Påvisning og overvågning af tumor associeret cirkulerende DNA i patientens Biofluider

Summary

Her præsenterer vi en protokol til påvisning af tumor somatiske mutationer i cirkulerende DNA til stede i patientens biologiske væsker (biofluider). Vores dråbe digital polymerase kædereaktion (dpcr)-baseret metode muliggør kvantificering af tumor mutation alleliske frekvens (MAF), lette et minimalt invasivt supplement til diagnose og tidsmæssig overvågning af tumorrespons.

Abstract

Komplikationer forbundet med på forhånd og gentagen kirurgisk vævs prøvetagning præsenterer behovet for minimalt invasive platforme, der er i stand til molekylær sub-klassifikation og tidsmæssig monitorering af tumorrespons på terapi. Her beskriver vi vores dPCR-baserede metode til påvisning af tumor somatiske mutationer i celle frit DNA (cfDNA), der er let tilgængelige i patientens biofluider. Selv om begrænset i antallet af mutationer, der kan testes for i hver analyse, denne metode giver en høj grad af følsomhed og specificitet. Overvågning af mutation overflod, som beregnet af MAF, giver mulighed for evaluering af tumorrespons på terapi, og dermed give et meget tiltrængt supplement til Radiografisk billeddannelse.

Introduction

På grund af begrænsninger i tilgængeligheden af tumor væv til molekylære analyser, der er behov for udvikling af meget følsomme metoder i stand til at afsløre tumor somatiske mutationer i patientens biofluider, herunder plasma, serum og cerebrospinalvæske (CSF) . For eksempel, Pediatric diffus midterlinje gliomer (dmgs) præsentere en udfordring på grund af deres anatomiske placering. I løbet af det seneste årti har molekyle profilering af DMG-vævsprøver afdækket driver mutationer i denne tumortype¹ og har afsløret rumlige og tidsmæssige heterogenitet af mutationer, hvilket gør biopsi nødvendig for at karakterisere en patient inden for en sygdom under gruppe og fremme af molekylært målrettede terapier². Som sådan, kliniske forsøg fortaler for integration af kirurgiske biopsier for tumor Molekylær profilering ved på forhånd diagnose^3,4,5,6. Under behandlingen, overvågning af terapeutiske respons i DMGs er begrænset til Mr, som mangler følsomhed til at detektere små ændringer eller tumor genomisk Evolution. MRI er også tilbøjelige til at detektere pseudoprogression, forbigående inflammation på stedet af tumoren, der efterligner sande progression på Imaging og kan misinforme fortolkning af tumorrespons⁷. Således, DMGs repræsenterer en tumortype med et stort behov for en alternativ, minimalt invasive midler til påvisning af tumor mutationer og overvågning klinisk respons. For at opfylde disse behov udviklede og optimerede vi en protokol til påvisning og kvantificering af den alleliske hyppighed af tumor mutationer i cfdna fra plasma, serum og CSF af børn med midterlinjen gliomer⁸. I betragtning af, at barndommen DMGs ofte (> 80%) havn en somatisk lysin-til-methioninmutation ved position 27 af Histon variant h 3.1 (h 3.1 k27m, 20% af tilfældene) eller h 3.3 (h 3,3 k27m, 60% af tilfældene)¹, disse og andre mutationer karakteristiske for dmgs (dvs., ACVR1, PIK3R1) var rettet mod mutant allel-kvantificering ved brug af cfdna⁸. Denne analyse kan skræddersys til at detektere hotspotmutationer i andre tumortyper ved hjælp af sekvens specifikke primere og sonder. Alsidigheden i denne fremgangsmåde gør den anvendelig på en række forskellige kræftformer, som vil kunne drage fordel af integrationen af cfDNA-baserede diagnosticeringsværktøjer og terapeutisk overvågning.

For at kunne detektere lave alleliske frekvens mutationer i cfdna, anvender vi en dråbe digital PCR (dpcr)-baseret tilgang. I denne metode opdeles PCR-reaktionsblandingen i et teoretisk maksimum på 10.000.000 dråber ved hjælp af dPCR-platformen (f. eks. RainDance) med 7-9 millioner dråber pr. PCR, der typisk ses eksperimentelt. På grund af den høje grad af prøve partitionering, højst kun én til to DNA-molekyler kan være til stede i hver dråbe. PCR amplifikation og sekvens-specifikke fluorescerende Probe hybridisering kan forekomme i hver dråbe, således at millioner af reaktioner finder sted. Dette maksimerer følsomheden og muliggør påvisning af sjældne mutante alleler, som ellers ville gå uopdaget mod en baggrund af dværg DNA. Udnyttelsen af låste nukleinsyre (LNA) sonder øger specificiteten af analysen ved at begrænse mismatch hybridisering og understøtter nøjagtig mutation detektion^9,10,11. Her beskriver vi vores metoder til prøve behandling, cfDNA-ekstraktion, præamplifikation af Target alleler, dPCR og dataanalyse.

