Summary
هنا، نقدم بروتوكول للكشف عن الطفرات الجسدية الورم في تعميم الحمض النووي الموجود في السوائل البيولوجية المريض (السوائل الحيوية). لدينا قطرات الرقمية البوليميراز سلسلة رد الفعل (dPCR) طريقة تستند إلى تمكين القياس الكمي لطفرة الورم تردد الاليليك (MAF)، مما يسهل تكملة طفيفة التوغل لتشخيص والرصد الزمني للاستجابة الورم.
Abstract
المضاعفات المرتبطة مسبقا وتكرار أخذ العينات الأنسجة الجراحية تقديم الحاجة إلى منصات طفيفة التوغل قادرة على التصنيف الفرعي الجزيئي والرصد الزمني لاستجابة الورم للعلاج. هنا، نحن نصف طريقة لدينا المستندة إلى dPCR للكشف عن الطفرات الجسدية الورم في الحمض النووي الخلية الحرة (cfDNA)، متاحة بسهولة في biofluids المريض. على الرغم من أن هذه الطريقة محدودة في عدد الطفرات التي يمكن اختبارها في كل اختبار، إلا أنها توفر مستوى عالًا من الحساسية والخصوصية. رصد وفرة الطفرة، كما تحسب هاف، يسمح لتقييم استجابة الورم للعلاج، وبالتالي توفير تكملة تشتد الحاجة إليها للتصوير الإشعاعي.
Introduction
بسبب القيود المفروضة على توافر أنسجة الورم للتحليلات الجزيئية، هناك حاجة لتطوير أساليب حساسة للغاية قادرة على الكشف عن الطفرات الجسدية الورم في السوائل الحيوية المريض، بما في ذلك البلازما والمصل والسائل الدماغي الشوكي (CSF) . على سبيل المثال، تشكل الأورام الدبقية للخط الأوسط المنتشرة لدى الأطفال (DMGs) تحدياً بسبب موقعها العصبي الذرّي. على مدى العقد الماضي، كشف التنميط الجزيئي لعينات الأنسجة DMG طفرات السائق في هذا النوع من الورم1 وكشف عن عدم تجانس الطفرات المكانية والزمنية، مما يجعل خزعة اللازمة لتوصيف المريض داخل مرض المجموعة الفرعية وتعزيز العلاجات المستهدفة جزيئيا2. على هذا النحو، التجارب السريرية الدعوة إلى دمج الخزعات الجراحية للتنميط الجزيئي الورم في التشخيص مقدما3،4،5،6. أثناء العلاج، يقتصر رصد الاستجابة العلاجية في DMGs على التصوير بالرنين المغناطيسي، الذي يفتقر إلى الحساسية للكشف عن التغيرات الصغيرة أو تطور الجينوم الورم. التصوير بالرنين المغناطيسي هو أيضا عرضة للكشف عن التضواء الزائفة، التهاب عابر في موقع الورم الذي يحاكي التقدم الحقيقي على التصوير، وقد تضليل تفسير استجابة الورم7. وهكذا، تمثل DMGs نوع الورم مع حاجة عالية لبديل، وسيلة طفيفة التوغل للكشف عن طفرات الورم ورصد الاستجابة السريرية. من أجل تلبية هذه الاحتياجات، قمنا بتطوير وتحسين بروتوكول للكشف عن، وقياس التردد الالي، وطفرات الورم في cfDNA من البلازما والمصل وCSF للأطفال الذين يعانون من الأورام الدبقية المتوسطة8. وبالنظر إلى أن الـ DMGs الطفولة في كثير من الأحيان (>80٪) تأوي طفرة الليسين إلى الميثيونين الجسدية في الموقع 27 من متغير الهيستون H3.1 (H3.1K27M، 20٪ من الحالات) أو H3.3 (H3.3K27M، 60٪ من الحالات)1، هذه وغيرها من الطفرات المميزة من DMGs (أي ACVR1، PIK3R1) استهدفت ل متحولة allele القياس الكمي باستخدام cfDNA8. يمكن تصميم هذا الفحص للكشف عن الطفرات الساخنة في أنواع الأورام الأخرى باستخدام التمهيديات وتحقيقات تسلسل محددة. وبراعة هذا النهج تجعل منه قابلا للتطبيق على مجموعة متنوعة من أنواع السرطان التي من شأنها أن تستفيد من إدماج أدوات التشخيص القائمة على cfDNA والرصد العلاجي.
للكشف بحساسية عن طفرات التردد المنخفضة في cfDNA، نستخدم نهجًا قائمًا على PCR رقميًا (dPCR). في هذه الطريقة، يتم تقسيم خليط تفاعل PCR إلى حد أقصى نظري قدره 10 مليون قطرة باستخدام منصة dPCR (على سبيل المثال، RainDance)، مع 7-9 مليون قطرة لكل PCR ينظر إليها بشكل جيد بشكل جيد تجريبياً. بسبب درجة عالية من تقسيم العينة، على الأكثر واحد فقط إلى اثنين من جزيئات الحمض النووي يمكن أن تكون موجودة في كل قطرة. يمكن أن يحدث تضخيم PCR وتسلسل محددة الهجين التحقيق الفلورسنت في كل قطرة، بحيث الملايين من ردود الفعل تحدث. وهذا يزيد من الحساسية ويتيح الكشف عن الأليلات المتحولة النادرة، والتي قد تذهب خلاف ذلك دون الكشف عنها على خلفية من الحمض النووي البري. استخدام حمض نووي مؤمن (LNA) تحقيقات يعزز خصوصية الاختبار عن طريق تقييد عدم تطابق التهجين ودعم الكشف الدقيق عن الطفرة9و10و11. هنا، ونحن نصف أساليبنا لمعالجة العينات، استخراج cfDNA، preamplification من الأليلات الهدف، dPCR وتحليل البيانات.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع الأساليب الموصوفة هنا من قبل مجلس الاستعراض المؤسسي لجامعة كاليفورنيا سان فرانسيسكو (سان فرانسيسكو, كاليفورنيا; IRB #14-13895) والنظام الصحي الوطني للأطفال (واشنطن العاصمة؛ iRB #1339). تم جمع العينات ودراستها بعد الحصول على موافقة مستنيرة من المريض أو الوصي على المريض.
