Summary
Qui presentiamo un protocollo per rilevare le mutazioni somatiche tumorali nel DNA circolante presente nei fluidi biologici dei pazienti (biofluidi). Il nostro metodo basato sulla reazione a catena della polimerasi digitale delle goccioline (dPCR) consente la quantificazione della frequenza allelica della mutazione tumorale (MAF), facilitando un complemento minimamente invasivo alla diagnosi e al monitoraggio temporale della risposta tumorale.
Abstract
Le complicanze associate al campionamento anticipato e ripetuto del tessuto chirurgico presentano la necessità di piattaforme minimamente invasive in grado di sottoclassificare molecolare e di monitorare temporale la risposta tumorale alla terapia. Qui, descriviamo il nostro metodo basato sul dPCR per la rilevazione di mutazioni somatiche tumorali nel DNA privo di cellule (cfDNA), prontamente disponibili nei biofluidi dei pazienti. Anche se limitato nel numero di mutazioni che possono essere testate in ogni analisi, questo metodo fornisce un alto livello di sensibilità e specificità. Il monitoraggio dell'abbondanza di mutazioni, calcolato dal MAF, consente la valutazione della risposta tumorale alla terapia, fornendo così un integratore tanto necessario all'imaging radiografico.
Introduction
A causa delle limitazioni nella disponibilità del tessuto tumorale per le analisi molecolari, è necessario lo sviluppo di metodi altamente sensibili in grado di rilevare mutazioni somatiche tumorali nei biofluidi dei pazienti, tra cui plasma, siero e liquido cerebrospinale (CSF) . Ad esempio, i gliomi della linea mediana diffusa pediatrica (DMG) rappresentano una sfida a causa della loro posizione neuroanatomica. Nell'ultimo decennio, la profilazione molecolare dei campioni di tessuto DMG ha scoperto mutazioni del conducente in questo tumore di tipo1 e ha rivelato l'eterogeneità spaziale e temporale delle mutazioni, rendendo necessaria la biopsia per caratterizzare un paziente all'interno di una malattia sottogruppo e promuovere terapie a tema molecolare2. Come tale, gli studi clinici sostengono l'integrazione di biopsie chirurgiche per la profilazione molecolare tumorale alla diagnosi iniziale3,4,5,6. Durante il trattamento, il monitoraggio della risposta terapeutica nei DMG è limitato alla risonanza magnetica, che manca di sensibilità per rilevare piccoli cambiamenti o evoluzione genomica tumorale. La risonanza magnetica è anche incline a rilevare la pseudoprogressione, infiammazione transitoria nel sito del tumore che imita la vera progressione sull'imaging e può disinformare l'interpretazione della risposta tumorale7. Pertanto, i DMG rappresentano un tipo di tumore con un elevato bisogno di un mezzo alternativo e minimamente invasivo per rilevare le mutazioni tumorali e monitorare la risposta clinica. Per rispondere a queste esigenze, abbiamo sviluppato e ottimizzato un protocollo per rilevare e quantificare la frequenza allelica delle mutazioni tutumorali nella cfDNA da plasma, siero e CSF di bambini con gliomi midline8. Dato che spesso i DMG infantili (>80%) presentare una mutazione somatica lisina-methionina nella posizione 27 della variante istonica H3.1 (H3.1K27M, 20% dei casi) o H3.3 (H3.3K27M, 60% dei casi)1, queste e altre mutazioni caratteristiche dei DMG (cioè, ACVR1, PIK3R1) sono state destinate a quantificazione allele mutante utilizzando cfDNA8. Questo saggio può essere adattato per rilevare mutazioni di hotspot in altri tipi di tumore utilizzando primer e sonde specifiche della sequenza. La versatilità di questo approccio lo rende applicabile a una varietà di tumori che trarrebbero vantaggio dall'integrazione di strumenti diagnostici basati su cfDNA e dal monitoraggio terapeutico.
Per rilevare in modo sensibile le mutazioni di bassa frequenza allelica nel cfDNA, impieghiamo un approccio basato su PCR digitale (dPCR) di goccioline. In questo metodo, la miscela di reazione PCR è suddivisa in un massimo teorico di 10 milioni di goccioline utilizzando la piattaforma dPCR (ad esempio, RainDance), con 7-9 milioni di goccioline per PCR ben viste sperimentalmente. A causa dell'elevato grado di partizionamento del campione, in ogni goccia possono essere presenti al massimo solo una o due molecole di DNA. L'amplificazione PCR e l'ibridazione della sonda fluorescente specifica della sequenza possono verificarsi in ogni goccia, in modo tale che si verifichino milioni di reazioni. Questo massimizza la sensibilità e consente di rilevare rari alleli mutanti, che altrimenti potrebbero passare inosservati su uno sfondo di DNA wildtype. L'utilizzo di sonde acidi nucleiche bloccate (LNA) migliora la specificità del saggio limitando l'ibridazione errata e supportando il rilevamento accurato delle mutazioni9,10,11. Qui, descriviamo i nostri metodi di elaborazione dei campioni, l'estrazione di cfDNA, la preamplificazione degli alleli bersaglio, il dPCR e l'analisi dei dati.
