Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לזהות מוטציות סומניות הגידול במחזור ה-DNA הנוכחי נוזלים ביולוגיים החולה (ביולואידים). שלנו droplet דיגיטלי פולימראז תגובת שרשרת (dPCR) שיטה מבוססת מאפשר כימות של מוטציה allelic תדירות הגידול (MAF), הקלה מינימלית פולשנית משלים אבחון וניטור זמני של תגובת הגידול.
Abstract
סיבוכים הקשורים מראש ולחזור דגימת רקמה כירורגית להציג את הצורך פלטפורמות פולשני מינימלית מסוגל תת סיווג מולקולרי ניטור הזמני של תגובת הגידול לטיפול. כאן, אנו מתארים שיטה מבוססת dPCR שלנו לאיתור מוטציות הגידול הסומטית ב-DNA התא ללא תשלום (cfDNA), זמין בתוך ביולואידים החולה. למרות שהוא מוגבל במספר המוטציות שניתן לבדוק בכל אחת מהשיטות, שיטה זו מספקת רמה גבוהה של רגישות וספציפיות. ניטור של שפע מוטציה, כפי שמחושב על ידי MAF, מאפשר הערכה של תגובת הגידול לטיפול, ובכך לספק תוספת הרבה צורך הדמיה רדיוגרפית.
Introduction
בשל מגבלות הזמינות של רקמת הגידול עבור ניתוחים מולקולריים, יש צורך בפיתוח שיטות רגישות מאוד מסוגל לזהות מוטציות גופניות של הגידול ב-ביולואידים של המטופל, כולל פלזמה, סרום ונוזל שדרתי (שדרתי) . לדוגמה, ילדים לפזר את קו האמצע gliomas (DMGs) להציג אתגר בשל מיקום נוירואנטומי שלהם. במהלך העשור האחרון, פרופיל מולקולרי של דגימות DMG רקמה חשפה מוטציות הנהג בסוג זה הגידול1 וחשף טרוגניות המרחבי הזמני של מוטציות, עושה ביופסיה הכרחי לאפיון החולה בתוך מחלה קבוצה וקידום טיפולים ממוקדים בעלי מטרה2. ככזה, ניסויים קליניים הפרקליטות על שילוב ביופסיות כירורגית ליצירת פרופיל מולקולרי הגידול באבחון מראש3,4,5,6. במהלך הטיפול, ניטור של התגובה הטיפולית DMGs מוגבל ל-MRI, אשר חסרה רגישות לזהות שינויים קטנים או האבולוציה גנומית הגידול. MRI הוא גם נוטה לזהות פסבדו אקראי, דלקת ארעית באתר של הגידול כי מחקה התקדמות אמיתית על הדמיה והוא עלול ליידע את הפרשנות של תגובת הגידול7. Thus, DMGs מייצגים סוג הגידול עם צורך גבוה חלופה, מינימלית פולשנית אמצעי זיהוי מוטציות הגידול וניטור התגובה הקלינית. על מנת לטפל בצרכים אלה, פיתחנו ואופטימיזציה של פרוטוקול לגילוי, ו לכמת את התדר הallelic של, מוטציות הגידול cfDNA מ פלזמה, סרום ו שדרתי של ילדים עם קו האמצע gliomas8. בהתחשב בעובדה DMGs הילדות לעתים קרובות (> 80%) הנמל מוטציה ליזין הסומטית למתיונין במיקום 27 של היסטון variant h 3.1 (h 3.1 k27m, 20% מהמקרים) או h 3.3 (h 3.3 k27m, 60% מהמקרים)1, אלה ומוטציות אחרות אופייני dmgs (כלומר, ACVR1, PIK3R1) המיועדים ל כימות המוטציות באמצעות cfDNA8. ניתן להתאים את השיטה לזיהוי מוטציות של נקודות מגע בסוגי גידולים אחרים בעזרת התחל והבדיקות הספציפיות לרצף. צדדיות של גישה זו הופך אותו לישימה מגוון של סרטן אשר יהנה שילוב של כלים אבחון cfDNA מבוססי ניטור טיפולית.
כדי לזהות ברגישות מוטציות allelic תדירות נמוכה ב cfDNA, אנו מעסיקים גישה דיגיטלית droplet (dPCR) מבוסס על גישת. בשיטה זו, תערובת התגובה של ה-PCR מחולקת באופן תיאורטי למקסימום של 10,000,000 טיפות באמצעות פלטפורמת dPCR (למשל, RainDance), עם 7-9 מיליון טיפות לכל PCR היטב בדרך כלל לראות ניסויים. בשל רמת גבוהה של לחיצה לדוגמה, ביותר רק אחד לשתי מולקולות DNA יכול להיות נוכח כל droplet. ה-PCR הגברה והכלאה של בדיקה פלואורסצנטית ספציפיים יכול להתרחש בכל droplet, כגון מיליוני תגובות מתרחשים. זה מגדיל את הרגישות ומאפשר זיהוי של אלולים נדירים מוטציות, אשר עשוי אחרת ללכת מבלי שיבחינו כנגד רקע של דנ א מסוג wildtype הניצול של חומצה גרעין נעולה (lna) רגשים מגביר את הספציפיות של השינוי על ידי הגבלת הכלאה של חוסר התאמה ותמיכה זיהוי מוטציה מדויקת9,10,11. כאן, אנו מתארים את שיטות העיבוד שלנו לדוגמה, חילוץ cfDNA, הגברה מראש של אלטלס היעד, dPCR וניתוח נתונים.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי מועצת הסקירה המוסדית של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו (סן פרנסיסקו, CA; IRB14-13895) ומערכת הבריאות הלאומית לילדים (וושינגטון הבירה; IRB1339). דגימות נאספו ולמדו לאחר קבלת הסכמה מושכלת של המטופל או אפוטרופוס של המטופל.
