Summary
Ici, nous présentons un protocole pour détecter des mutations somatiques de tumeur dans l'ADN circulant présent dans les fluides biologiques patients (biofluides). Notre méthode numérique de réaction en chaîne de polymérase de gouttelette (dPCR) permet de quantifier la fréquence allélique de mutation de tumeur (MAF), facilitant un complément mini-invasif au diagnostic et à la surveillance temporelle de la réponse de tumeur.
Abstract
Les complications associées à l'échantillonnage initial et chirurgical de tissu présentent le besoin des plates-formes mini-invasives capables de la sous-classification moléculaire et de la surveillance temporelle de la réponse de tumeur à la thérapie. Ici, nous décrivons notre méthode dPCR-basée pour la détection des mutations somatiques de tumeur dans l'ADN libre de cellules (CFDNA), facilement disponibles dans les biofluides patients. Bien que limitée dans le nombre de mutations qui peuvent être testées dans chaque essai, cette méthode fournit un niveau élevé de sensibilité et de spécificité. La surveillance de l'abondance de mutation, telle que calculée par MAF, permet l'évaluation de la réponse de tumeur à la thérapie, fournissant de ce fait un supplément bien nécessaire à la formation image radiographique.
Introduction
En raison des limitations dans la disponibilité du tissu tumoral pour des analyses moléculaires, il y a un besoin pour le développement des méthodes fortement sensibles capables de détecter des mutations somatiques de tumeur dans les biofluides patients, y compris le plasma, le sérum et le fluide céphalo-rachidien (CSF) . Par exemple, les gliomes diffus pédiatriques de ligne médiane (DMG) présentent un défi dû à leur emplacement neuroanatomique. Au cours de la dernière décennie, le profilage moléculaire des spécimens de tissu de DMG a découvert des mutations de conducteur dans ce type de tumeur1 et a indiqué l'hétérogénéité spatiale et temporelle des mutations, rendant la biopsie nécessaire pour caractériser un patient dans une maladie sous-groupe et la promotion de thérapies à visée moléculaire2. En tant que tel, les essais cliniques préconisent l'intégration des biopsies chirurgicales pour le profilage moléculaire des tumeurs au diagnostic initial3,4,5,6. Pendant le traitement, la surveillance de la réponse thérapeutique dans les DMG est limitée à MRI, qui manque de sensibilité pour détecter de petits changements ou l'évolution génomique de tumeur. MRI est également enclin à détecter la pseudoprogression, inflammation passagère à l'emplacement dela tumeur qui imite la vraie progression sur la formation image et peut désinformer l'interprétation de la réponse de tumeur 7. Ainsi, DMGs représentent un type de tumeur avec un besoin élevé d'un autre, moyen mini-invasif de détecter des mutations de tumeur et de surveiller la réponse clinique. Afin de répondre à ces besoins, nous avons développé et optimisé un protocole pour détecter, et quantifier la fréquence allélique des mutations detumeur dans cfDNA du plasma, du sérum et du CSF des enfants avec des gliomes de ligne médiane 8. Étant donné que les DGM de l'enfance sont souvent une mutation somatique de lysine-à-méthionine à la position 27 de la variante d'histone H3.1 (H3.1K27M, 20% des cas) ou H3.3 (H3.3K27M, 60% des cas)1, ces mutations et d'autres caractéristiques des DMG (c.-à-d., ACVR1, PIK3R1) ont été visées pour quantification de l'allele mutant à l'aide de cfDNA8. Cet analyse peut être adapté pour détecter les mutations hotspot dans d'autres types de tumeurs à l'aide d'amorces et de sondes spécifiques à la séquence. La polyvalence de cette approche la rend applicable à une variété de cancers qui bénéficieraient de l'intégration d'outils diagnostiques à base de cfDNA et d'une surveillance thérapeutique.
Pour détecter avec sensibilité les mutations de basse fréquence allélique dans cfDNA, nous employons une approche numérique de PCR de gouttelette (dPCR). Dans cette méthode, le mélange de réaction PCR est divisé en un maximum théorique de 10 millions de gouttelettes à l'aide de la plate-forme dPCR (par exemple, RainDance), avec 7-9 millions de gouttelettes par PCR bien vu expérimentalement. En raison du degré élevé de partitionnement de l'échantillon, au plus une à deux molécules d'ADN peuvent être présentes dans chaque gouttelette. L'amplification de PCR et l'hybridation de sonde fluorescente de séquence-spécifique peuvent se produire dans chaque gouttelette, de sorte que des millions de réactions aient lieu. Cela maximise la sensibilité et permet la détection d'allèles mutants rares, qui pourraient autrement passer inaperçus sur un fond d'ADN wildtype. L'utilisation de sondes d'acide nucléique verrouillé (LNA) améliore la spécificité de l'analyse en limitant l'hybridation de décalage et en soutenant la détection précise de mutation9,10,11. Ici, nous décrivons nos méthodes de traitement d'échantillon, d'extraction de cfDNA, de préamplification des alleles cibles, de dPCR et d'analyse de données.