Protocol
Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Review Board dell'Università della California san Francisco (San Francisco, CA; IRB #14-13895) e il Children's National Health System (Washington, D.C.; #1339 IRB). Gli spettri sono stati raccolti e studiati dopo aver ottenuto il consenso informato del paziente o del tutore del paziente.
1. Pazienti consenzienti ai sensi del protocollo IRB per la raccolta e l'immagazzinamento di spettri biologici
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Raccogliere i campioni di pazienti dopo il consenso informato scritto è ottenuto da ogni paziente, o tutore del paziente, per la partecipazione a uno studio clinico o per il biorepository come approvato dal rispettivo Institutional Review Board.
- Ai pazienti inclusi in questo studio è stato diagnosticato un tumore al cervello radiograficamente. Non sono stati utilizzati criteri di esclusione. Gli spettri sono stati raccolti e studiati dopo aver ottenuto il consenso informato del paziente o del tutore del paziente.
2. Raccolta del sangue e separazione del plasma o del siero
- Raccogliere il campione di sangue utilizzando un disegno di 10.0 mL in tubi di raccolta del sangue. Se si raccolgono sangue per il plasma, utilizzare K2- o K3- tubi EDTA, eparina o cFR tubi di raccolta del sangue. Se si raccolgono sangue per il siero, utilizzare tubi gel-barrier contenenti l'attivatore del coagulo e il gel per separare il siero.
NOT: Mentre si consiglia 10 mL per abilitare gli esperimenti di replica, sarà sufficiente un minimo di 3 mL. - Invertire con attenzione il tubo di raccolta 10 volte per mescolare il campione di sangue con i reagenti del tubo di raccolta.
- Lasciare i campioni di sangue da cui verrà raccolto il siero a temperatura ambiente per 30 min per consentire al sangue di coagulare. Se si elabora il sangue per ottenere il plasma, procedere immediatamente al punto 2.4.
NOT: I campioni in lavorazione per il plasma possono essere conservati sul ghiaccio per un massimo di 2 h prima della centrifugazione. Tuttavia, una rapida transizione dal prelievo di sangue all'elaborazione riduce al minimo la degradazione cfDNA. - Centrifugare i tubi di raccolta del sangue a 2.000 x g per 15 min in una centrifuga impostata a 4 gradi centigradi per separare plasma o siero dagli strati di globuli bianchi e rossi.
- Fare attenzione a non disturbare lo strato di cellule del sangue bianco (che forma una sottile linea tra lo strato superiore di plasma / siero e lo strato inferiore di globuli rossi confezionati), pipetta lo strato superiore di plasma / siero (che può essere chiaro, giallo o rosa nel colore) ugualmente in 1 mL in sterili crioviali a vite in polipropilene.
- Registrare il numero di identificazione del soggetto, il tipo di campione (plasma o siero) e la data di raccolta sull'etichetta dei crioviali.
- Conservare i crioviali nel congelatore -80 gradi centigradi fino all'uso. Se non è disponibile un congelatore a -80 gradi centigradi, conservare i campioni a -20 gradi centigradi per un massimo di una settimana.
3. Raccolta ed elaborazione CSF
- Raccogliere CSF da uno shunt, puntura lombare, o un intervento chirurgico.
NOT: Tali procedure devono essere condotte solo se ritenute necessarie dai medici. Un campione supplementare oltre a quello necessario per l'uso clinico può essere utilizzato per scopi di ricerca. - Misurare il volume di CSF raccolto e prendere nota del suo colore (sangue, giallo, chiaro).
- Centrifugare il tubo di raccolta a 10.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per pelletare i detriti cellulari.
- Trasferire il supernatante CSF in modo pari a 500 aliquote in crioviali a vite polipropilene.
- Registrare il numero di identificazione del soggetto, il tipo di campione e la data di raccolta dei campioni sull'etichetta dei crioviali. Conservare a -80 gradi centigradi fino all'uso.
4. Estrazione di cfDNA da liquid i campioni
- Eseguire il protocollo di estrazione cfDNA secondo le istruzioni del manuale12del kit di estrazione cfDNA .
- Pulire lo spazio e l'attrezzatura del banco con il 10% di candeggina e il 70% di etanolo.
NOT: L'uso di un cappuccio PCR, il cambio regolare dei guanti e la frequente decontaminazione dello spazio del banco e delle attrezzature con il 10% di candeggina e il 70% di etanolo durante tutte le fasi del protocollo è importante per evitare la contaminazione del campione. - Preparare le aliquote dei reagenti, ad esempio i tamponi di lavaggio, dal kit di estrazione per evitare la contaminazione incrociata.
- Pulire lo spazio e l'attrezzatura del banco con il 10% di candeggina e il 70% di etanolo.
- Scongelare i campioni di pazienti sul ghiaccio prima di iniziare l'estrazione. Per plasma/siero, scongelare 1 mL di campione. Per CSF, scongelare 500 l'aliquota del campione.
NOT: I gradini di lisi (4.5-4.8) del protocollo di estrazione differiscono tra plasma/siero e CSF, ma dal punto 4.9 in poi, il protocollo è identico per entrambi i tipi di biofluidi. - Impostare un blocco di riscaldamento a 60 gradi centigradi per l'uso durante la fase di lisi (4.6).