Protocol

Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af den institutionelle revisions bestyrelse på University of California San Francisco (San Francisco, CA; IRB #14-13895) og børnenes nationale sundheds system (Washington, D.C.; IRB-#1339). Prøver blev indsamlet og undersøgt efter at have indhentet informeret samtykke fra patienten eller patientens værge.

1. samtykkende patienter i henhold til IRB-protokollen til indsamling og opbevaring af biologiske prøver

1. Indsamle patientprøver efter skriftlig informeret samtykke fra hver patient, eller patientens værge, for deltagelse i et klinisk forsøg eller for biorepository som godkendt af den respektive institutionelle revisions bestyrelse.
   1. Patienter inkluderet i dette studie blev diagnosticeret med en hjernetumor Radiografisk. Der blev ikke anvendt udelukkelseskriterier. Prøver blev indsamlet og undersøgt efter at have indhentet informeret samtykke fra patienten eller patientens værge.

2. blod opsamling og separation af plasma eller serum

1. Blodprøven opsamles ved hjælp af en 10,0 mL, der trækkes ind i blodindsamlings rørene. Hvis du indsamler blod til plasma, skal du bruge K₂-eller k₃-EDTA-rør, heparin-eller cfdna-blodindsamlings slanger. Hvis du samler blod til serum, skal du bruge gel-barriere slanger, der indeholder koagulator Aktivatoren og gel til at adskille serum.
   Bemærk: Mens 10 mL anbefales for at muliggøre replikat eksperimenter, vil mindst 3 mL være tilstrækkelig.
2. Vend forsigtigt opsamlingsrøret 10 gange for at blande blodprøven med reagensglas til opsamlingsrøret.
3. Lad de blodprøver, hvorfra serum vil blive indsamlet ved stuetemperatur i 30 min for at tillade blodet at størkne. Hvis du behandler blod for at opnå plasma, skal du straks fortsætte til trin 2,4.
   Bemærk: Prøver, der forarbejdes for plasma, kan opbevares på is i højst 2 timer inden centrifugering. Men, en hurtig overgang fra blodet trække til forarbejdning minimerer cfDNA nedbrydning.
4. Centrifuge blod opsamlings rør ved 2.000 x g i 15 min i en centrifuge indstillet til 4 ° c til at adskille plasma eller serum fra hvide og røde blodlegemer lag.
5. Pas på ikke at forstyrre det hvide blodlegemer (som danner en tynd linje mellem det øvre plasma/serum lag og nedre lag af pakkede røde blodlegemer), pipette det øverste lag af plasma/serum (som kan være klar, gul eller lyserød i farve) ligeligt i 1 mL aliquoter i sterile skrue-Cap kryovialer af polypropylen.
6. Registrer emne identifikationsnummeret, prøve typen (plasma eller serum) og opsamlingsdatoen på etiketten på kryovialerne.
7. Opbevar cryovials i fryseren-80 °C indtil brug. Hvis a-80 °C fryser ikke er tilgængelig, opbevares prøverne ved-20 °C i op til en uge.

3. indsamling og behandling af CSF

1. Saml CSF fra en shunt, lumbl punktering, eller kirurgi.
   Bemærk: Sådanne procedurer bør kun gennemføres, hvis det skønnes nødvendigt af klinikere. Ekstra prøve ud over, hvad der er nødvendigt til klinisk brug, kan anvendes til forskningsformål.
2. Måle mængden af CSF indsamlet og notere sin farve (blodig, gul, klar).
3. Centrifuger opsamlingsrøret ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4 °c for at pille det cellulære snavs.
4. Overføre CSF supernatanten ligeligt i 500 μL aliquoter i polypropylen skruehætte cryovials.
5. Registrer emne identifikationsnummeret, prøve typen og datoen for prøveindsamlingen på etiketten på kryovialerne. Opbevares ved-80 °C indtil brug.