Protocol
Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l'Institutional Review Board de l'Université de Californie à San Francisco (San Francisco, CA; la CISR #14-13895) et le Children's National Health System (Washington, D.C.; c'#1339). Des spécimens ont été recueillis et étudiés après avoir obtenu le consentement éclairé du patient ou du tuteur du patient.
1. Consentement des patients en vertu du Protocole de la CISR pour la collecte et l'entreposage des spécimens biologiques
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Recueillir des échantillons de patients après le consentement éclairé écrit est obtenu de chaque patient, ou le tuteur du patient, pour la participation à un essai clinique ou pour biorepository tel qu'approuvé par la Commission d'examen institutionnel respective.
- Les patients inclus dans cette étude ont été diagnostiqués avec une tumeur de cerveau radiographiquement. Aucun critère d'exclusion n'a été utilisé. Des spécimens ont été recueillis et étudiés après avoir obtenu le consentement éclairé du patient ou du tuteur du patient.
2. Collecte de sang et séparation du plasma ou du sérum
- Recueillir l'échantillon de sang à l'aide d'un prélèvement de 10,0 ml dans les tubes de collecte de sang. Si vous collectez du sang pour le plasma, utilisez des tubes K2- ou K3-EDTA, héparine ou cfDNA. Si vous collectez du sang pour le sérum, utilisez des tubes à pare-gel contenant l'activateur de caillots et le gel pour séparer le sérum.
REMARQUE: Alors que 10 ml est recommandé pour permettre de reproduire des expériences, un minimum de 3 ml suffira. - Inversion prudemment du tube de collecte 10 fois pour mélanger l'échantillon de sang avec les réactifs du tube de collecte.
- Laissez les échantillons de sang à partir desquels le sérum sera prélevé à température ambiante pendant 30 min pour permettre au sang de clot. Si le traitement du sang pour obtenir du plasma, procéder immédiatement à l'étape 2.4.
REMARQUE: Les échantillons traités pour le plasma peuvent être conservés sur la glace pendant un maximum de 2 h avant la centrifugation. Cependant, une transition rapide du prélèvement sanguin au traitement minimise la dégradation de l'ADNc. - Centrifuger les tubes de collecte de sang à 2 000 x g pendant 15 min dans une centrifugeuse fixée à 4 oC pour séparer le plasma ou le sérum des couches de globules blancs et rouges.
- En prenant soin de ne pas déranger la couche de globules blancs (qui forme une mince ligne entre la couche supérieure de plasma/sérum et la couche inférieure des globules rouges emballés), pipette la couche supérieure de plasma/sérum (qui peut être claire, jaune, ou rose dans la couleur) également dans 1 ml aliquots en cryovials stériles à bouchon de vis en polypropylène.
- Enregistrez le numéro d'identification du sujet, le type de spécimen (plasma ou sérum) et la date de collecte sur l'étiquette des cryovials.
- Conserver les cryovials dans le congélateur de -80 oC jusqu'à l'utilisation. Si un congélateur de -80 oC n'est pas disponible, entreposez les échantillons à -20 oC pendant une semaine.
3. Collecte et traitement CSF
- Recueillir CSF à partir d'un shunt, ponction lombaire, ou la chirurgie.
REMARQUE: De telles procédures ne devraient être effectuées que si les cliniciens le jugent nécessaire. Un échantillon supplémentaire au-delà de ce qui est nécessaire pour une utilisation clinique peut être utilisé à des fins de recherche. - Mesurer le volume de CSF collecté et noter sa couleur (sanglante, jaune, claire).
- Centrifuger le tube de collecte à 10 000 x g pendant 10 min à 4 oC pour granuler les débris cellulaires.
- Transférer le supernatant CSF également en 500 aliquots ll dans des cryovials de bouchon de vis de polypropylène.
- Enregistrez le numéro d'identification du sujet, le type de spécimen et la date de la collecte des spécimens sur l'étiquette des cryovials. Conserver à -80 oC jusqu'à utilisation.
4. Extraction de cfDNA à partir de spécimens liquides
- Effectuer le protocole d'extraction de cfDNA selon les instructions dans le manuel du kit d'extraction cfDNA12.
- Nettoyez l'espace et l'équipement du banc avec 10 % d'eau de Javel et 70 % d'éthanol.
REMARQUE: L'utilisation d'une hotte PCR, le changement régulier de gants et la décontamination fréquente de l'espace et de l'équipement du banc avec 10 % d'eau de Javel et 70 % d'éthanol pendant toutes les étapes du protocole sont importants pour éviter la contamination par l'échantillon. - Préparer des aliquots de réactifs, par exemple, laver les tampons, à partir de la trousse d'extraction pour éviter la contamination croisée.
- Nettoyez l'espace et l'équipement du banc avec 10 % d'eau de Javel et 70 % d'éthanol.
- Décongeler les échantillons de patients sur la glace avant de commencer l'extraction. Pour le plasma/sérum, décongeler 1 mL d'aliquot d'échantillon. Pour cSF, décongeler 500 aliquot ll d'échantillon.
REMARQUE: Les étapes de lysis (4.5-4.8) du protocole d'extraction diffèrent entre le plasma/sérum et le CSF, mais à partir de l'étape 4.9, le protocole est identique pour les deux types de biofluides. - Définir un bloc de chauffage à 60 oC pour une utilisation pendant l'étape de lyse (4,6).