- Preparare il tampone di lisi e la miscela di RNA portante in un tubo da 15 mL aggiungendo 5,6 l di RNA portante e 0,9 mL di tampone di lisi per ogni campione12.
- Per il plasma/sirum, aggiungere 100 proteinasi L K, 1 mL di campione e 0,8 mL di miscela di RNA tampone/portatore di lisi preparata nel passaggio 4.4 a un tubo etichettato da 2,0 mL. Mescolare mediante vortice a impulsi per 30 s ad alta velocità12.
- Per la CSF, aggiungere 125 : proteinae K, 500 L del campione, 1 mL di miscela di RNA del buffer di lisi/portatore e un buffer di lisi di tessuto di 250 luna a un tubo da 2,0 mL. Portare l'intero volume fino a 2 mL aggiungendo 125 L di 1x salina con buffer fosfato (PBS). Mescolare mediante vortice a impulsi per 30 s ad alta velocità12.
- Incubare i campioni per 30 min a 60 s nel blocco di riscaldamento12.
- Togliere i campioni dal blocco di riscaldamento e abbassare la temperatura a 56 gradi centigradi. Riportare i campioni sul banco e trasferire il lisato in nuovi tubi etichettati da 15 mL.
- Per il plasma/sirum, aggiungere 1,8 mL di tampone di legame acido nucleicoe mix per 30 s da vortice a impulsi12.
- Per CSF, aggiungere 3,6 mL di buffer di legame acido nucleico e mescolare per 30 s mediante vortice a impulsi12.
- Incubare campioni per 5 min sul ghiaccio12.
- Inserire la colonna nel connettore a vuoto. Aprire la colonna e inserire un dispositivo di estensione del tubo da 20 mL nella colonna12.
- Pipette il contenuto del tubo da 15 mL direttamente nella parte inferiore dell'estensore tubo, evitando di lasciare goccioline sulle pareti del tubo estensore.
- Con l'interruttore del connettore a vuoto chiuso, accendere la pompa a vuoto. Una volta che la pressione è stata costruita a 900 mbar, aprire la valvola del connettore a vuoto. L'esempio scorrerà ora attraverso la colonna.
- Una volta che tutto il lisato è stato drenato dalla colonna, spegnere la pompa e aprire la botola al connettore a vuoto, alleviando il gradiente di pressione. Una volta che la pressione raggiunge 0 mbar, chiudere la valvola del connettore a vuoto e la botola.
- Rimuovere l'estensione del tubo da 20 mL, facendo attenzione a non passare l'extender di una colonna su una colonna vicina, in quanto ciò può incrociare i campioni. Smaltire l'extender del tubo.
- Aggiungere 600 l del primo tampone di lavaggio alla colonna12.
- Lasciare i coperchi dei tubi aperti e accendere la pompa a vuoto. Lasciare che il misuratore di pressione raggiunga i 900 mbar, quindi accendere l'interruttore sul connettore a vuoto in posizione aperta per disegnare il buffer di lavaggio attraverso la colonna.
- Spegnere la pompa del vuoto, aprire la botola per rilasciare la pressione e alleviare la pressione a 0 mbar. Ruotare la valvola del connettore a vuoto in posizione chiusa.
- Aggiungete 750 l del secondo buffer di lavaggio alla colonna e ripetete i passaggi da 4,16 a 4,1712.
- Aggiungere 750 MB di etanolo di grado MB alla colonna e ripetere i passaggi da 4,16 a 4,1712.
- Chiudere il coperchio della colonna e posizionarla all'interno di un nuovo tubo di raccolta di 2,0 mL. Smaltire il connettore a vuoto12.
- Centrifugare il tubo con la colonna a 20.000 x g per 3 min a temperatura ambiente12.
- Posizionare la colonna in un nuovo tubo di raccolta e aprire il coperchio del tubo. Posizionare un tessuto da laboratorio sopra la parte superiore e incubare a 56 gradi centigradi per 10 min12.
- Collocare la colonna in un tubo pulito da 1,5 mL di pulitura PCR e pipette 100 -L di tampone di eluizione (o biologia molecolare di grado H2O (MB H2O)) direttamente al centro della colonna. Non toccare la colonna con una punta pipetta. Chiudere il coperchio e lasciare a temperatura ambiente per 3 min.
- Centrifuga a 20.000 x g a temperatura ambiente per 1 min per eluire cfDNA12.
- Pipette l'eluate indietro nella colonna e incubare a temperatura ambiente per 3 min.
- Ripetere la centrifugazione a tutta velocità per 1 min per eluire il cfDNA una seconda volta per aumentare la resa (come raccomandazione del produttore).
- Conservare cfDNA in tubi PCR-clean gratuiti con etichetta d'uso DNase/RNase a 4 gradi centigradi o procedere direttamente al passaggio 5.
5. Concentrazione vuoto di cfDNA
- Inserire e bilanciare i tubi contenenti cfDNA eluiti in supporti sul concentratore di vuoto. Aprire i coperchi dei tubi. Impostare la temperatura del concentratore di vuoto a 23 gradi centigradi.
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Accendere il concentratore di vuoto, quindi accendere la trappola per vapori. Centrifuga per 40 min o fino a raggiungere un volume finale di 10,5-11 l.