4. ekstraktion af cfDNA fra flydende enheder

1. Udfør cfDNA ekstraktions protokol som pr instruktionerne i cfDNA Extraction kit håndbog¹².
   1. Rengør bænk plads og udstyr med 10% blegemiddel og 70% ethanol.
      Bemærk: Brug af en PCR Hood, regelmæssig udskiftning af handsker og hyppig dekontaminering af bænk plads og udstyr med 10% blegemiddel og 70% ethanol i alle faser af protokollen er vigtigt for at undgå prøve kontaminering.
   2. Forbered aliquoter af reagenser, fx vaske buffere, fra ekstraktions sættet for at undgå krydskontaminering.
2. Tø patientprøver på is, inden ekstraktionen påbegyndes. For plasma/serum, tø 1 mL alikvot prøve. For CSF, tø 500 μl alikvot af prøven.
   Bemærk: Lyse trin (4,5-4.8) af ekstraktions protokollen varierer mellem plasma/serum og CSF, men fra trin 4,9 og fremefter er protokollen identisk for begge typer af biofluider.
3. Indstil en opvarmnings blok til 60 °C til brug under lysis-trinnet (4,6).
4. Den lyse buffer og bære RNA-blandingen forberedes i et 15 mL rør ved tilsætning af 5,6 μL bære-RNA og 0,9 mL lysisbuffer pr. prøve¹².
5. For plasma/serum tilsættes 100 μL proteinase K, 1 mL prøve og 0,8 mL lysisbuffer/bære RNA-blanding fremstillet i trin 4,4 til et mærket 2,0 mL rør. Bland med Pulse vortexning for 30 s ved høj hastighed¹².
   1. For CSF tilsættes 125 μL proteinase K, 500 μL af prøven, 1 mL lysisbuffer/bære RNA-blanding og 250 μL vævs lyse buffer til et 2,0 mL rør. Det fulde volumen op til 2 mL bringes op ved tilsætning af 125 μL phosphatbufferet saltvand (PBS). Bland med Pulse vortexning for 30 s ved høj hastighed¹².
6. Inkuber prøverne i 30 min ved 60 °C i varme blokken¹².
7. Fjern prøverne fra varme blokken, og Sænk temperaturen til 56 °C. Returner prøverne til bænken og Overfør lysatet til nye mærket 15 mL rør.
8. For plasma/serum tilsættes 1,8 mL nukleinsyre bindbufferog blandes for 30 s ved puls vortexning¹².
   1. For CSF tilsættes 3,6 mL nukleinsyre binding buffer og blandes for 30 s ved Pulse vortexning¹².
9. Inkubere prøver i 5 minutter på Ice¹².
10. Indsæt kolonnen i vakuum stikket. Åbn kolonnen, og Indsæt en 20 mL rørforlænger i kolonne¹².
11. Indholdet af 15 mL røret afpipetteres direkte i bunden af slange extenderen, så det undgås at efterlade dråber på rørextenderens vægge.
12. Med kontakten på vakuum stikket lukket, Tænd for vakuumpumpen. Når trykket er bygget til 900 mbar, skal du åbne ventilen på vakuum stikket. Eksemplet vil nu flyde gennem kolonnen.
13. Når alle lysatet er blevet drænet fra kolonnen, skal du slukke for pumpen og åbne trapporten til vakuum stikket og lindre tryk gradienten. Når trykket når 0 mbar, lukkes ventilen på vakuum stikket og trapporten.
14. Fjern 20 mL tube extender, idet du skal passe på ikke at passere extenderen af en kolonne over en tilstødende kolonne, da dette kan kryds kontaminere prøver. Kassér slange extenderen.
15. Tilsæt 600 μL første vaskebuffer til kolonne¹².
16. Lad lågene på rørene stå åbne, og tænd for vakuumpumpen. Lad tryk måleren nå 900 mbar, og drej derefter kontakten på vakuum stikket til den åbne position for at trække vaskebufferen gennem søjlen.
17. Sluk for vakuumpumpen, Åbn trapporten for at frigøre trykket, og aflaster trykket til 0 mbar. Drej vakuum forbindelsens ventil til den lukkede position.
18. Tilsæt 750 μL anden vaskebuffer til kolonnen, og Gentag trin 4.16-4.17¹².
19. Tilsæt 750 μL ethanol af MB-kvalitet til kolonnen, og Gentag trin 4.16-4.17¹².
20. Luk låget på søjlen, og Placer kolonnen i et nyt 2,0 mL-opsamlings glas. Kassér vakuum stikket¹².
21. Centrifugeglasset centrifugeres med søjlen ved 20.000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur¹².
22. Placer søjlen i en ny opsamlings slange, og Åbn låget på røret. Placer et laboratorie væv over toppen og Inkuber ved 56 °C i 10 min¹².
23. Placer søjlen i en ren 1,5 mL PCR-Clean tube og pipette 100 μL elueringsbuffer (eller molekylær biologi grade H₂o (MB h₂o)) direkte ind i midten af søjlen. Rør ikke ved søjlen med en pipettespids. Luk låget, og lad det ligge ved stuetemperatur i 3 minutter.
24. Centrifuge ved 20.000 x g ved stuetemperatur i 1 min for at elueres cfdna¹².
25. Eluatet afpipetteres tilbage i kolonnen og inkubaterer ved stuetemperatur i 3 minutter.
26. Centrifugeringshastigheden gentages med fuld hastighed i 1 minut for at elueres cfdna for anden gang for at øge udbyttet (ifølge producentens anbefaling).
27. Opbevar cfDNA i mærkede DNase/RNase Free PCR-Clean-rør ved 4 °C eller Fortsæt direkte til trin 5.

5. vakuum koncentration af cfDNA

1. Indsæt og afbalancerer de rør, der indeholder elueret cfdna, i holdere på vakuum koncentratoren. Åbn låget på rørene. Indstil temperaturen på vakuum koncentratoren til 23 °C.
2. Tænd for vakuum koncentratoren, og tænd derefter for damp fælden. Centrifugerings prøverne i 40 min, eller indtil der nås et endeligt volumen på 10,5-11 μL.
   1. Hvis lydstyrken er under 10,5 μL, tilsættes DNA-affjedrings buffer eller MB H₂O for at nå et endeligt volumen på 10,5 μl.
3. Afpipetteres hele volumenet langs rørenes vægge for at fjerne resterende DNA-fragmenter.
4. Centrifuge prøverne centrifugeres kortvarigt på en Bordcentrifuge for at samle dråber på rørenes vægge.
5. Gå direkte til forforstærknings trinnet (trin 8) eller Opbevar prøverne ved 4 °C.
   1. Wrap låg af rør i en laboratorie film for at undgå kontaminering, hvis de er lagret til senere brug.

