacmi ekleyin. Eklemek 22 mL embed-812 (reçine). 37 mL toplam hacmine DDSA (sertleştirici) ekleyin. 50,5 mL toplam hacmine NMA (sertleştirici) ekleyin. 525 μL DMP-30 (Hızlandırıcı) ile bir pipet ekleyin. DMP çok viskoz olarak pipet pistonu çok yavaş hareket ettirin.
Not: katıştırma reaktifleri listelenen sıraya eklemek önemlidir. Hızlandırıcı (DMP-30) son eklenmesi gerekir. İstenilen özelliklere sahip bir tedavi blok elde etmek için, sertleştirici ve Hızlandırıcı tam miktarını kullanmak için önemlidir. Taze hazırlanmış gömme karışımları tercih edilir. - Pistonu geri koyun ve şırıngayı, en az 30 dakika boyunca sürekli sallayarak bir rocker üzerine yerleştirin. renk sarı kehribar değişecek.
Not: Tüm maddeler çok iyice karıştırılmalıdır. Bunu yapmak için başarısızlık doku numunesi ve düzensiz sertliğin bir blok düzensiz emsizler sonuçlanır
- Bir scint şişede 1 adet aseton ile EPON reçine 1 hacmi karıştırın ve karıştırın sallamak. Uygulama 1:1 EPON: son aseton durulama kaldırdıktan sonra doku üzerinde aseton karışımı. Aseton buharlaşma önlemek için kapalı tutun. 2-4 h sonra reçine ve aseton 1:1 karışımı çıkarın veya gece tutun.
Not: protokol burada duraklatılmış olabilir. - Tam reçine ile reçine ve aseton karışımı değiştirin. 4 saat ya da bir gecede oturalım. Tüm EPON israfını, daha sonra polimerize ve bertaraf edilecek bir toplama kapsayıcısına yerleştirin.
Not: protokol burada duraklatılmış olabilir.
8. düz gömme
Not: Numuneler, sandviç benzeri bir moda iki aclar filmi arasında düz gömülüdür.
- İki dikdörtgen parça net aclar levha kes. EtOH 70% ile temiz filmler silin. Bölümün her tarafında en az 1,5 cm doku içermeyen plastik olması için sayfaları kırpın. Üstte bulunan aclar levha altta aynı genişliğe sahip olmalıdır ve yüksekliği alt levha yaklaşık üçte ikisi olmalıdır.
- Yavaşça numune ile şişe eğim ve yavaşça şişenin alt dokusunu kaldırın.
- Bir mikro esnek spatula ve ince fırça kullanın dikkatle şişe duvarları boyunca bölümü taşımak ve aclar levha üzerine aktarmak için.
Not: Numune hasarını önlemek için bölümleri dikkatle ele almak. - Aclar sayfasını yavaşça numunenin üstüne yerleştirin.
Not: Sandviç mühürlemek için iki yaprak arasında yeterli reçine olduğundan emin olun - Herhangi bir sıkışmış hava kabarcıklarını, bölüme doğrudan basınç kullanmadan hafifçe itmek. Aşırı EPON silin.
Not: Hava kabarcıklarının eliminasyonu önemlidir, çünkü onların varlığı numunenin görselleştirilmesini zorlaştırır ve reçine bağlarının kararlılığını zayıflatır. - Bir solvent dayanıklı kalem ve fırın yer 60 ͦC için 2-3 gün polimerize ile yaprak etiket.
Not: protokol burada duraklatılmış olabilir.
9. kapsül gömme
Not: Ultraminomes, kapsüllerde numuneleri katıştırarak elde edilen silindirik blokları tutmak için aynalar ile birlikte verilir. Silindirik bloklar, sekleme sırasında kaynaklanan titreşimlerden en az etkilenecek ideal geometriye sahiptir.
- Yumuşak aclar filmleri nazikçe açın. Numune, iki aclar çarşafdan birine uyacaktır.
