Summary
Aqui, nós apresentamos um protocolo para detectar mutações somáticas do tumor no ADN de circulação atual nos líquidos biológicos pacientes (biofluids). Nosso método baseado da reacção em cadeia digital do polymerase da gota (dpcr)-permite a quantificação da freqüência alélicas da mutação de tumor (MAF), facilitando um complemento minimamente invasor ao diagnóstico e à monitoração temporal da resposta do tumor.
Abstract
As complicações associadas à amostragem inicial e repetida do tecido cirúrgico apresentam a necessidade de plataformas minimamente invasivas capazes de subclassificação molecular e monitorização temporal da resposta tumoral à terapêutica. Aqui, nós descrevemos nosso método dPCR-baseado para a deteção de mutações somáticas do tumor no ADN livre da pilha (cfDNA), prontamente-disponível em biofluids pacientes. Embora limitado no número de mutações que podem ser testadas para em cada ensaio, este método fornece um nível elevado de sensibilidade e de especificidade. A monitoração da abundância da mutação, como calculada por MAF, permite a avaliação da resposta do tumor à terapia, fornecendo desse modo um suplemento muito-necessário à imagem latente radiográfica.
Introduction
Devido às limitações na disponibilidade do tecido do tumor para análises moleculars, há uma necessidade para o desenvolvimento de métodos altamente sensíveis capazes de detectar mutações somáticas do tumor em biofluids pacientes, incluindo o plasma, o soro e o líquido cerebrospinal (CSF) . Por exemplo, os gliomas difusos pediátricos da linha média (DMGs) apresentam um desafio devido a sua posição neuroanatômica. Sobre a década passada, o perfilamento molecular de espécimes do tecido do DMG descobriu mutações do excitador neste tipo do tumor1 e revelou a heterogeneidade espacial e temporal das mutações, fazendo a biópsia necessária para caracterizar um paciente dentro de uma doença subgrupo e promovendo terapias molecularmente-alvejadas2. Como tal, os ensaios clínicos defendem a integração de biópsias cirúrgicas para o perfil molecular do tumor no diagnóstico adiantado3,4,5,6. Durante o tratamento, a monitoração da resposta terapêutica nos DMGs é limitada a MRI, que falta a sensibilidade para detectar mudanças pequenas ou a evolução genomic do tumor. MRI é igualmente propenso para detectar o pseudoprogressão, inflamação transiente no local do tumor que imita a progressão verdadeira na imagem latente e pode desinformar a interpretação da resposta do tumor7. Assim, os DMGs representam um tipo do tumor com uma necessidade elevada para uma alternativa, meios minimamente invasores de detectar mutações do tumor e de monitorar a resposta clínica. A fim endereçar estas necessidades, nós desenvolvemos e aperfeiçoamos um protocolo para detectar, e quantificar a freqüência alélicas de, mutações de tumor no cfdna do plasma, do soro e do CSF das crianças com gliomas do midline8. Dado que os DMGs da infância frequentemente (> 80%) abrigar uma mutação somática da lisina-à-metionina na posição 27 da variante H 3.1 de histona (H 3,1 K27M, 20% dos casos) ou H 3.3 (H 3.3 K27M, 60% dos casos)1, estas e outras mutações características de dmgs (i.e., ACVR1, PIK3R1) foram direcionadas para quantificação do alelo mutante usando o cfDNA8. Este ensaio pode ser adaptado para detectar mutações de HotSpot em outros tipos de tumores usando primers e sondas específicos de sequência. A versatilidade desta aproximação fá-la aplicável a uma variedade de cancros que beneficiariam da integração de ferramentas diagnósticas cfDNA-baseadas e de monitoração terapêutica.
Para detectar sensitivamente baixas mutações de frequência alélica no cfDNA, empregamos uma abordagem baseada em PCR digital de gotas (dPCR). Neste método, a mistura da reação do PCR é dividida em um máximo teórico de 10 milhões gotas usando a plataforma de dPCR (por exemplo, RainDance), com 7-9 milhão gotículas por o PCR poço visto tipicamente experimentalmente. Devido ao alto grau de particionamento da amostra, no máximo apenas uma a duas moléculas de DNA podem estar presentes em cada gota. A amplificação do PCR e a hibridação fluorescente seqüência-específica da ponta de prova podem ocorrer em cada gota, tais que os milhões das reações ocorrem. Isto maximiza a sensibilidade e permite a deteção de alelos raros do mutante, que poderiam de outra maneira ir sem ser detectado de encontro a um fundo do ADN do tipo selvagem. A utilização de sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) aumenta a especificidade do ensaio restringindo a hibridação de incompatibilidade e suportando a detecção precisa de mutação9,10,11. Aqui, descrevemos nossos métodos de processamento de amostras, extração de cfDNA, pré-amplificação de alelos-alvo, dPCR e análise de dados.
