Summary
Здесь мы представляем протокол для обнаружения опухолевых соматических мутаций в циркулирующих ДНК, присутствующих в биологических жидкостях пациента (биожидкости). Наш метод цифровой полимеразы на основе капли цифровой полимеразы (dPCR) позволяет количественно количественно определить частоту мутации опухоли (MAF), облегчая минимально инвазивное дополнение к диагностике и временному мониторингу опухолевой реакции.
Abstract
Осложнения, связанные с авансом и повторным отбором проб хирургической ткани, представляют необходимость в минимально инвазивных платформах, способных к молекулярной подклассификации и временному мониторингу опухолевой реакции на терапию. Здесь мы описываем наш метод dPCR для обнаружения опухолевых соматических мутаций в клеточной свободной ДНК (cfDNA), легко доступных в биожидкости пациента. Хотя количество мутаций ограничено в каждом анализе, этот метод обеспечивает высокий уровень чувствительности и специфичности. Мониторинг численности мутаций, как рассчитываетСя МАФ, позволяет оценить реакцию опухоли на терапию, тем самым обеспечивая столь необходимую добавку к рентгенографической визуализации.
Introduction
В связи с ограничениями в наличии опухолевых тканей для молекулярного анализа, существует необходимость в разработке высокочувствительных методов, способных обнаруживать опухолевые соматические мутации в биожидкости пациента, включая плазму, сыворотку и спинномозговую жидкость (CSF) . Например, педиатрические диффузные глиомы средней линии (DMGs) представляют собой проблему из-за их нейроанатомического расположения. За последнее десятилетие молекулярное профилирование образцов тканей DMG выявило мутации драйвера в этой опухолитипа 1 и выявило пространственную и височную неоднородность мутаций, что делает биопсию необходимой для характеристики пациента в болезни подгруппы и содействия молекулярно-ориентированной терапии2. Таким образом, клинические испытания выступают за интеграцию хирургической биопсии для молекулярного профилирования опухоли при авансовом диагнозе3,4,5,6. Во время лечения мониторинг терапевтической реакции в ДМГ ограничивается МРТ, которой не хватает чувствительности для выявления небольших изменений или геномной эволюции опухоли. МРТ также склонен к обнаружению псевдопрогрессии, преходящее воспаление в месте опухоли, которая имитирует истинное прогрессирование на визуализации и может дезинформировать интерпретацию опухолевого ответа7. Таким образом, DMGs представляют собой тип опухоли с высокой потребностью в альтернативных, минимально инвазивных средствах обнаружения опухолевых мутаций и мониторинга клинической реакции. Для того, чтобы удовлетворить эти потребности, мы разработали и оптимизировали протокол для обнаружения и количественной частоты мутаций опухоли в cfDNA из плазмы, сыворотки крови и CSF детей с глиомами средней линии8. Учитывая, что детство DMGs часто (No gt;80%) гавани соматический лизина к метионину мутации в положении 27 гистона вариант H3.1 (H3.1K27M, 20% случаев) или H3.3 (H3.3K27M, 60% случаев)1, эти и другие мутации, характерные для DMGs (т.е., ACVR1, PIK3R1) были направлены на мутант аллеля количественной с помощью cfDNA8. Этот анализ может быть адаптирован для обнаружения мутаций горячих точек в других типах опухолей с помощью последовательности конкретных грунтовки и зонды. Универсальность этого подхода делает его применимым к различным видам рака, которые выиграют от интеграции cfDNA на основе диагностических инструментов и терапевтического мониторинга.
Для чуткого обнаружения мутаций низкой аллеливой частоты в cfDNA мы используем подход, основанный на каплях цифрового ПЦР (dPCR). В этом методе, смесь реакции PCR разделена в теоретически максимум 10 миллионов капель используя платформу dPCR (например, RainDance), с 7-9 миллионами капель на ПЦР хорошо типично наблюдаемо экспериментально. Из-за высокой степени раздела образца, не более одной-двух молекул ДНК может присутствовать в каждой капли. PcR усиление и последовательности конкретных флуоресцентных гибридов может произойти в каждой капли, таким образом, что миллионы реакций происходят. Это максимизирует чувствительность и позволяет обнаружить редкие аллели мутантов, которые в противном случае могли бы остаться незамеченными на фоне ДНК дикого типа. Использование заблокированных нуклеиновой кислоты (LNA) зондов повышает специфичность анализ, ограничивая гибридизации несоответствия и поддерживая точное обнаружение мутаций9,10,11. Здесь мы описываем наши методы обработки образцов, извлечения cfDNA, предамплизации целевых аллелей, dPCR и анализа данных.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Калифорнийского университета в Сан-Франциско (Сан-Франциско, Калифорния; IRB #14-13895) и Национальная система здравоохранения для детей (Вашингтон, О.К.; IRB #1339). Виды были собраны и изучены после получения информированного согласия от пациента или опекуна пациента.
1. Согласие пациентов в соответствии с протоколом IRB для сбора и хранения биологических образцов
-
Сбор образцов пациента после письменного информированного согласия, полученного от каждого пациента или опекуна пациента, для участия в клинических испытаниях или для биовосстановления, утвержденного соответствующим Институциональным наблюдательным советом.
- Пациенты, включенные в это исследование были диагностированы с опухолью мозга радиографически. Критерии исключения не использовались. Виды были собраны и изучены после получения информированного согласия от пациента или опекуна пациента.