- Préparer le tampon de lyse et le mélange d'ARN porteur dans un tube de 15 ml en ajoutant 5,6 l d'ARN porteur et 0,9 ml de tampon de lyse par échantillon12.
- Pour le plasma/sérum, ajouter 100 l de protéase K, 1 ml d'échantillon et 0,8 ml de mélange d'ARN tampon/porteur de lyse préparé à l'étape 4,4 à un tube étiqueté de 2,0 ml. Mélanger par le tourbillon d'impulsion pour 30 s à grande vitesse12.
- Pour le CSF, ajouter 125 l de protéase K, 500 oL de l'échantillon, 1 ml de mélange d'ARN de lyse tampon/porteur, et 250 tampons de lyse tissulaire ll dans un tube de 2,0 mL. Porter le volume complet jusqu'à 2 ml en ajoutant 125 L de 1x saline tamponnée par phosphate (PBS). Mélanger par le tourbillon d'impulsion pour 30 s à grande vitesse12.
- Incuber des échantillons pendant 30 min à 60 oC dans le bloc chauffant12.
- Retirer les échantillons du bloc de chauffage et abaisser la température à 56 oC. Retourner les échantillons sur le banc et transférer le lysate dans de nouveaux tubes étiquetés de 15 ml.
- Pour le plasma/sérum, ajouter 1,8 mL de tampon de liaison d'acide nucléique pour 30 s en pulsant le vortex12.
- Pour CSF, ajouter 3,6 mL de tampon de liaison d'acide nucléique et mélanger pendant 30 s en pulsant le vortex12.
- Incuber des échantillons pendant 5 min sur la glace12.
- Insérez la colonne dans le connecteur à vide. Ouvrez la colonne et insérez un prolongateur de tube de 20 ml dans la colonne12.
- Pipette le contenu du tube de 15 ml directement dans le fond de l'extenseur de tube, en évitant de laisser des gouttelettes sur les parois de l'extenseur de tube.
- Avec le commutateur du connecteur à vide fermé, allumez la pompe à vide. Une fois que la pression a construit à 900 mbar, ouvrez la valve du connecteur à vide. L'échantillon va maintenant circuler à travers la colonne.
- Une fois que tout le lysate a été drainé de la colonne, éteignez la pompe et ouvrez la trappe au connecteur de vide, soulageant le gradient de pression. Une fois que la pression atteint 0 mbar, fermez la valve du connecteur à vide et de la trappe.
- Retirez l'extenseur de tube de 20 ml, en prenant soin de ne pas passer l'extenseur d'une colonne au-dessus d'une colonne voisine, car cela peut contaminer des échantillons. Disposer de l'extenseur de tube.
- Ajouter 600 l de tampon de lavage au premier tampon de lavage à la colonne12.
- Laissez les couvercles des tubes ouverts et allumez la pompe à vide. Laissez la jauge de pression atteindre 900 mbar, puis tournez l'interrupteur sur le connecteur à vide à la position ouverte pour dessiner le tampon de lavage à travers la colonne.
- Éteignez la pompe à vide, ouvrez la trappe pour relâcher la pression et soulagez la pression à 0 mbar. Tourner la soupape du connecteur à vide à la position fermée.
- Ajouter 750 l de tampon de lavage à la colonne et répéter les étapes 4.16-4.1712.
- Ajouter 750 L d'éthanol de qualité MB à la colonne et répéter les étapes 4.16-4.1712.
- Fermez le couvercle de la colonne et placez la colonne à l'intérieur d'un nouveau tube de collecte de 2,0 ml. Disposer du connecteur à vide12.
- Centrifuger le tube avec la colonne à 20.000 x g pendant 3 min à température ambiante12.
- Placez la colonne dans un nouveau tube de collecte et ouvrez le couvercle du tube. Placer un tissu de laboratoire sur le dessus et couver à 56 oC pendant 10 min12.
- Placez la colonne dans un tube propre de 1,5 mL PCR-propre et pipette 100 L de tampon d'élution (ou de biologie moléculaire de grade H2O (MB H2O)) directement au centre de la colonne. Ne touchez pas la colonne avec une pointe de pipette. Fermer le couvercle et laisser à température ambiante pendant 3 min.
- Centrifugeuse à 20 000 x g à température ambiante pendant 1 min à elute cfDNA12.
- Pipette l'éluate de nouveau dans la colonne et incuber à température ambiante pendant 3 min.
- Répétez la centrifugation à pleine vitesse pendant 1 min pour élifier cfDNA une deuxième fois pour augmenter le rendement (selon la recommandation du fabricant).
- Entreposez l'ADNc dans des tubes pcR-nettoyants sans Étiquette d'Adn-NAse/RNase à 4 oC ou passez directement à l'étape 5.
5. Concentration de vide de cfDNA
- Insérez et équilibrez les tubes contenant de l'ADNc éliqué dans les supports du concentrateur à vide. Ouvrez les couvercles des tubes. Fixer la température du concentrateur sous vide à 23 oC.
