Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تميز المسوخ ذات الصلة بالأمراض من Kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني باستخدام مجموعة من الأساليب العملية والممكنة

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59795
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

Summary

في هذه المقالة، قدمنا مجموعة من الطرق العملية والعملية لوصف المتحولين ذات الصلة بالأمراض من kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني، والتي تشمل في المختبر اختبار كيناز، ومختبر التنشيط المشترك، وتكملة الانقسام لوسيفيراز اختبار.

Abstract

تلعب الكينازات العائلية السريعة التسارع (RAF) دوراً محورياً في بيولوجيا الخلايا ويؤدي اختلالها الوظيفي إلى السرطانات واضطرابات النمو. ومن شأنه أن يساعدنا توصيف المتحولين المرتبطين بالأمراض في سلاح الجو الملكي البريطاني على اختيار الاستراتيجيات العلاجية المناسبة لعلاج هذه الأمراض. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الكيناس العائلية لسلاح الجو الملكي البريطاني لها أنشطة حفازة وأنشطة ألوستريك على حد سواء، والتي يتم تنظيمها بإحكام من خلال التمتميّز. هنا، قمنا ببناء مجموعة من الأساليب العملية والعملية لتحديد الأنشطة الحفازة وallosteric والتقارب/الاستقرار الخافت النسبي لقرابة أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني ومسوخهم. أولا، قمنا بتعديل اختبار كيناز الكلاسيكية في المختبر عن طريق الحد من تركيز المنظفات في المخازن المؤقتة، وذلك باستخدام إجراء غسل سريع لطيف، واستخدام الجلوتاثيون S-transferase (GST) الانصهار لمنع الدمامل RAF من التفكك خلال تنقيه. وهذا يمكننا من قياس النشاط الحفاز للمتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشط بشكل مناسب. ثانيا، قمنا بتطوير جديد سلاح الجو الملكي البريطاني في التفعيل المشترك لتقييم النشاط اللوستريك من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني ميتا كيناز باستخدام N-محطة اقتطاع البروتينات سلاح الجو الملكي البريطاني، والقضاء على متطلبات راس نشطة في البروتوكولات الحالية وبالتالي تحقيق أعلى حساسيه. وأخيراً، قمنا بتوليد عملية مسح منفصلة فريدة من نوعها لقياس التقارب/الاستقرار النسبي للمتحولين في سلاح الجو الملكي البريطاني، وهو أكثر موثوقية وحساسية مقارنة بالفحص التقليدي للمناعة. وباختصار، فإن هذه الأساليب لها المزايا التالية: (1) سهلة الاستخدام؛ (2) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام؛ (3) سهلة الاستخدام (2) قادرة على تنفيذ فعال دون معدات متقدمة؛ (3) فعالة من حيث التكلفة؛ (4) حساسة للغاية واستنساخها.

Introduction

وkinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني هي عنصر رئيسي من RAS / RAF / MEK / ERK إشارة تتالي، والتي تنقل إشارة من RAS لتنشيط كيناز البروتين المنشط ميثوجن (MEK)1،2،3،4. هذه الأسرة من kinases تلعب دورا حاسما في نمو الخلايا والبقاء على قيدالحياة والتمايز، وتعديلاتها تحفز العديد من الأمراض، ولا سيما السرطان 5،6،7،8. في الآونة الأخيرة، حددت التسلسلات الجينية العديد من المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض التي تظهر خصائص مختلفة في انتقال إشارة RAS / RAF / MEK / ERK شلال9،10،11. وصف دقيق لمسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني سوف تساعدنا على فهم الآليات الجزيئية لكيفية تغيير المتحولين RAF الناتج إشارة من RAS / RAF / MEK / ERK تتالي، في نهاية المطاف اختيار النهج المناسبة لعلاج مختلف الأمراض التي يحركها RAF متحولة.

وتشمل أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني ثلاثة أعضاء، CRAF، BRAF، وARAF، والتيلديها هياكل جزيئية مماثلة ولكن قدرات مختلفة لتنشيط المصب إشارة 1،2،3،4. من بين هذه paralogs، BRAF لديها أعلى نشاط بحكم الفسفوريةالمكونة لها NtA (N -terminal acidic) عزر12،13،14،في حين أن ARAF لديه أدنى النشاط الناشئ عن عزر ها غير الكنسي APE15. وهذا قد يفسر ترددات الطفرة المختلفة من PARALOGS RAF في الأمراض: BRAF>CRAF>ARAF. وعلاوة على ذلك، فإن الطفرات في مواقع مختلفة، في إطار نفس paralog RAF، قد تؤدي إلى إشارات في المصب بطريقة متميزة، مما يضيف طبقة أخرى من التعقيد إلى تنظيم الكيناس العائلية لسلاح الجو الملكي البريطاني. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن جميع kinases RAF لديها كل من الأنشطة الحفازة وallosteric13،14،16،17،18. يقوم متحولو سلاح الجو الملكي البريطاني النشطون بشكل تأسيسي بتشغيل الإشارات إلى المصب مباشرة عن طريق الفسفوريلات MEK، في حين يمكن لمسوخي سلاح الجو الملكي البريطاني الميتين تحويل نظرائهم من النوع البري من خلال التمتميّز من جانب إلى جنب وتفعيل إشارة MEK-ERK16 ،19،20. التقارب/ الاستقرار هو المعلمة الرئيسية التي لا تحدد فقط النشاط اللوستريك من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت ولكن أيضا يؤثر على النشاط الحفاز من متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشطة المكونة15،21، 22.يمكن للمتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت مع تقارب ديمر عالية / الاستقرار تحويل RAFs البرية من نوع الذاتية مباشرة15، في حين أن تلك مع تقارب ديمر المتوسطة / الاستقرار يتطلب تنسيق راس نشطة أو مستوى مرتفع من جزيئات سلاح الجو الملكي البريطاني من النوع البري لتعمل13،15،20،21،23. وبالمثل، فإن متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني النشطين بشكل تأسيسي فوسفوريلات MEK بطريقة تعتمد على ديمر، وأولئك الذين يعانون من انخفاض التقارب/الاستقرار الخافت يفقدون نشاطهم الحفاز في المختبر على الترسيب المناعي الذي يكسر ضعف سلاح الجو الملكي البريطاني15، 21،22. كما يحدد التقارب/الاستقرار الخافت حساسية متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني لمثبطاتهم، ويرتبط بشكل إيجابي بمقاومة مثبطات سلاح الجو الملكي البريطاني24. ولذلك، لتوصيف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض، فمن الضروري لقياس أنشطتهم الحفازة واللوستريك، وتقارب/استقرار خافت.