2. Сбор крови и разделение плазмы или сыворотки
- Соберите образец крови с помощью 10,0 мл обратить в трубки для сбора крови. При сборе крови для плазмы, используйте K2- или K3-EDTA трубки, гепарин или cfDNA трубки сбора крови. При сборе крови для сыворотки, используйте гелево-барьерные трубки, содержащие активатор сгустка и гель, чтобы отделить сыворотку.
ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как 10 мл рекомендуется для включения повторных экспериментов, не менее 3 мл будет достаточно. - Тщательно инвертируйте трубку для сбора 10 раз, чтобы смешать образец крови с реагентами трубки для сбора.
- Оставьте образцы крови, из которых сыворотка будет собрана при комнатной температуре в течение 30 минут, чтобы кровь сгусток. При обработке крови для получения плазмы немедленно переходите к шагу 2.4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы, обрабатываемые для плазмы, могут храниться на льду не более 2 ч до центрифугирования. Тем не менее, быстрый переход от крови обратить к обработке сводит к минимуму деградации cfDNA. - Центрифуга трубки сбора крови на 2000 х г в течение 15 минут в центрифуге набор до 4 градусов по Цельсию, чтобы отделить плазму или сыворотку от белых и красных слоев кровяных клеток.
- Заботясь о том, чтобы не нарушать слой белых кровяных клеток (который образует тонкую линию между верхним слоем плазмы/сыворотки и нижним слоем упакованных красных кровяных телец), пипетка верхний слой плазмы/сыворотки (которая может быть ясной, желтой или розовой по цвету) одинаково в 1 мл aliquots в стерильные полипропиленовые винтовые колпаки криовиалы.
- Запишите идентификационный номер предмета, тип образца (плазму или сыворотку) и дату сбора на этикетке криовиалов.
- Храните криовиалы в морозильной камере -80 градусов до использования. Если морозильник -80 градусов недоступен, храните образцы при -20 градусов по Цельсию в течение одной недели.
3. Сбор и обработка CSF
- Соберите CSF из шунта, поясничного прокола или хирургического вмешательства.
ПРИМЕЧАНИЕ: Такие процедуры должны проводиться только в том случае, если это необходимо врачам. Дополнительный образец сверх того, что необходимо для клинического использования, может быть использован в исследовательских целях. - Измерьте объем собранного CSF и сделайте к сведению его цвет (кровавый, желтый, ясный).
- Centrifuge сбора трубки на 10000 х г в течение 10 минут при 4 кв КС, чтобы гранулы клеточного мусора.
- Передача CSF супернатант в равной степени в 500 аликвотвов в полипропиленовый винт крышки криовиалы.
- Запись идентификационного номера объекта, типа образца и даты сбора образцов на этикетке криовцев. Хранить при -80 градусах по Цельсию до использования.
4. Извлечение cfDNA из жидких образцов
- Выполните протокол извлечения cfDNA в рамках инструкций в справочнике комплекта комплекта извлечения cfDNA12.
- Очистите скамейку и оборудование с 10% отбеливателя и 70% этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование капота ПЦР, регулярная смена перчаток и частое обеззараживание скамейки и оборудования с 10% отбеливателем и 70% этанолом во время всех этапов протокола важно, чтобы избежать загрязнения образца. - Приготовьте аликвоты реагентов, например, буферы для мытья, из комплекта для извлечения, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
- Очистите скамейку и оборудование с 10% отбеливателя и 70% этанола.
- Оттепель пациентов на льду до начала добычи. Для плазмы/ сыворотки, оттаивать 1 мл aliquot образца. Для CSF, оттепель 500 qL aliquot образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги lysis (4.5-4.8) протокола экстракции отличают между плазмой/сывороткой и CSF, но от шага 4.9 onwards, протокол идентичны для обоих типов биожидкости. - Установите нагревательный блок до 60 градусов по Цельсию для использования во время этапа лиза (4,6).
- Подготовьте буфер лиза и несущую РНК-смесь в трубке 15 мл, добавив 5,6 л РНК и 0,9 мл буфера лисиса на образец12.
- Для плазмы/сыворотки добавьте 100 юаней протеиназа K, 1 мл образца и 0,8 мл люизисной буфера/носителя РНК-смеси, приготовленной в шаге 4,4 к помеченной трубке 2,0 мл. Смешайте пульс вихрем для 30 s на высокой скорости12.
- Для CSF добавьте 125 л протеиназа K, 500 л образца, 1 мл люцисного буфера/носителя РНК-смеси и 250 мл буфера лиза ткани в трубку 2,0 мл. Доведите полный объем до 2 мл, добавив 125 л 1x фосфатно-буферного солья (PBS). Смешайте пульс вихрем для 30 s на высокой скорости12.
- Инкубировать образцы в течение 30 мин при 60 градусах ПоЦельси в нагревательном блоке12.
- Удалите образцы из нагревательного блока и понизите температуру до 56 градусов по Цельсию. Верните образцы на скамейку и перенесите лисат в новые помеченные трубки 15 мл.
- Для плазмы / сыворотки, добавить 1,8 мл нуклеиновой кислоты связывания буфераи смесь для 30 с импульсом вихря12.
- Для CSF добавьте 3,6 мл связывающего буфера нуклеиновой кислоты и смешайте по 30 с импульсным вихрем12.
- Инкубировать образцы на 5 мин на льду12.
- Вставьте колонку в вакуумный разъем. Откройте колонку и вставьте 20 мл трубки удлинитель в колонке12.