Protocol
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Conselho de revisão institucional da Universidade da Califórnia em São Francisco (São Francisco, CA; IRB #14-13895) e o sistema nacional de saúde da criança (Washington, D.C.; IRB #1339). Os espécimes foram coletados e estudados após a obtenção do consentimento informado do paciente ou tutor do paciente.
1. pacientes consentantes protocolo IRB para coleta e armazenamento de espécimes biológicos
-
Coletar amostras de pacientes após o consentimento informado por escrito é obtido de cada paciente, ou o tutor do paciente, para a participação em um ensaio clínico ou para biororepositório como aprovado pelo respectivo Conselho de revisão institucional.
- Os pacientes incluídos neste estudo foram diagnosticados com um tumor cerebral radiograficamente. Não foram utilizados critérios de exclusão. Os espécimes foram coletados e estudados após a obtenção do consentimento informado do paciente ou tutor do paciente.
2. coleta de sangue e separação de plasma ou soro
- Colete a amostra de sangue usando um sorteio de 10,0 mL em tubos de coleta de sangue. Se coleta de sangue para plasma, use K2-ou k3-tubos de EDTA, heparina ou tubos de coleta de sangue cfdna. Se coleta de sangue para o soro, use tubos de gel-barreira contendo o ativador de coágulo e gel para separar o soro.
Nota: Enquanto 10 mL é recomendado para habilitar experimentos replicar, um mínimo de 3 mL será suficiente. - Inverta cuidadosamente o tubo de recolha 10 vezes para misturar a amostra de sangue com os reagentes do tubo de recolha.
- Deixe as amostras de sangue a partir das quais o soro será coletado à temperatura ambiente durante 30 min para permitir que o sangue coagule. Se o processamento de sangue para obter o plasma, prossiga imediatamente para o passo 2,4.
Nota: As amostras que estão sendo processadas para o plasma podem ser mantidas no gelo por um máximo de 2 h antes da centrifugação. No entanto, uma rápida transição da tração do sangue para o processamento minimiza a degradação do cfDNA. - Centrifugue os tubos da coleção do sangue em 2.000 x g por 15 minutos em um centrifugador ajustado a 4 ° c para separar o plasma ou o soro das camadas brancas e vermelhas do glóbulo.
- Tomando cuidado para não perturbar a camada de glóbulos brancos (que forma uma linha fina entre o plasma superior/camada sérica e camada inferior de glóbulos vermelhos embalados), pipeta a camada superior de plasma/soro (que pode ser claro, amarelo ou cor de rosa) igualmente em 1 mL alíquotas em cryovials estéreis do parafuso-tampão do polypropylene.
- Registre o número de identificação do sujeito, o tipo de amostra (plasma ou soro) e a data de coleta no rótulo dos cryovials.
- Guarde os cryovials no congelador-80 ° c até o uso. Se a-80 ° c freezer não estiver disponível, armazene as amostras a-20 ° c por até uma semana.
3. coleta e processamento do CSF
- Colete o CSF de uma derivação, de uma punctura lombar, ou de uma cirurgia.
Nota: Tais procedimentos só devem ser conduzidos se considerados necessários pelos clínicos. A amostra extra além do que é necessário para o uso clínico pode ser usada para finalidades da pesquisa. - Meça o volume de CSF coletado e anote sua cor (sangrenta, amarela, desobstruída).
- Centrifugue o tubo de recolha a 10.000 x g durante 10 min a 4 ° c para sedimento dos detritos celulares.
- Transfira o sobrenadante do CSF ingualmente em 500 μL de alíquotas em cryovials da tampa de parafuso do polypropylene.
- Registre o número de identificação do sujeito, o tipo de amostra e a data da coleta de amostras no rótulo dos cryovials. Armazene em-80 ° c até o uso.
4. extração de cfDNA de espécimes líquidos
- Execute o protocolo de extração de cfDNA de acordo com as instruções do manual do kit de extração cfDNA12.
- Limpe o espaço e o equipamento do banco com o alvejante de 10% e o etanol 70%.
Nota: O uso de uma capa do PCR, a mudança regular das luvas e a descontaminação freqüente do espaço e do equipamento de banco com alvejante de 10% e o etanol de 70% durante todas as etapas do protocolo são importantes evitar a contaminação da amostra. - Prepare alíquotas de reagentes, por exemplo, tampões de lavagem, do kit de extração para evitar contaminação cruzada.
- Limpe o espaço e o equipamento do banco com o alvejante de 10% e o etanol 70%.
- Descongelar amostras de pacientes no gelo antes de iniciar a extração. Para plasma/soro, descongelar 1 mL de alíquota da amostra. Para o LCR, descongelar 500 μL de alíquota da amostra.
Nota: As etapas do lysis (4.5-4.8) do protocolo da extração diferem entre o plasma/soro e o CSF, mas da etapa 4,9 avante, o protocolo é idêntico para ambos os tipos de biofluids. - Ajuste um bloco de aquecimento a 60 ° c para o uso durante a etapa do lysis (4,6).