6. design og klargøring af Primers og sonder

1. Design fremad og reverse primere, og dværg og mutant LNA sonder, for mål (r) af interesse. Bestil lyofiliserede primere og sonder kommercielt (se tabel over materialer).
   Bemærk: sekvenser for primere og sonder rettet mod H3F3A p. K27M og andre målmutationer for pædiatriske midterlinjen gliomer findes i supplerende tabel 3 i Panditharatna et al., 2018⁸.
2. Før de lyofiliserede primere og sonder åbnes, centrifugeres rørene kortvarigt. Tilsæt den passende mængde DNA-affjedrings buffer eller MB H₂O, som anført på produkt specifikationsarket, for at resuspendere de lyofiliserede primere og sonder til en koncentration på 100 μM.
3. Vortex forsigtigt, pipetten op og ned flere gange for at blande og kort centrifuge primere og sonder ved hjælp af en bordplade centrifuge.
4. Forbered 10 μM-aliquoter af primere og sonder ved at tilsætte 10 μL 100 μM-lager til 90 μL DNA-affjedrings buffer eller MB H₂O.
5. Der fremstilles 1 μM-aliquoter af fremad-og bakgrundere (til Forforstærkning) ved tilsætning af 10 μL 10 μM primer til 90 μL DNA-affjedrings buffer eller MB H₂O.
6. Opbevar primere og sonder ved 4 °C i lufttætte, mørke beholdere. Wrap laboratorie folie omkring låg for at undgå kontaminering, og dække sonder i aluminiumsfolie for at undgå udsættelse for lys. Opbevar sonder ved-20 °C ved langtidsopbevaring, hvis de ikke anvendes regelmæssigt.

7. udvælgelse af positive kontroller

1. Vælg tumor vævs genomisk DNA (gDNA) prøve (r) med kendt DNA-koncentration, som huser mutationen af interesse ved en kendt allelisk frekvens, der skal anvendes som en positiv kontrol.
   1. Brug 0,025 ng af positiv kontrol tumor væv DNA i foramplifikation trin (trin 8).
      Bemærk: denne DNA-indgang giver et robust positivt signal om dpcr (som bestemmes ved at udføre serielle fortyndinger af tumorvævet gDNA husly H3F3A p. K27M mutation⁸) og samtidig minimere mængden af prøve, der kræves.

8. præamplifikation af Target alleler

Bemærk: Preamplifikation protokol er som pr Jackson et al., 2016¹³.

1. Rengør bænk plads og udstyr med 10% blegemiddel og 70% ethanol.
2. Få 1 μM fremad-og reverse-primere, cfDNA-prøver, gDNA-positive kontroller og DNA-polymerasemaster mix, og sæt på is.
3. Beregn mængden af reagenser, der er nødvendige for at preamplificere det ønskede antal cfDNA-prøver og positiv kontrol, for enten singleplex eller multiplex foramplifikation som følger:
   1. For singleplex-præamplifikation (for at forforstærke dværg og mutant alleler for en enkelt mutation af interesse), Forbered PCR-reaktionsblandingen ved tilsætning af 17,5 μl DNA-polymerasemaster mix og 3,5 μl fremad-og bakgrundere (100 nm) pr. prøve¹³.
   2. For multiplex præamplifikation (for at forforstærke to sæt af dværg og mutant alleler for to mutationer af interesse), Forbered PCR-reaktionsblanding ved tilsætning af 17,5 μl DNA-polymerasemaster mix og 1,75 μl af hvert sæt fremad-og bakgrundere (50 nm) pr. prøve ¹³.
      Bemærk: Forbered en nok PCR-reaktionsblanding til antallet af prøver plus 10% ekstra for at gøre opmærksom på eventuelle pipetteringsfejl.
4. 24,5 μL PCR-reaktionsblanding dispenserer i hver brønd af en 8-brønd PCR Strip tube¹³.
5. 10,5 μL DNA-prøve dispenserer i det rette godt for at bringe den samlede reaktions volumen op på 35 μL¹³. Pipetten forsigtigt den fulde lydstyrke op og ned 10 gange for at blande.
6. Udføre PCR amplifikation ved 98 °C i 3 min; 9 cyklusser af 98 °C for 10 s, udglødning temperatur for 3 min, 72 °C for 30 s; og en forlængelse ved 72 °C i 2 min¹³.
7. Det fulde volumen af det foramplificerede produkt overføres til den mærkede DNase/RNase Free PCR-Clean-rør og fortyndes i 140 μL TE-DNA-affjedrings buffer (pH 8,0)¹³.
8. Wrap låg af rørene i laboratorie film. Det foramplificerede produkt opbevares ved 4 °C. Til langtidsbevaring opbevares ved-20 °C.