1- موافقة المرضى بموجب بروتوكول IRB لجمع وتخزين العينات البيولوجية
-
جمع عينات المريض بعد الحصول على موافقة خطية مستنيرة من كل مريض، أو الوصي على المريض، للمشاركة في تجربة سريرية أو للمستودع البيولوجي على النحو الذي وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية المعنية.
- تم تشخيص المرضى المشمولين في هذه الدراسة مع ورم في الدماغ الأشعة. ولم تُستخدم أي معايير استبعاد. تم جمع العينات ودراستها بعد الحصول على موافقة مستنيرة من المريض أو الوصي على المريض.
2. جمع الدم وفصل البلازما أو المصل
- جمع عينة الدم باستخدام سحب 10.0 مل في أنابيب جمع الدم. إذا كان جمع الدم للبلازما، واستخدام K2- أو K3-EDTA أنابيب، الهيبارين أو أنابيب جمع الدم cfDNA. إذا كان جمع الدم للمصل، واستخدام أنابيب هلام حاجز تحتوي على المنشط جلطة وهلام لفصل المصل.
ملاحظة: في حين ينصح 10 مل لتمكين تكرار التجارب، فإن ما لا يقل عن 3 مل يكفي. - بعناية عكس أنبوب جمع 10 مرات لخلط عينة الدم مع الكواشف أنبوب جمع.
- اترك عينات الدم التي سيتم جمع المصل منها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح للدم بالتخثر. إذا معالجة الدم للحصول على البلازما، انتقل على الفور إلى الخطوة 2.4.
ملاحظة: ويمكن الاحتفاظ بالعينات التي يجري تجهيزها للبلازما على الجليد لمدة أقصاها 2 ساعة قبل الطرد المركزي. ومع ذلك، فإن الانتقال السريع من سحب الدم إلى المعالجة يقلل من تدهور الـ cfDNA. - أنابيب جمع الدم الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 15 دقيقة في جهاز طرد مركزي تعيين إلى 4 درجة مئوية لفصل البلازما أو المصل من طبقات خلايا الدم البيضاء والحمراء.
- مع الحرص على عدم إزعاج طبقة خلايا الدم البيضاء (التي تشكل خط رفيع بين طبقة البلازما / المصل العلوي والطبقة السفلى من خلايا الدم الحمراء معبأة)، ماصة الطبقة العليا من البلازما / المصل (والتي قد تكون واضحة، صفراء، أو الوردي في اللون) بالتساوي في 1 مل aliquots في البولي بروبلين المعقمة المسمار كاب cryovials.
- تسجيل رقم تعريف الموضوع، ونوع العينة (البلازما أو المصل)، وتاريخ التحصيل على تسمية الكفيالات.
- تخزين الفيافيال في -80 درجة مئوية الفريزر حتى استخدامها. في حالة عدم توفر فريزر -80 درجة مئوية، قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
3. جمع وتجهيز CSF
- جمع CSF من تحويلة، ثقب قطني، أو عملية جراحية.
ملاحظة: ولا ينبغي إجراء هذه الإجراءات إلا إذا رأى الأطباء ضرورة لذلك. ويمكن استخدام عينة إضافية تتجاوز تلك اللازمة للاستخدام السريري لأغراض البحث. - قياس حجم CSF التي تم جمعها ودوّن لونه (الدموية، الصفراء، واضحة).
- طرد مركزي أنبوب جمع في 10،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لبيليه الحطام الخلوي.
- نقل supernatant CSF بالتساوي في aliquots 500 ميكرولتر في البولي بروبلين المسمار غطاء cryovials.
- تسجيل رقم تعريف الموضوع ونوع العينة وتاريخ جمع العينات على تسمية الفيارير. يُحفظ عند -80 درجة مئوية حتى يُستعمل.
4. استخراج cfDNA من العينات السائلة
- تنفيذ بروتوكول استخراج cfDNA وفقا للتعليمات الواردة في كتيب مجموعة استخراج cfDNA12.
- تنظيف مساحة مقاعد البدلاء والمعدات مع التبييض 10٪ والإيثانول 70٪.
ملاحظة: استخدام غطاء PCR، وتغيير منتظم للقفازات وإزالة التلوث المتكرر من مساحة مقاعد البدلاء والمعدات مع التبييض 10٪ والإيثانول 70٪ خلال جميع خطوات البروتوكول مهم لتجنب التلوث عينة. - إعداد aliquots من الكواشف، على سبيل المثال، المخازن المؤقتة للغسيل، من مجموعة الاستخراج لتجنب التلوث المتبادل.
- تنظيف مساحة مقاعد البدلاء والمعدات مع التبييض 10٪ والإيثانول 70٪.
- إذابة عينات المريض على الجليد قبل البدء في استخراج. للبلازما / المصل، ذوبان 1 مل aliquot من العينة. لCSF، ذوبان 500 ميكرولتر aliquot من العينة.
ملاحظة: تختلف خطوات التحلل (4.5-4.8) من بروتوكول الاستخراج بين البلازما/المصل والسائل السائل، ولكن من الخطوة 4.9 فصاعداً، يكون البروتوكول متطابقاً لكلا النوعين من السوائل الحيوية. - تعيين كتلة التدفئة إلى 60 درجة مئوية للاستخدام أثناء خطوة lysis (4.6).
- إعداد العازلة lysis والناقل خليط RNA في أنبوب 15 مل عن طريق إضافة 5.6 ميكرولتر من الناقل RNA و 0.9 مل من العازلة lysis لكل عينة12.