- Bölümü içeren aclar levha tarafını işaretlemek için solvent dirençli bir kalem kullanın. Dokusunun yakınında Mark.
Not: Bu ilgi dokusu dışarı Punch önce bu adımı gerçekleştirmek için önemlidir. - Bölümün daire örneğini elde etmek için disk yumruk kullanın. Kalem işareti, delikli dokuların bir parçası olmalı.
- Gömme kapsül tarafındaki kapağı bir kapsül tutucuya hazırlayın. Kap üzerinde bir damla reçine yerleştirin.
- Delikli diski, doku bölümü yukarı bakacak şekilde kapağın içine yerleştirin. Numune üzerine ışık döküldiğinde kalem işareti parıldıracaktır.
- Kapağın içine bir kapsül yerleştirin ve etiketleme eklemek için ince cımbız kullanın. Kapsül içine baskılı 2 cm uzunluğunda bir kağıt rulo ve aşağı. Kapsülün yan duvarlarının eğriliği için etiketi uygun hale getirmek. Polimerizasyon tamamlanması için bekleyin, böylece etiket kalıcı olarak reçineye gömülür olur.
- Kapsül içine gömme reçine dökün ve kapsülün kenarına kadar doldurun.
- 2-3 gün boyunca 60 °C ' de fırında sivri bir tahta sopa ve yer yardımı ile doku örneğiyle kapsülün altına itin.
Not: Çok sert doku basın değil dikkat alın, bunun yerine gömme orta ince bir tabaka doku ve kapsül yüzeyi arasında mevcut böylece gevşek yalan izin. Protokol burada duraklatılmış olabilir.
10. blok yüz kırpma
Not: Küçük boyut ve blok yüzü uygun şekli tatmin edici sekleme için Önkoşullar vardır. Bu nedenle, numune bloğu kırpma bir zorunluluktur.
- Keskin tek kenarlı bir tıraş bıçağı kullanın. Kullanmadan önce hemen aseton ile temizleyin.
- Kapsül bloğunu bir blok tutucuya monte edin ve blok tutucusunu bir stereomikoskop aşamasına yerleştirin.
Not: Kırpma prosedürü mikroskop dürbün ve eğik aydınlatma altında yapılmalıdır. - Bir jilet kullanarak kapsülün ucunda aclar levha çıkarın. Aclar levha, diseksiyon kapsamı ışığında parlak bir tabaka olarak görünür.
- 45 derecelik bir açıyla razor blade tutun ve kapsül bloğunun dört tarafı aşağı kesmeler yapmak.
Not: Blade her iki elle de tutulsa, kırpma daha iyi kontrol edilir. - Blok yaklaşık 45 ° duvar açıları ile kısa bir piramit şeklinde alır, böylece kısa kesikler olun.
Not: Örnek yüz, yan tarafa giden taraf kısa tutulduğu takdirde çok daha iyi desteklenir. Blok ucu çok ince ve uzun ise, ince sekleme sırasında titreşecek. İdeal olarak, ilgi alanı blok yüzünde ortalanmalıdır. - Gereksiz dokusu atmak ve sadece ilgi alanı korumak için kapsül ucunu Trim.
Not: Kesit hiçbir parçası doku olmadan olmamalıdır, blok yüzü yoğunluğu varyasyonları sekleme zorluk önemli bir nedenidir. İdeal olarak, kapsül yüzünün yüzey alanı 1 mm 'den fazla olmamalıdır2. - Kapsül yüzünü bir skalen trapezoid şeklinde kırpın. Çünkü bir skalen yamuk hiçbir yan eşittir, bu şekil en iyi örnek geri kalanı göreli ilgi alanı yönlendirmek için.
Not: Kesme sırasında, Trapezoid şekilli yüz başka herhangi bir şekle göre çok daha iyi desteklenir.