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Allumez le concentrateur à vide, puis allumez le piège à vapeur. Échantillons de centrifugeuse pendant 40 min ou jusqu'à ce qu'un volume final de 10,5-11 L soit atteint.
- Si le volume est inférieur à 10,5 L, ajoutez un tampon de suspension d'ADN ou mb H2O pour atteindre un volume final de 10,5 l.
- Pipette le plein volume le long des parois du tube pour enlever les fragments d'ADN résiduels.
- Brièvement centrifuger les échantillons sur une centrifugeuse de table pour recueillir des gouttelettes sur les parois des tubes.
- Passez directement à l'étape de préamplification (étape 8) ou entreposez les échantillons à 4 oC.
- Enveloppez les couvercles des tubes dans un film de laboratoire pour éviter la contamination s'ils sont entreposés pour une utilisation ultérieure.
6. Conception et préparation des amorces et des sondes
- Concevez des amorces avant et inversées, et des sondes LNA wildtype et mutantes, pour la cible (s) d'intérêt. Commandez commercialement des amorces et des sondes lyophilisées (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE : Les séquences pour les amorces et les sondes ciblant H3F3A p.K27M et d'autres mutations cibles pour les gliomes pédiatriques de la ligne médiane peuvent être trouvées dans le tableau 3 supplémentaire de Panditharatna et al., 20188. - Avant d'ouvrir les amorces et les sondes lyophilisées, centrifuger brièvement les tubes. Ajoutez le volume approprié de tampon de suspension d'ADN ou de MB H2O, comme indiqué sur la feuille de spécification du produit, pour resuspendre les amorces et les sondes lyophilisées à une concentration de 100 M.
- Vortex doucement, pipette de haut en bas plusieurs fois pour mélanger et brièvement centrifugeuses amorces et sondes à l'aide d'une centrifugeuse de table.
- Préparer 10 aliquots M d'amorces et de sondes en ajoutant 10 'L de 100 'M stock à 90 'L de tampon de suspension d'ADN ou MB H2O.
- Préparer 1 aliquots M d'amorces avant et arrière (à utiliser pour la préamplification), en ajoutant 10 L de l'amorce de 10 M à 90 L de tampon de suspension d'ADN ou MB H2O.
- Entreposez les amorces et les sondes à 4 oC dans des contenants foncés hermétiques. Enroulez le film de laboratoire autour des couvercles pour éviter la contamination, et couvrez les sondes dans du papier d'aluminium pour éviter l'exposition à la lumière. Entreposez les sondes à -20 oC pour le stockage à long terme si elles ne sont pas utilisées régulièrement.
7. Sélection de contrôles positifs
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Sélectionnez l'échantillon génomique d'ADN (gDNA) de tissu de tumeur avec la concentration connue d'ADN, qui héberge la mutation d'intérêt à une fréquence allélique connue pour être employée comme contrôle positif.
- Utilisez 0,025 ng d'ADN de tissu tumoral témoin positif dans l'étape de préamplification (étape 8).
REMARQUE : Cette entrée d'ADN fournit un signal positif robuste sur dPCR (tel que déterminé en effectuant des dilutions sérielles du tissu tumoral gDNA hébergeant la mutation H3F3A p.K27M8) tout en minimisant la quantité d'échantillon exigée.
- Utilisez 0,025 ng d'ADN de tissu tumoral témoin positif dans l'étape de préamplification (étape 8).
8. Préamplification des alleles cibles
REMARQUE: Protocole de préamplification est selon Jackson et al., 201613.
- Nettoyez l'espace et l'équipement du banc avec 10 % d'eau de Javel et 70 % d'éthanol.
- Obtenir 1 M d'amorces avant et inverse, des échantillons d'ADNc, des contrôles positifs de l'ADNg, et le mélange maître de polymérase d'ADN, et mis sur la glace.
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Calculer le volume de réactifs nécessaires pour préamplifier le nombre désiré d'échantillons d'ADNc et de contrôle positif, pour la préamplification du singleplex ou du multiplex comme suit :
- Pour la préamplification monoplex (pour préamplifier les alloues de type sauvage et mutant pour une seule mutation d'intérêt), préparer le mélange de réaction PCR en ajoutant 17,5 L de mélange maître de polymérase d'ADN, et 3,5 L d'amorces avant et inverses (100 nM) par échantillon13.
- Pour la préamplification multiplex (pour préamplifier deux ensembles d'alleles de type sauvage et mutant pour deux mutations d'intérêt), préparer le mélange de réaction PCR en ajoutant 17,5 L de mélange maître de polymérase d'ADN et 1,75 l de chaque ensemble d'amorces avant et inverses (50 nM) par échantillon 13.
REMARQUE : Préparer suffisamment de mélange de réaction PCR pour le nombre d'échantillons plus 10 % de plus pour tenir compte de toute erreur de pipetage.
- Distribuer 24,5 L de mélange de réaction PCR dans chaque puits d'un tube à bande PCR 8-puits13.
- Distribuer 10,5 L d'échantillon d'ADN dans le puits approprié pour porter le volume total de réaction à 35 L13. Doucement pipette le volume complet de haut en bas 10 fois pour mélanger.