- Prepare o tampão de Lise e a mistura de RNA transportadora em um tubo de 15 mL adicionando 5,6 μL de RNA portador e 0,9 mL de tampão de Lise por amostra12.
- Para plasma/soro, adicione 100 μL de proteinase K, 1 mL de amostra e 0,8 mL de mistura de RNA tampão/portador de Lise preparada na etapa 4,4 para um tubo de 2,0 mL rotulado. Misture por pulso vortexing para 30 s em alta velocidade12.
- Para o LCR, Adicionar 125 μL de proteinase K, 500 μL da amostra, 1 mL de tampão de Lise/mistura de RNA portador e 250 μL de tampão de Lise tecidual em um tubo de 2,0 mL. Coloque o volume total até 2 mL adicionando 125 μL de soro fisiológico com tampão de fosfato 1x (PBS). Misture por pulso vortexing para 30 s em alta velocidade12.
- Incubar amostras durante 30 min a 60 ° c no bloco de aquecimento12.
- Retire as amostras do bloco de aquecimento e abaixe a temperatura para 56 ° c. Retorne amostras para o banco e transfira o lisado em novos tubos de 15 mL rotulados.
- Para plasma/soro, adicione 1,8 mL de buffer de ligação de ácido nucleico e misture por 30 s por pulso vortexing12.
- Para o LCR, adicione 3,6 mL de tampão de ligação de ácido nucleico e misture por 30 s por pulso vortexing12.
- Incubar amostras por 5 min no gelo12.
- Insira a coluna no conector de vácuo. Abra a coluna e insira um extensor de tubo de 20 mL na coluna12.
- Pipeta o conteúdo do tubo de 15 mL diretamente na parte inferior do extensor do tubo, evitando deixar gotículas nas paredes do extensor do tubo.
- Com o interruptor do conector de vácuo fechado, ligue a bomba de vácuo. Uma vez que a pressão foi construída para 900 mbar, abra a válvula do conector de vácuo. O exemplo agora irá fluir através da coluna.
- Uma vez que todo o lisado foi drenado da coluna, desligue a bomba e abra o alçapão ao conector do vácuo, aliviando o inclinação da pressão. Uma vez que a pressão atinge 0 mbar, feche a válvula do conector de vácuo e o alçapão.
- Retire o extensor do tubo de 20 mL, tendo cuidado para não passar o extensor de uma coluna sobre uma coluna vizinha, pois isso pode contaminar amostras. Elimine o extensor do tubo.
- Adicionar 600 μL do primeiro tampão de lavagem à coluna12.
- Deixe as tampas dos tubos abertos e gire sobre a bomba de vácuo. Deixe o calibre de pressão alcangar 900 mbar, a seguir gire o interruptor no conector do vácuo à posição aberta para extrair o amortecedor da lavagem através da coluna.
- Desligue a bomba de vácuo, abra o alçapão para liberar a pressão, e aliviar a pressão para 0 mbar. Gire a válvula do conector de vácuo para a posição fechada.
- Adicionar 750 μL de segundo tampão de lavagem à coluna e repetir os passos 4.16-4.1712.
- Adicione 750 μL de etanol grau MB à coluna e repita os passos 4.16-4.1712.
- Feche a tampa da coluna e coloque a coluna dentro de um novo tubo de coleta de 2,0 mL. Elimine o conector de aspiração12.
- Centrifugue o tubo com a coluna a 20.000 x g durante 3 min à temperatura ambiente12.
- Coloque a coluna em um novo tubo de coleta e abra a tampa do tubo. Coloc um tecido do laboratório sobre a parte superior e incubar em 56 ° c por 10 minutos12.
- Coloque a coluna em um tubo limpo de 1,5 mL de PCR-Clean e pipetar 100 μL de tampão de eluição (ou grau de biologia molecular H2o (MB h2o)) diretamente no centro da coluna. Não toque na coluna com uma ponta de pipeta. Feche a tampa e deixe à temperatura ambiente durante 3 min.
- Centrifugador em 20.000 x g na temperatura ambiente por 1 minuto a eluir cfdna12.
- Pipetar o eluado de volta para a coluna e incubar à temperatura ambiente durante 3 min.
- Repita a centrifugação em plena velocidade por 1 min para eluir cfdna uma segunda vez para aumentar o rendimento (como por recomendação do fabricante).
- Armazene o cfDNA no rotulado DNase/RNase Free PCR-Limpe os tubos a 4 ° c ou Prossiga diretamente para a etapa 5.
5. concentração de vácuo de cfDNA
- Insira e equilibre os tubos contendo cfdna eluída em suportes no concentrador de vácuo. Abra as tampas dos tubos. Ajuste a temperatura do concentrador do vácuo a 23 ° c.
-
Gire sobre o concentrador do vácuo, a seguir gire sobre a armadilha do vapor. Centrifugue amostras para 40 minutos ou até que um volume final de 10.5-11 μL esteja alcangado.