- Pipette содержимое трубки 15 мл непосредственно в нижней части трубки удлинитель, избегая оставляя капли на стенах трубки удлинитель.
- При выключенном вакуумном разъеме включите вакуумный насос. После того, как давление построено до 900 мбар, откройте клапан вакуумного разъема. Образец теперь будет проходить через столбец.
- После того, как весь лисат был слив из колонки, выключите насос и откройте люк для вакуумного разъема, снимая градиент давления. Как только давление достигнет 0 мбар, закройте клапан вакуумного разъема и люк.
- Удалите 20 мл трубки удлинитель, стараясь не пройти расширитель одной колонки над соседней колонкой, так как это может перекрестного загрязнения образцов. Утилизировать трубчатый удлинитель.
- Добавьте 600 л буфера первой стирки в столбец12.
- Оставьте крышки трубок открытыми и включите вакуумный насос. Пусть датчик давления достигает 900 мбар, а затем включите переключатель на вакуумный разъем в открытое положение, чтобы привлечь буфер стирки через колонку.
- Выключите вакуумный насос, откройте люк, чтобы выпустить давление, и снимите давление до 0 мбар. Поверните клапан вакуумного разъема в замкнутое положение.
- Добавьте 750 qL буфера второй стирки к столбце и повторите шаги 4.16-4.1712.
- Добавьте в колонку 750 кЛ этанола класса МБ и повторите шаги 4.16-4.1712.
- Закройте крышку колонны и поместите колонку в новую трубку коллекции 2,0 мл. Утилизировать вакуумный разъем12.
- Центрифуга трубки с колонкой на 20000 х г в течение 3 мин при комнатной температуре12.
- Поместите колонку в новую трубку сбора и откройте крышку трубки. Поместите лабораторную ткань сверху и инкубировать при 56 градусах по Цельсию в течение 10 мин12.
- Поместите столбец в чистую 1,5 мл ПЦР-чистой трубки и пипетки 100 л элекционного буфера (или молекулярной биологии класса H2O (MB H2O)) прямо в центр колонны. Не прикасайтесь к столбце кончиком пипетки. Закройте крышку и оставьте при комнатной температуре на 3 мин.
- Центрифуга при температуре 20 000 х при комнатной температуре в течение 1 мин до elute cfDNA12.
- Пипетка eluate обратно в колонку и инкубировать при комнатной температуре в течение 3 минут.
- Повторите центрифугацию на полной скорости в течение 1 мин, чтобы elute cfDNA второй раз, чтобы увеличить урожайность (в порядке производителя).
- Храните cfDNA в помеченных DNase/RNase бесплатных ПЦР-чистых трубок при 4 градусах Цельсия или перейдите непосредственно к шагу 5.
5. Вакуумная концентрация cfDNA
- Вставьте и уравновейдите трубки, содержащие eluted cfDNA в держатели на вакуумный концентратор. Откройте крышки трубок. Установите температуру вакуумного концентратора до 23 градусов по Цельсию.
-
Включите вакуумный концентратор, затем включите паровую ловушку. Образцы центрифуги в течение 40 мин или до достижения окончательного объема 10,5-11 л.
- Если объем ниже 10,5 л, добавьте буфер суспензии ДНК или MB H2O, чтобы достичь конечного объема в 10,5 л.
- Pipette полный объем вдоль стен окни трубки для удаления остаточных фрагментов ДНК.
- Кратко центрифуги образцов на столешницацентры для сбора капель на стенах труб.
- Приступить непосредственно к этапу предампрятия (шаг 8) или хранить образцы при 4 градусах Цельсия.
- Оберните крышки труб в лабораторной пленке, чтобы избежать загрязнения, если они хранятся для последующего использования.
6. Проектирование и подготовка праймеров и зондов
- Дизайн вперед и обратный грунтовки, и wildtype и мутант LNA зондов, для цели (ы) интерес. Коммерчески заказать лиофилизированные грунтовки и зонды (см. таблицу материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности для грунтовок и зондов, нацеленных на H3F3A p.K27M и другие целевые мутации для детских глиом средней линии, можно найти в дополнительной таблице 3 Panditharatna et al., 20188. - Перед открытием лиофилизированных грунтовок и зондов, кратко центрифуги труб. Добавьте соответствующий объем буфера суспензии ДНК или MB H2O, как указано на листе спецификации продукта, чтобы повторно приостановить лиофилизированные грунтовки и зонды до концентрации 100 мкм.
- Аккуратно вихрь, пипетка вверх и вниз несколько раз, чтобы смешать и кратко центрифуги грунтовки и зонды с помощью столешницы центрифуги.
- Подготовьте 10 аликотов праймеров и зондов, добавив 10 qL из 100 мкм запаса до 90 л буфера суспензии ДНК или MB H2O.
- Подготовьте 1 qM aliquots передних и обратных грунтовок (которые будут использоваться для преамплизации), добавив 10 qL из 10 КМ праймер до 90 qL буфера суспензии ДНК или MB H2O.
- Храните грунтовки и зонды при 4 градусах Цельсия в герметичных темных контейнерах. Оберните лабораторную пленку вокруг крышки, чтобы избежать загрязнения, и крышка зондов в алюминиевой фольге, чтобы избежать воздействия света. Храните зонды при -20 градусов по Цельсию для длительного хранения, если они не используются регулярно.