- Effectuer l'amplification de PCR à 98 oC pendant 3 min; 9 cycles de 98 oC pour 10 s, température d'annealing pendant 3 min, 72 oC pour 30 s; et une extension à 72 oC pour 2 min13.
- Transférer le volume complet du produit préamplifié sur des tubes PCR-clean sans DNase/RNase étiquetés et diluer dans un tampon de suspension d'ADN TE de 140 L (pH 8,0)13.
- Envelopper les couvercles des tubes dans un film de laboratoire. Entreposer le produit préamplifié à 4 oC. Pour la conservation à long terme, conserver à -20 oC.
9. Détection et quantification de l'ADN cible à l'aide du dPCR
- Nettoyez l'espace et l'équipement du banc avec 10 % d'eau de Javel et 70 % d'éthanol.
- Définir sur la glace 10 amorces et sondes, génotypage et échantillons d'ADN. Conserver l'huile stabilisatrice à température ambiante.
- Vortex doucement et brièvement centrifuger tous les réactifs sauf huile stabilisatrice gouttelette.
- Assurez-vous que la bouteille de gaz d'azote comprimé fixée à l'instrument générateur de gouttelettes et à l'instrument de quantification (Table of Materials) est fixée à 90 psi.
- Allumez l'instrument générateur de gouttes et l'ordinateur avec le logiciel de l'instrument. Lancez le logiciel et cliquez sur Démarrer initialiser.
- Exécuter une chasse d'eau haute pression sur l'instrument de génération de gouttes s'il n'a pas été utilisé en une semaine ou plus.
- Préparer le mélange de réaction dPCR pour 8 puits du tube à bande PCR plus 10 % de plus, en ajoutant 220 L de mélange maître de génotypage, 8,8 L chacun de 10 sondes de type sauvage et mutant, 39,6 L chacun de 10 apprêts avant et inversés, et 17,6 l d'huile stabilisatrice de gouttelettes14 /c0 >.
- Mélanger délicatement le mélange de réaction dPCR en pipetting le volume complet de haut en bas 10-20 fois. Ne pas vortex ou centrifugeuse après que l'huile stabilisatrice de gouttelette a été ajoutée au mélange de réaction.
- Obtenir un tube à bande PCR 8-puits et distribuer 38 L de mélange de réaction dPCR directement dans le fond de chaque puits14. Retirez les bulles avec une pointe de pipette propre.
REMARQUE: Les tubes à bande PCR qui sont imbriqués ou serrés serrés peuvent entraîner des charges électriques statiques, provoquant la coalescence et un signal bruyant lors de l'analyse des données dPCR. Pour éviter cela, aliquot tubes bande dans des sacs de biorisque séparés, éviter de sur-emballer les sacs, et garder les tubes de frotter ensemble. - Ajouter 12 L d'échantillon d'ADN préamplifié aux puits appropriés du tube à bande PCR. Pour le contrôle négatif, ajouter 12 'L de MB H2O.
REMARQUE: Analyser les échantillons d'ADNc dans des puits de repli. Pour CSF, analysez au moins en double, et pour le plasma/sérum analyser chaque échantillon en triple. - Doucement pipette le volume complet de haut en bas 10 fois pour mélanger le mélange de réaction avec l'échantillon d'ADN.
- Obtenir une nouvelle puce d'instrument génératrice de gouttelettes et pipette le volume complet des puits 1-8 du tube à bande PCR dans les canaux correspondants A-H dans la puce. Évitez de toucher le fond des canaux avec une pointe de pipette.
- Obtenir un nouveau tube à bande PCR propre et insérer dans l'instrument générateur de gouttelettes. Numérisez ou entrez manuellement l'ID de puce d'instrument générateur de gouttelettes dans le logiciel de l'ordinateur de l'instrument. Entrez les noms pour chacun des 8 canaux. Cliquez sur Démarrer la course pour commencer à déposer des échantillons.
- Lorsque la gouttelette est terminée, retirez le tube à bande PCR et appliquez des bouchons de tube à bande.
- Transférer le tube à bande à un cycleur thermique et équilibrer avec un autre tube à bande contenant 80 l d'eau par puits.
- Programme des conditions de cycle thermique14 comme : 95 oC pendant 10 min; 45 cycles de deux températures : 95 oC pour 30 s et température d'annealing pendant 2 min; 98 oC pendant 10 min; et maintenez à 10 oC.
- Fixez le taux de rampe à 0,5 oC/s et fixez le volume de l'échantillon à 80 l14.
- Lorsque le cycle thermique est terminé, retirez le tube à bande et transférez-le à l'instrument de quantification. Retirez les bouchons à bande PCR et remplacez-les par des bouchons à grande vitesse.
- Allumez l'instrument de quantification et l'ordinateur connecté avec un logiciel d'instrument. Lancez le logiciel d'instrument et cliquez sur Setup a Run.
- Placez le tube à bande dans l'instrument de quantification.
- Obtenir une nouvelle puce d'instrument de quantification et numériser ou entrer manuellement l'ID de puce dans l'instrument. Insérez la puce dans la machine.
- Placez le bouclier métallique sur le dessus de la puce et fermez le couvercle de l'instrument.