- Se o volume estiver abaixo de 10,5 μL, adicione o tampão de suspensão do ADN ou o MB H2o para alcançar um volume final de 10,5 μL.
- Pipeta o volume cheio ao longo das paredes do tubo para remover fragmentos residuais do ADN.
- Centrifugue momentaneamente as amostras em um centrifugador do tabletop para coletar gotas nas paredes dos tubos.
- Prossiga diretamente para a etapa de pré-amplificação (etapa 8) ou armazene amostras a 4 ° c.
- Enrole as tampas dos tubos em um filme de laboratório para evitar a contaminação se eles são armazenados para uso posterior.
6. concepção e preparação de primers e sondas
- Projete primers para diante e reverso, e pontas de prova do tipo selvagem e do mutante LNA, para o alvo (s) do interesse. Ordem comercial primários e sondas liofilizadas (consulte a tabela de materiais).
Nota: as sequências de primers e sondas visando H3F3A p. K27M e outras mutações-alvo para gliomas de linha média pediátrica podem ser encontradas na tabela complementar 3 de Panditharatna et al., 20188. - Antes de abrir os primers e sondas liofilizados, centrifugue brevemente os tubos. Adicione o volume apropriado de tampão de suspensão do ADN ou MB H2o, como anotou na folha da especificação de produto, para Ressuspender os primers e as pontas de prova liofilizados a uma concentração de 100 μm.
- Suavemente vortex, pipeta para cima e para baixo várias vezes para misturar e rapidamente centrifugar primers e sondas usando uma centrífuga de mesa.
- Prepare alíquotas de 10 μM de primers e sondas adicionando 10 μL de estoque de 100 μM a 90 μL de tampão de suspensão de DNA ou MB H2O.
- Prepare alíquotas de 1 μM de primers para a frente e reverso (para ser usado para pré-amplificação), adicionando 10 μL do primer de 10 μM a 90 μL de tampão de suspensão de DNA ou MB H2O.
- Armazene primers e sondas a 4 ° c em recipientes escuros herméticos. Enrole a película de laboratório em torno das tampas para evitar a contaminação, e cubra pontas de prova na folha de alumínio para evitar a exposição à luz. Armazene pontas de prova em-20 ° c para o armazenamento a longo prazo se não estão sendo usados regularmente.
7. seleção de controles positivos
-
Selecione a amostra (s) de DNA genômica do tecido tumoral (gDNA) com concentração de DNA conhecida, que abriga a mutação de interesse em uma frequência alélica conhecida para ser usada como um controle positivo.
- Use 0, 25 ng de DNA de tecido tumoral de controle positivo na etapa de pré-amplificação (etapa 8).
Nota: Esta entrada de DNA fornece um sinal positivo robusto na dPCR (conforme determinado pela realização de diluições seriais do tecido tumoral gDNA que abrigando a mutação H3F3A p. K27M8) enquanto minimiza a quantidade de amostra necessária.
- Use 0, 25 ng de DNA de tecido tumoral de controle positivo na etapa de pré-amplificação (etapa 8).
8. pré-amplificação dos alelos alvo
Nota: O protocolo de pré-amplificação é como por Jackson et al., 201613.
- Limpe o espaço e o equipamento do banco com o alvejante de 10% e o etanol 70%.
- Obtenha 1 μM de primers para a frente e reverso, amostras de cfDNA, controles positivos de gDNA, e mistura mestre da polimerase do ADN, e ajuste no gelo.
-
Calcule o volume de reagentes necessários para pré-amplificar o número desejado de amostras de cfDNA e controle positivo, tanto para a pré-amplificação singleplex ou multiplex como segue:
- Para a pré-amplificação singleplex (para pré-amplificar os alelos do tipo tipo selvagem e Mutant para uma única mutação de interesse), prepare a mistura de reação de PCR adicionando 17,5 μL de mistura mestre de polimerase de DNA e 3,5 μL de primers para frente e reverso (100 nm) por amostra13.
- Para pré-amplificação Multiplex (para pré-amplificar dois conjuntos de alelos tipo selvagem e mutantes para duas mutações de interesse), prepare a mistura de reação de PCR adicionando 17,5 μL de mistura mestre de polimerase de DNA e 1,75 μL de cada conjunto de primers para frente e reverso (50 nm) por amostra trezeanos.
Nota: Prepare suficiente mistura de reação de PCR para o número de amostras mais 10% extra para dar conta de qualquer erro de pipetagem.
- Dispense 24,5 μL da mistura da reação do PCR em cada poço de um tubo de tira do PCR de 8 poços13.
- Dispensar 10,5 μL de amostra de ADN para o poço adequado para trazer o volume total de reacção para 35 μL13. Gentilmente pipeta o volume total para cima e para baixo 10 vezes para misturar.
- Realize a amplificação do PCR em 98 ° c por 3 minutos; 9 ciclos de 98 ° c para 10 s, temperatura de recozimento por 3 min, 72 ° c por 30 s; e uma extensão em 72 ° c por 2 min13.