في السنوات الأخيرة، وقد وضعت مختبرنا وغيرها من الطرق المختلفة لتوصيف kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني والمتحولين بهم. وفقا لمختبرنا وتجربة الآخرين، ونحن نعتقد أن الاختبارات الثلاثة التالية لها مزايا في تعريف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض: (1) اختبار كيناز في المختبر التي يمكن تنفيذها بسهولة للكشف عن النشاط الحفاز من المكونة نشط [رف] متحولات15; (2) وسلاح الجو الملكي البريطاني المشاركة في تفعيل التقوله الذي هو وسيلة موثوقة ومريحة لقياس النشاط اللوستريك من kinase القتلى RAF متحولين13،15،21،22،23، 25; (3) الفحص لوسيفيراز الانقسام المجاني الذي لديه حساسية أعلى بكثير في قياس تقارب والاستقرار قاتمة نسبيا من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني على النقيض من الفحص التقليدي المشترك للمناعة، وقادرة على تنفيذ دون معدات متقدمة في على النقيض من الأساليب التحليليةالكمية مثل SPR (S urface Plasmon Resonance) تحليل15،22. الجمع بين هذه الاختبارات الثلاثة، يمكننا أن نفهم بسهولة كيف أن متحولة RAF ذات الصلة بالأمراض يغير الإشارات المصب وبالتالي استخدام استراتيجية علاجية مناسبة لعلاج المرض الناجم عن هذه الطفرة RAF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. في المختبر كيناز الاختبار لقياس النشاط الحفاز لمسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني

  1. بناء ناقلات ترميز متحولات RAF (الشكل1A) مع العلامة FLAG (DYKDDDDK) في C-terminus باستخدام جيبسون الجمعية أو أساليب الاستنساخ الجزيئي التقليدية.
    1. إدخال علامة FLAG والطفرات في تسلسلات الترميز RAF بواسطة PCRs، ثم قم بإدراج تسلسلات كاملة في متجه pCDNA3.1(+) باستخدام تجميع Gibson أو ربط الحمض النووي T4 واتباع بروتوكولات التصنيع. استخدم الشروط التالية لتفاعلات PCR: (1) 95 درجة مئوية، 2 دقيقة؛ (2) 95 درجة مئوية، 30 ق؛ (3) 59 درجة مئوية، 30 ق؛ (4) 68 درجة مئوية، 3 دقائق؛ (5) 20 دورة من (2 إلى 4)؛ (6) 4 درجة مئوية عقد.
      ملاحظة: التمهيديات PCR للاستنساخ: 5- AAATTAATACCTCACTATAGGGACCC-3 و 5-CAGCGTGTTTAAACGCCCTCTTA-3.
    2. إدراج تسلسل الترميز GST upstream من تسلسلات الترميز متحولة RAF لتوليد ناقلات ترميز مسوخ RAF GST-fused باستخدام نفس الأساليب كما هو موضح في الخطوة 1.1.1.
    3. التحقق من صحة جميع المتجهات بواسطة تسلسل الحمض النووي قبل التغوط.
  2. لوحة 293T الخلايا في لوحات 6-جيدا في كثافة 5 × 105 خلايا / جيدا يوم واحد قبل التغوط. عندما تصل كثافة الخلية إلى 80 ~ 90٪ التقاء في اليوم الثاني، transfect مع ناقلات ترميز العلم الموسومة RAF كيناز أو المسوخ الخاصة بهممن الخطوة 1.1 إلى الخلايا باتباع بروتوكول تصنيع أجهزة الانقاشف transfection (جدول المواد).
  3. استبدال وسط الثقافة 24 ساعة بعد الانعطاف.
  4. يستنشق الثقافة متوسّطة 48 [ه] بعد [ترّفكأيشن] وأضفت 400 [فل/ولّ] من [ليسس] احتياطيّة (25 [م] [تريس] · حمض الهيدروكلوريك، 150 مل كلوريد الصوديوم، 1 مل حمض الإثيلين ديامينتيراسيتيك (EDTA)، 0.25٪ NP-40، درجة الحموضة 7.2) تستكمل مع البروتياز ومثبطات الفوسفاتيز لخلايا الليس على الجليد.
    ملاحظة: تركيز NP-40 في العازلة تحلل أمر بالغ الأهمية للكشف عن النشاط الحفاز من متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني مع تقارب معتدل dimer / الاستقرار في المختبر. تركيز عال من المنظفات أو المنظفات القوية في العازلة تحلل قد كسر ديمور RAF وبالتالي قتل النشاط الحفاز من kinases سلاح الجو الملكي البريطاني أو المتحولين.
  5. نقل lysates الخلية إلى أنبوب 1.5 مل، وتدور بنسبة 12،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية لاستنفاد حطام الخلية.
  6. نقل 300 درجة مئوية لكل عينة من lysates خلية كاملة نظيفة إلى أنابيب 1.5 مل، إضافة 20 درجة مئوية لكل عينة من الخرز التقارب المضادة للعلم، وتناوب في غرفة باردة (4 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة. أيضا تأخذ 40 درجة مئوية لكل عينة من الليسات الخلية كاملة نظيفة جانبا للكشف عن التعبير والنشاط (phospho-ERK1/2) من متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني من قبل المناعية كما هو موضح أدناه.
  7. غسل الخرز المضادة للعلم مرة واحدة مع العازلة lysis، ثم مرة واحدة مع حاجز رد الفعلكيناز (20 M HePES، 10 M M MgCl 2، 0.5 mM Na3VO4،0.5 mM DTT، درجة الحموضة 7.2)، وإضافة 20 ميكرولتر من خليط رد الفعل كيناز (2 ميكروغرام من MEK1 (K97A) و 100 ميكرومتر ATP في 20 ميكرولتر من kinase re المخزن المؤقت للإجراء) لكل عينة.
    ملاحظة: يجب أن تكتمل غسل الخرزة بلطف وبسرعة، يجب أن يستنشق المخزن المؤقت المتبقي تماما قبل إضافة خليط رد الفعل kinase، وينبغي أن تنفذ جميع العمليات في هذه الخطوة في 4 درجة مئوية في غرفة باردة.
  8. احتضان ردود الفعل كيناز في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) لمدة 10 دقائق، والوجه الأنابيب التي تحتوي على ردود الفعل كيناز مع الأصابع كل دقيقة أخرى أثناء الحضانة.
  9. إضافة 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت نموذج SDS 5x (375 mM Tris· حمض الهيدروكلوريك، 9٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)، 50٪ الجلسرين، 0.03٪ بروموفينول الأزرق) لكل عينة لوقف تفاعلات كيناز، ومن ثم تسخين العينات في 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. تشغيل العينات في 9 ~ 12٪ بولياكريلاميد هلام الكهربائي (PAGE) مع 0.1٪ SDS، ونقل البروتينات إلى غشاء النيتروسيلولوز، والكشف عن مستويات فوسفو-MEK وRAF المسوخ في عينات من قبل المناعية.
    ملاحظة: ويمكن أيضا ً تحديد كمية phospho-MEK باستخدام γ32P-ATP التأسيس. باختصار، يتم إضافة 10 μM γ32P-ATP إلى المخزن المؤقت لرد الفعل kinase، ثم يتم قياس كمية MEK الفوسفورية بعد فصل PAGE باستخدام التصوير الشعاعي التلقائي القياسي أو التصوير الفوسفوري أو تقنيات عد التلألؤ السائل كما المناسبه.