- بالنسبة للبلازما/المصل، أضف 100 ميكرولتر بروتيناسي K، و1 مل من العينة، و0.8 مل من خليط الحمض النووي الريبي العازل/الحامل الذي تم إعداده في الخطوة 4.4 إلى أنبوب 2.0 مل مسمى. مزيج من دوامة نبض لمدة 30 ثانية في سرعة عالية12.
- بالنسبة لـ CSF، أضف 125 ميكرولتر بروتيناسي K، 500 ميكرولتر من العينة، و1 مل من خليط الحمض النووي الريبي العازلة/الحامل للتحليل، و250 ميكرولتر من الأنسجة العازلة إلى أنبوب سعة 2.0 مل. ارفع الحجم الكامل إلى 2 مل عن طريق إضافة 125 ميكرولتر من ملح 1x الفوسفات المخزن (PBS). مزيج من دوامة نبض لمدة 30 ثانية في سرعة عالية12.
- احتضان عينات لمدة 30 دقيقة في 60 درجة مئوية في كتلة التدفئة12.
- إزالة عينات من كتلة التدفئة وخفض درجة الحرارة إلى 56 درجة مئوية. إعادة العينات إلى مقاعد البدلاء ونقل lysate إلى أنابيب جديدة المسمى 15 مل.
- للبلازما / المصل، إضافة 1.8 مل من الحمض النووي ملزمة bufferand مزيج لمدة 30 ثانية عن طريق دوامة نبض12.
- لCSF، إضافة 3.6 مل من الحمض النووي العازلة ملزمة ومزيج لمدة 30 ثانية عن طريق نبض دوامة12.
- احتضان عينات لمدة 5 دقائق على الجليد12.
- أدخل العمود في موصل الفراغ. افتح العمود وأدخل موسع أنبوب 20 مل في العمود12.
- ماصة محتويات أنبوب 15 مل مباشرة في الجزء السفلي من أنبوب الموسع، وتجنب ترك قطرات على جدران أنبوب الموسع.
- مع إغلاق مفتاح موصل فراغ، والتبديل على مضخة فراغ. مرة واحدة وقد بنيت الضغط إلى 900 مبار، وفتح صمام موصل فراغ. سيتم الآن تدفق العينة من خلال العمود.
- مرة واحدة وقد استنزفت كل lysate من العمود، وإيقاف المضخة وفتح الباب إلى موصل فراغ، وتخفيف التدرج الضغط. بمجرد أن يصل الضغط إلى 0 مبار، أغلق صمام موصل الفراغ وباب الفخ.
- إزالة موسع أنبوب 20 مل، والحرص على عدم تمرير الموسع من عمود واحد على عمود مجاور، وهذا يمكن أن عبر تلوث العينات. التخلص من أنبوب الموسع.
- إضافة 600 μL من المخزن المؤقت للغسيل الأول إلى العمود12.
- ترك أغطية الأنابيب مفتوحة وبدوره على مضخة فراغ. دع مقياس الضغط يصل إلى 900 مبار، ثم قم بتشغيل مفتاح موصل الفراغ إلى الموضع المفتوح لرسم مخزن الغسيل المؤقت من خلال العمود.
- إيقاف مضخة فراغ، وفتح trapdoor للافراج عن الضغط، وتخفيف الضغط إلى 0 مبار. بدوره صمام موصل فراغ إلى موقف مغلق.
- إضافة 750 μL من المخزن المؤقت للغسيل الثاني إلى العمود وكرر الخطوات 4.16-4.1712.
- إضافة 750 درجة مئوية من الإيثانول درجة MB إلى العمود وكرر الخطوات 4.16-4.1712.
- أغلق غطاء العمود وضع العمود داخل أنبوب تجميع جديد بـ 2.0 مل. التخلص من موصل فراغ12.
- الطرد المركزي أنبوب مع العمود في 20،000 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة12.
- ضع العمود في أنبوب تجميع جديد وافتح غطاء الأنبوب. وضع نسيج المختبر على الجزء العلوي وحضانة في 56 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة12.
- ضع العمود في أنبوب نظيف بـ 1.5 مل من الـ PCR وأنبوب نظيف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للإلوتيون (أو درجة البيولوجيا الجزيئية H2O (MB H2O)) مباشرة في وسط العمود. لا تلمس العمود مع تلميح ماصة. أغلق الغطاء واترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- الطرد المركزي في 20،000 × ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة إلى elute cfDNA12.
- ماصّة eluate مرة أخرى في العمود وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- كرر الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة إلى elute cfDNA مرة ثانية لزيادة الغلة (وفقا لتوصية الشركة المصنعة).
- تخزين cfDNA في وصفت DNase / RNase أنابيب PCR نظيفة مجانا في 4 درجة مئوية أو المضي قدما مباشرة إلى الخطوة 5.
5. تركيز فراغ من cfDNA
- إدراج وموازنة الأنابيب التي تحتوي على cfDNA eluted في أصحاب على المكثف فراغ. افتح أغطية الأنابيب. تعيين درجة حرارة فراغ المكثف إلى 23 درجة مئوية.
-
تشغيل المكثف فراغ، ثم تشغيل فخ بخار. عينات الطرد المركزي لمدة 40 دقيقة أو حتى يتم التوصل إلى حجم نهائي من 10.5-11 درجة مئوية.
- إذا كان حجم أقل من 10.5 درجة مئوية، إضافة المخزن المؤقت تعليق الحمض النووي أو MB H2O للوصول إلى حجم نهائي من 10.5 ميكرولتر.
- ماصة حجم كامل على طول جدران الأنبوب لإزالة شظايا الحمض النووي المتبقية.
- لفترة وجيزة الطرد المركزي العينات على جهاز طرد مركزي منضدية لجمع قطرات على جدران الأنابيب.
- انتقل مباشرة إلى خطوة preamplification (الخطوة 8) أو تخزين عينات في 4 درجة مئوية.