11. mikrotome bölümleme
Not: Biyolojik numunelerin çoğunluğu bir elektron ışını ile nüfuz etmek için doğal durumlarında çok kalın. Bu nedenle, malzeme elektron ışını tarafından nüfuz edilebilir ince bölümlerde kesilmelidir.
- Yüzeye paralel düzlemlerde ultrayicrotome üzerinde ince bölümleri (gümüş girişim rengi, 600-900 Å) kes.
- Bölümleri kılavuzlara yerleştirin. Bu yazarın Laboratuvarı, 3,05 mm 'lik bakır ızgaraları Dış çapta kullanır.
Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir.
12. Uranyl asetat ile sonrası boyama
- Damıtılmış suda% 2 UA hazırlayın. Bir 200 ml hacimsel cam Flask 100 ml damıtılmış su içeren bir karıştırma plaka yerleştirin. Flask için 2 g UA ekleyin. Alüminyum folyo sarın (UA ışığa maruz kaldığında çökelir) ve sürekli karıştırın.
Not: UA hazırlık ayrıntıları için bu protokol 6 bölümüne bakın. - Bir petri çanak Diş balmumu temiz bir levha üzerinde 2% UA birkaç bireysel damla yerleştirin.
- 25 dakika boyunca bir damla UA üzerinde numune (kesit tarafı aşağı) ile ızgarayı float.
Not: Ayrı bir damla UA üzerinde her ızgarayı float. - Forseps ile kenarında ızgara tutun ve bir plastik yıkama şişesi oda sıcaklığında haşlanmış damıtılmış su yumuşak bir Jet altında iki kez durulayın.
Not: Kurşun ile boyama yapmadan önce ızgaranın kurumasına izin verme.
13. Lead ile boyama sonrası
- Bir CO2-Free odası hazırlamak (Co2 havada kurşun yağış birincil kaynağıdır). Bir petri çanak 1 N NaOH ile ıslatılmış filtre kağıdı bir parça yerleştirin. Filtre kağıdı üstüne temiz diş balmumu küçük bir levha yerleştirin ve yemeğin bir tarafında birkaç NaOH peletler yerleştirin. Tabağı koru.
Not: Izgaralar UA ile lekelenmeden önce bu kurulumu hazırlayın, böylece odanın atmosferi CO2 ücretsiz ve zaman UA boyama tamamlandığında kurşun boyama için hazır. - % 4 NaOH olun. 5 mL damıtılmış su için NaOH 0,2 g ekleyin.
- Sato 'nun Üçlü kurşun çözümünü hazırlayın. Hazırlamak için 10 mL, eklemek 0,1 g Kurşun nitrat, 0,1 g kurşun sitrat, 0,1 g Kurşun asetat ve 0,2 g sodyum sitrat bir cam şişe içine. 8,2 mL distile su ekleyin ve 5 dk için şiddetle sallayın. 30 s için sonicate, sonra eklemek 1,8 mL taze yapılmış 4% NaOH.
- Petri çanak balmumu üzerinde Sato 's kurşun birkaç damla yerleştirin.
- Yol damlası üzerinde UA (Bölüm tarafı aşağı) ile lekelenmiş ızgara yerleştirin.
Not: Her ızgaranın ayrı bir kurşun damlası üzerinde kaydırılmalıdır. Her damla yeterli ızgaranın kenarlarında aşağı kayar yerine damla kubbe üstünde float izin vermek için küçük olmalıdır. - Kapak çanak ve 5 dakika için leke izin.
- Forseps ile kenarında ızgara tutun ve plastik yıkama şişesi oda sıcaklığında haşlanmış damıtılmış su yumuşak bir Jet altında iyice yıkayın.
- Blot filtre kağıdı üzerinde ızgarayı kurutun ve ızgarayı saklayın.