- Transfira o volume completo de produto pré-amplificado para tubos de PCR-Clean livres rotulados com DNase/RNase e diluir em 140 μL de tampão de suspensão de DNA (pH 8,0)13.
- Enrole as tampas dos tubos em filme de laboratório. Armazene o produto pré-amplificado a 4 ° c. Para a preservação a longo prazo, armazene em-20 ° c.
9. detecção e quantificação do DNA alvo usando dPCR
- Limpe o espaço e o equipamento do banco com o alvejante de 10% e o etanol 70%.
- Defina primers e sondas de 10 μM, mistura mestre de genotipagem e amostras de DNA no gelo. Guarde o óleo de estabilização de gotas à temperatura ambiente.
- Vórtice suavemente e centrifugue brevemente todos os reagentes excepto óleo de estabilização de gotas.
- Assegure-se de que o cilindro de gás de nitrogênio comprimido anexado ao instrumento gerador de gotas e o instrumento de quantificação (tabela de materiais) seja fixado em 90 psi.
- Ative o instrumento gerador de gota e o computador com o software do instrumento. Inicie o software e clique em Iniciar inicializando.
- Execute um flush de alta pressão no instrumento gerador de gota se ele não tiver sido usado em uma semana ou mais.
- Prepare a mistura da reação de dPCR para 8 poços do tubo da tira do PCR mais 10% extra, adicionando 220 μL da mistura mestra genotipagem, 8,8 μL cada um de 10 μM de pontas do tipo e de sondas do mutante, 39,6 μL cada um de 10 μM para diante e primers reversos, e 17,6 μL do óleo estabilizando da gota14 .
- Misture delicadamente a mistura da reação de dPCR pipetando o volume cheio acima e para baixo 10-20 vezes. Não vórtice ou centrifugador após o óleo de estabilização da gota ter sido adicionado à mistura de reacção.
- Obtenha um tubo de tira do PCR 8-well e dispense 38 μL da mistura da reação de dPCR diretamente na parte inferior de cada poço14. Remova todas as bolhas com uma ponta de pipeta limpa.
Nota: Os tubos de tira do PCR que são Interlocked ou embalados firmemente junto podem conduzir às cargas elétricas estáticas, causando a coalescência e o sinal ruidoso ao analisar dados de dPCR. Para evitar este, os tubos de tira da alíquota em sacos separados do Biohazard, evitam a embalagem excedente os sacos, e mantêm os tubos da fricção junto. - Adicionar 12 μL de amostra de DNA pré-amplificada aos poços apropriados do tubo de tira de PCR. Para o controle negativo, adicione 12 μL de MB H2O.
Nota: Analise amostras de cfDNA em poços replicantes. Para o LCR, analisar pelo menos em duplicado, e para plasma/soro analisar cada amostra em triplicado. - Pipetar suavemente o volume completo para cima e para baixo 10 vezes para misturar a mistura de reacção com a amostra de ADN.
- Obter um novo chip de instrumento gerador de gotas e pipetar o volume total de poços 1-8 do tubo de tiras de PCR para os canais correspondentes a-H no chip. Evite tocar na parte inferior dos canais com uma ponta de pipeta.
- Obter um novo tubo de tira de PCR limpo e inserir no instrumento gerador de gotas. Digitalize ou insira manualmente o ID do chip do instrumento gerador de gotas no software no computador do instrumento. Digite os nomes para cada um dos 8 canais. Clique em iniciar a execução para começar a dropletizing amostras.
- Quando o dropletization terminou, remova o tubo da tira do PCR e aplique tampões do tubo de tira.
- Transfira o tubo de tira para um termociclador e balance com outro tubo de tira contendo 80 μL de água por poço.
- Programe as condições térmicas de ciclagem14 como: 95 ° c por 10 min; 45 ciclos de duas temperaturas: 95 ° c por 30 s e temperatura de recozimento por 2 min; 98 ° c por 10 min; e segure a 10 ° c.
- Ajuste a taxa de rampa para 0,5 ° c/s e ajuste o volume da amostra para 80 μL14.
- Quando o ciclo térmico estiver completo, retire o tubo de tira e transfira para o instrumento de quantificação. Remova tampões de tira do PCR e substitua-os com tampões de alta velocidade.
- Ative o instrumento de quantificação e o computador conectado com o software do instrumento. Inicie o software do instrumento e clique em Setup a Run.
- Coloque o tubo de tira no instrumento de quantificação.
- Obter um novo chip de instrumento de quantificação e digitalizar ou inserir manualmente o chip ID no instrumento. Insira o chip na máquina.
- Coloque o escudo metálico em cima do chip e feche a tampa do instrumento.
- No software de computador, incorpore um nome para o funcionamento de dPCR e para cada um dos 8 canaletas (A-H). Selecione o modo rápido (que deve ser usado com tampas de alta velocidade) e clique em Iniciar para iniciar a quantificação.