- التفاف أغطية الأنابيب في فيلم المختبر لتجنب التلوث إذا تم تخزينها للاستخدام في وقت لاحق.
6. تصميم وإعداد التمهيديات وتحقيقات
- تصميم التمهيديات إلى الأمام والعكسي، والبرية ومتحولة تحقيقات LNA، للهدف (ق) من الفائدة. من الناحية التجارية من أجل التمهيديات وتحقيقات lyophilized (راجع جدول المواد).
ملاحظة: يمكن الاطلاع على تسلسلات للمواد التمهيدية وتحقيقات تستهدف H3F3A p.K27M وغيرها من الطفرات المستهدفة للأورام الدبقية للخط الأوسط للأطفال في الجدول التكميلي 3 من Panditharatna وآخرون، 20188. - قبل فتح التمهيديات وتحقيقات lyophilized، طرد مركزي لفترة وجيزة الأنابيب. يضاف الحجم المناسب من المخزن المؤقت لتعليق الحمض النووي أو MB H2O، كما هو موضح في ورقة مواصفات المنتج، لإعادة تعليق المواد التمهيدية وتحقيقات اللوفيلي إلى تركيز قدره 100 درجة مئوية.
- دوامة بلطف، ماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لخلط ولفترة وجيزة أجهزة الطرد المركزي التمهيدية وتحقيقات باستخدام الطرد المركزي منضدية.
- إعداد 10 μquots من التمهيديات وتحقيقات عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من 100 درجة مئوية الأسهم إلى 90 درجة مئوية من الحمض النووي تعليق العازلة أو MB H2O.
- إعداد 1 μquots من التمهيديات الأمامية والعكسية (لاستخدامها في preamplification)، عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من التمهيدي 10 μM إلى 90 ميكرولتر من المخزن النووي تعليق العازلة أو MB H2O.
- تخزين التمهيديات وتحقيقات في 4 درجة مئوية في حاويات مظلمة ضيقة الهواء. التفاف فيلم المختبر حول الأغطية لتجنب التلوث، وتغطية تحقيقات في رقائق الألومنيوم لتجنب التعرض للضوء. تخزين تحقيقات في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل إذا لم يتم استخدامها بانتظام.
7. اختيار الضوابط الإيجابية
-
حدد تكوين (عينات) الحمض النووي الجينومي لأنسجة الورم (gDNA) مع تركيز الحمض النووي المعروف، والذي يأوي طفرة الاهتمام على تردد آلي معروف لاستخدامه كتحكم إيجابي.
- استخدام 0.025 نانوغرام من الحمض النووي للأنسجة الورم السيطرة الإيجابية في خطوة preamplification (الخطوة 8).
ملاحظة: يوفر هذا الإدخال الحمض النووي إشارة إيجابية قوية على dPCR (كما هو محدد من خلال تنفيذ التخفيفات التسلسلية من أنسجة الورم gDNA التي تأوي طفرة H3F3A p.K27M8)مع تقليل كمية العينة المطلوبة.
- استخدام 0.025 نانوغرام من الحمض النووي للأنسجة الورم السيطرة الإيجابية في خطوة preamplification (الخطوة 8).
8. Preamplification من الأليس الهدف
ملاحظة: بروتوكول Preamplification هو وفقا لجاكسون وآخرون، 201613.
- تنظيف مساحة مقاعد البدلاء والمعدات مع التبييض 10٪ والإيثانول 70٪.
- الحصول على 1 μM إلى الأمام وعكس التمهيديات، وعينات cfDNA، gDNA الضوابط الإيجابية، والحمض النووي البوليمرات مزيج الرئيسي، وتعيين على الجليد.
-
حساب حجم الكواشف اللازمة لتضخيم العدد المطلوب من عينات cfDNA والتحكم الإيجابي، إما singleplex أو تعدد التضخيم على النحو التالي:
- بالنسبة للخلط اتّصال أحادي السعة (لتضخيم النمط البري والأنواع المتحولة من أجل طفرة واحدة من الفائدة)، قم بإعداد خليط تفاعل PCR بإضافة 17.5 ميكرولتر من مزيج بوليميراز الحمض النووي الرئيسي، و3.5 ميكرولتر من المواد التمهيدية الأمامية والعكسية (100 nM) لكل عينة13.
- بالنسبة للتجهر متعدد التضخيم (لتضخيم مجموعتين من الأنواع البرية والأليلات المتحولة لطفرات ذات أهمية)، قم بإعداد خليط تفاعل PCR بإضافة 17.5 ميكرولتر من مزيج ثنائي الدم و1.75 ميكرولتر من كل مجموعة من المواد التمهيدية الأمامية والعكسية (50 nM) لكل عينة 13.
ملاحظة: إعداد ما يكفي من خليط تفاعل PCR لعدد العينات بالإضافة إلى 10٪ إضافية لحساب أي خطأ الأنابيب.
- الاستغناء عن 24.5 ميكرولتر من خليط تفاعل PCR في كل بئر من أنبوب قطاع PCR 8-well13.
- الاستغناء عن 10.5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي في البئر المناسب ة لجعل حجم التفاعل الكلي إلى 35 ميكرول13. ماصّة بلطف حجم كامل صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط.
- إجراء تضخيم PCR في 98 درجة مئوية لمدة 3 دقائق; 9 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 10 s، درجة حرارة الصلب لمدة 3 دقائق، 72 درجة مئوية لمدة 30 s؛ وتمديد في 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة13.
- نقل الحجم الكامل للمنتج المتضخم إلى أنابيب DNase/RNase الخالية من PCR والتخفيف في 140 ميكرولتر TE DNA تعليق العازلة (درجة الحموضة 8.0)13.
- التفاف أغطية الأنابيب في فيلم المختبر. تخزين المنتج قبل تضخيم في 4 درجة مئوية. للحفظ على المدى الطويل، مخزن في -20 درجة مئوية.