- Se il volume è inferiore a 10,5, aggiungere il buffer di sospensione del DNA o MB H2O per raggiungere un volume finale di 10,5 l.
- Pipette l'intero volume lungo le pareti del tubo per rimuovere i frammenti di DNA residuo.
- Centrifugare brevemente i campioni su una centrifuga da tavolo per raccogliere goccioline sulle pareti dei tubi.
- Procedere direttamente alla fase di preamplificazione (passaggio 8) o conservare i campioni a 4 gradi centigradi.
- Avvolgere i coperchi dei tubi in una pellicola da laboratorio per evitare la contaminazione se sono conservati per un uso successivo.
6. Progettazione e preparazione di Primer e Sonde
- Progettare primer in avanti e inretro, e sonde LNA selvagge e mutanti, per i bersagli di interesse. Ordina commercialmente primer e sonde liofilizzate (fare riferimento alla Tabella dei Materiali).
NOTA: Sequenze per primer e sonde rivolte h3F3A p.K27M e altre mutazioni bersaglio per glioma sferoe pediatrico sono disponibili nella Tabella supplementare 3 di Panditharatna et al., 20188. - Prima di aprire i primer e le sonde liofilizzate, centrifugare brevemente i tubi. Aggiungere il volume appropriato del buffer di sospensione del DNA o MB H2O, come indicato sul foglio di specifica del prodotto, per risospendere le primer e le sonde liofilizzate a una concentrazione di 100 M.
- Vortice dolce, pipetta su e giù più volte per mescolare e centrifugare brevemente primer e sonde utilizzando una centrifuga da tavolo.
- Preparare 10 aliquote m di primer e sonde aggiungendo 10 -L di 100 M di stock a 90 -L di buffer di sospensione del DNA o MB H2O.
- Preparare 1 aliquote M di primer avanti e indietro (da utilizzare per la preamplificazione), aggiungendo 10 L del primer da 10 M a 90 - L di buffer di sospensione del DNA o MB H2O.
- Conservare i primer e le sonde a 4 gradi centigradi in contenitori scuri a tenuta d'aria. Avvolgere pellicola di laboratorio intorno ai coperchi per evitare la contaminazione e coprire le sonde in un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce. Conservare le sonde a -20gradi per lo stoccaggio a lungo termine se non vengono utilizzate regolarmente.
7. Selezione dei controlli positivi
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Selezionare il campione di DNA genomico del tessuto tumorale (gDNA) con concentrazione nota del DNA, che ospita la mutazione di interesse ad una frequenza allelica nota da utilizzare come controllo positivo.
- Utilizzare 0.025 ng di DNA del tessuto tumorale di controllo positivo nella fase di preamplificazione (passaggio 8).
NOTA: Questo input di DNA fornisce un segnale positivo robusto su dPCR (come determinato eseguendo diluizioni seriali del tessuto tumorale gDNA con mutazione H3F3A p.K27M8) riducendo al minimo la quantità di campione richiesto.
- Utilizzare 0.025 ng di DNA del tessuto tumorale di controllo positivo nella fase di preamplificazione (passaggio 8).
8. Preamplificazione delle Alleli bersaglio
NOT: Il protocollo di preamplificazione è come da Jackson et al., 201613.
- Pulire lo spazio e l'attrezzatura del banco con il 10% di candeggina e il 70% di etanolo.
- Ottenere 1 primer in avanti e inverso, campioni di cfDNA, controlli positivi gDNA e mix master di polimerasi del DNA e impostarli sul ghiaccio.
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Calcolare il volume dei reagenti necessari per preamplificare il numero desiderato di campioni di cfDNA e il controllo positivo, per la preamplificazione singleplex o multiplex come segue:
- Per la preamplificazione singleplex (per preamplificare gli alleli selvatici e mutanti per una singola mutazione di interesse), preparare la miscela di reazione PCR aggiungendo 17,5 : L di mix master di polimerasi del DNA e 3,5 gradi di primer avanti e indietro (100 nM) per ogni campione13.
- Per la preamplificazione multiplex (per preamplificare due serie di alleli di tipo selvatico e mutanti per due mutazioni di interesse), preparare la miscela di reazione PCR aggiungendo 17,5 di mix master di polimerasi del DNA e 1,75L di ogni serie di primer in avanti e inverso (50 nM) per campione 13.
NOTA: Preparare una miscela di reazione PCR sufficiente per il numero di campioni più 10% in più per tenere conto di qualsiasi errore di pipettaggio.
- Distribuisci 24,5 gradi di miscela di reazione PCR in ogni pozzo di un tubo a strisce PCR a 8 pozzevita 13.
- Distribuisce 10,5 di l di dna nel pozzo appropriato per portare ilvolume totale della reazione a 35 . Pipette delicatamente l'intero volume su e giù 10 volte per mescolare.
- Eseguire l'amplificazione PCR a 98 gradi centigradi per 3 min; 9 cicli di 98 gradi centigradi per 10 s, temperatura di annealing per 3 min, 72 gradi centigradi per 30 s; e un'estensione a 72 gradi centigradi per 2 min13.
