Summary
Aquí, presentamos un protocolo para detectar mutaciones somáticas tumorales en el ADN circulante presente en fluidos biológicos del paciente (biofluidos). Nuestro método basado en la reacción en cadena de la polimerasa digital de gotas (dPCR) permite cuantificar la frecuencia alélica de la mutación tumoral (MAF), facilitando un complemento mínimamente invasivo para el diagnóstico y el monitoreo temporal de la respuesta tumoral.
Abstract
Las complicaciones asociadas con el muestreo de tejido quirúrgico inicial y repetido presentan la necesidad de plataformas mínimamente invasivas capaces de subclasificación molecular y monitoreo temporal de la respuesta tumoral a la terapia. Aquí, describimos nuestro método basado en dPCR para la detección de mutaciones somáticas tumorales en el ADN libre de células (CFDNA), fácilmente disponible en biofluidos de pacientes. Aunque limitado en el número de mutaciones que se pueden probar en cada ensayo, este método proporciona un alto nivel de sensibilidad y especificidad. El monitoreo de la abundancia de mutaciones, calculado por MAF, permite la evaluación de la respuesta tumoral a la terapia, proporcionando así un suplemento muy necesario a las imágenes radiográficas.
Introduction
Debido a las limitaciones en la disponibilidad de tejido tumoral para análisis moleculares, es necesario el desarrollo de métodos altamente sensibles capaces de detectar mutaciones somáticas tumorales en biofluidos del paciente, incluyendo plasma, suero y líquido cefalorraquídeo (LCR) . Por ejemplo, los gliomas de línea media difusa pediátrica (DDM) presentan un desafío debido a su ubicación neuroanatómica. Durante la última década, el perfil molecular de las muestras de tejido DMG ha descubierto mutaciones de conductores en este tumor tipo1 y ha revelado heterogeneidad espacial y temporal de mutaciones, haciendo que la biopsia sea necesaria para caracterizar a un paciente dentro de una enfermedad subgrupo y la promoción de terapias dirigidas molecularmente2. Como tal, los ensayos clínicos abogan por la integración de biopsias quirúrgicas para el perfil molecular tumoral en el diagnóstico inicial3,4,5,6. Durante el tratamiento, el seguimiento de la respuesta terapéutica en los DMR se limita a la RMN, que carece de sensibilidad para detectar pequeños cambios o evolución genómica tumoral. La RMN también es propensa a detectar la pseudoprogresión, inflamación transitoria en el sitio del tumor que imita la verdadera progresión en la imagen y puede desinformar la interpretación de la respuesta tumoral7. Por lo tanto, los DDM representan un tipo de tumor con una alta necesidad de un medio alternativo y mínimamente invasivo de detectar mutaciones tumorales y monitorear la respuesta clínica. Para hacer frente a estas necesidades, desarrollamos y optimizamos un protocolo para detectar y cuantificar la frecuencia alélica de lasmutaciones tumorales en cfDNA a partir de plasma, suero y LSN de niños con gliomas de línea media 8. Dado que los DMG de la infancia a menudo (>80%) una mutación somática de lisina a metionina en la posición 27 de la variante histona H3.1 (H3.1K27M, 20% de los casos) o H3.3 (H3.3K27M, 60% de los casos)1, estas y otras mutaciones características de los DDM (es decir, ACVR1, PIK3R1) fueron dirigidas a cuantificación de alelo mutante utilizando cfDNA8. Este ensayo se puede adaptar para detectar mutaciones de puntos críticos en otros tipos de tumores utilizando imprimaciones y sondas específicas de la secuencia. La versatilidad de este enfoque hace que sea aplicable a una variedad de cánceres que se beneficiarían de la integración de herramientas de diagnóstico basadas en adNado cfdna y monitoreo terapéutico.
Para detectar con sensibilidad mutaciones de baja frecuencia alélica en cfDNA, empleamos un enfoque basado en PCR digital de gotas (dPCR). En este método, la mezcla de reacción PCR se divide en un máximo teórico de 10 millones de gotas utilizando la plataforma dPCR (por ejemplo, RainDance), con 7-9 millones de gotas por PCR que normalmente se ven experimentalmente. Debido al alto grado de partición de muestras, a lo sumo sólo una o dos moléculas de ADN pueden estar presentes en cada gota. La amplificación de PCR y la hibridación de la sonda fluorescente específica de la secuencia pueden ocurrir en cada gota, de modo que se producen millones de reacciones. Esto maximiza la sensibilidad y permite la detección de alelos mutantes raros, que de lo contrario podrían pasar desapercibidos en un fondo de ADN de tipo salvaje. La utilización de sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) mejora la especificidad del ensayoal restringir la hibridación de discordancia y apoyar la detección precisa de mutaciones 9,10,11. Aquí, describimos nuestros métodos de procesamiento de muestras, extracción de ADNes cfDNA, preamplificación de alelos objetivo, dPCR y análisis de datos.
Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California San Francisco (San Francisco, CA; irB #14-13895) y el Sistema Nacional de Salud infantil (Washington, D.C.; IRB #1339). Los especímenes fueron recogidos y estudiados después de obtener el consentimiento informado del paciente o tutor del paciente.
1. Pacientes consentidos bajo el Protocolo IRB para la Recolección y Almacenamiento de Especímenes Biológicos
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Recoger muestras de pacientes después de que se obtenga el consentimiento informado por escrito de cada paciente, o del tutor del paciente, para participar en un ensayo clínico o para el biorrepositorio según lo aprobado por la respectiva Junta de Revisión Institucional.
- Los pacientes incluidos en este estudio fueron diagnosticados con un tumor cerebral radiográficamente. No se utilizaron criterios de exclusión. Los especímenes fueron recogidos y estudiados después de obtener el consentimiento informado del paciente o tutor del paciente.
2. Recolección de sangre y separación de plasma o suero
- Recoger la muestra de sangre utilizando un dibujo de 10,0 ml en tubos de extracción de sangre. Si recoge sangre para plasma, utilice tubos K2- o K3-EDTA, tubos de heparina o de recolección de sangre cfDNA. Si recoge sangre para suero, utilice tubos de barrera de gel que contengan el activador de coágulos y gel para separar el suero.
NOTA: Mientras que 10 mL se recomienda para habilitar los experimentos de réplica, un mínimo de 3 mL será suficiente. - Invierta cuidadosamente el tubo de recogida 10 veces para mezclar la muestra de sangre con los reactivos del tubo de recolección.
- Deje las muestras de sangre de las que se recogerá el suero a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que la sangre coagule. Si procesa sangre para obtener plasma, proceda inmediatamente al paso 2.4.
NOTA: Las muestras que se procesan para plasma pueden conservarse en hielo durante un máximo de 2 h antes de la centrifugación. Sin embargo, una rápida transición de la extracción de sangre al procesamiento minimiza la degradación del ADNr. - Tubos de recolección de sangre centrífuga a 2.000 x g durante 15 minutos en una centrífuga establecida en 4 oC para separar el plasma o suero de las capas de glóbulos blancos y rojos.
- Teniendo cuidado de no perturbar la capa de glóbulos blancos (que forma una línea delgada entre la capa plasmática/sérica superior y la capa inferior de glóbulos rojos envasados), pipetee la capa superior de plasma/suero (que puede ser transparente, amarillo o de color rosa) por igual en alícuotas de 1 ml en crioviales estériles de polipropileno atornillado.
- Registre el número de identificación del sujeto, el tipo de espécimen (plasma o suero) y la fecha de recolección en la etiqueta de los crioviales.
- Conservar crioviales en el congelador de -80oC hasta su uso. Si no se dispone de un congelador de -80 oC, almacene las muestras a -20 oC durante un máximo de una semana.
3. Recolección y Procesamiento del CSF
- Recoja el cSF de una derivación, una punción lumbar o una cirugía.
NOTA: Dichos procedimientos sólo deben llevarse a cabo si los médicos lo consideran necesario. La muestra adicional más allá de la necesaria para uso clínico puede utilizarse con fines de investigación. - Mida el volumen de LSN recogido y tome nota de su color (sangre, amarillo, claro).
- Centrifugar el tubo de recogida a 10.000 x g durante 10 min a 4 oC para peletizar los desechos celulares.
- Transfiera el sobrenadante De LCr por igual en alícuotas de 500 ol en crioviales de tapa de tornillo de polipropileno.
- Registre el número de identificación del sujeto, el tipo de espécimen y la fecha de recolección del espécimen en la etiqueta de los crioviales. Conservar a -80oC hasta su uso.
4. Extracción de ADNe de especímenes líquidos
- Realice el protocolo de extracción cfDNA según las instrucciones del manual12del kit de extracción de ADNación 12.
- Limpie el espacio y el equipo del banco con un 10% de lejía y un 70% de etanol.
NOTA: El uso de una campana PCR, el cambio regular de guantes y la descontaminación frecuente del espacio de banco y el equipo con 10% de lejía y 70% de etanol durante todos los pasos del protocolo es importante para evitar la contaminación de la muestra. - Preparar alícuotas de reactivos, por ejemplo, tampones de lavado, del kit de extracción para evitar la contaminación cruzada.
- Limpie el espacio y el equipo del banco con un 10% de lejía y un 70% de etanol.
- Descongelar las muestras de pacientes en hielo antes de comenzar la extracción. Para plasma/suero, descongelar 1 ml de alícuota de la muestra. Para el LESO, descontezca 500 l de la muestra.
NOTA: Los pasos de Lisis (4.5-4.8) del protocolo de extracción difieren entre plasma/suero y LSN, pero a partir del paso 4.9, el protocolo es idéntico para ambos tipos de biofluidos. - Establezca un bloque de calentamiento a 60 oC para su uso durante el paso de lisis (4.6).