2. سلاح الجو الملكي البريطاني المشاركة في تفعيل التقييم للنشاط اللوستريك من Kinase القتلى RAF المسوخ

  1. بناء ناقلات ترميز المتلقي RAF (CRAF المجال كيناز مع عزر NtA غير فوسفوريلابل، AAFF) أو المنشطات سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت (سلاح الجو الملكي البريطاني المجال kinase مع الفسفور تقليد NtA عزر، SSDD، DDEE أو DGEE) (الشكل1A)كما الموضحة في الخطوة 1.1.
  2. خلايا Transfect 293T مع اثنين من المتجهات ترميز كل من المتلقي RAF والمنشط RAF kinase الميت أو ترميز ناقلات واحدة من البروتينات كما هو موضح في الخطوتين 1.2 و 1.3.
  3. استبدال وسط الثقافة في 24 ساعة بعد التغوط، وحصاد 293T transfectants في 48 ساعة لإعداد lysates الخلية بأكملها كما هو موضح في الخطوتين 1.4 و 1.5.
  4. يُمزج اللمعة الخلوية الكاملة النظيفة مع المخزن المؤقت للعينة SDS بمعدل 5 x بسرعة في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ثم يغلي عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. تشغيل عينات الليسات الخلية الكاملة المسلوقة في 9 ~ 12٪ الصفحة مع 0.1٪ SDS، ونقل البروتينات إلى غشاء النيتروسيلولوز، والكشف عن مستويات فوسفو-ERK1/2 والبروتينات السيطرة من قبل المناعة.

3. مسح مجاني سبليت لوسيفيراز لقياس التقارب ديمر النسبية / الاستقرار من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني

  1. بناء ناقلات ترميز العلم الموسومة RAF المسوخ تنصهر إلى N-terminus من نلوك (N-terminus من لوسيفيراز اليراعة، aa2-416) أو C-terminus Cluc (C-terminus من لوسيفيراز اليراعة، aa398-550) كما هو موضح في الخطوة 1.1.
  2. Transfect 293T الخلايا مع زوج من المتجهات ترميز مختلف المسوخ Nluc-RAF والمتحولين Cluc-RAF كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  3. في 24 ح بعد الإنحراف، لوحة 293T خلية transfectants في لوحات صورة سوداء كريستال في كثافة الخلية من 2X105 في بئر مع متوسط خال من الألوان (أي، DMEM دون الفينول الأحمر).
  4. 24 ح في وقت لاحق، إضافة D-لوسيفيرين (0.2 ملغ / مل) إلى 293T transfectants الخلية، وحضانة لمدة 30 دقيقة، وقياس إشارات لوسيفيراز باستخدام نظام الكشف المتعدد (جدولالمواد).
  5. بعد قياس إشارات لوسيفيراز، يستنشق الترانسفيكتات المتوسطة والليس 293T مع العازلة الليسيس لإعداد الليسات الخلية بأكملها كما هو موضح في الخطوتين 1.4 و 1.5.
  6. تشغيل عينات lysate الخلية بأكملها في 9 ~ 12٪ الصفحة مع 0.1٪ SDS والكشف عن مستويات التعبير من المسوخ Nluc-RAF والمسوخ Cluc-RAF من قبل المضادة للعلم المناعية كما هو موضح في الخطوة 2.5. يتم تحديد مستويات التعبير النسبي لكل من متحولة Nluc-RAF ومتحولة Cluc-RAF في 293T transfectants باستخدام الصورة J من مناعتهم.
  7. تطبيع إشارات لوسيفيراز من transfectants الخلية 293T وفقا لمستويات التعبير من المسوخ Nluc-RAF والمسوخ Cluc-RAF. وباختصار، يتحقق ذلك عن طريق تقسيم إشارة لوسيفيراز الخام عن طريق مستويات التعبير النسبي للمتحولين Nluc-RAF والمتحولين Cluc-RAF من الخطوة 3.6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لدى أسرة سلاح الجو الملكي البريطاني أنشطة محفزة وألوستريك على حد سواء، والتي تمكن المتحولين المرتبطين بالأمراض من تشغيل المصب الإشارات من خلال آليات مختلفة13،14،16،17 ،18. إن متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني النشطين بشكل مباشر يقومون بالفوسفور على ركائزهم، في حين أن متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني الذين ماتوا من كيناز يقومون بعملهم من خلال إعادة تنشيط نظرائهم من النوع البري. كما هو مبين في الشكل 1باء،وكلاهما متحولون سلاح الجو الملكي البريطاني النشطين بشكل تأسيسي (مثل العمود الفقري التنظيمي (R-spine) المسوخ (BRAF(L505M)، CRAF (DDEE/L397M)، وARAF (DGEE/L358M))13،23،25 , 26،BRAF (V600E)، وBRAF (NVTAP)) وkinase الميت RAF المسوخ (مثل العمود الفقري الحفاز (C-العمود الفقري) تنصهر BRAF (، NVTAP / V471F)15) ينشط ERK عندما أعرب في خلايا 293T. لذلك، فإن قدرة المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني على تفعيل إشارات ERK في الخلايا لا يمكن أن تكون بمثابة معيار للتمييز بين متحولنشط بشكل تأسيسي من متحولة ميتة كيناز، على الرغم من أن بعض المتحولين kinase الميت مع تقارب معتدل ضتر / الاستقرار يتحول على المصب إشارة فقط بالتعاون مع راس النشطة. ثلاث طرق قدمناها هنا يمكن أن تساعدنا على توصيف جميع المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني ذات الصلة بالأمراض بشكل فعال. وقد تم تلخيص الخصائص البيولوجية لجميع المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني التي تم الكشف عنها باستخدام هذه الاختبارات في دراساتنا السابقة في الجدول 1.

الطريقة الأولى التي يمكن أن نستخدمها للتمييز بين المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشطين بشكل تأسيسي من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني الميتين هو الفحص في المختبر. في هذا الفحص، تم تنقية متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني عن طريق الترسيب المناعي، ونفذت ردود الفعل الحفازة في المختبر مع KINase-dead MEK1 (K97A) وATP كركائز. تم قياس النشاط الحفاز لمسوخ سلاحالجو الملكي البريطاني على أنه AL (A ctivation Loop)-phosphorylation من MEK1(K97A) في خلائط التفاعل kinase بواسطة immunoblot. كما هو مبين في الشكل 1ج، وهذا الفحص يمكن التحقيق بشكل فعال النشاط الحفاز من المتحولين R العمود الفقري من BRAF ، CRAF وARAF13،15،23، BRAF (V600E)9، وBRAF (، NVTAP)15، ولكن ليس أن من BRAF kinase الميت (V471F /】NVTAP)15 التي لديها تنصهر C-العمود الفقري. ومع ذلك، فإن النشاط الحفاز لمسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني النشطين الذين يعانون من ضعف التقارب/الاستقرار مثل متحولة العمود الفقري ARAF (ARAF(DGEE/L358M)) (الشكل1C,lane 4) وCRAF وARAF المسوخ مع واجهة خافتة معدلة (CRAF(DDEE/ L397M/R401H)، ARAF (DGEE/L358M/APE/R362H))15،22 (الشكل1D، E)قد لا يتم التحقيق باستخدام هذا القول، منذ كسر الخافتات الخاصة بهم خلال تنقية، وخاصة عندما كان تنقية نفذت مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على منظفات قوية أو عالية التركيز. لتجنب فقدان النشاط الحفاز من المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني مع ضعف التقارب والاستقرار، ونحن عادة تنصهر هذه المتحولين مع GST(زlutathione S-رransferase)، بروتين dimeric مع تقارب قوي / الاستقرار قبل إجراء في المختبر فحص كيناز، والتي يمكن أن تنقذ النشاط الحفاز لهذه المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني15،22 (الشكل1E). بشكل عام، يمكن تصنيف معظم المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني على أنهم متحولون نشطون أو ميتون من الكيناسي باستخدام هذا التبيّس.