9. påvisning og kvantificering af Target DNA ved hjælp af dPCR

1. Rengør bænk plads og udstyr med 10% blegemiddel og 70% ethanol.
2. Sæt 10 μM primere og sonder, genotypebestemmelse Master Mix og DNA-prøver på is. Opbevar dråbe stabiliserende olie ved stuetemperatur.
3. Vortex forsigtigt, og centrifuger kortvarigt alle reagenser undtagen dråbe stabiliserende olie.
4. Sørg for, at den komprimerede nitrogen Gascylinder, der er fastgjort til dråbe frembringende instrument og kvantificerings instrumentet (tabel over materialer), er indstillet til 90 PSI.
5. Tænd for drop-genererer instrumentet og computeren med instrumentet software. Start softwaren, og klik på Start initialisering.
   1. Kør en højtryks flush på dråbe genererende instrument, hvis den ikke har været brugt i en uge eller mere.
6. DPCR-reaktionsblandingen forberedes til 8 brønde i PCR-Strip røret plus 10% ekstra ved tilsætning af 220 μL genotype Master Mix, 8,8 μL hver af 10 μM-jokertegn og mutant sonder, 39,6 μL af 10 μM fremad-og reversegrundere og 17,6 μL dråbe stabiliserende olie^{14 .}
7. Bland forsigtigt dPCR-reaktionsblandingen ved at pipettere den fulde lydstyrke op og ned 10-20 gange. Må ikke vortex eller centrifugeres efter dråbe stabiliserende olie er blevet føjet til reaktionsblandingen.
8. Få en PCR 8-brønd Strip tube og dispensere 38 μL dPCR-reaktionsblanding direkte i bunden af hver brønd¹⁴. Fjern eventuelle bobler med en ren pipettespids.
   Bemærk: PCR Strip rør, der er blokeret eller pakket tæt sammen kan resultere i statiske elektriske ladninger, forårsager sammensmeltningen og støjende signal ved analyse af dpcr data. For at undgå dette, alikvot Strip rør i separate Biohazard poser, undgå over pakning poser, og holde rørene fra gnidning sammen.
9. Tilsæt 12 μL præamplificeret DNA-prøve til de relevante brønde i PCR-Strip røret. For den negative kontrol tilsættes 12 μL MB H₂O.
   Bemærk: Analysér cfDNA-prøver i replikat brønde. For CSF, analysere mindst i duplikat, og for plasma/serum analysere hver prøve i triplicate.
10. Pipetten forsigtigt den fulde lydstyrke op og ned 10 gange for at blande reaktionsblandingen med DNA-prøven.
11. Få en ny dråbe skabende instrument chip og pipetten hele volumenet fra brønde 1-8 af PCR Strip røret ind i de tilsvarende kanaler A-H i chippen. Undgå at berøre bunden af kanalerne med en pipettespids.
12. Få en ny ren PCR Strip tube og Indsæt i det dråbe skabende instrument. Scan eller indtast det dråbe genererede instrument chip-ID manuelt i softwaren på instrument computeren. Indtast navne for hver af de 8 kanaler. Klik på Start kørslen for at begynde at dropletiserende prøver.
13. Når dropletiseringen er fuldført, skal du fjerne PCR Strip røret og anvende Strip tube caps.
14. Overføre Strip røret til en termisk variator og balance med en anden strimmel rør indeholdende 80 μl vand per brønd.
15. Programmer de termiske cykelforhold¹⁴ som: 95 °c i 10 min; 45 cyklusser af to temperaturer: 95 °c for 30 s og udglødning temperatur i 2 min; 98 °C i 10 min; og hold ved 10 °C.
    1. Indstil rampe hastigheden til 0,5 °C/s, og Indstil prøvevolumenet til 80 μL¹⁴.
16. Når termisk cykling er fuldendt, skal du fjerne Strip røret og overføre det til kvantificerings instrumentet. Fjern PCR Strip caps og Udskift med høj hastighed caps.
17. Tænd for kvantificerings instrumentet og den tilsluttede computer med instrument software. Start instrument softwaren, og klik på Opsæt en løbetur.
18. Anbring Strip røret i kvantificerings instrumentet.
19. Få et nyt kvantificerings instrument chip og Scan eller manuelt indtaste chip-ID i instrumentet. Sæt chippen i maskinen.
20. Placer metal skjoldet oven på chippen, og luk låget på instrumentet.
21. I computer softwaren skal du indtaste et navn for dPCR-kørslen og for hver af de 8 kanaler (A-H). Vælg hurtigtilstand (som skal bruges med høje hastigheds hætter), og klik på Start for at begynde kvantificeringen.
22. Når kvantificeringen er færdig, skal du fjerne metal skjoldet (gemmes og genbruges) og kassere PCR Strip røret og chippen. På instrument computeren vil kørsels loggen indeholde resultatfiler for hver kørsel. Brug. FCS-filerne til hver prøve til at analysere med analytikerens software.