- Preparar el tampón de lisis y la mezcla de ARN portador en un tubo de 15 ml añadiendo 5,6 ml de ARN portador y 0,9 ml de tampón de lisis por muestra12.
- Para plasma/suero, añadir 100 l de proteinasa K, 1 ml de muestra y 0,8 ml de mezcla de tampón de lisis/ARN portador a un tubo etiquetado de 2,0 ml. Mezclar por vórtice por pulso para 30 s a alta velocidad12.
- Para el LIF, añadir 125 l de proteinasa K, 500 l de la muestra, 1 ml de mezcla de tampón de lisis/ARN portador y 250 ml de tampón de lisis tisular a un tubo de 2,0 ml. Lleve el volumen completo hasta 2 ml agregando 125 ml de solución salina con 1 fosfato (PBS). Mezclar por vórtice por pulso para 30 s a alta velocidad12.
- Incubar muestras durante 30 min a 60oC en el bloque de calentamiento12.
- Retirar las muestras del bloque de calentamiento y bajar la temperatura a 56 oC. Vuelva a colocar las muestras en el banco y transfiera el lisado a tubos nuevos de 15 ml etiquetados.
- Para plasma/suero, añadir 1,8 ml de tampón de unión de ácido nucleico y mezclar durante 30 s por vórtice de pulso12.
- Para el LSC, añadir 3,6 ml de tampón de unión de ácido nucleico y mezclar durante 30 s por vórtice por pulso12.
- Incubar muestras durante 5 min sobre hielo12.
- Inserte la columna en el conector de vacío. Abra la columna e inserte un extensor de tubo de 20 ml en la columna12.
- Pipetear el contenido del tubo de 15 ml directamente en la parte inferior del extensor del tubo, evitando dejar gotas en las paredes del extensor del tubo.
- Con el interruptor del conector de vacío cerrado, encienda la bomba de vacío. Una vez que la presión se haya construido a 900 mbar, abra la válvula del conector de vacío. La muestra ahora fluirá a través de la columna.
- Una vez que todo el lisado se ha drenado de la columna, apague la bomba y abra la trampilla al conector de vacío, aliviando el gradiente de presión. Una vez que la presión alcance 0 mbar, cierre la válvula del conector de vacío y la trampilla.
- Retire el extensor de tubo de 20 ml, teniendo cuidado de no pasar el extensor de una columna sobre una columna vecina, ya que esto puede contaminar las muestras. Deseche el extensor del tubo.
- Agregue 600 s l de primer búfer de lavado a la columna12.
- Deje las tapas de los tubos abiertas y encienda la bomba de vacío. Deje que el manómetro alcance 900 mbar, luego gire el interruptor del conector de vacío a la posición abierta para dibujar el búfer de lavado a través de la columna.
- Apague la bomba de vacío, abra la trampilla para liberar presión y alivie la presión a 0 mbar. Gire la válvula del conector de vacío a la posición cerrada.
- Agregue 750 s l de segundo búfer de lavado a la columna y repita los pasos 4.16-4.1712.
- Añadir 750 ml de etanol de grado MB a la columna y repetir los pasos 4.16-4.1712.
- Cierre la tapa de la columna y coloque la columna dentro de un nuevo tubo de recogida de 2,0 ml. Deseche el conector de vacío12.
- Centrifugar el tubo con la columna a 20.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente12.
- Coloque la columna en un nuevo tubo de recogida y abra la tapa del tubo. Colocar un tejido de laboratorio sobre la parte superior e incubar a 56oC durante 10 min12.
- Coloque la columna en un tubo limpio de 1,5 ml limpio de PCR y pipeta de 100 ml de tampón de elución (o grado de biología molecular H2O (MB H2O)) directamente en el centro de la columna. No toque la columna con una punta de pipeta. Cierre la tapa y déjela a temperatura ambiente durante 3 min.
- Centrífuga a 20.000 x g a temperatura ambiente durante 1 min para elute cfDNA12.
- Pipetear el eluido de nuevo en la columna e incubar a temperatura ambiente durante 3 min.
- Repita la centrifugación a toda velocidad durante 1 min para eludir el ADNr un segundo para aumentar el rendimiento (según la recomendación del fabricante).
- Almacene el ADNcfDNA en tubos limpios de PCR libres de DNase/RNase etiquetados a 4 oC o proceda directamente al paso 5.
5. Concentración al vacío de cfDNA
- Inserte y equilibre los tubos que contienen adNado cfdna eludado en soportes en el concentrador de vacío. Abra las tapas de los tubos. Ajuste la temperatura del concentrador de vacío a 23 oC.
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Encienda el concentrador de vacío y, a continuación, encienda la trampa de vapor. Muestras de centrífuga durante 40 min o hasta que se alcance un volumen final de 10,5-11 l.
- Si el volumen es inferior a 10,5 l, añada el tampón de suspensión de ADN o MB H2O para alcanzar un volumen final de 10,5 l.