7. Выбор положительных элементов управления
-
Выберите образец геномной ДНК (gDNA) с известной концентрацией ДНК, которая таит в себе мутацию интереса на известной аллеличной частоте, которая будет использоваться в качестве положительного контроля.
- Используйте 0.025 нг положительного контроля опухолевой ткани ДНК в шаге предампрягения (шаг 8).
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот вход ДНК обеспечивает надежный положительный сигнал на dPCR (как определяется путем выполнения серийных разбавлений опухолевой ткани gDNA укрывательство H3F3A p.K27M мутации8)при минимизации количества образца требуется.
- Используйте 0.025 нг положительного контроля опухолевой ткани ДНК в шаге предампрягения (шаг 8).
8. Преамплификация целевых аллелей
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол предамации в порядке Джексона и др., 201613.
- Очистите скамейку и оборудование с 10% отбеливателя и 70% этанола.
- Получить 1 ММ вперед и обратный праймеры, образцы cfDNA, GDNA положительный контроль, и ДНК-полимераза мастер смеси, и установить на льду.
-
Рассчитайте объем реагентов, необходимых для предусилия желаемого количества образцов cfDNA и положительного контроля, для односепекса или мультиплексной предусилификации следующим образом:
- Для односепфиксной преусилиции (для предувлажнения wildtype и мутантных аллелей для одной мутации интереса), подготовить пЦР реакции смесь, добавив 17,5 л ДНК полимеразы мастер смеси, и 3,5 л вперед и обратного грунтовки (100 нм) на образец13.
- Для мультиплексной преусилиции (для предамплификации двух наборов wildtype и мутантных аллелей для двух мутаций, представляющих интерес), приготовьте смесь реакции ПЦР, добавив 17,5 л миполимного миполиза ДНК и 1,75 л каждого набора передних и обратных грунтовок (50 нм) на образец 13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте достаточное количество смеси реакции ПЦР для количества образцов плюс 10% дополнительно для учета любой ошибки пипетки.
- Распределить 24,5 л смеси реакции ПЦР в каждую скважину 8-хорошо ПЦР полосы трубки13.
- Распределить 10,5 л образца ДНК в соответствующую скважину, чтобы довести общий объем реакции до 35 ЛЛ13. Аккуратно pipette полный объем вверх и вниз в 10 раз, чтобы смешать.
- Выполните усиление ПЦР при 98 градусах по Цельсию в течение 3 мин; 9 циклов 98 градусов по Цельсию на 10 с, температура annealing в течение 3 мин, 72 градуса по Цельсию на 30 с; и расширение на 72 кс в течение 2 мин13.
- Перенесите полный объем преампложденного продукта на маркированные DNase/RNase бесплатные ПЦР-чистые трубки и разбавьте в 140 Л TE ДНК суспензии буфера (pH 8.0)13.
- Заверните крышки труб оков в лабораторную пленку. Храните преамплированный продукт при 4 градусах Цельсия. Для длительной консервации, хранить при -20 градусах Цельсия.
9. Обнаружение и количественная оценка целевой ДНК с использованием dPCR
- Очистите скамейку и оборудование с 10% отбеливателя и 70% этанола.
- Установите 10 праймеров и зондов, генотипирование мастер-микс, и образцы ДНК на льду. Храните капельное стабилизирующее масло при комнатной температуре.
- Аккуратно вихрь и кратко центрифуга всех реагентов, кроме капель стабилизации нефти.
- Убедитесь, что сжатый азотный газовый баллон, прикрепленный к прибору для производства капель и инструменту количественной оценки(Таблицаматериалов), установлен на уровне 90 пси.
- Включите инструмент, генерирующий падение, и компьютер с программным обеспечением инструмента. Запустите программное обеспечение и нажмите Начало инициализации.
- Запустите флеш высокого давления на инструменте генерации капель, если он не был использован в течение одной недели или более.
- Подготовьте реакционную смесь dPCR для 8 скважин прокладки пЦР плюс 10% дополнительно, добавив 220 л генотипирующей мастерской смеси, 8,8 л каждый из 10 мкм диких и мутантных зондов, 39,6 л каждый из 10 мкм вперед и обратных грунтовок, и 17,6 л капель стабилизирующего масла14 х к0 >.
- Аккуратно смешайте реакционную смесь dPCR, протяните полный объем вверх и вниз в 10-20 раз. Не вихрь или центрифуга после капли стабилизирующего масла был добавлен в реакционную смесь.
- Получить ПЦР 8-хорошо полосы трубки и обойтись 38 Зл реакции смеси dPCR непосредственно в нижней части каждого колодца14. Удалите любые пузырьки с чистой наконечником пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: ПЦР полосы труб, которые взаимосвязаны или упакованы плотно вместе может привести к статическим электрическим зарядам, вызывая слияние и шумный сигнал при анализе данных dPCR. Чтобы избежать этого, aliquot полосы труб в отдельные мешки биоопасности, избежать чрезмерной упаковки мешки, и держать трубки от трения вместе. - Добавьте 12 зЛ преампложденного образца ДНК к соответствующим скважинам прокладки ПЦР. Для отрицательного контроля добавьте 12 л МБ Н2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте образцы cfDNA в репликатных скважинах. Для CSF, анализировать по крайней мере в дубликате, и для плазмы / сыворотки анализировать каждый образец в тройной. - Аккуратно пипетка полный объем вверх и вниз в 10 раз, чтобы смешать смесь реакции с образцом ДНК.