9. الكشف عن الحمض النووي المستهدف وتحديده كمياً باستخدام dPCR
- تنظيف مساحة مقاعد البدلاء والمعدات مع التبييض 10٪ والإيثانول 70٪.
- تعيين 10 μM التمهيديات وتحقيقات، ومزيج ماجستير علم الوراثة، وعينات الحمض النووي على الجليد. تخزين قطرات استقرار النفط في درجة حرارة الغرفة.
- دوامة بلطف ولفترة وجيزة الطرد المركزي جميع الكواشف باستثناء قطرات استقرار النفط.
- تأكد من أن اسطوانة غاز النيتروجين المضغوط المرفقة بأداة توليدقطرات وأداة القياس الكمي (جدول المواد) يتم تعيينها في 90 رطل لكل بوصة مربعة.
- قم بتشغيل أداة توليد الإفلات والكمبيوتر باستخدام برنامج الآلات. قم بتشغيل البرنامج وانقر فوق بدء التهيئة.
- تشغيل تدفق الضغط العالي على أداة توليد قطرة إذا لم يتم استخدامه في أسبوع واحد أو أكثر.
- إعداد خليط رد الفعل dPCR ل8 آبار من أنبوب قطاع PCR بالإضافة إلى 10٪ إضافية، عن طريق إضافة 220 ميكرولتر من مزيج رئيسي علم الوراثة، 8.8 ميكرولتر كل من 10 μM البرية وتحقيقات متحولة، 39.6 ميكرولتر كل من 10 ميكرومتر إلى الأمام وعكس التمهيديات، و 17.6 ميكرولتر من قطرات استقرار النفط14.
- قم بمزج خليط رد الفعل dPCR بلطف عن طريق توجيه الصوت الكامل صعودا وهبوطا 10-20 مرة. لا دوامة أو الطرد المركزي بعد قطرات وقد أضيف النفط استقرار إلى خليط التفاعل.
- الحصول على PCR 8-جيدا أنبوب قطاع والاستغناء عن 38 ميكرولتر من خليط رد فعل dPCR مباشرة في الجزء السفلي من كل بئر14. إزالة أي فقاعات مع تلميح ماصة نظيفة.
ملاحظة: أنابيب شريط PCR التي يتم متشابكة أو معبأة بإحكام معا يمكن أن يؤدي إلى شحنات كهربائية ثابتة، مما تسبب في التآلف وإشارة صاخبة عند تحليل البيانات dPCR. لتجنب هذا، أنابيب شريط aliquot في أكياس الخطر البيولوجي منفصلة، وتجنب الإفراط في التعبئة والحقائب، والحفاظ على أنابيب من فرك معا. - إضافة 12 درجة مئوية من عينة الحمض النووي المتضخم مسبقا إلى الآبار المناسبة من أنبوب قطاع PCR. للتحكم السلبي، أضف 12 ميكرولتر من MB H2O.
ملاحظة: تحليل عينات cfDNA في الآبار المكررة. لCSF، تحليل على الأقل في مكررة، والبلازما / المصل تحليل كل عينة في ثلاثة أضعاف. - ماصّة بلطف حجم كامل صعودا وهبوطا 10 مرات لخلط خليط التفاعل مع عينة الحمض النووي.
- الحصول على رقاقة أداة جديدة توليد قطرات وماصة الحجم الكامل من الآبار 1-8 من أنبوب قطاع PCR في القنوات المقابلة A-H في رقاقة. تجنب لمس الجزء السفلي من القنوات مع طرف ماصة.
- الحصول على أنبوب شريط PCR نظيفة جديدة وإدراجها في أداة توليد قطرات. مسح أو يدويا أدخل معرف رقاقة أداة توليد قطرات في البرنامج على جهاز الكمبيوتر الصك. أدخل أسماء لكل قناة من القنوات الثمانية. انقر فوق بدء التشغيل لبدء أخذ عينات قطرات.
- عند اكتمال قطرات، وإزالة أنبوب قطاع PCR وتطبيق أغطية أنبوب الشريط.
- نقل أنبوب الشريط إلى دورة الحرارية والتوازن مع أنبوب شريط آخر يحتوي على 80 درجة مئوية من الماء لكل بئر.
- برنامج ظروف ركوب الدراجات الحرارية14 على النحو: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ 45 دورات من درجتين في درجات الحرارة: 95 درجة مئوية لمدة 30 درجة مئوية ودرجة حرارة الصلب لمدة 2 دقيقة؛ 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق؛ وعقد في 10 درجة مئوية.
- تعيين معدل المنحدر إلى 0.5 درجة مئوية / ثانية وتعيين حجم العينة إلى 80 درجة مئوية14.
- عند اكتمال ركوب الدراجات الحرارية، قم بإزالة أنبوب الشريط ونقلها إلى أداة القياس الكمي. إزالة قبعات قطاع PCR واستبدالها بأغطية عالية السرعة.
- تشغيل أداة القياس الكمي والكمبيوتر المتصل مع برنامج الصك. قم بتشغيل برنامج العدادات وانقر فوق إعداد تشغيل.
- وضع أنبوب الشريط في أداة القياس الكمي.
- الحصول على رقاقة أداة القياس الكمي الجديد والمسح الضوئي أو يدويا إدخال معرف رقاقة في الصك. أدخل الرقاقة في الجهاز.
- وضع الدرع المعدني على رأس رقاقة وإغلاق غطاء الصك.
- في برنامج الكمبيوتر، أدخل اسم تشغيل dPCR ولكل قناة من القنوات الثمانية (A-H). حدد الوضع السريع (الذي يجب استخدامه مع قبعات عالية السرعة) وانقر فوق ابدأ لبدء القياس الكمي.