الطريقة الثانية التي وصفناها هنا هي فحص التفعيل المشترك لسلاح الجو الملكي البريطاني الذي يمكن استخدامه لتقييم النشاط اللوستريكي للمسوخ اتلاف كيناز راف13،15،21،22،23 , 25.على الرغم من أن عدد قليل من kinase الميت RAF المسوخ مع تقارب ديمر عالية جدا / الاستقرار مثل BRAF (V471F/】NVTAP)15،يمكن تنشيط مباشرة جزيئات RAF الذاتية عندما أعرب في الخلايا (الشكل1B، حارة 7)، ومعظم kinase القتلى من لمسوخ يفير تتطلب التعاون من راس نشطة لتبديل RAFs البرية من نوع. ومع ذلك، راس النشطة هو المنشط المباشر للإشارة ERK، الذي إدخال سيزيد من المستوى القاعدي ة من ERK النشطة. لتجنب تداخل راس النشطة، استخدمنا N-terminus-اقتطاع RAF المسوخ في هذا القول (الشكل2A). كما هو مبين في الشكل 2ب، متحولين ميتين من BRAF ، CRAF، وRAF مع عزر NtA الحمضية وC-العمود الفقري الانصهار (BRAF (V471F، aa431-766)، CRAF (DDEE / V363F، aa323-648)، وARAF (DGEE / V324F، aa284-606)) تعمل كمنشطين اللوستريك ل تشغيل النشاط الحفاز من CRAF مع غير phosphorylatable NtA عزر (CRAF المتلقي، CRAF (AAFF، aa323-648)) عندما أعرب في الخلايا 293T. وعلى النقيض من ذلك، فإن متحولة BRAF الميتة كيناز (V471F/】NVTAP, aa431-766) التي لديها تقارب/استقرار خافت عالية جداً (انظر أدناه) تحولت على إشارات ERK عن طريق تحريك RAFs الذاتية، حتى من دون التعبير المشترك من جهاز استقبال CRAF. عموما، يمكن استخدام هذا الفحص لتقييم القدرة على نقل من جميع المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني القتلى kinase.

إن إضفاء الطابع الخافت على الكيناس العائلية لسلاح الجو الملكي البريطاني لا ينظم فقط قدرتها على تنشيط إشارات MEK-ERK في المصب، بل يحدد أيضاً حساسيتها لمثبطات سلاح الجو الملكي البريطاني.15,16 سنة,20,22,24,27,28,29,30,31,32. على النقيض من التفاعلات البروتين البروتينية الأخرى بين هذا المسار33,34,35، وdimerization من kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني والمتحولين لها ضعيفة نسبيا ويصعب تقييمها باستخدام اختبارات الكيمياء الحيوية التقليدية مثل الترسيب المناعي المشترك. لحل هذه المشكلة، قمنا مؤخرًا بتطوير عملية تحليل منفصلة لللوسيفيراز لقياس التقارب/الاستقرار النسبي لقرابة/استقرار عائلة سلاح الجو الملكي البريطاني ومسوخهم15,22,36. كما هو مبين فيالشكل 3ألف، تم دمج مجالات كيناز سلاح الجو الملكي البريطاني (aa431-766 لBRAF، aa323-648 لCRAF، وaa284-606 لARAF) على التوالي مع N-terminus (aa2-416) أو C-terminus (aa398-550) من لوسيفيراز اليراعة (Nluc وCluc)، والتي سيتم جمعها معا لتجميع سليمة لوسيفيرز على الديميتر سلاح الجو الملكي البريطاني. ويرتبط نشاط لوسيفيراز في هذا التساي ارتباطا ً مباشراً بكمية الديمرز من سلاح الجو الملكي البريطاني. هذا الفحص حساس جدا ويمكن الكشف حتى عن ضعف ضعيف جدا من المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني. كما أبلغنا من قبل15، وBRAF oncogenic (V600E) يعمل كديمر، وفقط طفرة مركبة مع طفرة Arg-to-His (R509H) في واجهة ديمر والتغيير غير الكنسي APE (P622A في عزر APE) يمكن إلغاء تماما dimerization وبالتالي منع الحفاز لها النشاط (الشكل 3ب). باستخدام في المختبر كيناز الاختبار، وجدنا كذلك أن BRAF (V600E) البديل مع عزر APE المعدلة، BRAF (V600E / AAE)، ولكن ليس ذلك مع طفرة Arg-to-His في واجهة خافت، BRAF (V600E/R509H)، فقدت نشاطها الحفاز عند تنقية (الشكل 3ج)، مما يشير إلى أن البديل السابق لديه تقارب/استقرار أقل بكثير من الأخير. لقياس مباشرة ميل هذه المتغيرات BRAF (V600E) لتشكيل dimers، قمنا بفحص لوسيفيراز الانقسام مجانا، وأكد أن هذه المتغيرات كان مختلف تماما تقارب والاستقرار مع BRAF (V600E) أعلى من BRAF (V600E / R509H) من BRAF (V600E / AAE) من BRAF (V600E /R509H/AAE) (الشكل 3د). وكانت إشارة لوسيفيراز التي تنتجها BRAF أحادية (V600E/R509H/AAE) قابلة للمقارنة مع إشارة التحكم غير المنقولة 293T (الشكل 3د، الممر الأيسر 5)، مما يشير إلى أن هذا القول لديه خلفية منخفضة جدا. لمزيد من تحديد فعالية تحليل لوسيفيراز الانقسام المجاني، ونحن قياس المقبل باستخدام هذا التقييم تقارب قاتمة نسبيا / الاستقرار لمجموعة من المتحولين BRAF oncogenic مع الحذف في الإطار من β3- حلقة αC التي تم تحديدها من قبلنا وغيرها من مجموعات15,37,38. كما كنا نعرف، على الرغم من أن كل هذه المتحولين تنشيط ERK إشارة عندما أعرب في خلايا 293T (الشكل 3ه)، وأظهرت نشاط محفز تفاضلي جدا في المختبر (الشكل 3و). وBRAF (MLN (aa484-486 del)) وBRAF (NVTAP(aa486-490 del)) كانت نشطة جدا عند تنقية عن طريق المناعة على الرغم من أن الشرط نفسه، في حين أن BRAF (NVTAPT (aa486-491 del)) وBRAF (QA(aa496-497 del)) فقدت نشاطها الحفاز في ظل نفس الحالة على الرغم من أنه يمكن إنقاذها من قبل الانصهار GST. وبالإضافة إلى ذلك، فإن النسخة الميتة كيناز من BRAF (،،، BRAF (V471F/NVTAP) أظهرت قوة قوية لتنشيط RAFs الذاتية عندما أعرب في الخلايا (الشكل 1بحارة 7). هذه البيانات تشير إلى أن هذه المجموعة من المتحولين BRAF لديها تقارب مختلف تماما مع BRAF (،NVTAP) أعلى من BRAF (MLN) من BRAF (NVTAPT) وBRAF (QA). في الواقع، فإن النتيجة من تقسيم الانقسام لوسيفيراز &من أيسالفير أيد تماما استنتاجنا (الشكل 3ز). وإذا ما أُخذت بياناتنا معاً، فإن تحليل لوسيفيراز المنقسم المجاني هو طريقة موثوقة لقياس التقارب/الاستقرار النسبي للمسوخ من سلاح الجو الملكي البريطاني.