1. מטופלים בהסכמה תחת פרוטוקול IRB לאיסוף ואחסנה של דגימות ביולוגיות
-
לאסוף דגימות החולה לאחר בכתב הסכמה מושכלת מתקבל מכל מטופל, או אפוטרופוס של המטופל, להשתתפות בניסוי קליני או עבור biorepository כפי שאושרו על ידי הלוח המוסדי סקירה מוסדית.
- מטופלים כלולים במחקר זה אובחנו עם גידול במוח רדיוגרפית. לא נעשה שימוש בקריטריוני אי-הכללה. דגימות נאספו ולמדו לאחר קבלת הסכמה מושכלת של המטופל או אפוטרופוס של המטופל.
2. איסוף דם והפרדה של פלזמה או סרום
- לאסוף את דגימת הדם באמצעות 10.0 mL לצייר לתוך צינורות איסוף דם. אם איסוף דם עבור פלזמה, השתמש K2-או k3-edta צינורות, הפארין או בדיקת דם cfdna צינורות. במקרה של איסוף דם לנסיוב, השתמשו בצינורות המחסום ג'ל המכילים את קריש הדם הactivator והג'ל לסרום נפרד.
הערה: בעוד 10 מ"ל מומלץ לאפשר שכפול ניסויים, מינימום של 3 מ ל יספיק. - בזהירות להפוך את צינור הגבייה 10 פעמים כדי לערבב את דגימת הדם עם ריאגנטים הקולקציה האוסף.
- הניחו את דגימות הדם שממנה ייאספו הנסיוב בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות כדי לאפשר לדם להיקריש. אם לעבד דם כדי להשיג פלזמה, להמשיך מיד לשלב 2.4.
הערה: דגימות המעובדים עבור פלזמה ניתן לשמור על הקרח עבור מקסימום 2 h לפני צנטריפוגה. עם זאת, מעבר מהיר מן הדם לצייר לעיבוד ממזער השפלה cfDNA. - אוסף צנטריפוגה דם צינורות ב 2,000 x g עבור 15 דקות בצנטריפוגה להגדיר 4 ° צ' כדי להפריד פלזמה או סרום מן לבן ואדום שכבות תא דם.
- הטיפול לא להפריע שכבת התאים הלבנים דם (אשר יוצר קו דק בין שכבת הפלזמה/סרום העליון והשכבה התחתונה של כדוריות דם אדומות), פיפטה השכבה העליונה של פלזמה/סרום (אשר עשוי להיות ברור, צהוב, או ורוד בצבע) באופן שווה 1 mL הסוכר לקריובקבוקונים. ברגים מעוקרים של פוליפרופילן
- הקלט את מספר זיהוי הנושא, סוג הדגימה (פלזמה או סרום) ותאריך איסוף בתווית של הקריובקבוקונים.
- חנות קריובקבוקונים ב-80 ° c מקפיא עד השימוש. אם a-80 מקפיא ° c לא זמין, לאחסן את הדגימות ב-20 ° c עבור עד שבוע אחד.
3. איסוף ועיבוד שדרתי
- לאסוף שדרתי מפני הדלף, ניקוב המותניים, או ניתוח.
הערה: הליכים כאלה צריכים להתבצע רק אם הם הכרחיים על ידי מטפלים. דוגמה נוספת מעבר לכך אשר הכרחי לשימוש קליני עשוי לשמש למטרות מחקר. - למדוד את הנפח של שדרתי שנאסף ולשים לב לצבע שלה (מדמם, צהוב, ברור).
- צנטריפוגה את צינור האוסף ב 10,000 x g עבור 10 דקות ב 4 ° צ' כדי לצנפה את הפסולת התאית.
- באופן שווה ב-500 Μi. לתוך כובעי בורג מפוליפרופילן
- הקלט את מספר הזיהוי של הנושא, סוג הדגימה והתאריך של אוסף הדגימות על התווית של הקריובקבוקונים. חנות at-80 ° צ' עד השימוש.
4. הוצאת cfDNA מדגימות נוזל
- בצע את פרוטוקול החילוץ cfDNA לפי ההוראות של ערכת החילוץ cfDNA מדריך12.
- נקו את מרחב הספסל וציוד עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול.
הערה: שימוש במכסה ה-PCR, שינוי רגיל של כפפות וטיהור תכופים של מרחב הספסל וציוד עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול במהלך כל השלבים של הפרוטוקול חשוב כדי למנוע זיהום לדוגמה. - הכינו מאגרים של ריאגנטים, למשל, לשטוף את המאגרים, מערכת החילוץ כדי למנוע זיהום צולב.
- נקו את מרחב הספסל וציוד עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול.
- הפשרת דגימות מטופלים על קרח. לפני תחילת החילוץ עבור פלזמה/סרום, הפשרת 1 מ ל של דגימה. עבור השדרתי, הפשרת 500 μl סדרת מחלקים של דגימה.
הערה: צעדי ליזיס (4.5-4.8) של פרוטוקול החילוץ שונים בין פלזמה/סרום לבין שדרתי, אך משלב 4.9 ואילך, הפרוטוקול זהה לשני סוגי היולואידים. - הגדר בלוק חימום ל 60 ° c לשימוש במהלך שלב הפירוק (4.6).
- הכן את מאגר הליזה ואת תערובת RNA המוביל בצינור 15 מ ל על ידי הוספת 5.6 μL של הספק RNA ו 0.9 mL של מאגר הליזה לכל מדגם12.