- Dans le logiciel informatique, entrez un nom pour l'exécution dPCR et pour chacun des 8 canaux (A-H). Sélectionnez Mode rapide (qui doit être utilisé avec des bouchons à grande vitesse) et cliquez sur Démarrer pour commencer la quantification.
- Lorsque la quantification est terminée, retirez le bouclier métallique (à enregistrer et à réutiliser) et jetez-le du tube et de la puce de bande PCR. Sur l'ordinateur d'instrument, le run Log contiendra des fichiers de résultats pour chaque exécution. Utilisez les fichiers .fcs pour chaque échantillon à analyser avec le logiciel d'analyste.
10. Analyse des données
- Lancez le logiciel d'analyste et ouvrez les fichiers .fcs pour analyser les données spectrales brutes. Sous Analyse View, sélectionnez Intact. Sous sample View, cliquez sur les cases à côté de chacun des 8 échantillons afin qu'il y ait une coche dans chaque case. Le logiciel tracera des signaux pour le mutant (FAM) et wildtype (HEX) allèle le long des x- et y-axes, respectivement.
- Utilisez la fonction de matrice calculée pour demander la compensation spectrale sur les gouttelettes intactes, selon les instructions du fabricant15.
- Ajuster les paramètres de l'axe sous Axis Options. Définir l'axe X à un minimum de 0 et un maximum de 30 000, et l'axe y à un minimum de -5 000 et un maximum de 10 000. Lorsque des amas de gouttelettes ont été identifiés, ajustez les axes pour réduire l'espace vide dans le graphique.
REMARQUE: La position des amas mutants et sauvages dépendra des sondes utilisées, du fluorophore et de leur concentration. - Sélectionnez l'échantillon correspondant à l'ADNc de tissu de tumeur de contrôle positif pour définir les barrières négatives (cluster le plus proche de l'origine), mutantes (cluster le plus proche de l'axe X) et wildtype (cluster le plus proche de l'axe y). Assurez-vous que les grappes sont distinctes et facilement identifiées dans un résultat d'action réussi.
- Appliquer les paramètres de la porte pour le contrôle positif à tous les échantillons en cliquant à droite sur l'échantillon de contrôle positif et en cliquant sur l'option d'appliquer tous les paramètres à des échantillons sélectionnés.
- Sous la vue graphique, cliquez sur l'onglet Échantillons multiples pour afficher les parcelles de tous les échantillons sélectionnés. Exporter l'image comme un . Fichier TIF.
- Sous l'onglet Espace de travail en haut à gauche de l'écran, sélectionnez Analyse d'exportation (csv) et enregistrez le fichier de données analysé s'il s'adresse à un fichier .csv.
- Ouvrez le fichier .csv dans le logiciel de tableur pour afficher les comptes de gouttelettes négatives, wildtype et mutantes pour chaque échantillon. Calculez le MAF en divisant le nombre de gouttelettes mutantes corrigées par la somme du mutant corrigé Poisson plus des nombres de gouttelettes de type sauvage pour chaque échantillon.
REMARQUE: Utilisez le décompte corrigé de Poisson parce que les statistiques de Poisson expliquent que les gouttelettes positives peuvent contenir plus d'une seule copie de l'ADN cible, et donc résumer les gouttelettes positives peut ne pas donner un compte exact16.
Representative Results
La figure 1 montre des résultats représentatifs pour la détection réussie de la mutation H3F3A p.K27M dans le plasma préamplifié (panneau supérieur gauche) et l'ADNc CSF (panneau supérieur droit) de deux enfants atteints de DMG. cfDNA échantillons ont été analysés en réplique, mais un seul graphique représentatif est montré pour chaque type d'échantillon. Les parcelles dPCR montrent la génération réussie de gouttelettes, avec 7-9 millions de gouttelettes par puits de PCR (dont la plupart sont des gouttelettes négatives qui ne contiennent pas d'ADN cible). Un minimum de 7 millions de gouttelettes par puits PCR indique une dropletisation réussie, tandis que moins de 7 millions indiquent une défaillance de l'analyse, auquel cas l'utilisateur ne devrait pas procéder à l'analyse des données. La figure 1 montre une séparation claire entre les amas mutants et les amas de type sauvage le long des axes x et y, respectivement. Les grappes robustes de type sauvage indiquent que l'extraction de cfDNA a été réussie parce que l'ADN de modèle est présent. Les amas mutants montrent un MAF de 1,60% et 39,92% pour les échantillons de plasma et de CSF, respectivement, démontrant la détection positive de la mutation. Pour ces patients, les résultats de dPCR sont en conformité avec l'état de mutation de tumeur, comme confirmé par l'analyse génomique du tissu de tumeurdebiopsie 8. Le contrôle négatif (panneau inférieur gauche) montre 0 gouttelettes mutantes et 0 wildtype, ce qui indique qu'il n'y a pas eu de contamination du mélange de réaction PCR. Le gDNA positif de tissu de tumeur de contrôle (panneau droit inférieur) montre la mutation étant détectée à la fréquence allélique prévue pour l'échantillon particulier de tumeur choisi.