10. data analyse

1. Start analytikerens software, og Åbn. FCS-filerne for at analysere rå spektraldata. Vælg intaktunder analysevisning. Under eksempelvisning skal du klikke på boksene ud for hver af de 8 eksempler, så der er en markering i hver boks. Softwaren vil afbilde signaler for henholdsvis mutant (Fam) og dværg (Hex) alleler langs x-og y-aksen.
2. Brug den beregnede matrix funktion til at ansøge om spektral kompensation på intakte dråber, som pr producentens anvisninger¹⁵.
3. Juster akse indstillingerne under Akseindstillinger. Indstil x-aksen til minimum 0 og maksimum på 30.000, og y-aksen til et minimum på-5.000 og maksimum på 10.000. Når der er identificeret dråbe klynger, skal du justere akser for at reducere den tomme plads i grafen.
   Bemærk: Positionen af mutant og dværg klynger vil afhænge af de anvendte sonder, fluoroforet og deres koncentration.
4. Vælg den prøve, der svarer til den positive kontrol tumor væv gDNA at indstille den negative (klynge tættest på oprindelsen), mutant (klynge tættest på x-aksen), og dværg (klynge tættest på y-aksen) Gates. Sørg for, at klyngerne er forskellige og let identificeres i en vellykket analyse.
5. Anvend Gate-indstillingerne for det positive kontrolelement på alle prøver ved at højreklikke på eksemplet positivt kontrolelement og klikke på indstillingen for at anvende alle indstillinger på udvalgte eksempler.
6. Under den grafiske visning skal du klikke på fanen flere eksempler for at få vist plots for alle markerede eksempler. Eksporter billedet som en. TIF fil.
7. Under fanen arbejdsområde øverst til venstre på skærmen skal du vælge Eksporter analyse (CSV) og gemme den analyserede datafil som en. csv-fil.
8. Åbn. csv-filen i regnearkssoftware for at få vist negative, wildtype og mutant dråbetæller for hver prøve. Beregn MAF ved at dividere Poisson korrigeret mutant dråbe tælling med summen af Poisson korrigeret mutant plus dværg dråbetæller for hver prøve.
   Bemærk: Brug Poisson korrigeret Count, fordi Poisson Statistics tegner sig for det faktum, at positive dråber kan indeholde mere end en enkelt kopi af Target DNA, og dermed opsummere de positive dråber kan ikke give en nøjagtig tælle¹⁶.

Representative Results

Figur 1 viser repræsentative resultater for vellykket påvisning af H3F3A p. K27M mutation i foramplificeret plasma (øverste venstre panel) og CSF (øverste højre panel) cfdna fra to børn med dmg. cfDNA-prøverne blev analyseret i replikat, men der vises kun én repræsentativ graf for hver prøvetype. DPCR-plottet viser en vellykket dråbedannelse med 7-9 millioner dråber pr. PCR brønd (hvoraf de fleste er negative dråber, der ikke indeholder måldna). Et minimum af 7.000.000 dråber pr PCR godt indikerer en vellykket droplesering, mens færre end 7.000.000 indikerer svigt af analysen, i hvilket tilfælde brugeren bør ikke fortsætte med dataanalyse. Figur 1 viser en klar adskillelse mellem mutant-og dværg-klynger langs henholdsvis x-og y-aksen. Robuste dværg klynger indikerer, at cfdna-udvindingen var vellykket, fordi Template DNA er til stede. Mutant klynger viser en MAF på 1,60% og 39,92% for henholdsvis plasma-og CSF-prøverne, hvilket viser en positiv påvisning af mutationen. For disse patienter, dPCR resultater er i overensstemmelse med tumor mutation status, som bekræftet af genomisk analyse af biopsi tumor væv⁸. Den negative kontrol (nederste venstre panel) viser 0 mutant og 0 dværg dråber, hvilket indikerer, at der ikke var nogen kontaminering af PCR-reaktionsblandingen. Den positive kontrol tumor væv gDNA (nederste højre panel) viser mutationen detekteres på den forventede alleliske frekvens for den pågældende tumorprøve valgt.

I figur 2vises repræsentative resultater for mislykket påvisning af mutationen af interesse, H3F3A p. K27M, i plasma cfdna fra et barn med dmg. Mutation status blev bekræftet af genomisk analyse af tumor væv⁸. Der vises repræsentative resultater fra to replikate PCR-brønde (toppaneler). Det samlede antal dråber, herunder negative dråber, er mellem 7-9 millioner pr. PCR brønd, hvilket indikerer en vellykket droplesering. Dværg-klynger, afbildet langs y-aksen, viser ca. 7-8000 dværg dråber pr. PCR godt for plasma cfdna, hvilket indikerer vellykket cfdna-ekstraktion (da der er Target dværg DNA i prøven). Der påvises dog 0 mutant dråber i plasma prøven. Det nederste venstre panel viser negativ kontrol (MB H₂O) uden dværg eller mutant dråber; og det nederste højre panel viser den positive kontrol præamplificeret tumor væv gDNA (0,025 ng) med positiv mutation detektion. Som vist i denne figur, fraværet af mutation påvisning i plasma kan ikke nødvendigvis betyde, at patienten er dværg for mutation af interesse, som falske negativer gør forekomme⁸. I nogle tilfælde, når mutationen er savnet i plasma indsamlet ved på forhånd biopsi, det påvises i plasma opnået fra den samme patient på et senere tidspunkt⁸.