- عند اكتمال القياس الكمي، قم بإزالة الدرع المعدني (ليتم حفظه وإعادة استخدامه) والتخلص من أنبوب شريط PCR ورقاقة. على الكمبيوتر الصك، سوف يحتوي "سجل التشغيل" على ملفات النتائج لكل تشغيل. استخدم ملفات .fcs لكل عينة لتحليلها مع برنامج المحلل.
10. تحليل البيانات
- قم بتشغيل برنامج المحلل وفتح ملفات .fcs لتحليل البيانات الطيفية الخام. ضمن طريقة عرض التحليل، حدد سليم. ضمن طريقة عرض نموذج ، انقر فوق المربعات بجانب كل من النماذج 8 بحيث يكون هناك علامة اختيار في كل مربع. سيقوم البرنامج برسم إشارات للمتحولين (FAM) وwildtype (HEX) alleles على طول x- و y-محاور، على التوالي .
- استخدم وظيفة المصفوفة المحسوبة لتطبيق التعويض الطيفي على قطرات سليمة، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة15.
- ضبط إعدادات المحور ضمن خيارات المحور. قم بتعيين المحور س إلى حد أدنى قدره 0 والحد الأقصى 30,000، والمحور ص إلى الحد الأدنى -5,000 والحد الأقصى 10,000. عند تحديد مجموعات قطرات، ضبط المحاور لتقليل المساحة الفارغة في الرسم البياني.
ملاحظة: وسيتوقف وضع التجمعات المتحولة والبرية على التحقيقات المستخدمة، والفلوروفور وتركيزها. - حدد العينة المقابلة لgDNA أنسجة الورم التحكم الإيجابي لتعيين السلبية (الكتلة الأقرب إلى الأصل)، متحولة (كتلة الأقرب إلى المحور س)، والنوع البري (الكتلة الأقرب إلى المحور ص) البوابات. التأكد من أن المجموعات متميزة وسهلة التعرف عليها في اختبار ناجح.
- تطبيق إعدادات البوابة للتحكم الإيجابي على كافة العينات عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على نموذج التحكم الإيجابي والنقر فوق الخيار لتطبيق كافة الإعدادات على العينات المحددة.
- ضمن طريقة العرض الرسومية، انقر فوق علامة التبويب نماذج متعددة لعرض المؤامرات لكافة العينات المحددة. تصدير الصورة كـ . TIF.
- ضمن علامة التبويب مساحة العمل في أعلى يسار الشاشة، حدد تحليل التصدير (csv) وحفظ ملف البيانات الذي تم تحليله كملف .csv.
- افتح ملف .csv في برنامج جدول البيانات لعرض عدد القطرات السالبة والبرية والمتحولة لكل عينة. حساب MAF عن طريق تقسيم عدد قطرات متحولة تصحيح بواسون من قبل مجموع متحولة بواسون تصحيح بالإضافة إلى عدد قطرات البرية لكل عينة.
ملاحظة: استخدام عدد بواسون تصحيح لأن إحصاءات بواسون حساب هذه الحقيقة أن قطرات إيجابية قد تحتوي على أكثر من نسخة واحدة من الحمض النووي المستهدف، وبالتالي جمع قطرات إيجابية قد لا تسفر عن عدد دقيق16.
Representative Results
يظهر الشكل 1 النتائج التمثيلية للكشف الناجح عن طفرة H3F3A p.K27M في البلازما المتضخمة (اللوحة اليسرى العليا) وCSF (اللوحة اليمنى العليا) cfDNA من طفلين مصابين بـ DMG. تم تحليل عينات cfDNA في النسخ المتماثل ولكن يتم عرض رسم بياني تمثيلي واحد فقط لكل نوع عينة. تظهر قطع الأراضي dPCR توليد قطرات ناجحة، مع 7-9 مليون قطرة لكل PCR جيدا (معظمها قطرات سلبية التي لا تحتوي على الحمض النووي المستهدف). ويشير ما لا يقل عن 7 ملايين قطرة لكل PCR إلى حدوث انخفاض ناجح، في حين أن أقل من 7 ملايين تشير إلى فشل عملية التحليل، وفي هذه الحالة لا ينبغي للمستخدم المضي قدما في تحليل البيانات. ويبين الشكل 1 فصلاً واضحاً بين مجموعات المتحولين والأنواع البرية على طول المحورين x وy على التوالي. تشير مجموعات النوع البري القوية إلى أن استخراج cfDNA كان ناجحاً لأن الحمض النووي القالب موجود. تظهر مجموعات المتحولين MAF بنسبة 1.60% و39.92% لعينات البلازما وCSF، على التوالي، مما يدل على اكتشاف إيجابي للطفرة. بالنسبة لهؤلاء المرضى، تكون نتائج dPCR وفقًا لحالة طفرة الورم، كما يؤكد التحليل الجينومي لأنسجة الورم الخزعة8. السيطرة السلبية (أسفل اللوحة اليسرى) يظهر 0 متحولة و 0 قطرات النوع البري، مما يشير إلى أنه لم يكن هناك تلوث لخليط تفاعل PCR. يُظهر نسيج الورم المُرَمِّي الموجب gDNA (اللوحة السفلية اليمنى) الطفرة التي يتم اكتشافها عند التردد الأليليك المتوقع لعينة الورم المحددة.