- Pipetear todo el volumen a lo largo de las paredes del tubo para eliminar fragmentos de ADN residuales.
- Centrifugar brevemente las muestras en una centrífuga de mesa para recoger gotas en las paredes de los tubos.
- Proceda directamente al paso de preamplificación (paso 8) o almacene las muestras a 4 oC.
- Envuelva las tapas de los tubos en una película de laboratorio para evitar la contaminación si se almacenan para su uso posterior.
6. Diseño y Preparación de Primers y Sondas
- Diseñe imprima imprimadores hacia adelante y hacia atrás, y sondas lNA de tipo salvaje y mutante, para los objetivos de interés. Ordene comercialmente imprimaciones y sondas liofilizadas (consulte la Tabla de Materiales).
NOTA: Las secuencias para imprimaciones y sondas dirigidas a H3F3A p.K27M y otras mutaciones diana para gliomas pediátricos de línea media se pueden encontrar en la Tabla Suplementaria 3 de Panditharatna et al., 20188. - Antes de abrir las imprimaciones y sondas liofilizadas, centrifugar brevemente los tubos. Añadir el volumen adecuado de tampón de suspensión de ADN o MB H2O, como se indica en la hoja de especificaciones del producto, para resuspender las imprimaciones y sondas liofilizadas a una concentración de 100 m.
- Suavemente vórtice, pipeta arriba y abajo varias veces para mezclar y centrifugar brevemente imprimaciones y sondas usando una centrífuga de mesa.
- Preparar alícuotas de imprimaciones y sondas de 10 m añadiendo 10 sl de stock de 100 m a 90 ml de tampón de suspensión de ADN o MB H2O.
- Preparar 1 m de alícuotas de imprimaciones delanteras y inversas (para ser utilizadas para la preamplificación), añadiendo 10 sL de la imprimación de 10 m a 90 ml de tampón de suspensión de ADN o MB H2O.
- Almacene las imprimaciones y las sondas a 4 oC en recipientes oscuros herméticos. Envuelva la película de laboratorio alrededor de las tapas para evitar la contaminación, y cubra las sondas en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Almacene las sondas a -20 oC para su almacenamiento a largo plazo si no se utilizan con regularidad.
7. Selección de controles positivos
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Seleccione muestras de ADN genómico de tejido tumoral (ADN) con concentración de ADN conocida, que alberga la mutación de interés a una frecuencia alélica conocida que se utilizará como un control positivo.
- Utilice 0,025 ng de ADN de tejido tumoral de control positivo en el paso de preamplificación (paso 8).
NOTA: Esta entrada de ADN proporciona una señal positiva robusta en dPCR (según lo determinado por la realización de diluciones en serie del tejido tumoral gDNA que alberga la mutación H3F3A p.K27M8) mientras se minimiza la cantidad de muestra requerida.
- Utilice 0,025 ng de ADN de tejido tumoral de control positivo en el paso de preamplificación (paso 8).
8. Preamplificación de alelos objetivo
NOTA: El protocolo de preamplificación es según Jackson et al., 201613.
- Limpie el espacio y el equipo del banco con un 10% de lejía y un 70% de etanol.
- Obtenga imprimaciones de 1 M hacia adelante y hacia atrás, muestras de ADNcfDNA, controles positivos de ADNr y mezcla maestra de la polimerasa de ADN, y se establece en hielo.
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Calcule el volumen de reactivos necesarios para preamplificar el número deseado de muestras de ADNcfDNA y el control positivo, ya sea para la preamplificación de un solo plex o multiplex de la siguiente manera:
- Para la preamplificación de un solo plex (para preamplificar el tipo silvestre y los alelos mutantes para una sola mutación de interés), prepare la mezcla de reacción de PCR añadiendo 17,5 ml de mezcla maestra de la polimerasa de ADN y 3,5 ml de imprimaciones delanteras y inversas (100 nM) por muestra13.
- Para la preamplificación múltiple (para preamplificar dos conjuntos de alelos de tipo salvaje y mutantes para dos mutaciones de interés), prepare la mezcla de reacción de PCR añadiendo 17,5 ml de mezcla maestra de polimerasa de ADN y 1,75 ml de cada conjunto de imprimaciones delanteras y inversas (50 nM) por muestra por muestra de 13.
NOTA: Prepare suficiente mezcla de reacción de PCR para el número de muestras más un 10% adicional para tener en cuenta cualquier error de pipeteo.
- Dispensar 24,5 l de mezcla de reacción de PCR en cada pocal de un tubo de tira de PCR de 8 pozos13.
- Dispensar 10,5 l de muestra de ADN en el pozo adecuado para llevar el volumen total de reacción a 35 sL13. Pipetear suavemente el volumen completo hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar.
- Realizar la amplificación de PCR a 98 oC durante 3 min; 9 ciclos de 98oC para 10 s, temperatura de recocido durante 3 min, 72oC para 30 s; y una extensión a 72oC durante 2 min13.