Figur 1 : Vellykket påvisning af H3F3A p. K27M mutation i foramplificeret plasma og CSF cfDNA fra børn med midterlinjen gliomer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2 : Falsk negative resultater opnået ved analyse af en præamplificeret plasma-cfDNA-prøve fra en patient, der er kendt for at havne mutationen af interesse H3F3A p. K27M, i tumoren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Her har vi præsenteret vores metode til påvisning og kvantificering af den alleliske hyppighed af tumor mutationer i cfDNA fra patient Liquid biopsi. Vi fremhæver kritiske trin for denne metodes succes, herunder præanalytisk prøve behandling, cfDNA-ekstraktion, PCR-analyse design og dataanalyse. For at begrænse den anvendte prøvevolumen ekstraheres cfDNA fra 1 mL plasma, men kun 500 μL CSF. Ved udvinding fra CSF anvendes protokollen for ekstraktion fra 1 mL urin (efter instruktionsbog for cfDNA Extraction kit¹²) som pr. fabrikantens anbefaling. Forskellen i prøvevolumen, der kræves mellem plasma og CSF skyldes lavere niveauer af tumor-specifikke cfDNA i plasma sammenlignet med CSF af patienter med hjernetumorer, nødvendiggør større prøvevolumener for mutation detektion⁸. Hvis prøven er tilgængelig, kan der udvindes mere end 1 mL plasma fra at producere højere DNA-udbytte. Men, i tilfælde af pædiatriske patienter, det er vigtigt at minimere mængden af blod, der anvendes, når det er muligt, som selv en simpel procedure såsom blod trækker er trætte til pædiatriske patienter med kræft undergår strålebehandlinger. Ekstraktion fra 1 mL aliquoter af plasma gør det også muligt at gentage ekstraktioner, således at analysen kan gentages (f. eks. i tilfælde af svigt i DNA-ekstraktion eller prøve kontaminering).

I et forsøg på at reducere enhver prøve brug, der ikke er strengt nødvendig, er cfDNA typisk ikke kvantificeret. Vi har imidlertid fundet en række cfDNA-koncentrationer mellem 0,2-2 ng/μL og 0,6-13 ng/μL i henholdsvis plasma og CSF. I betragtning af den lave mængde cfDNA og det faktum, at tumor specifikke mutante alleler er til stede ved en lav frekvens, er et præ-forstærknings trin med det samme sæt primere, der anvendes til dPCR, nødvendigt for at øge mængden af MÅLDNA i prøven betydeligt, hvilket er med til at hjælpe Mutations detektering⁸. Fortynding af det præ-amplificerede produkt i DNA-affjedrings buffer giver tilstrækkelig volumen til tekniske replikater, hvilket hjælper med at skelne sande positiver. Da antallet af mutante dråber kan være lavt (f. eks. mellem 0-2 mutant dråber i en plasmaprøve), er inkluderingen af tekniske replikater nøglen til at løse mutationsstatus. Mens en PCR brønd kan give 0 mutant dråber, kan de to andre give 1-2 for en enkelt plasmaprøve, der analyseres i tre eksemplarer; optagelsen af replikater giver således større nøjagtighed ved bestemmelse af mutationsstatus. MAF beregnes derefter som gennemsnittet af replikatværdierne.

Multiplexed præ-amplifikation (præamplificerende dværg og mutant alleler af to mutationer af interesse) øger nytten af en enkelt prøve, da det samme udgangsmateriale kan bruges til at teste for to mutationer. Vigtigere, en multiplex foramplifikation produkt kan analyseres i singleplex under dPCR for større enkelhed, som beskrevet her. Både præamplifikationpcr og dPCR kan dog være multiplexed. Ved multiplexing skal betingelserne optimeres for begge sæt primere og sonder: primer-udglødnings temperaturer skal være de samme som at køre sammen i PCR-forstærkning, og sonder skal konstrueres til at generere særskilte klynger (baseret på fluorescerende signal og intensitet). Når du validerer et nyt sæt primere og sonder, skal du køre en udglødnings temperaturgradient for at bestemme optimal udglødnings temperatur baseret på det område, der foreslås af producenten. Før du tester sonder på patientens cfDNA-prøver, skal du validere dem ved hjælp af syntetiske DNA-konstruktioner og/eller tumor vævs gDNA af forskellige indgange (dvs. op til 10 ng).