في الشكل 2، تظهر النتائج التمثيلية للكشف غير الناجح عن طفرة الاهتمام، H3F3A p.K27M، في cfDNA البلازما من طفل مع DMG. تم تأكيد حالة الطفرة من خلال التحليل الجينومي لأنسجة الورم8. وتظهر النتائج التمثيلية من بئرين من آبار PCR المكررة (اللوحات العليا). ويتراوح العدد الإجمالي للقطرات، بما في ذلك قطرات سالبة، بين 7 و9 ملايين لكل PCR بشكل جيد، مما يشير إلى أن الإسقاط الناجح. تُظهر مجموعات النوع البري، المرسومة على طول المحور ص، ما يقرب من 7-8000 قطرة من النوع البري لكل PCR بشكل جيد لـ cfDNA البلازما، مما يشير إلى استخراج cfDNA الناجح (كما أن هناك الحمض النووي البري الهدف في العينة). ومع ذلك، يتم الكشف عن 0 قطرات متحولة في عينة البلازما. تظهر اللوحة اليسرى السفلية التحكم السلبي (MB H2O) مع عدم وجود قطرات من النوع البري أو المتحولة. واللوحة اليمنى السفلى يظهر السيطرة الإيجابية قبل تضخيم أنسجة الورم gDNA (0.025 نانوغرام) مع الكشف عن طفرة إيجابية. كما هو مبين في هذا الرقم، فإن عدم الكشف عن الطفرة في البلازما قد لا يعني بالضرورة أن المريض هو wildtype لطفرة الاهتمام، كما تحدث السلبيات كاذبة8. في بعض الحالات ، عندما يتم تفويت الطفرة في البلازما التي تم جمعها في خزعة مقدمة ، يتم الكشف عنها في البلازما التي تم الحصول عليها من نفس المريض في وقت لاحق نقطة8.
الشكل 1 الكشف الناجح عن: H3F3A طفرة p.K27M في البلازما المتضخمة وCFDNA CSF من الأطفال الذين يعانون من الأورام الدبقية في خط الوسط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 النتائج السلبية الكاذبة التي تم الحصول عليها من تحليل عينة cDNA البلازما متضخم مسبقا من مريض معروف لإيواء طفرة من الفائدة، H3F3A p.K27M، في الورم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هنا قدمنا طريقتنا للكشف عن وتحديد التردد الالي لطفرات الورم في cfDNA من خزعة السائل المريض. ونشدد على الخطوات الحاسمة لنجاح هذه الطريقة، بما في ذلك معالجة العينات قبل التحليلية، واستخراج الـ cfDNA، وتصميم فحص PCR، وتحليل البيانات. للحد من حجم العينة المستخدمة، يتم استخراج cfDNA من 1 مل من البلازما ولكن فقط 500 درجة مئوية من CSF. عند استخراج من CSF، يتم استخدام بروتوكول لاستخراج من 1 مل من البول (بعد كتيب مجموعة استخراج cfDNA12)،وفقا لتوصية الشركة المصنعة. الفرق في حجم العينة المطلوبة بين البلازما وCSF يرجع إلى انخفاض مستويات cfDNA خاصة بالورم في البلازما مقارنة مع CSF من المرضى الذين يعانون من أورام الدماغ، مما يستلزم كميات أكبر من العينة للكشف عن الطفرة8. إذا كانت العينة متوفرة، يمكن استخراج أكثر من 1 مل من البلازما لإنتاج عائد أعلى من الحمض النووي. ومع ذلك، في حالة مرضى الأطفال، من المهم تقليل كمية الدم المستخدمة كلما كان ذلك ممكنا، كما حتى إجراء بسيط مثل سحب الدم هو fatiguing لمرضى الأطفال الذين يعانون من السرطان الذين يخضعون للعلاجات الإشعاعية. استخراج من aliquots 1 مل من البلازما أيضا تمكن تكرار عمليات الاستخراج، بحيث يمكن تكرار الفحص (على سبيل المثال، في حالات الفشل في استخراج الحمض النووي أو تلوث العينة).
في محاولة للحد من أي استخدام العينة التي ليست ضرورية تماما، لا يتم تحديد cfDNA عادة. ومع ذلك، وجدنا مجموعة من تركيزات cfDNA بين 0.2-2 نانوغرام/ميكرولتر و 0.6-13 نانوغرام/ميكرولتر في البلازما وCSF، على التوالي. وبالنظر إلى انخفاض كمية cfDNA، وحقيقة أن الأليلات متحولة محددة الورم موجودة على وتيرة منخفضة، خطوة ما قبل التضخيم باستخدام نفس المجموعة من التمهيديات المستخدمة لdPCR ضروري لزيادة كبيرة في كمية الحمض النووي المستهدف في العينة، والمساعدة في الكشف عن الطفرة8. تخفيف المنتج قبل تضخيمها في المخزن المؤقت تعليق الحمض النووي يوفر حجم كاف لتكرار التقنية، مما يساعد في التمييز بين الإيجابيات الحقيقية. لأن عدد قطرات متحولة يمكن أن تكون منخفضة (على سبيل المثال، بين 0-2 قطرات متحولة في عينة البلازما)، وإدراج تكرار التقنية هو المفتاح لحل حالة الطفرة. في حين أن بئر PCR واحد قد تسفر عن 0 قطرات متحولة, اثنين آخرين قد تسفر 1-2 لعينة بلازما واحدة تحليلها في ثلاثة أضعاف; وبالتالي، فإن إدراج تكرار يسمح لمزيد من الدقة عند تحديد حالة الطفرة. ثم يتم حساب MAF كمتوسط قيم النسخ المتماثل.
يزيد التضخيم المتعدد (النوع البري المتضخم المسبق والأليلات المتحولة من اثنين من الطفرات ذات الاهتمام) فائدة عينة واحدة، حيث يمكن استخدام نفس مادة البداية لاختبار اثنين من الطفرات. الأهم من ذلك، يمكن تحليل منتج preamplification متعددة في singleplex أثناء dPCR لمزيد من البساطة، كما هو موضح هنا. ومع ذلك، قد يتم مضاعفة كل من PCR preamplification و dPCR. عند تعدد الإرسال، يجب تحسين الظروف لكل من مجموعات من التمهيديات وتحقيقات: يجب أن تكون درجات حرارة الصلب التمهيدي مماثلة لتشغيل معا في تضخيم PCR، وينبغي أن تصمم تحقيقات لتوليد مجموعات متميزة (على أساس إشارة الفلورسنت و كثافة). عند التحقق من صحة مجموعة جديدة من التمهيديات وتحقيقات، تشغيل تدرج درجة حرارة الصلب لتحديد درجة الحرارة الصلب الأمثل على أساس النطاق الذي اقترحته الشركة المصنعة. قبل اختبار تحقيقات على عينات cfDNA المريض، والتحقق من صحة لهم باستخدام بنيات الحمض النووي الاصطناعية و / أو أنسجة الورم gDNA من مدخلات مختلفة (أي، ما يصل إلى 10 نانوغرام).