Not: Bölümün filtre kağıdıyla doğrudan temas etmediği emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Özellikle TEM için numunenin tatmin edici veya arızalı Koruma göstergesi olarak kabul edilen genel kriterler kurulmuştur. Bu kriterler, bu protokolde açıklanan yöntemlerden sonra genç sıçan beyin dokusunu tedavi ederek elde edilen dört seçilmiş elektron mikrografında (optimum hazırlık iki örnek, kusurlu hazırlık iki örnek) örneklenmiştir.
Genel olarak, iyi kaliteli bir elektron MİKROGRAFİ düzenli, farklı ve genel grimsi görüntü olarak görünür. Tatmin edici hazırlanmış bir örnekten, membranlar arasındaki boşluklar granül malzemeyle doldurulmalıdır ve boş olmamalıdır. Benzer şekilde, sitoplazmik zemin maddesine veya organelleri içinde boş boşluklar bulunmamalıdır (şekil 1a ve şekil 2A Ile şekil 3 ve Şekil 4' ü karşılaştırın). Bununla birlikte, çok genç hayvanların merkezi sinir sisteminin, Yetişkin beyine kıyasla belirli bir ölçüde ekstrasellüler alanların genişlemesini göstermesinin önemli olduğunu, hücreler ve genel bir beyazlık arasında daha gevşek bağlantıları olan, daha az Elektron-yoğun görünüm. Membranlar bozulma veya kırılma olmadan sürekli olmalıdır (Şekil 1a ve Şekil 2a). Mitokondri stroma, boş boşluk olmadan, üniforma ve yoğun görünmelidir. Cristae bozulmamış olmalı ve şişmiş değil, ve mitokondriyal dış çift membran (şekil 3Ile rakam 1a karşılaştırmak) kırık olmalıdır. Ön sinaptik vezikül organizasyonun morfometrik analizini kolaylaştırmak için, ön ve sonrası sinaptik membranların sağlam ve temelde birbirine paralel olması gerekir (bkz. Şekil 1). Sinaptik veziküller sürekli tek membran ile izlenebilir ve bağlı olmalıdır (bkz. Şekil 2).
Daha da önemlisi, en iyi uygulamalar takip edildiğinde bile numunenin fiksatif, leke ve reçineler ile tedavisi eserler sunar. Eserler ortadan kaldırılamaz olduğundan, hangi işlemin kaynaklandığını anlamak önemlidir, böylece numunenin görünümü12' nin yapıldığı tedavi ile ilgili olarak yorumlanabilir. Bir artifakı bir örnek-Tem için numune hazırlama sırasında oluşturulabilir birkaç arasında-bir miyelin figürü, miyelin kılıfları benzer bir membranöz lameller dahil. Miyokelin rakamları patolojik koşullarda görülebilir olsa da12, çoğu zaman aldehitler ile fikmasyon sırasında membran lipidlerin çıkarılması sonucu (bkz. Şekil 4).