- Quando a quantificação estiver concluída, retire o escudo metálico (a ser guardado e reutilizado) e elimine o tubo de tiras de PCR e o chip. No computador do instrumento, o log de execução conterá arquivos de resultado para cada execução. Use os arquivos. FCS para cada amostra para analisar com o software do analista.
10. análise de dados
- Inicie o software de Analista e abra os arquivos. FCS para analisar dados espectrais brutos. Em modo de exibição de análise, selecione intacto. Em modo de exibição de amostra, clique nas caixas ao lado de cada uma das 8 amostras para que haja uma marca de seleção em cada caixa. O software plotará os sinais para os alelos mutantes (Fam) e tipo selvagem (Hex) ao longo dos eixos x e y, respectivamente.
- Use a função de matriz calculada para aplicar a compensação espectral em gotas intactas, de acordo com as instruções do fabricante15.
- Ajuste as configurações do eixo em opções do eixo. Defina o eixo x para um mínimo de 0 e máximo de 30.000 e o eixo y para um mínimo de-5.000 e máximo de 10.000. Quando os clusters de gotas foram identificados, ajuste os eixos para reduzir o espaço vazio no gráfico.
Nota: A posição dos aglomerados mutantes e tipo selvagem dependerá das sondas utilizadas, do fluoróforo e da sua concentração. - Selecione a amostra correspondente ao tecido tumoral de controle positivo gDNA para definir o negativo (cluster mais próximo da origem), mutante (cluster mais próximo ao eixo x) e tipo selvagem (cluster mais próximo ao eixo y) portões. Assegure-se de que os clusters sejam distintos e facilmente identificados em um ensaio bem-sucedido.
- Aplique as configurações do portão para o controle positivo a todas as amostras clicando com o botão direito do mouse na amostra de controle positivo e clicando na opção para aplicar todas as configurações a amostras selecionadas.
- Na visualização gráfica, clique na guia vários exemplos para exibir plotagens para todas as amostras selecionadas. Exporte a imagem como um. Arquivo TIF.
- Na guia espaço de trabalho , na parte superior esquerda da tela, selecione Exportar análise (CSV) e salve o arquivo de dados analisado como um arquivo. csv.
- Abra o arquivo. csv no software de planilha para exibir contagens de gotas negativas, de tipo curinga e mutantes para cada amostra. Calcule a MAF dividindo a contagem de gotas de mutante corrigida por Poisson pela soma do mutante corrigido de Poisson mais contagens de gotas de tipo selvagem para cada amostra.
Nota: Use a contagem corrigida de Poisson porque as estatísticas de Poisson respondem por esse fato de que as gotas positivas podem conter mais de uma única cópia do DNA alvo e, assim, somar as gotas positivas pode não produzir uma contagem exata16.
Representative Results
A Figura 1 mostra resultados representativos para a deteção bem sucedida da mutação de H3F3A p. K27M no plasma pré-amplificado (painel esquerdo superior) e no CSF (painel superior direito) cfdna de duas crianças com dmg. as amostras de cfDNA foram analisadas em repetição, mas apenas um gráfico representativo é mostrado para cada tipo de amostra. As parcelas de dPCR mostram a geração bem sucedida da gota, com 7-9 milhão gotas por o PCR bem (a maioria de que são as gotas negativas que não contêm o ADN do alvo). Um mínimo de 7 milhões gotas por PCR bem indica uma dropletização bem-sucedida, enquanto menos de 7 milhões indicam falha do ensaio, caso em que o usuário não deve prosseguir com a análise de dados. A Figura 1 mostra uma separação clara entre os clusters mutante e tipo selvagem ao longo dos eixos x e y, respectivamente. Clusters de tipo selvagem robustos indicam que a extração de cfdna foi bem-sucedida porque o DNA do modelo está presente. Clusters mutantes mostram um MAF de 1,60% e 39,92% para as amostras de plasma e LCR, respectivamente, demonstrando a detecção positiva da mutação. Para estes pacientes, os resultados de dPCR são de acordo com o status da mutação de tumor, como confirmado pela análise genomic do tecido do tumor da biópsia8. O controle negativo (painel esquerdo inferior) mostra 0 mutante e 0 gotas de tipo selvagem, indicando que não havia nenhuma contaminação da mistura da reação do PCR. O tecido do tumor do controle positivo gDNA (painel direito inferior) mostra a mutação que está sendo detectada na freqüência alélicas esperada para a amostra particular do tumor selecionada.