- Получить новый чип приборопроизводства и пипетку полного объема из скважин 1-8 из прокладки ПЦР в соответствующие каналы A-H в чипе. Избегайте прикосновения к нижней части каналов с кончиком пипетки.
- Получить новую чистую прокладку пЦР трубки и вставить в капельки генерирующих инструмент. Сканирование или вручную введите идентификатор чипа, генерирующего капельку, в программное обеспечение на приборном компьютере. Введите имена для каждого из 8 каналов. Нажмите Нажмите Запустите запустить, чтобы начать dropletizing образцов.
- Когда капля завершена, удалите прокладку прокладки ПЦР трубки и нанесите колпачки полоски трубки.
- Перенесите прокладку трубки на термальный велосипедист и баланс с другой полосой трубки, содержащей 80 злитровую воду на скважину.
- Программа термальных условий цикла14 как: 95 градусов по Цельсию в течение 10 мин; 45 циклов по две температуры: 95 градусов по Цельсию на 30 с и температура 2 мин; 98 кВ в течение 10 мин; и удерживайте при 10 градусах Цельсия.
- Установите скорость рампы до 0,5 градуса по Цельсию/с и установите объем выборки до 80 qL14.
- Когда тепловой цикл завершен, удалить полоску трубки и передачи на инструмент количественной оценки. Снимите пЦР-полоски и замените высокоскоростными колпачками.
- Включите инструмент количественной оценки и подключенный компьютер с программным обеспечением приборов. Запустите программное обеспечение инструмента и нажмите Setup aRun.
- Поместите полоску трубки в инструмент количественной оценки.
- Получить новый чип количественного инструмента и сканирование или вручную ввести идентификатор чипа в инструмент. Вставьте чип в машину.
- Поместите металлический щит на верхней части чипа и закройте крышку инструмента.
- В программном обеспечении компьютера введите имя для запуска dPCR и для каждого из 8 каналов (A-H). Выберите Быстрый режим (который должен быть использован с высокой скоростью шапки) и нажмите Кнопка Начало, чтобы начать количественную оценку.
- Когда количественная оценка будет завершена, удалите металлический щит (чтобы сохранить и повторно использовать) и утилизировать прокладку пЧР трубки и чипа. На приборном компьютере журнал Run Log будет содержать файлы результатов для каждого запуска. Используйте файлы .fcs для каждого образца для анализа с помощью программного обеспечения аналитика.
10. Анализ данных
- Запустите программное обеспечение аналитика и откройте файлы .fcs для анализа необработанных спектральных данных. Под анализом Вид, выберите Intact. Под Sample View щелкните коробки рядом с каждым из 8 образцов, чтобы в каждой коробке была галочка. Программное обеспечение будет график сигналов для мутантов (FAM) и wildtype (HEX) аллели вдоль x- и y-осей, соответственно.
- Используйте вычисленная матричная функция, чтобы подать заявку на спектральную компенсацию на нетронутых каплях, в зависимости от инструкций производителя15.
- Отрегулируйте настройки оси под опционами Axis. Установите x-оси до минимума 0 и максимум 30 000, а y-оси до минимума -5000 и максимум 10000. При выявлении скоплений капель отрегулируйте осевы, чтобы уменьшить пустое пространство на графике.
ПРИМЕЧАНИЕ: Положение скоплений мутантов и диких типов будет зависеть от используемых зондов, флюорофора и их концентрации. - Выберите образец, соответствующий положительной контрольной опухолевой ткани gDNA, чтобы установить отрицательные (кластер ближе всего к происхождению), мутант (кластер ближе всего к x-оси) и дикий тип (кластер ближе всего к y-оси) ворота. Убедитесь, что кластеры отличаются и легко идентифицируются в успешном асссе.
- Примените настройки ворот для положительного контроля ко всем образцам, нажав на положительный образец контроля и нажав на опцию применения всех настроек квыбранным образцам.
- Под графическим представлением щелкните вкладку «Несколько образцов» для просмотра участков для всех выбранных образцов. Экспорт изображения как . Файл TIF.
- Под вкладкой Workspace в левом верхнем верхнем конце экрана выберите экспортный анализ (CSV) и сохраните анализируемый файл данных в виде файла .csv.
- Откройте файл .csv в программном обеспечении для электронной таблицы для просмотра отрицательных, диких и мутантных капель для каждого образца. Рассчитайте MAF, разделив количество капли мутантов, по сумме скорректированного мутанта Пуассона плюс количество капель дикого типа для каждого образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте Пуассон исправлено рассчитывать, потому что Статистика Пуассона объяснить тот факт, что положительные капли могут содержать больше, чем одна копия целевой ДНК, и, таким образом, суммируя положительные капли не может дать точное количество16.