Resim 1: hücre yapısının tatmin edici şekilde korunması Için elektron mikrograf temsilcisi (örnek 1). (A) nöronal hücreli membranlar katmanlı ve molalar olmadan. Sitoplazma ince granül ve boş alanlar olmadan. Mitokondri ne şişmiş ne de küçültüyor. Onların dış çift membran korunur, ve iç cristae bozulmamış. (B) ön sinaptik membrandan sinaptik veziküllerin mesafesini ölçmek için bir yöntemin örneği olan panel A 'nın ayrıntısı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 2: hücre yapısının tatmin edici şekilde korunması Için elektron mikrograf temsilcisi (örnek 2). (A) sinaptik veziküller ayrı ve kırık bir tek membran ile kaplıdır. Sinaptik vezikül dağılımının morfometrik analizine izin vermek için, ön sinaptik ve post-sinaptik membranların paralel olması ve sürekliliği korunmalıdır. (B) ön sinaptik terminalin içinde sinaptik veziküllerin sayımını örnek alan A paneli 'nin detayı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: doku yapısının arızalı korunması Için elektron mikrograf temsilcisi (örnek 1). Nöronal hücre membranlarının bozulması ve bozulmasını ve belirgin şekilde genişlemiş ekstrasellüler alanların varlığını unutmayın (* ile işaretlenir). Mitokondri şişmiş görünür ve şişmiş cristae var (ok ile işaretlenmiş). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: doku yapısının arızalı korunması Için elektron mikrograf temsilcisi (örnek 2). Sitoplazma içinde büyük beyaz boş alanların varlığını unutmayın (ǂ ile işaretlenmiş), ince granül sitoplazmik madde yerine. Ekstrsellüler boşluklar büyütülmüş görünüyor. Bir artifaktüel membrous ağırşak (miyelin rakam), muhtemelen glutaraldehit ile fiksasyon sırasında lipidlerin seferberlik kaynaklanan, kısaltma ile işaretlenir MF. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TEM için numune hazırlama sırasında doku bölümlerinin işlenmesi önemli ölçüde incelik, konsantrasyon ve sabır gerektirir. Çözümler eklemek ve kaldırmak için bir mikropipet kullanırken, numuneler yüzey gerilimi ile Pipet ucunu içine çekilebilir, bu nedenle pipet tarafından doku hasarından kaçınmak için büyük bir özen gösterilebilir. Ayrıca, dehidrasyon dizisinin belirli adımlar kadar hızlı olabilir 1 dakika, bu nedenle operatör hızlı bir sonraki dehidrasyon adım zamanında başlatıldı ve numune kuru veya kırışıklık sağlamak için çalışması gerekir. Özel dikkat gerektiren bir prosedür osmiyum ile post-fikme olduğunu. Bölümler osmiyum ile tedavi sonrası katı hale gelir ve kolayca zarar görebilir. Osmium eklemeden önce, bu bölümler şişenin altında düzleştirilmiş olması zorunludur, başka herhangi bir kat doku kırığı neden olur. Osmicated doku kullanımı özellikle düz gömme için aclar filmler üzerine bölümler aktarırken zordur. Özel bakım parçalanma önlemek için şişenin altındaki numune kaldırma ve film sandviç dışarı hava kabarcıkları itirken gereklidir. Herhangi bir sıkışmış hava itmek için önemli olmakla beraber, bu numunenin görselleştirmesini zorlaştırır ve reçine tahvillerin stabilitesini zayıflar, osşlı doku üzerine doğrudan basınç kolayca zarar verebilir. Ek bakım gerektiren bir başka adım da numune infiltrasyonu ve gömme için reçine karışımının hazırlanması. EPON, en yaygın olarak kullanılan gömme reçine, bir sertleştirici ve bir Hızlandırıcı ilavesi ile sertleştirilmiş olabilir. İstenilen özelliklere sahip bir tedavi bloğu elde etmek için sertleştirici ve hızlandırıcının tam miktarını kullanmak zorunludur. Hem gravimetrik hem de Volumetrik Yöntemler, viskoz reçineleri ölçmek için tanımlanmıştır. Gravimetrik Yöntemler geleneksel olarak daha hassas12olarak kabul edilmiştir rağmen, bu yazarın Laboratuvarı Volumetrik modları ile iyi bir başarı vardı (yani, bir gavaj şırınga yoluyla artımlı olarak reçine karışımı her maddenin hacmi ekleyerek) . Reçine bileşenleri dikkatle ölçüldüğünde, onlar farklı viskozite ve polimerizasyon oranları sahip olduğundan, üniforma emberlik başarmak için çok iyice karışık olmalıdır. Tam karıştırma elde etmek için başarısızlık ince kesme için uygun olmayan bir düzensiz sertlik bloğu ile sonuçlanır.