- עבור פלזמה/סרום, להוסיף 100 μL פרוטטינוז K, 1 מ ל לדוגמה, ו 0.8 mL של לוליזיס מאגר/המנשא RNA תערובת הכין בשלב 4.4 ל שפופרת בעלת תווית 2.0 mL. מערבבים על ידי מפולס וורטקנג עבור 30 s במהירות גבוהה12.
- עבור שפופרת שדרתי, להוסיף 125 μL פרוטטינואז K, 500 μL של המדגם, 1 מ ל של הספק מאגר/מנשא RNA תערובת, ו 250 μL לפירוק רקמות מאגר לצינור מדגם 2.0 mL. הביאי את הנפח המלא עד 2 מ ל על-ידי הוספת 125 μL של תמיסת מלח באגירה של 1 x פוספט (PBS). מערבבים על ידי מפולס וורטקנג עבור 30 s במהירות גבוהה12.
- הדגימות של הדגירה במשך 30 דקות ב 60 ° c בגוש החימום12.
- הסירו דגימות מבלוק החימום והורידו את הטמפרטורה ל-56 ° c. החזר דגימות אל הספסל והעבר את הליפוסט לתוך שפופרות חדשות של 15 מ"ל.
- עבור פלזמה/סרום, להוסיף 1.8 mL של חומצות גרעין מחייב bufferand לערבב עבור 30 s על ידי הדופק vortexing12.
- עבור שדרתי, להוסיף 3.6 mL של חומצות גרעין מאגר כריכה ומערבבים עבור 30 s על ידי הדופק vortexing12.
- מודקון דגימות עבור 5 דקות על קרח12.
- הכנס את העמודה לתוך מחבר הוואקום. פתח את העמודה והכנס מאריך שפופרת של 20 מ ל לעמודה12.
- פיפטה את התוכן של 15 מ"ל שפופרת ישירות לתוך החלק התחתון של המרחיב הצינור, הימנעות משאירים טיפות על קירות הרחבה הצינור.
- כאשר המתג של מחבר הוואקום סגור, הפעל את משאבת הוואקום. לאחר הלחץ בנוי 900 mbar, לפתוח את שסתום של מחבר ואקום. המדגם יזרום כעת דרך העמודה.
- לאחר כל lysate כבר רוקן מתוך העמודה, לכבות את המשאבה ולפתוח את דלת הסתרים למחבר ואקום, להקל על הלחץ הדרגתי. לאחר הלחץ מגיע 0 mbar, לסגור את שסתום של מחבר ואקום ואת דלת הסתרים.
- הסר את מאריך השפופרת של 20 מ"ל, היזהר שלא להעביר את המרחיב של עמודה אחת מעל טור שכן, שכן זה יכול לזהם דגימות מוצלבות. היפטר מextender הצינורית.
- הוסף 600 μL של מאגר הכביסה הראשון לעמודה12.
- השאירו מכסים של צינורות לפתוח ולהדליק את משאבת ואקום. תן את מד הלחץ להגיע 900 mbar, ואז להפעיל את המתג על מחבר ואקום למצב פתוח כדי לצייר את המאגר לשטוף דרך הטור.
- כבה את משאבת ואקום, לפתוח את דלת הסתרים כדי לשחרר לחץ, ולהקל את הלחץ על 0 mbar. הפעל שסתום של מחבר ואקום למצב סגור.
- הוסף 750 μL של מאגר הכביסה השניה לעמודה וחזור על שלבים 4.16-4.1712.
- הוסף 750 μL של אתנול כיתה MB לעמודה וחזור על שלבים 4.16-4.1712.
- סגור את המכסה של העמודה ומלא את העמודה בתוך שפופרת אוסף חדש של 2.0 mL. היפטר ממחבר ואקום12.
- צנטריפוגה את הצינור עם העמודה ב 20,000 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר12.
- הצב את העמודה לתוך צינור אוסף חדש ופתח את מכסה השפופרת. מניחים רקמת מעבדה מעל החלק העליון ו-הדגירה ב 56 ° c עבור 10 דקות12.
- מניחים את העמודה לתוך נקי 1.5 mL PCR-ניקוי צינור ופיפטה 100 μL של מאגר הימנעות (או ביולוגיה מולקולרית כיתה H 2 o (MB H2)) ישירות לתוך מרכז הטור. אל תגעו בטור בעזרת עצת פיפטה. סגרו את המכסה ועזבו בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
- צנטריפוגה ב 20,000 x g בטמפרטורת החדר עבור 1 דקות עד Elute cfdna12.
- הפיפטה בחזרה לתוך הטור והדגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
- חזור על הצנטריפוגה במהירות מלאה במשך 1 דקות עד לשעה שנייה כדי להגדיל את התשואה (לפי המלצת היצרן).
- חנות cfDNA בתווית DNase/RNase חינם PCR-clean צינורות ב 4 ° צ' או להמשיך ישירות לשלב 5.
5. ריכוז ואקום של cfDNA
- להוסיף ולאזן את הצינורות המכילים cfDNA מחזיקי בתוך מרכז ואקום. פתח את העפעפיים של הצינורות. הגדר את טמפרטורת מרכז הוואקום ל -23 ° c.
-
, תדליק את מרכז הוואקום. ואז תדליק את מלכודת האדים דגימות צנטריפוגה עבור 40 דקות או עד כמות אחרונה של 10.5-11 μL מתמלאת.
- אם אמצעי האחסון הוא מתחת 10.5 μL, להוסיף מאגר ההשעיה DNA או MB H2O כדי להגיע לנפח הסופי של 10.5 μl.
- מנקז את הנפח המלא לאורך קירות הצינור כדי להסיר חלקי DNA שיורית.