Representative Results
На рисунке 1 показаны репрезентативные результаты для успешного обнаружения мутации H3F3A p.K27M в преамплофицированной плазме (верхняя левая панель) и CSF (верхняя правая панель) cfDNA от двух детей с DMG. образцы cfDNA были проанализированы в репликации, но для каждого типа образца показан только один репрезентативный график. Участки dPCR показывают успешное поколение капель, с 7-9 миллионов капель на ПЦР хорошо (большинство из которых отрицательные капли, которые не содержат днк-мишени). Минимум 7 миллионов капель на ПЦР хорошо указывает на успешную капельку, в то время как менее 7 миллионов указывают на сбой анализа, и в этом случае пользователь не должен продолжать анализ данных. На рисунке 1 показано четкое разделение между скоплениями мутантов и диких типов вдоль x и y-axes, соответственно. Устойчивые кластеры дикого типа указывают на то, что экстракция cfDNA была успешной, потому что днк шаблона присутствует. Мутантные кластеры показывают МАФ 1,60% и 39,92% для плазмы и CSF образцов, соответственно, демонстрируя положительное обнаружение мутации. Для этих пациентов результаты dPCR соответствуют статусу мутации опухоли, что подтверждается геномным анализом биопсии опухолевой ткани8. Отрицательный контроль (нижняя левая панель) показывает 0 мутантов и 0 капель дикого типа, что указывает на отсутствие загрязнения смеси реакции ПЦР. Положительный контроль опухолевой ткани gDNA (нижняя правая панель) показывает мутацию, обнаруживаемую на ожидаемой аллеличной частоте для выбранного конкретного образца опухоли.
На рисунке 2, репрезентативные результаты показаны для неудачного обнаружения мутации интереса, H3F3A p.K27M, в плазме cfDNA от ребенка с DMG. Мутационный статус был подтвержден геномным анализом опухолевой ткани8. Представлены репрезентативные результаты двух повторяютных скважин ПЦР (верхние панели). Общее количество капель, включая отрицательные капли, составляет от 7 до 9 миллионов на ПЦР, что свидетельствует об успешной капельке. Кластеры wildtype, проложенные вдоль оси y, показывают приблизительно 7-8,000 капель wildtype в наилучшим образом для cfDNA плазмы, показывая успешно извлечение cfDNA (по мере того как будет дна wildtype цели в образце). Однако в образце плазмы обнаружено 0 капель мутантов. Нижняя левая панель показывает отрицательный контроль (MB H2O) без капли дикого типа или мутанта; а нижняя правая панель показывает положительный контроль предусилифицированной опухолевой ткани gDNA (0.025 нг) с положительным обнаружением мутаций. Как показано на этой цифре, отсутствие обнаружения мутаций в плазме не обязательно означает, что пациент является диким типом для мутации интереса, так как ложные негативы действительно происходят8. В некоторых случаях, когда мутация пропущена в плазме, собранной при авансовой биопсии, она обнаруживается в плазме, полученной от того же пациента в более поздний моментвремени8.
Рисунок 1 : Успешное обнаружение H3F3A p.K27M мутации в преамплоченной плазме и CSF cfDNA у детей с глиомами средней линии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2 : Ложные отрицательные результаты, полученные в результате анализа преамплифицированного образца плазмы cfDNA от пациента, известного как гавань мутации интереса, H3F3A p.K27M, в опухоли. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Discussion
Здесь мы представили наш метод для обнаружения и количественной оценки аллеливой частоты опухолевых мутаций в cfDNA от жидкой биопсии пациента. Мы подчеркиваем критические шаги для успеха этого метода, включая преданалитическую обработку образцов, извлечение cfDNA, проектирование анализа ПЦР и анализ данных. Чтобы ограничить используемый объем выборки, cfDNA извлекается из 1 мл плазмы, но только 500 л CSF. При извлечении из CSF, протокол для извлечения из 1 мл мочи (после комплекта экстракта cfDNA12) используется, в соответствии с рекомендацией производителя. Разница в объеме выборки, требуемой между плазмой и CSF, обусловлена более низкимуровнем опухолевого cfDNA вплазме по сравнению с CSF пациентов с опухолями головного мозга, что требует больших объемов выборки для обнаружения мутаций 8. Если образец доступен, более 1 мл плазмы может быть извлечено из для получения более высокой урожайности ДНК. Однако, в случае педиатрических пациентов, важно, чтобы свести к минимуму количество крови, используемой, когда это возможно, так как даже простая процедура, такие как анализ крови является утомительным для педиатрических пациентов с раком, проходящих лучевой терапии. Извлечение из 1 мл аликвот плазмы также позволяет повторить экстракции, такие, что анализ может быть повторен (например, в случае отказа в извлечении ДНК или загрязнении образца).
В попытке уменьшить любое использование выборки, которое не является строго необходимым, cfDNA, как правило, не количественно. Тем не менее, мы обнаружили диапазон концентраций cfDNA между 0,2-2 нг/Л и 0,6-13 нг/Л в плазме и CSF, соответственно. Учитывая низкое количество cfDNA, а также тот факт, что опухолевые мутантные аллели присутствуют на низкой частоте, предусиливающий шаг с использованием того же набора грунтовок, используемых для dPCR, необходимо значительно увеличить количество целевой ДНК в образце, помогая в обнаружение мутаций8. Разбавление предварительно усиленного продукта в буфере суспензии ДНК обеспечивает достаточный объем для технических репликаций, что помогает различать истинные срабатывания. Поскольку количество капель мутантов может быть низким (например, между каплями мутантов в плазменном образце), включение технических репликатов является ключом к разрешению состояния мутации. В то время как один ПЦР хорошо может дать 0 мутантных капель, два других могут дать 1-2 для одного образца плазмы, проанализированного в тройном; таким образом, включение репликатов обеспечивает большую точность при определении статуса мутации. Затем MAF рассчитывается как среднее значение репликации.