Til påvisning af mutant alleler med større specificitet og reducerede mismatch i hybridiseringen af sonde til måldna anvendes låste nukleinsyre (LNA) sonder. LNA er en nukleinsyre analog med en methylen-bro, der forbinder 2 '-oxygen og 4 '-Carbon af den ribose ring⁹. Methylen broen låser nukleinsyre i en stiv bicyklisk konstellation, der begrænser fleksibiliteten, øger termisk dupleks stabilitet og forbedrer specificiteten af Probe hybridiseringen for at målrette DNA^{10,18, 19}. Hvis der findes en enkelt base uoverensstemmelse mellem LNA Probe og Template DNA, vil duplexdannelse mellem Probe og Target destabilisere. Som sådan forbedrer LNA-sonder specificiteten af sonde bindingen og resulterer i et højere signal-støj-forhold¹¹. Analyse af plasma og CSF fra ikke-CNS-syge pædiatriske patienter har fastslået specificiteten af vores analyse med LNA-sonder rettet mod H3F3A p. K27M, for at fastslå, at en allelisk frekvens på mindst 0,001% betragtes som en falsk positiv ⁸. for yderligere overvejelser for optimering af designet af sonder og primere, herunder GC-indhold, amplikonen størrelse, Probe reporter farvestoffer, og quenchers, henvises til dpcr producentens retningslinjer^14,17. Selvom vores metode er optimeret til brug med Raindance-systemet, kan protokollen tilpasses til brug sammen med andre dPCR-platforme.

Den metode, der præsenteres her, trækker styrke fra den høje følsomhed og målberigelse opnået af dPCR, som fortsat er den foretrukne platform til påvisning af sjældne tumor mutationer i cfDNA. Selv om den er kraftig, er dPCR begrænset i antallet af mutationer, der kan testes for i en enkelt analyse. Et alternativ til dpcr er Next Generation sekventering (NGS), som kan detektere flere mutationer på tværs af mange gener, hvilket øger nytten af en enkelt prøve. NGS kan detektere mutationer i CSF og plasma hos patienter med hjernestammen gliomer²⁰, men er i øjeblikket mindre følsom end dpcr ved påvisning af tumor mutationer i cfdna, med detektionsgrænser på 0,1-10% MAF sammenlignet med 0,001% i PCR-baserede tilgange²¹ . dPCR opnår også hurtigere ekspeditionstid end NGS, hvilket muliggør hurtig påvisning af mutationer af interesse. PCR-tilgangen er anvendelig på tværs af kræfttyper og kan udvides til at detektere hotspotmutationer og methyleret cfDNA²².

Den flydende biopsi er faktisk i sin vorden og vil kræve yderligere udvikling for at skræddersy til specifikke sygdomme. Tumor overvågning i forbindelse med tumor Evolution vil være den næste udfordring, hvor en platform i stand til at detektere nye mutationer med høj følsomhed ville være påkrævet. Derudover, platforme i stand til at detektere en række biomolekyler (peptider, cytokiner, RNA) vil være meget gavnligt i vurderingen tumorrespons på behandling, samt fremme personlige kliniske indgreb.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA DNA Suspension Buffer (pH 8.0)	Teknova	T0227
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg Blood Collection Tubes (10 mL)	Becton Dickinson Diagnostics	367525	For plasma collection
BD Vacutainer Plastic Serum tube with Red BD Hemogard Closure (10 mL)	Becton Dickinson Diagnostics	367895	For serum collection
Bleach	General Lab Supplier
Buffer ATL	Qiagen	19076
Cell-Free DNA Blood Collection Tubes	Streck	218961	cfDNA blood collection tubes (optional)
CentriVap Concentrator	Labconco	7810010
Forward Primer	Integrated DNA Technologies, Inc.		Custom design
MiniAmp Thermal Cycler	Thermofisher Scientific	A37834
Molecular Biology Grade Absolute Ethanol (200 proof)	General Lab Supplier
Mutant Probe	Integrated DNA Technologies, Inc.		Custom design
PAXgene Blood ccfDNA tubes	PreAnalytiX	768115	cfDNA blood collection tubes (optional)
PCR 8 well strip tube caps	VWR	10011-786
PCR 8 well strip tubes	Axygen	PCR-0208-C
Pipette (p20, p200, p1000)	General Lab Supplier
Pipette filter tips (p20, p200, p1000)	General Lab Supplier
Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix	New England Biolabs Inc	M0494S
QIAamp Circulating Nucleic Acid HandBook	Qiagen		cfDNA extraction kit handbook (2013 edition)
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	cfDNA extraction kit (Protocol Step 4)
QIAamp MinElute Virus Spin Kit	Qiagen	57704	Optional kit for DNA extraction from small (< or =200 µL) sample volumes
Qiavac 24 Plus	Qiagen	19413	For use with QIAamp Circulating Nucleic Acids kit
Raindance Consumable Kit	Bio-Rad	20-04411	Contains droplet-generating instrument chips, quantification instrument chips, PCR strip caps including high-speed caps, and droplet stabilizing oil
Raindance Sense Instrument	Bio-Rad		Quantification instrument (used in Protocol Step 9)
Raindance Source Instrument	Bio-Rad		Droplet-generating instrument (used in Protocol Step 9)
RainDrop Analyst II Software	RainDance Technologies		Analyst software used for Data Analysis (Protocol Step 10)
Refrigerated Vapor Trap	Savant	RVT5105-115
Reverse Primer	Integrated DNA Technologies, Inc.		Custom design
Smartblock 2 mL	Eppendorf	05 412 506
TaqMan Genotyping Master Mix	Thermofisher Scientific	4371353
Thermomixer C	Eppendorf	14 285 562PM
WT Probe	Integrated DNA Technologies, Inc.		Custom design