- Trasferire l'intero volume del prodotto preamplificatore ad etichettato DNase/RNase free PCR-clean tubes e diluire in 140 buffer di sospensione DEL DNA TE (pH 8.0)13.
- Avvolgere i coperchi dei tubi in pellicola da laboratorio. Conservare il prodotto preamplificatore a 4 gradi centigradi. Per la conservazione a lungo termine, conservare a -20 gradi centigradi.
9. Rilevamento e quantificazione del DNA target utilizzando dPCR
- Pulire lo spazio e l'attrezzatura del banco con il 10% di candeggina e il 70% di etanolo.
- Impostare su ghiaccio 10 primer e sonde m, mix master di genotipizzazione e campioni di DNA. Conservare l'olio stabilizzante gocciolina a temperatura ambiente.
- Vortice delicatamente e centrifugare brevemente tutti i reagenti tranne l'olio stabilizzante gocciolante.
- Assicurarsi che il cilindro compresso del gas di azoto collegato allo strumento di generazione delle goccioline e allo strumento di quantificazione (Tabella dei materiali) sia impostato a 90 psi.
- Accendere lo strumento di generazione di goccia e il computer con il software dello strumento. Avviare il software e fare clic su Avvia inizializzazione.
- Eseguire una scala ad alta pressione sullo strumento di generazione goccia se non è stato utilizzato in una settimana o più.
- Preparare la miscela di reazione dPCR per 8 pozzetti del tubo a strisce PCR più il 10% in più, aggiungendo 220 l.l di miscela master di genotipizzazione, 8,8 litri ciascuno di 10 m di sonde selvatiche e mutanti, 39,6 L ciascuno di 10 M, invertitori in avanti e primi, e 17,6 litri di olio di stabilizzazione gocciolamento14.
- Mescolare delicatamente la miscela di reazione dPCR pipetting l'intero volume su e giù 10-20 volte. Non vortice o centrifugare dopo gocciolamento olio stabilizzante è stato aggiunto alla miscela di reazione.
- Ottenere un tubo a striscia PCR 8-well e erogare 38 l di miscela di reazione dPCR direttamente nel fondo di ogni pozzo14. Rimuovere eventuali bolle con una punta pipetta pulita.
NOT: I tubi a strisce PCR che sono interconnessi o imballati strettamente insieme possono provocare cariche elettriche statiche, causando coalescenza e segnale rumoroso durante l'analisi dei dati dPCR. Per evitare questo, tubi striscia aliquota in sacchetti biohazard separati, evitare di sovraccaricare i sacchetti, e mantenere i tubi da sfregamento insieme. - Aggiungere 12 l di campione di DNA preamplificatore agli appositi pozzi del tubo a strisce PCR. Per il controllo negativo, aggiungere 12 : L di MB H2O.
NOT: Analizzare i campioni cfDNA nei pozzi di replica. Per CSF, analizzare almeno in duplicato, e per plasma/siero analizzare ogni campione in triplice copia. - Pipette delicatamente l'intero volume su e giù 10 volte per mescolare la miscela di reazione con il campione di DNA.
- Ottenere un nuovo chip strumento generagocce e pipetta l'intero volume dai pozzi 1-8 del tubo di striscia PCR nei canali corrispondenti A-H nel chip. Evitare di toccare la parte inferiore dei canali con una punta di pipetta.
- Ottenere un nuovo tubo di striscia PCR pulito e inserire nello strumento di generazione goccia. Eseguire la scansione o inserire manualmente l'ID del chip dello strumento che genera droplet nel software del computer dello strumento. Immettere i nomi per ciascuno degli 8 canali. Fare clic su Avvia la concorsa per iniziare a eliminare i campioni.
- Quando la gocciolificazione è completata, rimuovere il tubo striscia PCR e applicare tappi tubo striscia.
- Trasferire il tubo a strisce in un ciclore termico ed equilibrare con un altro tubo striscia contenente 80 .L di acqua per pozzo.
- Programmare le condizioni del ciclo termico14 come: 95 gradi centigradi per 10 min; 45 cicli di due temperature: 95 gradi centigradi per 30 s e temperatura di annealing per 2 min; 98 gradi centigradi per 10 min; e tenere a 10 gradi centigradi.
- Impostare la velocità di rampa su 0,5 gradi centigradi e impostare il volume del campione su 80 .L14.
- Quando il ciclo termico è completo, rimuovere il tubo a strisce e trasferirlo allo strumento di quantificazione. Rimuovere i tappi a strisce PCR e sostituirli con tappi ad alta velocità.
- Attivare lo strumento di quantificazione e il computer collegato con il software dello strumento. Avviare il software dello strumento e fare clic su Imposta un'esecuzione.
- Inserire il tubo a strisce nello strumento di quantificazione.
- Ottenere un nuovo chip strumento di quantificazione e la scansione o inserire manualmente l'ID del chip nello strumento. Inserire il chip nella macchina.
- Posizionare lo scudo metallico sulla parte superiore del chip e chiudere il coperchio dello strumento.
- Nel software del computer, immettere un nome per l'esecuzione dPCR e per ciascuno degli 8 canali (A-H). Selezionare Modalità veloce (che deve essere utilizzata con tappi di velocità elevati) e fare clic su Avvia per iniziare la quantificazione.