Мультиплексируемая предусилительация (преамплоция wildtype и мутантные аллели двух мутаций, представляющих интерес) повышает полезность одного образца, так как один и тот же исходный материал может быть использован для тестирования на две мутации. Важно отметить, что мультиплекс преамплификации продукт может быть проанализирован в singleplex во время dPCR для большей простоты, как описано здесь. Тем не менее, как предусилитель pcR и dPCR могут быть мультиплексированы. При мультиплексировании условия должны быть оптимизированы как для наборов грунтовок, так и для зондов: температуры грунтовки должны быть похожи на совместное увеличение ПЦР, а зонды должны быть разработаны для генерации различных кластеров (на основе флуоресцентного сигнала и интенсивности). При проверке нового набора грунтовок и зондов, запустить градиент температуры annealing, чтобы определить оптимальную температуру аннулирования на основе диапазона, предложенного производителем. Перед тестированием зондов на образцах cfDNA пациента, проверить их с помощью синтетических конструкций ДНК и / или опухолевой ткани gDNA различных входов (т.е., до 10 нг).
Для обнаружения мутантных аллелей с большей специфичностью и уменьшенными несоответствиями в гибридизации зонда к целевой ДНК используются заблокированные нуклеиновые кислоты (LNA). LNA является аналогом нуклеиновой кислоты с метиленовым мостом, соединяющим 2'-кислород и 4'-углерод кольца рибоза9. Метиленовый мост запирает нуклеиновую кислоту в жесткую бикливую конформацию, которая ограничивает гибкость, повышает тепловую стабильность дуплекса и улучшает специфичность гибридизации зонда для целевой ДНК10,18, 19. Если одно базовое несоответствие существует между зондом LNA и ДНК шаблона, дуплексное образование между зондом и целью дестабилизируется. Таким образом, зонды LNA улучшают специфичность связывания зонда и приводят к более высокому соотношению сигнала к шуму11. Анализ плазмы и CSF от не-CNS больных педиатрических пациентов установил специфику нашего анализа с зондами LNA ориентации H3F3A p.K27M, чтобы определить, что аллельный частота равна или менее 0,001% считается ложным положительным 8. Для дополнительных соображений для оптимизации дизайна зондов и грунтовки, в том числе GC содержание, размер ампилкона, зонд репортер красителей, и утоления, обратитесь к dPCR производителя руководящих принципов14,17. Хотя наш метод оптимизирован для использования с системой RainDance, протокол может быть адаптирован для использования с другими платформами dPCR.
Представленный здесь метод черпает силу из высокой чувствительности и целевого обогащения, достигнутого dPCR, который остается платформой выбора для обнаружения редких опухолевых мутаций в cfDNA. Несмотря на мощный, dPCR ограничен в количестве мутаций, которые могут быть проверены в одном анализе. Альтернативой dPCR является секвенирование следующего поколения (NGS), которое может обнаружить несколько мутаций во многих генах, увеличивая полезность одного образца. NGS может обнаружить мутации в CSF и плазме пациентов с глиомами ствола мозга20, однако, в настоящее время менее чувствителен, чем dPCR при обнаружении мутаций опухоли в cfDNA, с пределами обнаружения 0,1-10% МАФ по сравнению с 0,001% в ПЦР-подходах21 . dPCR также обеспечивает более быстрое время оборота, чем NGS, что позволяет быстро выявлять мутации, представляющие интерес. Подход ПЦР применим по типам рака и может быть расширен для выявления мутаций в горячих точках и метилированных cfDNA22.
Биопсия жидкости действительно находится в зачаточном состоянии и потребует дальнейшего развития для адаптации к конкретным заболеваниям. Мониторинг опухолей в контексте эволюции опухоли будет следующей проблемой, где платформа, способная обнаруживать возникающие мутации с высокой чувствительностью, потребуется. Кроме того, платформы, способные обнаруживать различные биомолекулы (пептиды, цитокины, РНК), будут весьма полезны при оценке опухолевого ответа на лечение, а также в продвижении персонализированных клинических вмешательств.
Disclosures
Метод, описанный в данной рукописи, включен в Международную патентную заявку «Методы обнаружения биомаркеров рака» Джавада Назаряна и Эшини Пандитаратны.