للكشف عن الأليلات متحولة مع مزيد من الخصوصية وتقليل عدم التطابق في تهجين التحقيق إلى الحمض النووي المستهدف، وتستخدم تحقيقات حمض نووي مؤمن (LNA). LNA هو التناظرية حمض نووي مع جسر الميثيلين ربط 2 '-الأكسجين و 4 '-الكربون من حلقة الريبوز9. جسر الميثيلين يقفل حمض النوى في مطابقة صلبة للبيجيك الذي يقيد المرونة، ويزيد من الاستقرار الحراري المزدوج، ويحسن خصوصية التهجين التحقيق لاستهداف الحمض النووي10،18، 19.إذا كان هناك عدم تطابق قاعدة واحدة بين التحقيق LNA والحمض النووي قالب، وتشكيل دوبلكس بين التحقيق والهدف سوف يزعزع الاستقرار. على هذا النحو، تحقيقات LNA تحسين خصوصية الربط التحقيق وتسفر عن نسبة أعلى إشارة إلى الضوضاء11. وقد أثبت تحليل البلازما وCSF من مرضى الأطفال غير المصابين بالجهاز العصبي المركزي خصوصية اختبارنا مع تحقيقات LNA التي تستهدف H3F3A p.K27M، لتحديد أن التردد الالي يساوي أو أقل من 0.001٪ يعتبر إيجابي كاذبة 8.لاعتبارات إضافية لتحسين تصميم تحقيقات والتمهيديات، بما في ذلك محتوى GC، حجم amplicon، الأصباغ مراسل التحقيق، وquenchers، والرجوع إلى المبادئ التوجيهية للشركة المصنعة dPCR14،17. على الرغم من أن أسلوبنا هو الأمثل للاستخدام مع نظام RainDance، قد يتم تكييف البروتوكول للاستخدام مع منصات dPCR الأخرى.
الطريقة المعروضة هنا تستمد قوتها من الحساسية العالية وإثراء الهدف الذي حققته dPCR، والتي لا تزال منصة الاختيار للكشف عن طفرات الورم النادرة في cfDNA. على الرغم من قوة، dPCR محدودة في عدد الطفرات التي يمكن اختبارها في اختبار واحد. بديل لdPCR هو تسلسل الجيل القادم (NGS)، والتي قد تكشف عن طفرات متعددة عبر العديد من الجينات، مما يزيد من فائدة عينة واحدة. NGS يمكن الكشف عن الطفرات في CSF والبلازما من المرضى الذين يعانون من الأورام الدبقية جذع الدماغ20، ومع ذلك ، هو حاليا أقل حساسية من dPCR في الكشف عن طفرات الورم في cfDNA ، مع حدود الكشف من 0.1-10٪ MAF مقارنة مع 0.001٪ في النهج المستندة إلى PCR21 . كما يحقق dPCR وقت تحول أسرع من NGS، مما يتيح الكشف السريع عن الطفرات ذات الاهتمام. نهج PCR ينطبق على أنواع السرطان ويمكن توسيعه للكشف عن الطفرات الساخنة وميثيلات cfDNA22.
الخزعة السائلة هي في الواقع في مهدها، وسوف تتطلب المزيد من التطوير لتكييفها مع أمراض محددة. وسيكون رصد الورم في سياق تطور الورم هو التحدي التالي، حيث يلزم وجود منصة قادرة على الكشف عن الطفرات الناشئة ذات الحساسية العالية. بالإضافة إلى ذلك، فإن منصات قادرة على الكشف عن مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية (الببتيدات، السيتوكينات، RNA) ستكون مفيدة للغاية في تقييم استجابة الورم للعلاج، فضلا عن النهوض بالتدخلات السريرية الشخصية.
Disclosures
تم تضمين الطريقة الموضحة في هذه المخطوطة في طلب براءة اختراع دولي "طرق الكشف عن العلامات الحيوية للسرطان" من قبل جواد نازاريان وإيشيني بانديثاراتنا.
Acknowledgments
ويود أصحاب البلاغ أن يعترفوا بسخاء جميع المرضى وأسرهم. وقد تم دعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة الجوز المحطمة (ميدلبورغ، فيرجينيا)، ومؤسسة V (أتلانتا، جورجيا)، ومركز غابرييلا ميلر للأطفال أول موارد البيانات، ومعهد العلوم السريرية والترجمة في الوطنية للأطفال ( 5UL1TR001876-03)، مؤسسة موسيلا (هيوليت، نيويورك)، مؤسسة ماثيو لارسون (فرانكلين ليك، نيو جيرسي)، مؤسسة ليلابين لبحوث سرطان الدماغ لدى الأطفال (سيلفر سبرينغ، MD)، مؤسسة أورام الدماغ في مرحلة الطفولة (جيرمانتاون، MD)، ودماغ الأطفال اتحاد أنسجة الأورام (فيلادلفيا، بنسلفانيا)، ومؤسسة التجمع لبحوث سرطان الطفولة (أتلانتا، جورجيا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2 mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
- Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19 (4), iv21 (2017).
- Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19 (4), iv14 (2017).
- Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20 (2), i64 (2018).
- Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951 (2017).
- Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).
- Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81 (2012).
- Qiagen. QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. , 1090257 (2013).
- Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Assay Guidelines. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Analyst II Operator's Manual. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).
- Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617 (2017).
- Biorad. Droplet Digital PCR Applications Guide. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).
- Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).
- Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. , (2018).
- Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).