Genç sıçan beynin bölümlerini işlemek için kullanılan çözümlerin tonisite işaretlenmiş değişiklikler ve/veya ekstrellüler alan ve hücresel bileşenlerin şişmesi neden olabilir12,35,36,37 . Fikyasyon sırasında perfusatın osrotik basıncı, çalışma altındaki dokuya mümkün olduğunca benzer şekilde tutulduğunda en iyi sonuçlar elde edilir. Sıçan beyni osmolalite yaklaşık 330 mOsm 'dir. 0,1 M PB solüsyonda% 2 glutaraldehit sadece biraz hipertonik (400-450 mOsm) ve ekstrasküler alan12' nin genişlemesini en aza indirir. Özellikle, membran aldehydes ile fikrasyon sonrası durulama ve dehidrasyon çözeltileri ozostik basıncında değişikliklere duyarlı kalır. Bu nedenle, fiktatif osmolaritesi ile daha sonra12,35,36,37kullanılan çözümler arasındaki farklılıkları en aza indirmek de önemlidir. Bu nedenle, aynı araç (0,1 M PB, yaklaşık Osmolarite 440 mOsm) bu protokoldeki tüm çözümler için bir solvent olarak kullanılır. Ancak, birkaç farklı tampon başarıyla TEM için numune hazırlama sırasında kullanılan ve hiçbir tek tampon diğerleri üzerinde evrensel üstünlüğü talep edebilirsiniz belirtilmelidir. Alt tonallık arabellekleri tercih edildiğinde, diğer laboratuvarlar elektrolit veya non-elektrolit ile Osmolarite artırmak için seçmiş12.
Bu protokoldeki birkaç adım, düzgün şekilde işlenmezse toksik olabilecek kimyasalların kullanılmasını gerektirir. Aldehylar, osmiyum, uranyum ve kurşun bileşikleri ele alırken bir duman-kaput altında çalışma ve kişisel koruyucu ekipman giymek önemi abartılamaz. Otomatik kontrast sistemleri bazı risklerin hafifletmeye yardımcı olabilir ve ticari olarak kullanılabilir iken, onlar oldukça pahalı olabilir ve TEM rutin kullanımı yapmaz laboratuvarlar tarafından uygun olmayabilir. Elektron mikroskop Laboratuvarı potansiyel olarak tehlikeli bir yer olabilir, ancak TEM için numune işleme titizlikle gerçekleştirildiğinde genel olarak güvenlidir.
Son zamanlarda, süper çözünürlüklü ışık mikroskobu giriş yaklaşık 15 Nm34için güç çözme optik görüntüleme artmıştır. Ancak, amaç ön sinaptik terminallerde sinaptik vezikül mekansal organizasyonun morfometrik analizini gerçekleştirmek için, hiçbir tekniği morfolojik ayrıntı aynı ölçüde sağlar. Daha da önemlisi, TEM, numunenin işlenip görselleştirilmeden önce ölü olması ihtiyacı ile sınırlıdır. Bu nedenle, çalışma amacı sinaptik vezikül kaçakçılığı ve exocytosis dinamik veya işlevsel yönlerini araştırmak için ise, TEM dışında araçlar dikkate alınmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu yazıda NıH/NIGMS K08 123321 (N.L.) ve Virginia Üniversitesi Anesteziyoloji bölümü 'nden fon tarafından destekleniyordu. Yazarlar, TEM ile mükemmel eğitim ve teknik yardım ve onun paha biçilemez el yazması eleştirileri için alev erisir 'e (Biyoloji bölümü, Virginia Üniversitesi, Charlottesville, VA) teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca numune bölümleme ve sonrası boyama ile teknik yardım için Virginia Üniversitesi 'nde gelişmiş elektron mikroskopisi tesisi teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19170 | acqueous |
| 50% Glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, acqueous |
| Aclar 33 C embedding film | Electron Microscopy Sciences | 50425-25 | 7.8 mil thickness, size 8"x10" |
| BEEM capsule holder | Electron Microscopy Sciences | 69916 | holds size "00" capsules |
| BEEM embedding capsules | Electron Microscopy Sciences | 70021 | "size 00, flat (cut bottom)" |
| Butler block trimmer | Electron Microscopy Sciences | 69945-01 | |
| Camel hair paint brush | Electron Microscopy Sciences | 65576-01 | |
| Disc punch | Electron Microscopy Sciences | 77850-09 | |
| Embed 812 kit | Electron Microscopy Sciences | 14120 | |
| Lead acetate | Electron Microscopy Sciences | 17600 | |