Acknowledgments
Авторы хотели бы отметить щедрость всех пациентов и их семей. Эта работа была поддержана финансированием из Smashing Грецкие орехи фонда (Middleburg, Va), V Фонд (Атланта, штат Джорджия), Габриэлла Миллер Дети Первый ресурсный центр данных, клинические и трансляционные науки института в Национальном детских ( 5UL1TR01876-03), Фонд Музеллы (Хьюлетт, Штат Нью-Джерси), Фонд Мэтью Ларсона (Франклин Лейк, Нью-Джерси), Фонд Лиллабина по исследованию детского рака мозга (Серебряная весна, MD), Фонд опухолей головного мозга детства (Germantown, MD), Детский мозг Консорциум опухолевых тканей (Филадельфия, пенсильвания) и Фонд ралли для исследования рака детства (Атланта, джорджия).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0) | Teknova | T0227 | |
| BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367525 | For plasma collection |
| BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL) | Becton Dickinson Diagnostics | 367895 | For serum collection |
| Bleach | General Lab Supplier | ||
| Buffer ATL | Qiagen | 19076 | |
| Cell-Free DNA Blood Collection Tubes | Streck | 218961 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| CentriVap Concentrator | Labconco | 7810010 | |
| Forward Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| MiniAmp Thermal Cycler | Thermofisher Scientific | A37834 | |
| Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof) | General Lab Supplier | ||
| Mutant Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| PAXgene Blood ccfDNA tubes | PreAnalytiX | 768115 | cfDNA blood collection tubes (optional) |
| PCR 8 well strip tube caps | VWR | 10011-786 | |
| PCR 8 well strip tubes | Axygen | PCR-0208-C | |
| Pipette (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Pipette filter tips (p20, p200, p1000) | General Lab Supplier | ||
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | New England Biolabs Inc | M0494S | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook | Qiagen | cfDNA extraction kit handbook (2013 edition) | |
| QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit | Qiagen | 55114 | cfDNA extraction kit (Protocol Step 4) |
| QIAamp MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes |
| Qiavac 24 Plus | Qiagen | 19413 | For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit |
| Raindance Consumable Kit | Bio-Rad | 20-04411 | Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil |
| Raindance Sense Instrument | Bio-Rad | Quantification instrument (used in Protocol Step 9) | |
| Raindance Source Instrument | Bio-Rad | Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9) | |
| RainDrop Analyst II Software | RainDance Technologies | Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10) | |
| Refrigerated Vapor Trap | Savant | RVT5105-115 | |
| Reverse Primer | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design | |
| Smartblock 2 mL | Eppendorf | 05 412 506 | |
| TaqMan Genotyping Master Mix | Thermofisher Scientific | 4371353 | |
| Thermomixer C | Eppendorf | 14 285 562PM | |
| WT Probe | Integrated DNA Technologies, Inc. | Custom design |
References
- Mackay, A., et al. Integrated molecular meta-analysis of 1,000 pediatric high-grade and diffuse intrinsic pontine glioma. Cancer Cell. 32, 520-537 (2017).
- Hoffman, L. M., et al. Spatial genomic heterogeneity in diffuse intrinsic pontine and midline high-grade glioma: implications for diagnostic biopsy and targeted therapeutics. Acta Neuropathologica Communications. 4 (1), (2016).
- Puget, S., et al. Biopsy in a series of 130 pediatric diffuse intrinsic pontine gliomas. Child's Nervous System. 31 (10), 1773-1780 (2015).
- Leary, S., et al. Year one in the molecular era of pediatric brain tumor diagnosis: application of universal clinical targeted sequencing in an unselected cohort of children. Neuro-Oncology. 19 (4), iv21 (2017).
- Mueller, S., et al. DIPG-40. PNOC003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma. Neuro-Oncology. 19 (4), iv14 (2017).
- Kilburn, L., et al. DIPG-76. PNOC-003: Precision medicine trial for children with diffuse intrinsic pontine glioma: preliminary experience with multi-agent personalized therapy recommendations. Neuro-Oncology. 20 (2), i64 (2018).
- Aquino, D., Gioppo, A., Finocchiaro, G., Bruzzone, M. G., Cuccarini, V. MRI in glioma immunotherapy: evidence, pitfalls, and perspectives. Journal of Immunology Research. 2017, 5813951 (2017).
- Panditharatna, E., et al. Clinically relevant and minimally invasive tumor surveillance of pediatric diffuse midline gliomas using patient-derived liquid biopsy. Clinical Cancer Research. , (2018).
- Singh, S. K., Koshkin, A. A., Wengel, J., Nielsen, P. LNA (locked nucleic acids): synthesis and high-affinity nucleic acid recognition. Chemical Communications. 29 (4), 455-456 (1998).
- Owczarzy, R., You, Y., Groth, C. L., Tataurov, A. V. Stability and mismatch discrimination of locked nucleic acid-DNA duplexes. Biochemistry. 50 (43), 9352-9367 (2011).
- Priya, N. G., Pandey, N., Rajagopal, R. LNA probes substantially improve the detection of bacterial endosymbionts in whole mount of insects by fluorescent in-situ hybridization. BMC Microbiology. 12, 81 (2012).
- Qiagen. QIAamp Circulating Nucleic Acid Handbook. , 1090257 (2013).
- Jackson, J. B., et al. Multiplex preamplification of serum DNA to facilitate reliable detection of extremely rare cancer mutations in circulating DNA by digital PCR. The Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 235-243 (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Assay Guidelines. , LCN 50-04334 Rev. D (2016).
- Rain Dance Technologies. RainDrop Analyst II Operator's Manual. , LCN 50-08157, Rev. A (2015).
- Majumdar, N., Banerjee, S., Pallas, M., Wessel, T., Hegerich, P. Poisson Plus quantification for digital PCR system. Scientific Reports. 7, 9617 (2017).
- Biorad. Droplet Digital PCR Applications Guide. , Life Science Group. Bulletin 6407 Rev. A. 13-0579 0214 Sig 1213 (2018).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Moller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Review of Molecular Diagnostics. 3 (1), 27-38 (2013).
- Ugozzoli, L. A., Latorra, D., Puckett, R., Arar, K., Hamby, K. Real-time genotyping with oligonucleotide probes containing locked nucleic acids. Analytical Biochemistry. 324 (1), 143-152 (2004).
- Pan, C., et al. Molecular profiling of tumors of the brainstem by sequencing of CSF-derived circulating tumor DNA. Acta Neuropathologica. , (2018).
- Stewart, C. M., Tsui, D. W. Y. Circulating cell-free DNA for non-invasive cancer management. Cancer Genetics. , (2018).
- Barault, L., et al. Discovery of methylated circulating DNA biomarkers for comprehensive non-invasive monitoring of treatment response in metastatic colorectal cancer. Gut. 67 (11), 1995-2005 (2018).