Na Figura 2, os resultados representativos são mostrados para a deteção mal sucedida da mutação do interesse, H3F3A p. K27M, no plasma cfdna de uma criança com dmg. O estado da mutação foi confirmado pela análise genomic do tecido do tumor8. São mostrados os resultados representativos de dois poços de PCR replicados (painéis superiores). O número total de gotas, incluindo gotas negativas, está entre 7-9 milhões por PCR bem, indicando uma dropletização bem-sucedida. Os clusters de tipo selvagem, plotados ao longo do eixo y, mostram aproximadamente 7-8000 gotas do tipo selvagem por o PCR bem para o plasma cfdna, indicando a extração bem sucedida de cfdna (porque há um ADN do tipo selvagem do alvo na amostra). No entanto, 0 gotículas mutantes são detectadas na amostra de plasma. O painel inferior esquerdo mostra o controle negativo (MB H2O) sem tipo selvagem ou gotas do mutante; e o painel inferior direito mostra o controle positivo pré-amplificado tecido tumoral gDNA (0, 25 ng) com detecção de mutação positiva. Como mostrado nesta figura, a ausência de deteção da mutação no plasma não pode necessariamente significar que o paciente é tipo selvagem para a mutação do interesse, porque os negativos falsos ocorrem8. Em alguns casos, quando a mutação é perdida no plasma coletado na biópsia adiantado, é detectado no plasma obtido do mesmo paciente em um ponto de tempo mais atrasado8.
Figura 1 : Detecção bem-sucedida de H3F3A mutação de p. K27M no plasma pré-amplificado e no CSF cfDNA das crianças com gliomas do midline. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Resultados falsos negativos obtidos a partir da análise de uma amostra de cfDNA plasmática pré-amplificada de um paciente conhecido por abrigar a mutação de interesse, H3F3A p. K27M, no tumor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Aqui nós apresentamos nosso método para detectar e quantificar a freqüência alélicas de mutações do tumor em cfdna da biópsia líquida paciente. Enfatizamos etapas críticas para o sucesso deste método, incluindo processamento de amostras pré-analíticas, extração de cfDNA, projeto de ensaio de PCR e análise de dados. Para limitar o volume de amostra utilizado, o cfDNA é extraído de 1 mL de plasma, mas apenas 500 μL de LCR. Ao extrair do CSF, o protocolo para a extração de 1 mL da urina (que segue o manual12do jogo da extração de cfdna) é usado, como por a recomendação do fabricante. A diferença no volume de amostra exigido entre o plasma e o CSF é devido aos níveis mais baixos de cfDNA tumor-específico no plasma comparado ao CSF dos pacientes com tumores cerebrais, necessitando volumes maiores da amostra para a deteção da mutação8. Se a amostra estiver disponível, mais de 1 mL de plasma pode ser extraído para produzir maior rendimento de DNA. No entanto, no caso de pacientes pediátricos, é importante minimizar a quantidade de sangue utilizada sempre que possível, pois mesmo um procedimento simples, como a tração do sangue, está fatigado para pacientes pediátricos com câncer submetidos a terapias de radiação. A extração de alíquotas de 1 mL de plasma também permite replicar extrações, de tal forma que o ensaio pode ser repetido (por exemplo, em casos de falha na extração de DNA ou contaminação da amostra).
Em um esforço para reduzir qualquer uso de amostra que não é estritamente necessário, cfDNA normalmente não é quantificada. Entretanto, nós encontramos uma escala de concentrações do cfDNA entre 0.2-2 ng/μL e 0.6-13 ng/μL no plasma e no CSF, respectivamente. Dado a baixa quantidade de cfDNA, e o fato que os alelos tumor-específicos do mutante estão atuais em uma baixa freqüência, uma etapa da Pre-amplificação usando o mesmo jogo dos primers usados para dPCR é necessário aumentar significativamente a quantidade de ADN do alvo na amostra, auxiliando dentro detecção de mutação8. Diluir o produto pré-amplificado em tampão de suspensão de DNA fornece volume suficiente para réplicas técnicas, que auxilia na distinção de verdadeiros positivos. Como o número de gotículas mutantes pode ser baixo (por exemplo, entre 0-2 gotas mutantes em uma amostra de plasma), a inclusão de repetições técnicas é fundamental para a resolução do status da mutação. Quando um poço do PCR pode render 0 gotas do mutante, os outros dois podem render 1-2 para uma única amostra do plasma analisada no Triplicate; assim, a inclusão de repetições permite maior acurácia na determinação do estado de mutação. O MAF é então calculado como a média dos valores replicados.
A pré-amplificação multiplexada (pré-amplificando o tipo selvagem e os alelos do mutante de duas mutações do interesse) aumenta a utilidade de uma única amostra, porque o mesmo material começar pode ser usado para testar para duas mutações. É importante ressaltar que um produto de pré-amplificação multiplex pode ser analisado em singleplex durante a dPCR para maior simplicidade, conforme descrito aqui. Entretanto, o PCR e o dPCR da pré-amplificação podem ser multiplexados. Quando a multiplexação, as condições devem ser otimizadas para ambos os conjuntos de primers e sondas: as temperaturas de recozimento de primer devem ser semelhantes para serem executadas juntas na amplificação de PCR, e as sondas devem ser projetadas para gerar clusters distintos (com base no sinal fluorescente e intensidade). Ao validar um novo conjunto de primers e sondas, execute um gradiente de temperatura de recozimento para determinar a temperatura de recozimento ideal com base na faixa sugerida pelo fabricante. Antes de testar pontas de prova em espécimes pacientes de cfDNA, validá-los usando construções sintéticas do ADN e/ou gDNA do tecido do tumor de entradas diferentes (isto é, até 10 NG).