| Lead citrate | Electron Microscopy Sciences | 17800 | |
| Lead nitrate | Electron microscopy Sciences | 17900 | |
| Leica UC7 ultracut microtome | Leica | ||
| Micro scale | Electron Microscopy Sciences | 62091-23 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | EM grade, granular |
| Precision Thelco laboratory oven | Thelco | 51221159 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldricht | S2002 | |
| StatMark pen | Electron Microscopy Sciences | 72109-01 | |
| Tyrode solution | Electron Microscopy Sciences | 11760-05 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | powder |
References
- Lunardi, N., Oklopcic, A., Prillaman, M., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. Early exposure to general anesthesia disrupts spatial organization of presynaptic vesicles in nerve terminals of the developing subiculum. Molecular Neurobiology. 52 (2), 942-951 (2015).
- Lunardi, N., Ori, C., Erisir, A., Jevtovic-Todorovic, V. General anesthesia causes long-lasting disturbances in the ultrastructural properties of developing synapses in young rats. Neurotoxicity Research. 17 (2), 179-188 (2010).
- Sanchez, V., et al. General anesthesia causes long-term impairment of mitochondrial morphogenesis and synaptic transmission in developing rat brain. Anesthesiology. 115 (5), 992-1002 (2011).
- Boscolo, A., et al. The abolishment of anesthesia-induced cognitive impairment by timely protection of mitochondria in the developing rat brain: the importance of free oxygen radicals and mitochondria integrity. Neurobiology of Disease. 45 (3), 1031-1041 (2012).
- Aghajanian, G. K., Bloom, F. E. The formation of synaptic junctions in developing rat brain: a quantitative electron microscopy study. Brain Research. 6 (4), 716-727 (1967).
- Akert, K., Sandri, C. Significance of the Maillet method for cytochemical studies of synapses. Golgi centennial symposium; Perspectives in Neurobiology. Santini, M. , Raven Press. NY. 387-399 (1975).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Cytochemistry of synapses: selective staining for electron microscopy. Science. 154 (3756), 1575-1577 (1966).
- Bloom, F. E., Aghajanian, G. K. Fine structural and cytochemical analysis of the staining of synaptic junctions with phosphotungstic acid. Journal of Ultrastructure Research. 22 (5-6), 361-375 (1968).
- Burry, R. W., Lasher, R. S. A quantitative electron microscopy study of synapse formation in dispersed cell cultures of rat cerebellum stained either by O-UL or by E-PTA. Brain Research. 147 (1), 1-15 (1978).
- Pellegrino de Iraldi, A., Suburo, A. M. Electron staining of synaptic vesicles using the Champy-Maillet technique. Journal of Microscopy. 91 (2), 99-103 (1970).
- Pfenninger, K. H. The cytochemistry of synaptic densities. I. An analysis of the bismuth iodide impregnation method. Journal of Ultrastructural Research. 34 (1), 103-122 (1971).
- Hayat, M. A. Chemical fixation. Principles and techniques of electron microscopy. Biological applications. Hayat, M. A. , Cambridge University Press. 4-84 (2000).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visual Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hayat, M. A. Fixation for electron microscopy. Hayat, M. A. , Academic Press. San Diego. (1981).
- Behrman, E. J., et al. The chemistry of osmium tetroxide fixation. The science of biological specimen preparation for microscopy and microanalysis. Revel, J. P., et al. , Scanning Electron microscopy Inc, AMF. O’Hare, Chicago. 1-5 (1983).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Reactions of osmium tetroxide with protein side chains and unsaturated lipids. Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions. (6), 1084-1088 (1979).