- Una volta completata la quantificazione, rimuovere lo scudo metallico (da salvare e riutilizzare) e smaltire il tubo e il truciolo di strip PCR. Nel computer dello strumento, il registro di esecuzione conterrà i file dei risultati per ogni esecuzione. Utilizzare i file fcs per ogni campione da analizzare con il software degli analisti.
10. Analisi dei dati
- Avviare il software analyst e aprire i file .fcs per analizzare i dati spettrali grezzi. In Visualizzazione analisi, selezionare Intatto. In Visualizzazione di esempio fare clic sulle caselle accanto a ciascuno degli 8 campioni in modo che in ogni casella sia presente un segno di spunta. Il software traccia i segnali per gli alleli mutanti (FAM) e wildtype (HEX) lungo gli assi x e y, rispettivamente.
- Utilizzare la funzione di matrice calcolata per applicare la compensazione spettrale su goccioline intatte, secondo le istruzioni del produttore15.
- Regolare le impostazioni dell'asse in Opzioni asse. Impostare l'asse x su un minimo di 0 e un massimo di 30.000 e l'asse y su un minimo di -5.000 e un massimo di 10.000. Una volta identificati i cluster di gocciolini, regolare gli assi per ridurre lo spazio vuoto nel grafico.
NOT: La posizione degli ammassi mutanti e selvatici dipenderà dalle sonde utilizzate, dal fluoroforo e dalla loro concentrazione. - Selezionare il campione corrispondente al tessuto tumorale di controllo positivo gDNA per impostare le porte negative (cluster più vicino all'origine), mutante (cluster più vicino all'asse x) e wildtype (cluster più vicino all'asse y). Assicurarsi che i cluster siano distinti e facilmente identificabili in un'esito positivo.
- Applicare le impostazioni del cancello per il controllo positivo a tutti i campioni facendo clic con il pulsante destro del mouse sul campione di controllo positivo e facendo clic sull'opzione Applica tutte le impostazioni ai campioniselezionati.
- Nella vista grafica, fare clic sulla scheda Campioni multipli per visualizzare i grafici per tutti i campioni selezionati. Esportare l'immagine come file . TIF.
- Nella scheda Area di lavoro nella parte superiore sinistra dello schermo, selezionare Esporta analisi (csv) e salvare il file di dati analizzato come file CSV.
- Aprire il file CSV nel software per fogli di calcolo per visualizzare i conteggi delle goccioandole negative, wildtype e mutanti per ogni campione. Calcolare il MAF dividendo il numero di goccioline mutate corrette di Poisson per la somma del numero di goccioline per mutanti corretti di Poisson più conteggi di gocciolina di tipo selvaggio per ogni campione.
NOT: Utilizzare il conteggio corretto Poisson perché le statistiche di Poisson spiegano che le goccioline positive possono contenere più di una singola copia del DNA bersaglio, e quindi sommare le goccioline positive potrebbe non produrre un conteggio accurato16.
Representative Results
La figura 1 mostra risultati rappresentativi per il rilevamento di una mutazione H3F3A p.K27M nel plasma preamplificatore (pannello in alto a sinistra) e CSF (pannello in alto a destra) cfDNA da due bambini affetti da DMG. I campioni di cfDNA sono stati analizzati in replica, ma viene visualizzato un solo grafico rappresentativo per ogni tipo di campione. I grafici dPCR mostrano la generazione di goccioline di successo, con 7-9 milioni di goccioline per PCR bene (la maggior parte delle quali sono goccioline negative che non contengono DNA bersaglio). Un minimo di 7 milioni di goccioline per PCR indica bene una contagocce di successo, mentre meno di 7 milioni indicano un guasto del saggio, nel qual caso l'utente non dovrebbe procedere con l'analisi dei dati. La figura 1 mostra una netta separazione tra gli ammassi mutanti e quelli wildtype lungo gli assi x e y, rispettivamente. Robusti cluster di caratteri selvatici indicano che l'estrazione cfDNA è riuscita perché il DNA del modello è presente. Gli ammassi mutanti mostrano un MAF dell'1,60% e del 39,92% rispettivamente per i campioni di plasma e CSF, dimostrando la rilevazione positiva della mutazione. Per questi pazienti, i risultati della dPCR sono conformi allo stato di mutazione tumorale, come confermato dall'analisi genomica del tessuto tumorale biopsia8. Il controllo negativo (pannello in basso a sinistra) mostra 0 goccioline mutanti e 0 goccioline di tipo selvatico, che indicano che non c'era contaminazione della miscela di reazione PCR. Il tessuto tumorale di controllo positivo gDNA (pannello in basso a destra) mostra la mutazione rilevata alla frequenza allelica prevista per il particolare campione di tumore selezionato.