Para a deteção de alelos do mutante com maior especificidade e desencontros reduzidos na hibridação da ponta de prova ao ADN do alvo, as pontas de prova bloqueadas do ácido nucleico (LNA) são usadas. LNA é um análogo de ácido nucleico com uma ponte de metileno conectando o 2 '-oxigênio e 4 '-carbono do anel ribose9. A ponte de metileno bloqueia o ácido nucleico em uma conformação bicíclico rígida que restringe a flexibilidade, aumenta a estabilidade duplex térmica, e melhora a especificidade da hibridação da ponta de prova para alvejar o ADN10,18, 19. se existir uma incompatibilidade de base única entre a sonda LNA e o DNA do modelo, a formação duplex entre a sonda e o alvo desestabilizará. Como tal, as sondas LNA melhoram a especificidade da ligação da sonda e resultam em uma relação sinal-ruído mais alta11. A análise do plasma e do CSF de pacientes pediatras não-CNS-doentes estabeleceu a especificidade de nosso ensaio com as pontas de prova de LNA que visam H3F3A p. K27M, para determinar que uma freqüência alélicas de igual a ou menos de 0, 1% é considerada um falso positivo 8. para considerações adicionais para otimizar o design de sondas e primers, incluindo o conteúdo de GC, tamanho do amplicon, tintas de repórter de sonda e Quenchers, consulte as diretrizes do fabricante do dpcr14,17. Embora nosso método seja otimizado para uso com o sistema RainDance, o protocolo pode ser adaptado para uso com outras plataformas dPCR.
O método apresentado aqui extrai a força da sensibilidade elevada e do enriquecimento do alvo conseguidos por dPCR, que remanesce a plataforma da escolha para detectar mutações raras do tumor em cfDNA. Embora poderoso, dPCR é limitado no número de mutações que podem ser testadas em um único ensaio. Uma alternativa ao dPCR é o sequenciamento da próxima geração (NGS), que pode detectar múltiplas mutações em vários genes, aumentando a utilidade de uma única amostra. NGS pode detectar mutações no CSF e no plasma dos pacientes com gliomas do tronco encefálico20, entretanto, é atualmente menos sensível do que o dpcr em detectar mutações de tumor em cfdna, com limites da deteção de 0.1-10% MAF comparado a 0, 1% em aproximações PCR-baseadas21 . dPCR igualmente alcança um tempo de retorno mais rápido do que NGS, permitindo a deteção rápida das mutações do interesse. A aproximação do PCR é aplicável através dos tipos do cancro e pode ser expandida para detectar mutações do ponto quente e o cfdna misturado22.
A biópsia líquida é realmente em sua infância e exigirá um desenvolvimento mais adicional para adaptar às doenças específicas. A monitoração do tumor no contexto da evolução do tumor será o próximo desafio, onde uma plataforma capaz de detectar mutações emergentes com sensibilidade elevada seria exigida. Adicionalmente, plataformas capazes de detectar uma variedade de biomoléculas (peptídeos, citocinas, RNA) serão altamente benéficas na avaliação da resposta tumoral ao tratamento, bem como no avanço de intervenções clínicas personalizadas.
Disclosures
O método descrito neste manuscrito está incluído em um aplicativo Internacional de patentes "métodos para a detecção de biomarcadores de câncer" por Javad Nazarian & Eshini Panditharatna.
Acknowledgments
Os autores gostariam de reconhecer a generosidade de todos os pacientes e suas famílias. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da Smashing Walnuts Foundation (Middleburg, VA), a Fundação V (Atlanta, GA), o Gabriella Miller Kids primeiro data Resource Center, clínica e translational Science Institute no Children ' s National ( 5UL1TR001876-03), Fundação de Musella (Hewlett, NY), Fundação de Matthew Larson (Lago Franklin, NJ), a Fundação Lilabean para a pesquisa pediatra do cancro do cérebro (mola de prata, MD), a Fundação do tumor do cérebro da infância (Germantown, MD), o cérebro das crianças Consortium do tecido do tumor (Filadélfia, PA), e Fundação da reunião para a pesquisa do cancer da infância (Atlanta, GA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2 mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
- Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19 (4), iv21 (2017).
- Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19 (4), iv14 (2017).
- Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20 (2), i64 (2018).
- Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951 (2017).
- Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).
- Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81 (2012).
- Qiagen. QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. , 1090257 (2013).
- Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Assay Guidelines. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Analyst II Operator's Manual. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).
- Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617 (2017).
- Biorad. Droplet Digital PCR Applications Guide. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).
- Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).
- Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. , (2018).
- Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).