- Nielson, A. J., Griffith, W. P. Tissue fixation by osmium tetroxide. A possible role for proteins. Journal of Hystochemistry & Cytochemistry. 27 (5), 997-999 (1979).
- Hanker, J. S., Deb, C., Wasserkrug, H. L., Seligman, A. M. Staining tissue for light and electron microscopy by bridging metals with multidentate ligands. Science. 152 (3729), 1631-1634 (1966).
- Zobel, C. R., Beer, M. The use of heavy metal salts as electron stains. International Review of Cytology. 18, 363-400 (1965).
- Silva, M. T., Guerra, F. C., Magalhaes, M. M. The fixative action of uranyl acetate in electron microscopy. Experientia. 24 (10), 1074 (1968).
- Terzakis, J. A. Uranyl acetate, a stain and a fixative. Journal of Ultrastructural Research. 22 (1-2), 168-184 (1968).
- Feldman, I., Jones, J., Cross, R. Chelation of uranyl ions by adenine nucleotides. Journal of the American Chemical Society. 89 (1), 49-53 (1967).
- Shah, D. O. Interaction of uranyl ions with phospholipid and cholesterol monolayer. Journal of Colloid and Interface Science. 29 (2), 210-215 (1969).
- Daems, W. T., Persijn, J. P. Section staining with heavy metals of osmium-fixed and formol-fixed mouse liver tissue. Journal. Royal Microscopical Society. 81 (pts 3&4), 199-201 (1963).
- Lombardi, L., Prenna, G., Okolicsanyi, L., Gautier, A. Electron staining with uranyl acetate: possible role of free amino groups. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 19 (3), 161-168 (1971).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Kinetics of lead citrate staining of thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 58 (1), 29-40 (1983).
- Reynolds, E. S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque stain in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 17 (1), 208-212 (1963).
- Cattini, P. A., Davies, H. G. Observations on the kinetics of uranyl acetate and phosphotungstic acid staining of chromatin in thin sections for electron microscopy. Stain Technology. 59 (5), 291-304 (1984).
- Derksen, J. W., Meekes, H. Selective staining of nucleic acid containing structures by uranyl acetate-lead citrate. Micron and Microscopica Acta. 15 (1), 55-58 (1984).
- Frasca, J. M., Parks, V. R. A routine technique for double-staining ultrathin sections using uranyl and lead salts. Journal of Cell Biology. 25 (1), 157-161 (1965).
- Hanaichi, T., Sato, T., Iwamoto, T., Malavasi-Yamashiro, J., Hoshino, M., Mizuno, N. A stable lead by modification of Sato’s method. Journal of Electron Microscopy. 35 (3), 304-306 (1986).
- Sato, T. A modified method for lead staining of thin sections. Journal of Electron Microscopy. 17 (2), 158-159 (1968).
- Lever, J. D. A method of staining tissues with lead for electron microscopy. Nature. , 810-811 (1960).
- Derek, G., et al. Self organization of the Escherichia Coli chemotaxis network imaged with super-resolution light microscopy. Public Library of Science Biology. 7 (6), e1000137 (2009).
- Richards, J. G. Ultrastructural histochemistry of nervous tissue. Techniques in Neuroanatomical Research. Heyn, C., Forssmann, W. G. , Springer. Berlin. 277-292 (1981).
- Wood, R. L., Luft, J. H. The influence of the buffer system on fixation with osmium tetroxide. Journal of Ultrastructural Research. 12 (1-2), 22-45 (1965).
- Louw, J., Williams, K., Harper, I. S., Walfe-Coote, S. A. Electron dense artifactual deposits in tissue sections: the role of ethanol, uranyl acetate and phosphate buffer. Stain Technology. 65 (5), 243-250 (1990).