Nella Figura2, i risultati rappresentativi sono indicati per il rilevamento senza successo della mutazione di interesse, H3F3A p.K27M, nel plasma cfDNA da un bambino con DMG. Lo stato di mutazione è stato confermato dall'analisi genomica del tessuto tumorale8. I risultati rappresentativi di due pozze tè PCR replicati sono mostrati (pannelli superiori). Il numero totale di goccioline, comprese le goccioline negative, è compreso tra 7-9 milioni per PCR bene, che indica il successo dropletzzazione. Gli ammassi di caratteri selvatici, tracciati lungo l'asse y, mostrano circa 7-8.000 goccioline di tipi selvatici per PCR per il plasma cfDNA, indicando il successo dell'estrazione cfDNA (in quanto c'è DNA wildtype bersaglio nel campione). Tuttavia, nel campione di plasma vengono rilevate 0 goccioline mutanti. Il pannello in basso a sinistra mostra il controllo negativo (MB H2O) senza goccioline di tipo selvatico o mutanti; e il pannello in basso a destra mostra il controllo positivo preamplificatore gDNA (0.025 ng) con rilevamento di mutazione positiva. Come mostrato in questa figura, l'assenza di rilevamento della mutazione nel plasma potrebbe non significare necessariamente che il paziente sia wildtype per la mutazione di interesse, poiché i falsi negativi si verificano8. In alcuni casi, quando la mutazione viene persa nel plasma raccolto in biopsia iniziale, viene rilevata nel plasma ottenuto dallo stesso paziente in un secondo momento8.
Figura 1 : Rilevamento riuscito H3F3A mutazione di p.K27M nel plasma preamplificatore e nel cedro CSF da bambini con gliomi della linea mediana. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : risultati falsi negativi ottenuti dall'analisi di un campione di cfDNA plasma preamplificatore da un paziente noto per ospitare la mutazione di interesse, H3F3A P.K27M, nel tumore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Qui abbiamo presentato il nostro metodo per rilevare e quantificare la frequenza allelica delle mutazioni tumorali nel cfDNA dalla biopsia liquida del paziente. Sottolineiamo i passaggi critici per il successo di questo metodo, tra cui l'elaborazione dei campioni pre-analitici, l'estrazione dei cfDNA, la progettazione di analisi PCR e l'analisi dei dati. Per limitare il volume del campione utilizzato, il cfDNA viene estratto da 1 mL di plasma, ma solo 500 L L di CSF. Quando si estrae dalla CSF, viene utilizzato il protocollo per l'estrazione da 1 mL di urina (dopo il manuale12del kit di estrazione cfDNA), secondo la raccomandazione del produttore. La differenza nel volume del campione richiesta tra plasma e CSF è dovuta a livelli più bassi di cfDNA specifico per il tumore nel plasma rispetto alla CSF dei pazienti con tumori cerebrali, rendendo più grandi volumi di campioni per il rilevamento delle mutazioni8. Se il campione è disponibile, più di 1 mL di plasma può essere estratto da per produrre una resa di DNA più elevata. Tuttavia, nel caso di pazienti pediatrici, è importante ridurre al minimo la quantità di sangue utilizzato quando possibile, poiché anche una semplice procedura come l'estrazione del sangue è faticosa per i pazienti pediatrici con tumori sottoposti a terapie radiologiche. L'estrazione da 1 mL di aliquote di plasma consente anche di replicare le estrazioni, in modo che il saggio possa essere ripetuto (ad esempio, in caso di guasto nell'estrazione del DNA o contaminazione del campione).
Nel tentativo di ridurre qualsiasi uso di campione che non è strettamente necessario, cfDNA in genere non è quantificato. Tuttavia, abbiamo trovato una gamma di concentrazioni di CFDNA tra 0,2-2 ng/ l e 0,6-13 ng/L nel plasma e nella CSF, rispettivamente. Data la bassa quantità di cfDNA, e il fatto che gli alleli mutanti specifici del tumore siano presenti a bassa frequenza, è necessario un passaggio di pre-amplificazione utilizzando lo stesso set di primer utilizzati per dPCR per aumentare significativamente la quantità di DNA bersaglio nel campione, rilevamento mutazioni8. La diluizione del prodotto pre-amplificato nel buffer di sospensione del DNA fornisce un volume sufficiente per le repliche tecniche, il che aiuta a distinguere i veri positivi. Poiché il numero di goccioline mutanti può essere basso (ad esempio, tra 0-2 goccioline mutanti in un campione di plasma), l'inclusione di repliche tecniche è fondamentale per risolvere lo stato di mutazione. Mentre un pozzo di PCR può produrre 0 goccioline mutanti, le altre due possono produrre 1-2 per un singolo campione di plasma analizzato in triplice copia; pertanto, l'inclusione di repliche consente una maggiore precisione nella determinazione dello stato della mutazione. Il MAF viene quindi calcolato come la media dei valori di replica.
La pre-amplificazione multiplexata (preamplificatore selvatico e alleli mutanti di due mutazioni di interesse) aumenta l'utilità di un singolo campione, poiché lo stesso materiale di partenza può essere utilizzato per testare due mutazioni. È importante sottolineare che un prodotto di preamplificazione multiplex può essere analizzato in singleplex durante dPCR per una maggiore semplicità, come descritto qui. Tuttavia, sia la preamplificazione PCR che la dPCR possono essere multiplexate. Quando il multiplexing, le condizioni devono essere ottimizzate sia per set di primer che di sonde: le temperature di fissazione dei primer devono essere simili a quelle dell'amplificazione PCR e le sonde devono essere progettate per generare cluster distinti (basati su segnali fluorescenti e intensità). Durante la convalida di un nuovo set di primer e sonde, eseguire un gradiente di temperatura di annealing per determinare la temperatura di fissazione ottimale in base alla gamma suggerita dal produttore. Prima di testare le sonde sui campioni di cfDNA dei pazienti, convalidarli utilizzando costrutti di DNA sintetico e/o gDNA di tessuto tumorale di diversi input (ad esempio, fino a 10 ng).