Figure 1
الشكل 1 تحقيق النشاط الحفاز لمسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني باستخدام في المختبر فحص كيناز. (أ) رسم تخطيطي لطفرات سلاح الجو الملكي البريطاني المستخدمة في هذه الدراسة. (B) يمكن لكل من المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني النشطة المكونة وkinase الميتة تنشيط إشارات ERK عندما أعرب في الخلايا. تم نقل الخلايا 293T مع ناقلات التي ترميز مختلف المسوخ RAF، وتم الكشف عن نشاط ERK من قبل المضادة للفوسفو-ERK1/2 المناعية. (C) متحولات سلاح الجو الملكي البريطاني النشطة بشكل تأسيسي مع تقارب ديمر منخفضة / الاستقرار، فضلا عن متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني ميتا kinase لا يمكن phosphorylate MEK في المختبر على تنقية عن طريق الترسيب المناعي. تم تنقية متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني في B باستخدام الخرز المضاد للفلاغ، وتم التحقيق في نشاطهم الحفاز باستخدام فحص كيناز في المختبر كما هو موضح في البروتوكول. (د-هـ) يمكن إنقاذ النشاط الحفاز في المختبر من المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشطين الذين يعانون من تقارب/استقرار منخفض من قبل GST. (D) تم التعبير عن متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشط بشكل تأسيسي ونظرائهم المنصهرين في ضريبة السلع والخدمات في خلايا 293T وتم قياس نشاطهم من قبل المضادة للفوسفو-ERK1/2 المناعية. (E) تم تنقية متحولين سلاح الجو الملكي البريطاني في D عن طريق الترسيب المناعي، وتم التحقيق في نشاطهم الحفاز في المختبر باستخدام الفحص في المختبر كيناز كما هو موضح في البروتوكول. RAF R-العمود الفقري المسوخ: BRAF (L505M)، CRAF (DDEE / L397M)، وARAF (DGEE / L358M). "،" يمثل "NVTAP" لحذف aa486-490 في BRAF. الطفرة APE من ARAF يعني A475P الذي يولد عزر APE الكنسية في ARAF. يمثل "KD" "مجال كيناز" في النص الكامل. BRAF (KD) يعني aa431-766 جزء من BRAF، في حين أن CRAF (KD) وARAF (KD) تمثل على التوالي لaa323-648 جزء من CRAF وaa284-606 جزء من ARAF. وقد تم الإبلاغ عن النتائج في هذا الرقم سابقا15،22. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 تقييم قدرة متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني على تحويل RAFs من النوع البري باستخدام نموذج تنشيط التنشيط المشترك لسلاح الجو الملكي البريطاني. (أ) رسم تخطيطي يوضح اختبار التنشيط المشترك لسلاح الجو الملكي البريطاني. (B) تم التعبير عن متحولات سلاح الجو الملكي البريطاني الميتة كيناز مع عزر NtA الحمضية مع المتلقي CRAF الحفز المختصة في الخلايا 293T، وتم قياس نشاط ERK1/2 في 293T transfectants من قبل المضادة للفوسو-ERK1/2 المناعية. معظم متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني القتلى ما عدا BRAF (V471F/】NVTAP) التي لديها تقارب ديمر عالية جدا / الاستقرار يتطلب التعبير المشترك من المتلقي سلاح الجو الملكي البريطاني الخارجية لتشغيل إشارات ERK. وقد تم الإبلاغ عن النتائج في هذا الرقم سابقا15،22. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 قياس التقارب الخافت النسبي / استقرار المتحولين RAF باستخدام تحليل لوسيفيراز الانقسام المجاني. (أ) رسم بياني يوضح اختبار لوسيفيراز المنقسم المجاني. (باء - دال) مطلوب التميّز من BRAF(V600E) المتغيرات لنشاطهم الحفاز في الجسم الحي وفي المختبر. (B) البديل BRAF أحادية (V600E)، BRAF (V600E / R509H / AAE) ليس لديه أي نشاط حفاز في الجسم الحي، والتي يمكن استردادها عن طريق الانصهار GST. تم التعبير عن المتغيرات BRAF (V600E) ونظرائهم GST تنصهر في خلايا 293T، وتم قياس نشاطهم من قبل المضادة للفوسفو ERK1/2. (C) وBRAF (V600E) البديل مع تقارب ديمر منخفضة / الاستقرار، BRAF (V600E / AAE) فقدت نشاطها الحفاز في المختبر عند تنقية، والتي يمكن إنقاذها من قبل الانصهار GST. تم تنقية المتغيرات BRAF(V600E) من B عن طريق الترسيب المناعي وتم التحقيق في نشاطها الحفاز من خلال فحص كيناز في المختبر كما هو موضح في البروتوكول. (D) تم قياس التقارب/الاستقرار النسبي للمتغيرات BRAF(V600E) باستخدام فحص لوسيفيراز الانقسام المجاني كما هو موضح في البروتوكول. (ع-ع) متحولات BRAF مع الحذف في الإطار من β3- αC وظيفة حلقة كما dimers لتنشيط إشارات ERK. (E) متحولات BRAF مع الحذف في الإطار من β3- αC حلقة تنشيط إشارات ERK عندما أعرب في الخلايا. تم التعبير عن متحولين BRAF في خلايا 293T وتم قياس نشاطهم كما هو موضح في B. (F) فقدت متحولات BRAF مع تقارب ديمر منخفضة / الاستقرار من E نشاطها الحفاز في المختبر، والتي يمكن إنقاذها من قبل الانصهار GST. تم قياس النشاط الحفاز في المختبر من المتحولين BRAF ونظرائهم GST تنصهر من E كما هو الحال في C. (G) متحولة BRAF مع الحذف في الإطار من β3- حلقة αC لها تقارب مختلف تماما dimer / الاستقرار. تم قياس التقارب/الاستقرار النسبي للمتحولين BRAF مع الحذف في الإطار من حلقة β3- αC كما هو الحال في D. تمثل أشرطة الخطأ في D&G s.d. لإظهار التباين بين التجارب المستقلة (n = 4). الطفرة AAE من BRAF يعني P622A في عزر APE الذي يولد عزر APE غير الكنسية. "MLN"، "NVTAPT"، و "،ق" تمثل على التوالي لحذف aa484-486، aa486-491، aa496-497 في حلقة β3- αC من BRAF. وقد تم الإبلاغ عن بعض النتائج في هذا الرقم سابقا15. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Table 1
الجدول 1: الممتلكات البيولوجية لمختلف المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني. وقد تم تلخيص النشاط الحفاز، والنشاط اللوستريك، والتقارب/الاستقرار النسبي لجميع المتحولين من سلاح الجو الملكي البريطاني المستخدم في هذه الدراسة في هذا الجدول. "Y" تعني "نعم"، بينما "N" تعني "لا". "N*" يشير إلى أن هؤلاء المتحولين لديهم نشاط حفاز إذا تنصهر مع GST. "++++"، "+++"، "++"، "+"، "-" على التوالي تمثل "قوية جداً"، "قوية"، "متوسطة"، "ضعيفة"، و"لا شيء".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه المقالة، قدمنا ثلاث طرق لوصف المتحولين RAF ذات الصلة بالأمراض، والتي تشمل في المختبر اختبار كيناز، وسلاح الجو الملكي البريطاني اختبار التنشيط المشترك، ومجانية انقسام لوسيفيراز اختبار. وبما أن كيناز سلاح الجو الملكي البريطاني لها نشاط حفاز ونشاط أللوستريك على حد سواء، يمكن لمختلف المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني تنشيط الإشارات النهائية من خلال آليتين متميزتين13،14،16،17، 18.المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني النشطة بشكل تأسيسي بشكل مباشر phosphorylate تأثير المصب MEK، في حين أن متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني kinase الميت ة الزناد إشارة المصب من خلال إعادة تنشيط نظرائهم من النوع البري. ومع ذلك، كل من المسوخ سلاح الجو الملكي البريطاني النشطة المكونة وkinase ميت ة تتطلب التمليس للوفاء بوظيفتها15،16،17،19،20،وdimer الميل من متحولي سلاح الجو الملكي البريطاني يحدد ليس فقط النشاط الحفاز أو اللوستريك من المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني ولكن أيضا حساسيتها لمثبطات سلاح الجو الملكي البريطاني15،24. اختبار كيناز في المختبر، واختبارات تنشيط التنشيط المشترك لسلاح الجو الملكي البريطاني، والاختبار المجاني لللوسيفيراز المنقسم، توفر لنا مجموعة من الطرق البسيطة والفعالة والموثوقة للتمييز بين المتحولين النشطين بشكل تأسيسي من المتحولين الميتين، فضلاً عن تقييم القدرة على تنشيط الإشارات المصب.