Dans la figure 2, des résultats représentatifs sont montrés pour la détection infructueuse de la mutation d'intérêt, H3F3A p.K27M, dans la cfDNA plasmatique d'un enfant avec DMG. L'état de mutation a étéconfirmé par l'analyse génomique du tissu de tumeur 8. Les résultats représentatifs de deux puits PCR répliqués sont affichés (panneaux supérieurs). Le nombre total de gouttelettes, y compris les gouttelettes négatives, se situe entre 7 et 9 millions par puits PCR, ce qui indique une baisse réussie. Les amas de type sauvage, tracés le long de l'axe y, montrent environ 7 à 8 000 gouttelettes de type sauvage par puits PCR pour l'ADNc plasmatique, ce qui indique une extraction réussie de l'ADNc (car il y a de l'ADN sauvage cible dans l'échantillon). Cependant, 0 gouttelettes mutantes sont détectées dans l'échantillon plasmatique. Le panneau inférieur gauche montre un contrôle négatif (MB H2O) sans wildtype ou gouttelettes mutantes; et le panneau inférieur droit montre le contrôle positif préamplifié gDNA tissu tutueux (0,025 ng) avec détection de mutation positive. Comme le montre ce chiffre, l'absence de détection de mutation dans le plasma peut ne pas nécessairement signifier que le patient est wildtype pour la mutation d'intérêt, comme de faux négatifs se produisent8. Dans certains cas, lorsque la mutation est manquée dans le plasma recueilli à la biopsie initiale, il est détecté dans le plasma obtenu à partir du même patient à un moment ultérieur8.
Figure 1 : Détection réussie de H3F3A H3F3A mutation de p.K27M dans le plasma préamplifié et l'ADNc cfDNA de CSF des enfants avec des gliomes de midline. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Faux résultats négatifs obtenus à partir de l'analyse d'un échantillon préamplifié de cfDNA plasmatique d'un patient connu pour abriter la mutation d'intérêt, H3F3A H3F3A p.K27M, dans la tumeur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Ici nous avons présenté notre méthode pour détecter et quantifier la fréquence allélique des mutations de tumeur dans cfDNA de la biopsie liquide patiente. Nous mettons l'accent sur les étapes critiques pour le succès de cette méthode, y compris le traitement pré-analytique de l'échantillon, l'extraction de l'ADNc, la conception des analyses PCR et l'analyse des données. Pour limiter le volume d'échantillon utilisé, l'ADNccf est extrait de 1 ml de plasma, mais seulement 500 L de CSF. Lors de l'extraction de CSF, le protocole pour l'extraction de 1 ml d'urine (suivant le manuel du kit d'extraction de l'ADNc12) est utilisé, conformément à la recommandation du fabricant. La différence dans le volume d'échantillon exigé entre le plasma et cSF est due aux niveaux plus bas de cfDNA tumeur-spécifique dans le plasma comparé à CSF des patients présentant des tumeurs de cerveau, nécessitant de plus grands volumes d'échantillon pour la détectiondemutation 8. Si l'échantillon est disponible, plus de 1 ml de plasma peut être extrait pour produire un rendement d'ADN plus élevé. Cependant, dans le cas des patients pédiatriques, il est important de réduire au minimum la quantité de sang utilisée chaque fois que possible, car même une procédure simple telle que le prélèvement de sang est fatigante pour les patients pédiatriques avec des cancers subissant des thérapies de rayonnement. L'extraction d'aliquots de 1 ml de plasma permet également de reproduire les extractions, de sorte que l'analyse peut être répétée (par exemple, en cas d'échec dans l'extraction de l'ADN ou la contamination de l'échantillon).
Dans un effort pour réduire toute utilisation d'échantillon qui n'est pas strictement nécessaire, cfDNA n'est généralement pas quantifié. Cependant, nous avons trouvé une gamme de concentrations de cfDNA entre 0.2-2 ng/L et 0.6-13 ng/L dans le plasma et cSF, respectivement. Compte tenu de la faible quantité d'ADNc cf, et le fait que les allèles mutants spécifiques à la tumeur sont présents à une basse fréquence, une étape de pré-amplification en utilisant le même ensemble d'amorces utilisées pour dPCR est nécessaire pour augmenter considérablement la quantité d'ADN cible dans l'échantillon, aidant à détection de mutation8. La dilution du produit préamplifié dans le tampon de suspension d'ADN fournit un volume suffisant pour les répliques techniques, ce qui aide à distinguer les vrais positifs. Étant donné que le nombre de gouttelettes mutantes peut être faible (par exemple, entre 0-2 gouttelettes mutantes dans un échantillon de plasma), l'inclusion de répliques techniques est essentielle pour résoudre le statut de mutation. Tandis qu'un PUITS de PCR peut produire 0 gouttelettes mutantes, les deux autres peuvent donner 1-2 pour un échantillon simple de plasma analysé dans le triplicate ; ainsi, l'inclusion des répliques permet une plus grande précision lors de la détermination du statut de mutation. Le MAF est ensuite calculé comme la moyenne des valeurs de repli.