- Transfiera el volumen completo del producto preamplificado a tubos limpios de PCR libres de DNase/RNase etiquetados y diluya en un tampón de suspensión de ADN te de 140 ml (pH 8.0)13.
- Envuelva las tapas de los tubos en película de laboratorio. Conservar el producto preamplificado a 4oC. Para su conservación a largo plazo, conservar a -20oC.
9. Detección y cuantificación del ADN objetivo mediante dPCR
- Limpie el espacio y el equipo del banco con un 10% de lejía y un 70% de etanol.
- Establecer imprimaciones y sondas de 10 M, mezcla maestra de genotipado y muestras de ADN en hielo. Almacene el aceite estabilizador de las gotas a temperatura ambiente.
- Vórtice suavemente y centrifugar brevemente todos los reactivos excepto el aceite estabilizador de gotas.
- Asegúrese de que el cilindro de gas nitrógeno comprimido conectado al instrumento generador de gotas y el instrumento de cuantificación (Tablade materiales)esté ajustado a 90 psi.
- Encienda el instrumento generador de gotas y el ordenador con el software del instrumento. Inicie el software y haga clic en Iniciar inicialización.
- Ejecute un lavado de alta presión en el instrumento generador de gotas si no se ha utilizado en una semana o más.
- Preparar la mezcla de reacción dPCR para 8 pocillos del tubo de tira de PCR más 10% extra, añadiendo 220 ol de mezcla maestra de genotipado, 8,8 ml cada uno de sondas de tipo salvaje y mutantes de 10 m, 39,6 ml cada una de 10 m de imprimaciones delanteras y traseras, y 17,6 ol de aceite estabilizador de gotas14.
- Mezcle suavemente la mezcla de reacción dPCR pipeteando el volumen completo hacia arriba y hacia abajo 10-20 veces. No vórtice ni centrífuga después de que se haya añadido aceite estabilizador de gotas a la mezcla de reacción.
- Obtener un tubo de tira PCR de 8 pozos y dispensar 38 lde mezcla de reacción dPCR directamente en la parte inferior de cada poca 14. Retire las burbujas con una punta de pipeta limpia.
NOTA: Los tubos de tiras de PCR que están entrelazados o empaquetados estrechamente juntos pueden dar lugar a cargas eléctricas estáticas, causando carbonescencia y señal de ruidoso al analizar los datos de dPCR. Para evitar esto, tubos de tiras de alícuota en bolsas de riesgo biológico separadas, evite empacar en exceso las bolsas y evite que los tubos se froten juntos. - Añadir 12 l de muestra de ADN preamplificada a los pocillos apropiados del tubo de tira de PCR. Para el control negativo, agregue 12 sL de MB H2O.
NOTA: Analice las muestras de ADNcfDNA en pozos de réplica. Para el LSN, analice al menos por duplicado y para plasma/suero analice cada muestra en triplicado. - Pipetear suavemente el volumen completo hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar la mezcla de reacción con la muestra de ADN.
- Obtenga un nuevo chip de instrumento generador de gotas y pipetee el volumen completo de los pozos 1-8 del tubo de tira PCR en los canales Correspondientes A-H en el chip. Evite tocar la parte inferior de los canales con una punta de pipeta.
- Obtenga un nuevo tubo de tira de PCR limpio e insértelo en el instrumento generador de gotas. Escanee o introduzca manualmente el ID de chip del instrumento generador de gotas en el software del ordenador del instrumento. Introduzca los nombres de cada uno de los 8 canales. Haga clic en Iniciar la ejecución para comenzar a soltar muestras.
- Cuando se haya completado la dropletización, retire el tubo de tira de PCR y aplique tapas de tubo de tira.
- Transfiera el tubo de la tira a un ciclor térmico y equilibre con otro tubo de tira que contenga 80 ml de agua por poca.
- Programar las condiciones del ciclo térmico14 como: 95 oC durante 10 min; 45 ciclos de dos temperaturas: 95 oC para 30 s y temperatura de recocido durante 2 min; 98 oC durante 10 min; y mantener a 10 oC.
- Establezca la velocidad de rampa en 0,5 oC/s y establezca el volumen de la muestra en 80 sL14.
- Cuando se complete el ciclo térmico, retire el tubo de tira y transfiera al instrumento de cuantificación. Retire las tapas de la tira PCR y sustitúyalas con tapas de alta velocidad.
- Encienda el instrumento de cuantificación y el ordenador conectado con el software del instrumento. Inicie el software del instrumento y haga clic en Configurar una ejecución.
- Coloque el tubo de tira en el instrumento de cuantificación.
- Obtenga un nuevo chip de instrumento de cuantificación y escanee o introduzca manualmente el ID del chip en el instrumento. Inserte el chip en la máquina.
- Coloque el escudo metálico en la parte superior de la viruta y cierre la tapa del instrumento.
- En el software del ordenador, escriba un nombre para la ejecución de dPCR y para cada uno de los 8 canales (A-H). Seleccione Modo rápido (que debe utilizarse con tapas de alta velocidad) y haga clic en Iniciar para comenzar la cuantificación.
- Una vez completada la cuantificación, retire el escudo metálico (que se guardará y reutilizará) y deseche el tubo y el chip de la tira pcR. En el equipo del instrumento, el registro de ejecución contendrá archivos de resultados para cada ejecución. Utilice los archivos .fcs de cada muestra para analizarlos con el software de analista.
10. Análisis de datos
- Inicie el software de análisis y abra los archivos .fcs para analizar los datos espectrales sin procesar. En Vista de análisis, seleccione Intacto. En Vista de ejemplo, haga clic en las casillas situadas junto a cada uno de los 8 ejemplos para que haya una marca de verificación en cada casilla. El software trazará señales para los alelos mutante (FAM) y wildtype (HEX) a lo largo de los ejes X e Y, respectivamente.
- Utilice la función de matriz calculada para solicitar la compensación espectral en gotas intactas, según las instrucciones del fabricante15.
- Ajuste la configuración del eje en Opciones de eje. Establezca el eje x en un mínimo de 0 y un máximo de 30.000, y el eje Y en un mínimo de -5.000 y un máximo de 10.000. Cuando se hayan identificado los clústeres de gotas, ajuste los ejes para reducir el espacio vacío en el gráfico.
NOTA: La posición de los cúmulos de mutantes y de tipo salvaje dependerá de las sondas utilizadas, el fluoróforo y su concentración. - Seleccione la muestra correspondiente a las puertas gDNA del tejido tumoral de control positivo para establecer las puertas negativas (cluster más cercanas al origen), mutantes (cúmulo más cercana al eje X) y wildtype (cluster más cercana al eje Y). Asegúrese de que los clústeres sean distintos y se identifiquen fácilmente en un ensayo correcto.
- Aplique la configuración de la puerta para el control positivo a todas las muestras haciendo clic con el botón derecho en la muestra de control positivo y haciendo clic en la opción Aplicar todos los ajustes a las muestras seleccionadas.
- En la vista gráfica, haga clic en la ficha Múltiples muestras para ver los trazados de todas las muestras seleccionadas. Exporte la imagen como un archivo . Archivo TIF.
- En la pestaña Espacio de trabajo en la parte superior izquierda de la pantalla, seleccione Exportar análisis (csv) y guarde el archivo de datos analizado como un archivo .csv.
- Abra el archivo .csv en el software de hoja de cálculo para ver los recuentos de gotas negativas, wildtype y mutantes para cada muestra. Calcula el MAF dividiendo el recuento de gotas mutantes corregidas de Poisson por la suma del mutante corregido de Poisson más los recuentos de gotas de tipo salvaje para cada muestra.
NOTA: Utilice el recuento corregido de Poisson porque las estadísticas de Poisson representan el hecho de que las gotas positivas pueden contener más de una sola copia del ADN objetivo, y por lo tanto sumar las gotas positivas puede no producir un recuento preciso16.
Representative Results
La Figura 1 muestra resultados representativos para la detección exitosa de la mutación H3F3A p.K27M en plasma preamplificado (panel superior izquierdo) y CFDNA CSF (panel superior derecho) de dos niños con DMG. las muestras de adNC cfse se analizaron en replicación, pero solo se muestra un gráfico representativo para cada tipo de muestra. Las gráficas dPCR muestran una generación exitosa de gotas, con 7-9 millones de gotas por PCR (la mayoría de las cuales son gotas negativas que no contienen ADN objetivo). Un mínimo de 7 millones de gotas por PCR indica bien una gota de caletización exitosa, mientras que menos de 7 millones indican un error del ensayo, en cuyo caso el usuario no debe proceder con el análisis de datos. La Figura 1 muestra una clara separación entre los cúmulos de mutantes y de tipo salvaje a lo largo de los ejes X e Y, respectivamente. Los sólidos cúmulos de tipo silvestre indican que la extracción del ADNcf se realizó correctamente porque el ADN de la plantilla está presente. Los cúmulos mutantes muestran un MAF de 1,60% y 39,92% para las muestras de plasma y LSN, respectivamente, lo que demuestra una detección positiva de la mutación. Para estos pacientes, los resultados de la dPCR están de acuerdo con el estado de la mutación tumoral, como se confirma mediante el análisis genómico del tejido tumoral de la biopsia8. El control negativo (panel inferior izquierdo) muestra 0 gotas mutantes y 0 gotas de tipo salvaje, lo que indica que no hubo contaminación de la mezcla de reacción de PCR. El gDNA del tejido tumoral de control positivo (panel inferior derecho) muestra la mutación que se detecta en la frecuencia alélica esperada para la muestra de tumor en particular seleccionada.
En la Figura2, se muestran resultados representativos para la detección fallida de la mutación de interés, H3F3A p.K27M, en cfDNA plasmático de un niño con DMG. El estado de la mutaciónse confirmó mediante un análisis genómico del tejido tumoral 8. Se muestran los resultados representativos de dos pozos de PCR replicados (paneles superiores). El número total de gotas, incluidas las gotas negativas, es de entre 7-9 millones por PCR, lo que indica una gota exitosa. Los racimos de tipo silvestre, trazados a lo largo del eje Y, muestran aproximadamente 7-8.000 gotas de tipo salvaje por pozo de PCR para el CFDNA plasmático, lo que indica una extracción exitosa del ADNcf (ya que hay ADN de tipo salvaje objetivo en la muestra). Sin embargo, se detectan 0 gotas mutantes en la muestra de plasma. El panel inferior izquierdo muestra control negativo (MB H2O) sin tipo salvaje o gotas mutantes; y el panel inferior derecho muestra el control positivo preamplificado tejido tumoral gDNA (0.025 ng) con detección de mutación positiva. Como se muestra en esta figura, la ausencia de detección de mutaciones en plasma puede no significar necesariamente que el paciente sea de tipo salvaje para la mutación de interés, ya que se producen falsos negativos8. En algunos casos, cuando se pierde la mutación en el plasma recogido en la biopsia inicial,se detecta en el plasma obtenido del mismo paciente en un momento posterior 8.
Figura 1 : Detección exitosa de H3F3A mutación p.K27M en plasma preamplificado y ADNr CSF de niños con gliomas de línea media. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Resultados negativos falsos obtenidos a partir del análisis de una muestra de ADNamiento plasmático preamplificado de un paciente conocido por albergar la mutación de interés, H3F3A p.K27M, en el tumor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Aquí hemos presentado nuestro método para detectar y cuantificar la frecuencia alélica de las mutaciones tumorales en cfDNA a partir de la biopsia líquida del paciente. Hacemos hincapié en los pasos críticos para el éxito de este método, incluido el procesamiento de muestras preanalíticas, la extracción de CFDNA, el diseño de ensayos de PCR y el análisis de datos. Para limitar el volumen de muestra utilizado, cfDNA se extrae de 1 ml de plasma, pero sólo 500 l de L de L de L de L de L de L de L. Al extraer de CSF, se utiliza el protocolo para la extracción de 1 ml de orina (siguiendo el manual 12 del kit de extracción de ADNación12), según la recomendación del fabricante. La diferencia en el volumen de muestra requerido entre plasma y LSN se debe a niveles más bajos de CFDNA específico stumoral en plasma en comparación con el LFC de pacientes con tumores cerebrales, lo que requiere mayores volúmenes de muestra para la detección de mutaciones8. Si la muestra está disponible, se puede extraer más de 1 ml de plasma para producir un mayor rendimiento del ADN. Sin embargo, en el caso de los pacientes pediátricos, es importante minimizar la cantidad de sangre utilizada siempre que sea posible, ya que incluso un procedimiento simple como la extracción de sangre es fatigoso para los pacientes pediátricos con cánceres sometidos a radioterapias. La extracción de 1 ml de alícuotas de plasma también permite replicar extracciones, de forma que el ensayo puede repetirse (por ejemplo, en casos de fallo en la extracción de ADN o contaminación de muestras).
En un esfuerzo por reducir cualquier uso de la muestra que no sea estrictamente necesario, cfDNA normalmente no se cuantifica. Sin embargo, hemos encontrado un rango de concentraciones de ADNes entre 0,2-2 ng/L y 0,6-13 ng/L en plasma y LSF, respectivamente. Dada la baja cantidad de ADNe cfDNA, y el hecho de que los alelos mutantes específicos del tumor están presentes a una frecuencia baja, es necesario un paso de preamplificación utilizando el mismo conjunto de imprimaciones utilizadas para la dPCR para aumentar significativamente la cantidad de ADN objetivo en la muestra, detección de mutaciones8. La dilución del producto preamplificado en el tampón de suspensión de ADN proporciona un volumen suficiente para réplicas técnicas, lo que ayuda a distinguir los verdaderos positivos. Debido a que el número de gotas mutantes puede ser bajo (por ejemplo, entre 0-2 gotas mutantes en una muestra de plasma), la inclusión de réplicas técnicas es clave para resolver el estado de la mutación. Mientras que un pozo de PCR puede producir 0 gotas mutantes, las otras dos pueden producir 1-2 para una sola muestra de plasma analizada en triplicado; por lo tanto, la inclusión de réplicas permite una mayor precisión a la hora de determinar el estado de la mutación. A continuación, el MAF se calcula como el promedio de los valores de réplica.
La preamplificación multiplexada (preamplificación de alelos silvestres y mutantes de dos mutaciones de interés) aumenta la utilidad de una sola muestra, ya que el mismo material de partida se puede utilizar para probar dos mutaciones. Es importante destacar que un producto de preamplificación multiplex se puede analizar en un solo plex durante dPCR para una mayor simplicidad, como se describe aquí. Sin embargo, tanto la PRER como la dPCR pueden multiplexarse. Al multiplexar, las condiciones deben optimizarse tanto para conjuntos de imprimaciones como para sondas: las temperaturas de recocido de imprimación deben ser similares a las que se ejecutan juntas en la amplificación de PCR, y las sondas deben diseñarse para generar clústeres distintos (basados en señal fluorescente y intensidad). Al validar un nuevo conjunto de imprimaciones y sondas, ejecute un gradiente de temperatura de recocido para determinar la temperatura de recocido óptima en función del rango sugerido por el fabricante. Antes de probar las sondas en muestras de ADNr del paciente, valide las construcciones de ADN sintético y/o gDNA de tejido tumoral de diferentes insumos (es decir, hasta 10 ng).
Para la detección de alelos mutantes con mayor especificidad y reducción de las desajustes en la hibridación de la sonda al ADN objetivo, se utilizan sondas de ácido nucleico (LNA) bloqueadas. LNA es un análogo de ácido nucleico con un puente de metileno queconecta el 2'-oxígeno y 4'-carbono del anillo de ribosa 9. El puente de metileno bloquea el ácido nucleico en una conformación rígida bicíclica que restringe la flexibilidad, aumenta la estabilidad de los dúplex térmicos y mejora la especificidad de la hibridación de la sonda para apuntar al ADN10,18, 19. Si existe una sola discordancia de base entre la sonda LNA y el ADN de la plantilla, la formación dúplex entre la sonda y el objetivo se desestabilizará. Como tal, las sondas LNA mejoran la especificidad de la unión de la sonda y dan como resultado una mayor relación señal-ruido11. El análisis del plasma y el LSF de pacientes pediátricos no enfermos del SNC ha establecido la especificidad de nuestro ensayo con sondas LNA dirigidas a H3F3A p.K27M, para determinar que una frecuencia alélica igual o inferior al 0,001% se considera un falso positivo 8. Para consideraciones adicionales para optimizar el diseño de sondas y imprimaciones, incluyendo contenido GC, tamaño de amplificación, colorantes de reportero de sonda y quenchers, consulte las directrices del fabricante dPCR14,17. Aunque nuestro método está optimizado para su uso con el sistema RainDance, el protocolo puede adaptarse para su uso con otras plataformas dPCR.
El método presentado aquí obtiene fuerza de la alta sensibilidad y el enriquecimiento objetivo logrado por dPCR, que sigue siendo la plataforma de elección para detectar mutaciones tumorales raras en cfDNA. Aunque es potente, el dPCR está limitado en el número de mutaciones que se pueden probar en un solo ensayo. Una alternativa a la dPCR es la secuenciación de próxima generación (NGS), que puede detectar múltiples mutaciones en muchos genes, aumentando la utilidad de una sola muestra. NGS puede detectar mutaciones en el LCP y el plasma de pacientes con gliomas de tronco cerebral20, sin embargo, actualmente es menos sensible que la dPCR en la detección de mutaciones tumorales en cfDNA, con límites de detección de 0.1-10% MAF en comparación con 0.001% en enfoques basados en PCR21 . dPCR también logra un tiempo de respuesta más rápido que el NGS, lo que permite una detección rápida de mutaciones de interés. El enfoque de PCR es aplicable en todos los tipos de cáncer y se puede ampliar para detectar mutaciones de puntos críticos y cfDNA22metilado.
La biopsia líquida está en su infancia y requerirá un mayor desarrollo para la adaptación a enfermedades específicas. El monitoreo tumoral en el contexto de la evolución tumoral será el próximo reto, donde sería necesaria una plataforma capaz de detectar mutaciones emergentes con alta sensibilidad. Además, las plataformas capaces de detectar una variedad de biomoléculas (péptidos, citoquinas, ARN) serán altamente beneficiosas a la hora de evaluar la respuesta tumoral al tratamiento, así como avanzar en intervenciones clínicas personalizadas.
Disclosures
El método descrito en este manuscrito se incluye en una solicitud de patente internacional "Métodos para la detección de biomarcadores de cáncer" de Javad Nazarian & Eshini Panditharatna.
Acknowledgments
Los autores quieren reconocer la generosidad de todos los pacientes y sus familias. Este trabajo fue apoyado por la financiación de la Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), la V Foundation (Atlanta, GA), The Gabriella Miller Kids First Data Resource Center, Clinical and Translational Science Institute at Children's National ( 5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), The Lilabean Foundation for Pediatric Brain Cancer Research (Silver Spring, MD), Childhood Brain Tumor Foundation (Germantown, MD), Children's Brain Tumor Tissue Consortium (Philadelphia, PA) y Rally Foundation for Childhood Cancer Research (Atlanta, GA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2 mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
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