إن الاختبار في المختبر هو طريقة كلاسيكية للكشف عن النشاط الحفاز للبروتين كيناز. لاعتماد هذه الطريقة لقياس النشاط الحفاز للمتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني، قمنا ببعض التنقيحات الهامة في الكواشف والإجراءات15،21،22. منذ سلاح الجو الملكي البريطاني الأسرة kinases تعمل كوحدات التسريب لالفوسفور الركيزة الخاصة بهم، MEK، وتقاربهم قاتمة / الاستقرار منخفضة نسبيا، قمنا بتخفيض تركيز المنظفات NP-40 من 1٪ إلى 0.25٪ في المخازن المؤقتة لتنقية البروتينات RAF من أجل منع سلاح الجو الملكي البريطاني من التفكك. وعلى نفس المنوال، استخدمنا أيضًا إجراءً لطيفًا للغسيل السريع لتنقية بروتين RAF. هذه التغييرات حاسمة للكشف عن النشاط الحفاز من المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني النشطة التي تشكلها مع تقارب ضعيف جدا ً/استقرار، والتي يمكن تحديدها على أنها متحولة سلاح الجو الملكي البريطاني "kinase-dead" من قبل اختبار كيناز الكلاسيكية في المختبر. وبالإضافة إلى ذلك، لقد أثبتنا أن الانصهار GST هو وسيلة بديلة جيدة لمنع ديمرز سلاح الجو الملكي البريطاني من التفكك أثناء تنقية في هذا اختبار15،21،22. أما فيما يتعلق بالمتحولين في سلاح الجو الملكي البريطاني، حتى لو تم دمجها مع ضريبة السلع والخدمات، فإنها لا تظهر أي نشاط حفاز في هذا التحليل.