La préamplification multiplexée (préamplification du type sauvage et des allèles mutants de deux mutations d'intérêt) augmente l'utilité d'un seul échantillon, car le même matériau de départ peut être utilisé pour tester deux mutations. Fait important, un produit de préamplification multiplex peut être analysé en singleplex pendant dPCR pour une plus grande simplicité, comme décrit ici. Cependant, pcR de préamplification et dPCR peuvent être multiplexed. Lors du multiplexage, les conditions doivent être optimisées pour les deux ensembles d'amorces et de sondes : les températures d'annelage des amorces doivent être similaires à celles qui s'exécutent ensemble dans l'amplification du PCR, et les sondes doivent être conçues pour générer des amas distincts (basés sur le signal fluorescent et intensité). Lors de la validation d'un nouvel ensemble d'amorces et de sondes, exécutez un gradient de température annealing pour déterminer la température d'annealing optimale basée sur la gamme suggérée par le fabricant. Avant de tester les sondes sur des échantillons patients d'ADNc, validez-les à l'aide de constructions d'ADN synthétiqueets et/ou d'adans de tissus tumoraux de différentes entrées (c.-à-d. jusqu'à 10 ng).
Pour la détection des allèles mutants avec une plus grande spécificité et des décalages réduits dans l'hybridation de la sonde à l'ADN cible, des sondes verrouillées d'acide nucléique (LNA) sont utilisées. LNA est un analogue d'acide nucléique avec un pont de méthylène reliant le 2'-oxygène et 4'-carbone de l'anneau de ribose9. Le pont de méthylène verrouille l'acide nucléique dans une conformation biccyclique rigide qui limite la flexibilité, augmente la stabilité thermique duplex, et améliore la spécificité de l'hybridation de sonde pour cibler l'ADN10,18, 19. S'il existe un décalage de base unique entre la sonde LNA et l'ADN du modèle, la formation duplex entre la sonde et la cible se déstabilisera. En tant que tel, les sondes LNA améliorent la spécificité de la liaison de sonde et donnent lieu à un rapport signal-bruit plus élevé11. L'analyse du plasma et du CSF des patients pédiatriques non-CNS-diseased a établi la spécificité de notre analyse avec des sondes de LNA ciblant H3F3A p.K27M, pour déterminer qu'une fréquence allélique égale ou inférieure à 0.001% est considérée un faux positif 8. Pour des considérations supplémentaires pour optimiser la conception des sondes et des amorces, y compris le contenu de GC, la taille d'amplicon, les colorants de journaliste de sonde, et les quenchers, se référer aux directives de fabricant de dPCR14,17. Bien que notre méthode soit optimisée pour une utilisation avec le système RainDance, le protocole peut être adapté pour une utilisation avec d'autres plates-formes dPCR.
La méthode présentée ici tire la force de la sensibilité élevée et de l'enrichissement cible réalisé par dPCR, qui reste la plate-forme de choix pour détecter les mutations tumorales rares dans cfDNA. Bien que puissant, dPCR est limité dans le nombre de mutations qui peuvent être testés dans un seul essai. Une alternative au dPCR est le séquençage de prochaine génération (NGS), qui peut détecter des mutations multiples à travers de nombreux gènes, augmentant l'utilité d'un seul échantillon. NGS peut détecter des mutations dans CSF et plasma des patients présentant des gliomes de tronc cérébral20,cependant, est actuellement moins sensible que dPCR à détecter des mutations de tumeur dans cfDNA, avec des limites de détection de 0.1-10% MAF comparé à 0.001% dans les approches PCR-basées21 . dPCR réalise également un délai d'exécution plus rapide que NGS, permettant la détection rapide des mutations d'intérêt. L'approche PCR est applicable à tous les types de cancer et peut être étendue pour détecter les mutations des points chauds et l'ADNc22méthylé22 .
La biopsie liquide en est en effet à ses balbutiements et nécessitera un développement plus approfondi pour s'adapter à des maladies spécifiques. La surveillance tumorale dans le contexte de l'évolution tumorale sera le prochain défi, où une plate-forme capable de détecter les mutations émergentes avec une sensibilité élevée serait nécessaire. En outre, les plates-formes capables de détecter une variété de biomolécules (peptides, cytokines, ARN) seront très bénéfiques dans l'évaluation de la réponse tumorale au traitement, ainsi que l'avancement des interventions cliniques personnalisées.
Disclosures
La méthode décrite dans ce manuscrit est incluse dans une demande internationale de brevet "Méthodes pour détecter les biomarqueurs du cancer" par Javad Nazarian et Eshini Panditharatna.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent souligner la générosité de tous les patients et de leurs familles. Ce travail a été soutenu par le financement de la Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), la V Foundation (Atlanta, GA), Le Gabriella Miller Kids First Data Resource Center, Clinical and Translational Science Institute at Children's National ( 5UL1TR001876-03), Musella Foundation (Hewlett, NY), Matthew Larson Foundation (Franklin Lake, NJ), The Lilabean Foundation for Pediatric Brain Cancer Research (Silver Spring, MD), Childhood Brain Tumor Foundation (Germantown, MD), the Children's Brain Tumor Tissue Consortium (Philadelphie, PA), et Rally Foundation for Childhood Cancer Research (Atlanta, GA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2 mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
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