Per la rilevazione di alleli mutanti con maggiore specificità e riduzione delle discrepanze nell'ibridazione della sonda al DNA bersaglio, vengono utilizzate sonde con acido nucleico bloccato (LNA). LNA è un analogo acido nucleico con un ponte di metilene che collega l'ossigeno 2'-ossigeno e 4'-carbonio dell'anello ribosio9. Il ponte di metilene blocca l'acido nucleico in una rigida conformazione bicyclic che limita la flessibilità, aumenta la stabilità termica duplex e migliora la specificità dell'ibridazione della sonda per colpire il DNA10,18, 19.Se esiste una singola mancata corrispondenza di base tra la sonda LNA e il DNA del modello, la formazione duplex tra la sonda e il bersaglio si destabilizza. Di conseguenza, le sonde LNA migliorano la specificità della legatura della sonda e si traducono in un rapporto segnale-rumore11più elevato. L'analisi del plasma e del CSF da pazienti pediatrici non malati di CNS ha stabilito la specificità del nostro saggio con sonde LNA rivolte H3F3A p.K27M, per determinare che una frequenza allelica pari o inferiore allo 0,001% è considerata un falso positivo 8.Per ulteriori considerazioni per ottimizzare la progettazione di sonde e primer, tra cui contenuti GC, dimensioni dell'amplificatore, coloranti per reporter di sonde e quenchers, fare riferimento alle linee guida del produttore dPCR14,17. Anche se il nostro metodo è ottimizzato per l'uso con il sistema RainDance, il protocollo può essere adattato per l'uso con altre piattaforme dPCR.
Il metodo qui presentato trae forza dall'elevata sensibilità e dall'arricchimento obiettivo raggiunto da dPCR, che rimane la piattaforma di scelta per rilevare rare mutazioni tumorali nel cfDNA. Anche se potente, il dPCR è limitato nel numero di mutazioni che possono essere testate in un unico test. Un'alternativa al dPCR è il sequenziamento di nuova generazione (NGS), che può rilevare più mutazioni in molti geni, aumentando l'utilità di un singolo campione. NGS è in grado di rilevare mutazioni nella CSF e nel plasma di pazienti con gliomi staminali cerebrali20, tuttavia è attualmente meno sensibile del dPCR nel rilevamento di mutazioni tumorali nel cfDNA, con limiti di rilevazione dello 0,1-10% MAF rispetto allo 0,001% negli approcci basati su PCR21 . dPCR raggiunge anche tempi di consegna più rapidi rispetto a NGS, consentendo una rapida individuazione delle mutazioni di interesse. L'approccio PCR è applicabile in tutti i tipi di cancro e può essere ampliato per rilevare mutazioni di hotspot e cfDNA metilata22.
La biopsia liquida è davvero agli inizi e richiederà un ulteriore sviluppo per adattarsi a malattie specifiche. Il monitoraggio del tumore nel contesto dell'evoluzione tumorale sarà la prossima sfida, dove sarebbe necessaria una piattaforma in grado di rilevare mutazioni emergenti con alta sensibilità. Inoltre, le piattaforme in grado di rilevare una varietà di biomolecole (peptidi, citochine, RNA) saranno altamente utili nel valutare la risposta del tumore al trattamento, oltre a far progredire gli interventi clinici personalizzati.
Disclosures
Il metodo descritto in questo manoscritto è incluso in una domanda di brevetto internazionale "Metodi per rilevare biomarcatori del cancro" da Javad Nazarian & Eshini Panditharatna.
Acknowledgments
Gli autori desiderano riconoscere la generosità di tutti i pazienti e delle loro famiglie. Questo lavoro è stato sostenuto da finanziamenti dalla Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), la V Foundation (Atlanta, GA), The Gabriella Miller Kids First Data Resource Center, Clinical and Translational Science Institute presso Children's National ( 5UL1TR001876-03), Fondazione Musella (Hewlett, NY), Fondazione Matthew Larson (Franklin Lake, NJ), Fondazione Lilabean per la ricerca sul cancro del cervello pediatrico (Primavera d'Argento, MD), la Fondazione del Tumore Del Cervello Infantile (Germantown, MD), il Cervello dei Bambini Il Consorzio dei tessuti tumorali (Philadelphia, PA) e la Rally Foundation for Childhood Cancer Research (Atlanta, GA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2 mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
- Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19 (4), iv21 (2017).
- Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19 (4), iv14 (2017).
- Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20 (2), i64 (2018).
- Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951 (2017).
- Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).
- Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81 (2012).
- Qiagen. QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. , 1090257 (2013).
- Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Assay Guidelines. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Analyst II Operator's Manual. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).
- Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617 (2017).
- Biorad. Droplet Digital PCR Applications Guide. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).
- Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).
- Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. , (2018).
- Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).