- בקצרה צנטריפוגה את הדגימות על צנטריפוגה שולחן לאסוף טיפות על קירות הצינורות.
- המשך ישירות לשלב הקדם-הגברה (שלב 8) או לאחסון דגימות ב-4 ° c.
- לעטוף מכסים של צינורות בסרט מעבדה כדי למנוע זיהום אם הם מאוחסנים לשימוש מאוחר יותר.
6. עיצוב והכנת התחל וזונדים
- עצב קדימה והפוך התחל, ומסוג wildtype בדיקה LNA מוטציה, עבור היעד (ים) של עניין. הסדר מסחרי התחל והבדיקות (עיין בלוח החומרים).
הערה: רצפים למטרות התחל והבדיקות המכוונות H3F3A p. K27M ומוטציות היעד אחרים עבור ילדים gliomas קו ביניים ניתן למצוא בטבלה המשלים 3 של Panditharatna ואח ', 20188. - , לפני שפותחים את התחל והבדיקות. מצנטריפוגה בקצרה את הצינורות הוסף את הנפח המתאים של מאגר ההשעיה של ה-DNA או MB H2O, כפי שצוין על גיליון מפרט המוצר, כדי להשעות את התחל החדש והבדיקות לריכוז של 100 μm.
- מערבולת בעדינות, פיפטה למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לערבב בקצרה צנטריפוגה התחל ובדיקה באמצעות צנטריפוגה שולחן.
- להכין 10 μM ali, של התחל והבדיקות על ידי הוספת 10 μL של 100 μM מלאי 90 μL של מאגר ההשעיה של DNA או MB H2O.
- להכין 1 μM ali, של קדימה והפוך התחל (לשמש עבור הגברה), על ידי הוספת 10 μL של 10 μM פריימר כדי 90 μL של מאגר ההשעיה של DNA או MB H2O.
- החנות התחל והגששים ב -4 ° c במיכלים הדוקים באוויר. לעטוף סרט מעבדה סביב כיסוי כדי למנוע זיהום, ולכסות בדיקות ברדיד אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור. אחסן בדיקה ב-20 ° c עבור אחסון ארוך טווח אם הם לא נמצאים בשימוש קבוע.
7. בחירת פקדים חיוביים
-
בחירת רקמת הגידול גנומית DNA (gDNA) מדגם (עם) עם ריכוז דנ א ידוע, אשר הנמלים את מוטציה של עניין בתדר allelic ידוע לשמש כשליטה חיובית.
- השתמש 0.025 ng של שליטה חיובית רקמות הגידול DNA בשלב הגברה (שלב 8).
הערה: קלט ה-DNA זה מספק אות חיובית חזקה על dPCR (כפי שנקבע על ידי ביצוע דיעות סדרתיות של רקמת הגידול gDNA מחסה H3F3A p. K27M מוטציה8) תוך צמצום כמות המדגם הנדרש.
- השתמש 0.025 ng של שליטה חיובית רקמות הגידול DNA בשלב הגברה (שלב 8).
8. הגברה מראש של אלטלס היעד
הערה: פרוטוקול קדם הגברה הוא בהתאם לג ואח ', 201613.
- נקו את מרחב הספסל וציוד עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול.
- השג 1 μM קדימה והפוך התחל, דגימות cfDNA, הפקדים חיוביים gDNA, ו-DNA פולימראז הורים לערבב, ולהגדיר על קרח.
-
לחשב את עוצמת הקול של הריאגנטים הדרוש כדי להגביר את המספר הרצוי של דגימות cfDNA ושליטה חיובית, עבור אחד בלבד או מולטיפלקס הגברה כדלקמן:
- עבור הגברה מראש של יחיד (כדי להגביר מראש את סוג ומוטציה אללים המוטציות עבור מוטציה אחת של עניין), להכין את התערובת התגובה PCR על ידי הוספת 17.5 μl של DNA פולימראז מומחה לערבב, ו 3.5 μl של קדימה והפוך התחל (100 nM) לכל מדגם13.
- עבור הגברה מראש (כדי להגביר שתי סטים של מסוג wildtype ו אללים מוטציות עבור שני המוטציות של עניין), להכין את התערובת התגובה PCR על ידי הוספת 17.5 μl של DNA פולימראז מאסטר לערבב ו 1.75 μl של כל קבוצה של קדימה והפוך התחל (50 nM) לכל מדגם . שלוש עשרה
הערה: הכינו מספיק שילוב של תגובת PCR עבור מספר הדגימות ועוד 10% תוספת לחשבון עבור כל שגיאת הליטוף.
- לחלק 24.5 μL של תערובת התגובה PCR לתוך כל טוב של 8-היטב ה-PCR רצועת הצינור13.
- לחלק 10.5 μL של דגימת DNA לתוך הבאר המתאים כדי להביא את נפח התגובה הכולל ל 35 μL13. מצנעת בעדינות את הנפח המלא למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב.
- לבצע הגברה PCR ב 98 ° צ' צלזיוס עבור 3 דקות; 9 מחזורים של 98 ° צ' עבור 10 s, ריפוי טמפרטורה עבור 3 דקות, 72 ° צ' עבור 30 s; והארכה ב 72 ° c עבור 2 דקות13.
- להעביר את הנפח המלא של מוצר מוגבר כדי לתייג DNase/RNase חינם PCR-clean צינורות ולדלל ב 140 μL TE ההשעיה של DNA מאגר (pH 8.0)13.
- עוטפים את העפעפיים של הצינורות בסרט המעבדה. אחסן את המוצר שהיה מוגבר ב-4 ° c. לשימור לטווח ארוך, חנות ב-20 ° c.
9. זיהוי וקוונפיקציה של DNA היעד באמצעות dPCR
- נקו את מרחב הספסל וציוד עם 10% אקונומיקה ו 70% אתנול.
- Set 10 μM התחל ובדיקות, מיקס מאסטר הגנוטיפים, ו-DNA דגימות על קרח. מאחסנים את השמן הייצוב של ה-droplet בטמפרטורת החדר.
- בעדינות מערבולת ובקצרה צנטריפוגה את כל הריאגנטים מלבד droplet ייצוב שמן.
- ודא שצילינדר הגז הדחוס שמחובר לכלי ה-droplet ולכלי הקוונפיקציה (טבלת חומרים) מוגדר ב-90 psi.
- הפעל את כלי הייצור הנפתח ואת המחשב עם תוכנת המכשיר. הפעל את התוכנה ולחץ על התחל אתחול.
- הפעל סומק בלחץ גבוה על כלי הפקת השחרור אם לא נעשה בו שימוש בשבוע או יותר.
- הכן את התערובת dpcr עבור 8 בארות של צינור ה-PCR ועוד 10% תוספת, על ידי הוספת 220 μl של מיקס בסיס הגנוטיפ, 8.8 μl כל אחד 10 μm מסוג wildtype ו מוטציה, 39.6 μl כל אחד 10 μm קדימה והפוך התחל, ו17.6 μl של droplet ייצוב שמן14 .
- לערבב בעדינות את התערובת dPCR על ידי ליטוף הנפח המלא למעלה ולמטה 10-20 פעמים. אין ומערבולת או צנטריפוגה לאחר השמן הייצוב droplet נוספה לתערובת התגובה.
- להשיג את ה-PCR 8-ושפופרת הסטריפ ולוותר 38 μL של התגובה dPCR התגובות ישירות לתוך החלק התחתון של כל באר14. להסיר את כל הבועות עם קצה הצנרת נקי.
הערה: הצינורות של רצועת ה-PCR כי הם נעולים או ארוזים היטב ביחד יכול לגרום לחיובים חשמליים סטטיים, גרימת ביולוגית ואות רועש בעת ניתוח נתוני dPCR. כדי למנוע את זה, להתפשט צינורות לתוך שקיות בידוד נפרד, להימנע לארוז את השקיות, ולשמור את הצינורות משפשף יחד. - הוסף 12 μL של דגימת דנ א מוגברת לבארות המתאימות של צינור ה-PCR. עבור הפקד השלילי, הוסף 12 μL של MB H2O.
הערה: לנתח דגימות cfDNA בשכפול בארות. עבור הנוזל השדרתי, לנתח לפחות בשכפול, ועבור פלזמה/סרום לנתח כל מדגם בטרילקאט. - מצנעת בעדינות את הנפח המלא למעלה ולמטה 10 פעמים כדי לערבב את תערובת התגובה עם דגימת ה-DNA.
- השיגו שבב מכשיר חדש שיוצר droplet ופיפטה את הנפח המלא מבארות 1-8 של צינור ה-PCR לתוך הערוצים המתאימים A-H בשבב. הימנע לגעת בתחתית הערוצים עם טיפ פיפטה.
- השיגו צינורית ניקוי חדשה של ה-PCR, והכניסו אותו לתוך מכשיר להפקת droplet. סרוק או הכנס באופן ידני את מזהה שבב הכלי של מכשיר ה-droplet לתוכנה במחשב המכשיר. הזן שמות עבור כל אחד משמונה הערוצים. לחץ על התחל את ההפעלה כדי להתחיל בדגימות מדרוטיזציה.
- כאשר הושלמה השלמת הדרופלטיזציה, הסירו את הצינורית מרצועת ה-PCR והחילו מכסי שפופרת.
- העבר את שפופרת הרצועה לציקלייר תרמי ואיזון עם שפופרת רצועה אחרת המכילה 80 μL של מים לכל טוב.
- לתכנת את תנאי הרכיבה התרמיים14 כ: 95 ° צ' למשך 10 דקות; 45 מחזורים של שתי טמפרטורות: 95 ° צ' עבור 30 s וטמפרטורה ריפוי עבור 2 דקות; 98 ° צ' במשך 10 דקות; ולהמתין 10 ° c.
- קבע את קצב השיפוע ל-0.5 ° צ'/ים והגדר את אמצעי האחסון לדוגמה ל-80 μL14.
- כאשר הרכיבה התרמית תושלם, הסר את צינור החשפנות והעבר לכלי הכמת. הסר מכסי הרצועה PCR והחלף באותיות מהירות גבוהה.
- הפעל את מכשיר הכמת ואת המחשב המחובר עם תוכנת מכשיר. הפעל את תוכנת המכשיר ולחץ על הגדרת הפעלה.
- הניחו את צינור החשפנות לתוך מכשיר הכמת.
- השג שבב מכשיר חדש ולסרוק או להזין באופן ידני את מזהה שבב לתוך הכלי. . הכנס את השבב לתוך המכונה
- הנח את מגן המתכת על גבי השבב וסגור את המכסה של המכשיר.
- בתוכנת המחשב, הזן שם עבור הפעלת dPCR ועבור כל אחד מבין 8 הערוצים (A-H). בחרו ' מצב מהיר ' (שיש להשתמש בו עם כמוסות במהירות גבוהה) ולחצו על ' התחל ' כדי להתחיל בכמת.
- כאשר הכמת הושלמה, להסיר את מגן מתכת (כדי להינצל ולעשות שימוש חוזר) ולהיפטר שפופרת הסטריפ ושבב ה-PCR. במחשב המכשיר, יומן ההפעלה יכיל קבצי תוצאה עבור כל הפעלה. השתמש בקבצי. fcs עבור כל דוגמה כדי לנתח עם תוכנת האנליסט.
10. ניתוח נתונים
- הפעל את תוכנת האנליסט ופתח את קבצי ה-. fcs כדי לנתח נתונים ספקטרלי גולמיים. תחת תצוגת ניתוח, בחר בללא שינוי. תחת תצוגת דוגמה, לחץ על התיבות שליד כל אחת מ-8 הדגימות כך שיהיה סימן ביקורת בכל תיבה. התוכנה יהיה להתוות אותות עבור המוטציות (משפחה) ו-wildtype (HEX) לאורך x ו-y צירים, בהתאמה.
- השתמש בפונקציית המטריצה המחושבת כדי להחיל על הפיצוי הספקטרלי על טיפות שלמות, לפי הוראות היצרן15.
- כוונן את הגדרות הציר תחת אפשרויות ציר. הגדר את ציר ה-x למינימום של 0 ומקסימום של 30,000, ואת ציר ה-y למינימום של 5,000 ומקסימום של 10,000. כשאותרו אשכולות droplet, התאימו את הצירים כדי להקטין את השטח הריק בגרף.
הערה: המיקום של אשכולות המוטציות ומסוג מוטציה יהיה תלוי בבדיקות בשימוש, fluorophore ואת הריכוז שלהם. - בחר את המדגם המתאים רקמת הגידול בשליטה חיובית gDNA להגדיר את שלילי (האשכול הקרוב ביותר למקור), המוטציות (האשכול הקרוב ביותר לציר x), ו-wildtype (אשכול הקרוב ביותר לציר y) שערים. ודא שהאשכולות נבדלים ומזוהים בקלות בתוך שיטת מוצלחת.
- החל את הגדרות השער עבור הפקד החיובי על כל הדגימות על-ידי לחיצה ימנית על דגימת הבקרה החיובית ולחיצה על האפשרות כדי להחיל את כל ההגדרות על דגימות נבחרות.
- תחת התצוגה הגרפית, לחץ על כרטיסיית דוגמאות מרובות כדי להציג מגרשים עבור כל הדגימות שנבחרו. יצא את התמונה כ-. טיף קובץ.
- תחת הכרטיסיה סביבת עבודה בקצה השמאלי העליון של המסך, בחר באפשרות ' ניתוח ייצוא ' (csv) ושמור את קובץ הנתונים שנותח כקובץ csv.
- פתח את קובץ ה-. csv בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי להציג שלילי, מסוג wildtype וספירות מוטציה של מוטציות עבור כל דוגמה. חישוב ה-MAF על-ידי חלוקת מונה ה-droplet של מוטציה מתוקנת של פואסון על-ידי סכום הספירות של מוטציה מתוקנת בתוספת מסוג droplet עבור כל דוגמה.
הערה: השתמש בספירה המתוקנת של הפואסון מכיוון שחשבון הסטטיסטיקה של פואסון עשוי להכיל יותר מעותק אחד של ה-DNA המשמש כיעד, ולכן סיכום הטיפות החיוביות עשוי שלא להניב ספירה מדויקת של16.
Representative Results
איור 1 מציג את תוצאות הנציג לאיתור מוצלח של H3F3A p. K27M מוטציה ב פלזמה מוגבר (הפאנל השמאלי העליון) ו שדרתי (הפאנל הימני העליון) cfdna משני ילדים עם dmg. דגימות cfDNA נותחו בשכפול, אך רק גרף מייצג אחד מוצג עבור כל סוג לדוגמה. המגרשים dPCR מציגים דור מוצלח של droplet, עם 7-9 מיליון טיפות ל-PCR היטב (רובן הן טיפות שליליות שאינן מכילות את ה-DNA של היעד). מינימום של 7,000,000 טיפות ל-PCR היטב מציין הדרוטיזציה מוצלחת, בעוד שפחות מ-7,000,000 מציינים כישלון של הטיפול, ובמקרה זה המשתמש לא צריך להמשיך בניתוח נתונים. איור 1 מציג הפרדה ברורה בין אשכולות מוטנטים ומסוג wildtype לאורך ציר x ו-y, בהתאמה. אשכולות חזקים סוג wildtype ציינים כי החילוץ cfDNA היה מוצלח כי ה-DNA תבנית קיים. אשכולות המוטציות להראות MAF של 1.60% ו 39.92% עבור דגימות פלזמה ו שדרתי, בהתאמה, הוכחת זיהוי חיובי של המוטציה. עבור חולים אלה, תוצאות dPCR בהתאם למצב מוטציה הגידול, כפי שאושרו על ידי ניתוח גנומית של רקמת גידול ביופסיה8. השליטה השלילית (בתחתית הפאנל השמאלי) מראה 0 מוטציה ו -0 טיפות ומסוג, המציין כי לא היה זיהום של תערובת התגובה PCR. שליטה חיובית רקמות הגידול gDNA (התחתון הפאנל הימני) מראה את המוטציה להתגלות בתדר allelic צפוי עבור דגימת גידול מסוים נבחר.
באיור 2, תוצאות הנציג מוצגים עבור זיהוי מוצלח של מוטציה של עניין, H3F3A p. K27M, ב-cfdna פלזמה מילד עם dmg. מצב המוטציה אושר על ידי ניתוח גנומית של רקמת הגידול8. תוצאות הנציגים משני בארות ה-PCR מוצגות (לוחות מובילים). המספר הכולל של טיפות, כולל טיפות שליליות, הוא בין 7-9 מיליון לכל PCR היטב, המציין dropletization מוצלחת. אשכולות מסוג wildtype המותוות לאורך ציר y, להראות כ 7-8000 ווילסוג טיפות לכל PCR היטב עבור cfDNA פלזמה, המציין החילוץ cfDNA מוצלחת (כמו יש היעד wildtype DNA במדגם). עם זאת, 0 טיפות מוטציה מזוהות בדגימת פלזמה. החלונית השמאלית התחתונה מראה שליטה שלילית (MB H2O) ללא מסוג wildtype טיפות מוטציה; ואת הפאנל הימני התחתון מציג את השליטה החיובית רקמת הגידול מוגבר gDNA (0.025 ng) עם זיהוי מוטציה חיובית. כפי שמוצג באיור זה, היעדר זיהוי מוטציה בפלסמה עשוי לא בהכרח אומר המטופל הוא מסוג wildtype עבור מוטציה של עניין, כמו שליליות שווא מתרחשים8. במקרים מסוימים, כאשר המוטציה הוא החמיץ פלזמה שנאסף בביופסיה מראש, הוא זוהה פלזמה המתקבל מאותו החולה בשלב מאוחר יותר8.
איור 1 : זיהוי מוצלח של H3F3A p. K27M המוטציה פלזמה מוגבר ושדרתי cfDNA מילדים עם מסלול gliomas. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : תוצאות שליליות כוזבות שהתקבלו מניתוח של דגימת פלזמה מוגברת מחולה הידוע הנמל מוטציה של עניין, H3F3A . פ. K27M, בגידול אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
כאן יש לנו הציג את השיטה שלנו לגילוי ולכמת את תדירות allelic של מוטציות גידול cfDNA מתוך ביופסיה נוזלי החולה. אנו מדגישים את הצעדים הקריטיים להצלחת השיטה, כולל עיבוד לדוגמה טרום ניתוח, חילוץ cfDNA, עיצוב שיטת ה-PCR וניתוח נתונים. כדי להגביל את נפח המדגם בשימוש, cfDNA מופק 1 מ ל של פלזמה, אבל רק 500 μL של שדרתי. כאשר מחלץ מ-שדרתי, את הפרוטוקול לחילוץ מ 1 מ ל של שתן (בעקבות מדריך cfDNA ערכת החילוץ12) משמש, לפי ההמלצה של היצרן. ההבדל בנפח המדגם הנדרש בין פלזמה ו שדרתי היא בשל רמות נמוכות יותר של הגידול cfDNA מסוים פלזמה לעומת שדרתי של חולים עם גידולים במוח, המחייב הפחתת כרכים לדוגמה גדול יותר עבור זיהוי מוטציה8. אם המדגם זמין, יותר מ-1 מ ל פלזמה ניתן לחלץ כדי לייצר תשואה DNA גבוה יותר. עם זאת, במקרה של חולים ילדים, חשוב למזער את כמות הדם המשמש כאשר הדבר אפשרי, כמו גם הליך פשוט כגון דם לצייר היא מעייפת לחולים ילדים עם סרטן שעברו טיפולים הקרינה. חילוץ מ-1 מ"ל הפחת של פלזמה גם מאפשר שכפול עקירת, כך ניתן לחזור על האפשרות (למשל, במקרים של כישלון בחילוץ DNA או זיהום מדגם).
במאמץ להפחית כל שימוש לדוגמה שאינו הכרחי לחלוטין, cfDNA הוא בדרך כלל לא כימות. עם זאת, מצאנו מגוון של ריכוזי cfDNA בין 0.2-2 ng/μL ו-0.6-13 ng/μL ב פלזמה ו שדרתי, בהתאמה. בהינתן כמות נמוכה של cfdna, ואת העובדה אללים מוטנטים ספציפיים הגידול נמצאים בתדר נמוך, צעד מראש הגברה באמצעות אותה קבוצה של התחל המשמש dpcr הוא הכרחי כדי להגדיל באופן משמעותי את כמות ה-DNA היעד במדגם, לסייע ב זיהוי מוטציה8. דילול המוצר pre-מוגבר במאגר ההשעיה DNA מספק נפח מספיק עבור משכפל טכני, אשר מסייע בהבחנה תוצאות חיוביות אמיתיות. כיוון שמספר טיפות המוטציות יכול להיות נמוך (לדוגמה, בין 0-2 טיפות מוטאנטים בדגימת פלזמה), הכללת השכפל הטכני היא המפתח לפתרון מצב מוטציה. בעוד אחד PCR היטב עשוי להניב 0 מוטציה טיפות, השניים האחרים עשויים להניב 1-2 עבור דגימת פלזמה אחת ניתח בטריליטה; לפיכך, הכללת המשכפלת מאפשרת דיוק רב יותר בעת קביעת מצב המוטציה. לאחר מכן, ה-MAF מחושב כממוצע של ערכי השכפול.
ריבוב מראש הגברה (הגברת מקדם מסוג wildtype ומוטציה אללים של שני מוטציות של עניין) מגביר את השירות של מדגם אחד, כמו חומר התחלתי אותו ניתן להשתמש כדי לבדוק שני מוטציות. חשוב לעשות זאת, מוצר הגברה מראש של מולטיפלקס יכול להיות מנותח בסינגפלקס במהלך dPCR למען פשטות רבה יותר, כפי שמתואר כאן. עם זאת, הגברה מראש של PCR ו-dPCR עשוי להיות מרובב. כאשר ריבוב, התנאים חייבים להיות ממוטבים עבור שתי קבוצות של התחל והבדיקות: פריימר הטמפרטורות ריפוי חייב להיות דומה לרוץ יחד ב-PCR הגברה, ובדיקה צריך להיות מתוכנן כדי ליצור אשכולות שונים (בהתבסס על אות פלורסנט ו אינטנסיביות). בעת אימות קבוצה חדשה של התחל והבדיקות, הפעל הדרגתי של טמפרטורת ריפוי כדי לקבוע את טמפרטורת הריפוי האופטימלית המבוססת על הטווח שהוצע על ידי היצרן. לפני בדיקת הבדיקות על החולה cfDNA דגימות, לאמת אותם באמצעות בנייה DNA סינתטי ו/או רקמת הגידול gDNA של תשומות שונות (כלומר, עד 10 ng).
לאיתור אללים המוטציות עם יותר ספציפיות וחוסר התאמות מופחת הכלאה של בדיקה ל-DNA היעד, נעול חומצת גרעין (lna) בדיקות משמשות. Lna היא חומצה גרעין אנלוגי עם גשר מתילן חיבור 2 '-חמצן ו-4 '-פחמן של טבעת ריבוז9. גשר מתילן נועל את חומצת הגרעין לתוך היווצרות האופניים נוקשה המגבילה גמישות, מגביר את יציבות הדופלקס התרמי, ומשפר את הספציפיות של הכלאה בדיקה למטרה DNA10,18, 19. אם קיים אי התאמה בסיסית בודדת בין ה-DNA של הבדיקה לבין התבנית, היווצרות הדופלקס בין הגשוש למטרה יגרום לחוסר יציבות. בתור כזה, בדיקה LNA לשפר את הספציפיות של כריכת הבדיקה ולגרום האות לרעש גבוה יותר לקול11. ניתוח פלזמה ושדרתי מפני חולים לא-החולה החולי ילדים הקימה את הספציפיות של הקביעה שלנו עם LNA רגשים המיקוד H3F3A p. K27M, כדי לקבוע כי תדירות allelic של שווה או פחות מ 0.001% נחשב חיובי כוזב 8. לקבלת שיקולים נוספים למיטוב העיצוב של הבדיקות והתחל, כולל התוכן GC, אמפליקון גודל, צבע עיתונאי בדיקה, ו מקדחים, מתייחסים הנחיות יצרן dpcr14,17. למרות שהשיטה שלנו היא ממוטבת לשימוש עם מערכת RainDance, הפרוטוקול עשוי להיות מותאם לשימוש עם פלטפורמות dPCR אחרים.
השיטה המוצגת כאן שואבת כוח מרוב רגישות גבוהה והעשרה היעד שהושגו על ידי dPCR, אשר נשאר פלטפורמת הבחירה לגילוי מוטציות גידול נדירות cfDNA. למרות העוצמה, dPCR מוגבל במספר מוטציות שניתן לבדוק בתוך שיטת יחיד. חלופה dPCR היא רצף הדור הבא (NGS), אשר עשוי לזהות מוטציות מרובות על פני גנים רבים, הגדלת כלי השירות של מדגם אחד. NGS יכול לזהות מוטציות ב שדרתי ופלזמה של חולים עם גזע המוח gliomas20, עם זאת, הוא כרגע פחות רגיש מאשר dpcr בזיהוי מוטציות הגידול cfdna, עם מגבלות זיהוי של 0.1-10% maf לעומת 0.001% ב-PCR מבוססי גישות21 . dPCR משיגה גם זמן טיפול מהיר יותר מאשר NGS, המאפשר זיהוי מהיר של מוטציות עניין. הגישה ה-PCR ישימה לאורך סוגי הסרטן וניתן להרחבה כדי לזהות מוטציות נקודה חמה ו-cfDNA22.
הביופסיה הנוזלית היא אכן בחיתוליו והיא תדרוש התפתחות נוספת לתפירת מחלות ספציפיות. ניטור הגידול בהקשר של האבולוציה הגידול יהיה האתגר הבא, שבו פלטפורמה מסוגל לזהות מוטציות המתעוררים עם רגישות גבוהה יהיה צורך. בנוסף, פלטפורמות המסוגלים לזהות מגוון של biomolecules (פפטידים, ציטוקינים, RNA) יהיה מועיל מאוד בהערכת תגובת הגידול לטיפול, כמו גם קידום התערבויות קליניות אישית.
Disclosures
השיטה המתוארת בכתב יד זה כלולה ביישום פטנטים בינלאומי "שיטות לגילוי ביוכי סרטן" על ידי Javad נזריאן & Eshini Panditharatna.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר בנדיבות של כל המטופלים ומשפחותיהם. עבודה זו נתמכת על ידי מימון של קרן הסמאשינג אגוזי מלך (מידבורג, VA), קרן V (אטלנטה, GA), מרכז המידע הראשון של גבריאלה מילר לילדים, המכון למדעי המחקר והפיסיקה של הילדים הלאומי ( 5UL1TR001876-03), קרן Musella (היולט, NY), קרן מתיו לארסון (פרנקלין לייק, ניו ג'רזי), קרן Lilabean לחקר סרטן המוח ילדים (בסילבר ספרינג, MD), הקרן לגידול במוח ילדות (הגרמנית, MD), מוח הילדים רקמות הגידול (פילדלפיה, PA), וקרן ראלי לחקר סרטן ילדות (אטלנטה, GA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2 mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
- Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19 (4), iv21 (2017).
- Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19 (4), iv14 (2017).
- Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20 (2), i64 (2018).
- Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951 (2017).
- Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).
- Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81 (2012).
- Qiagen. QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. , 1090257 (2013).
- Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Assay Guidelines. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Analyst II Operator's Manual. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).
- Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617 (2017).
- Biorad. Droplet Digital PCR Applications Guide. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).
- Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).
- Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. , (2018).
- Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).