وقد تم تطوير نموذج تفعيل سلاح الجو الملكي البريطاني من قبلنا لتقييم قدرة المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني القتلى كيناز على تحويل نظرائهم من النوع البري13،15،21،22،23 , 25.في هذا الاختبار الرواية، ونحن نستخدم N-تيرمينوس البروتينات RAF اقتطاع وبالتالي لا تحتاج إلى التعبير المشترك من متحولة RAS النشطة أو تفعيل RAS، مما يجعل هذا الاختبار حساسة جدا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة عزل المنشط اللوستريك (متحولة سلاح الجو الملكي البريطاني الميتة) والمتلقي (متحولة سلاح الجو الملكي البريطاني المختصة بحفز) في هذا الفحص وتنقيته للتحقيق في الأحداث الجزيئية في عملية التحول القائم على التممّر 13.

كما ذكرنا أعلاه، وتقارب قاتمة / الاستقرار هو عامل رئيسي ينظم وظيفة kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني والمتحولين، ويحدد أيضا حساسيتهم لمثبطات سلاح الجو الملكي البريطاني13،14،15، 16،17،18،24. ومع ذلك، فإن التقارب/الاستقرار الخافت لقرابة عائلة سلاح الجو الملكي البريطاني والمتحولين الأكثر صلة بالأمراض منخفض جداً. ولقياس هذه المعلمة، تتطلب اختبارات الكيمياء الحيوية التقليدية تعقيد الإجراءات التجريبية والمعدات المتقدمة (مثل اختبار موارد البرنامج الخاصة)، أو بالكاد تنتج بيانات موثوقة ويمكن استنساخها (مثل اختبار هطول الأمطار المناعية). في المقابل، فإن اختبار لوسيفيراز الانقسام المجاني هو طريقة بسيطة وحساسة ومتسقة وفعالة من حيث التكلفة لقياس التقارب/استقرار عائلة سلاح الجو الملكي البريطاني والمتحولين15و21، 22،36. هذا الفحص يمكن التحقيق في الفرق خفية من تقارب قاتمة / الاستقرار بين مختلف المتحولين سلاح الجو الملكي البريطاني. كما أبلغنا قبل15،BRAF (V600E / AAE) لديه تقارب ضعيف جدا قاتمة / الاستقرار وسيتم كسر تماما على التنقية حتى لو كان ذلك باستخدام إجراء لطيف جدا. باستخدام هذا الفحص، يمكننا التمييز بين ضعف تقارب/استقرار BRAF (V600E/AAE) عن BRAF أحادية الستيروية (V600E/AAE/R509H) (الشكل3).

وباختصار، فإن هذه المجموعة من الأساليب العملية والعملية يمكن أن تفي بمتطلبات تحديد جميع المتحولين المرتبطين بالأمراض في سلاح الجو الملكي البريطاني، وبالتالي تساعدنا على اختيار الاستراتيجيات المناسبة لعلاج مختلف الأمراض التي يقودها سلاح الجو الملكي البريطاني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنهما ليس لديهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

ويود المؤلفان أن يعترفا بزمالة سرطان الدم في الخلايا المشعرة لدعم يوان جيمين. وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق آسيا لبحوث السرطان (AFCR2017/2019-JH)، وجائزة دوك-نوس خو لجسر التمويل (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014)، والمنحة الانتقالية لـ NCCRF (NCCRF-YR2018-JUL-BG4)، والمنحة التجريبية لـ NCCRF (NCCRF-YR2017-JUL-PG3)، والطب الأكاديمي SHF منحة بحثية (AM/TP011/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
  2. Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
  3. Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
  4. Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
  5. Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
  6. Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
  7. McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
  8. Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
  9. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  10. Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
  11. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
  12. Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
  13. Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
  14. Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
  15. Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
  16. Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
  17. Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
  18. Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
  19. Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
  20. Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
  21. Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
  22. Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
  23. Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
  24. Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
  25. Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
  26. Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
  27. Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  28. Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
  29. Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).
  30. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
  31. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
  32. Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
  33. Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
  34. Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
  35. García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
  36. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  37. Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
  38. Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 149، كيناز الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني، طفرة سلاح الجو الملكي البريطاني، راس / RAF / MEK / ERK الإشارات، dimerization، تقارب ديمر / الاستقرار، والنشاط الحفاز، والنشاط اللوستريك، في اختبار كيناز المختبر، اختبار التنشيط المشترك لسلاح الجو الملكي البريطاني، لوسيفيراز الانقسام التكميلي فحص سرطان
تميز المسوخ ذات الصلة بالأمراض من Kinases الأسرة سلاح الجو الملكي البريطاني باستخدام مجموعة من الأساليب العملية والممكنة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H.,… More

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter