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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

व्यावहारिक और संभावित तरीकों का एक सेट का उपयोग करके आरएएफ परिवार Kinases के रोग से संबंधित उत्परिवर्ती विशेषता

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59795
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

Summary

इस लेख में, हम आरएएफ परिवार kinases, जो इन विट्रो kinase परख, आरएएफ सह सक्रियण परख, और पूरक विभाजन luciferase परख में शामिल हैं रोग से संबंधित म्यूटेंट की विशेषता के लिए व्यावहारिक और व्यावहारिक तरीकों का एक सेट प्रस्तुत किया.

Abstract

तेजी से त्वरित फाइब्रोसार्कोमा (आरएएफ) परिवार kinases सेल जीव विज्ञान में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं और उनके रोग कैंसर और विकास संबंधी विकारों की ओर जाता है। रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट का एक लक्षण हमें इन रोगों के इलाज के लिए उपयुक्त चिकित्सीय रणनीतियों का चयन करने में मदद करेगा। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि आरएएफ परिवार kinases दोनों उत्प्रेरक और allosteric गतिविधियों, जो कसकर dimerization द्वारा विनियमित कर रहे हैं. यहाँ, हम उत्प्रेरक और allosteric गतिविधियों और RAF परिवार kinases और उनके म्यूटेंट के रिश्तेदार dimer आत्मीयता / सबसे पहले, हमने बफर्स में डिटर्जेंट एकाग्रता को कम करके, एक कोमल त्वरित धोने की प्रक्रिया का उपयोग करके, और आरएएफ डिमरकोस को अलग करने से रोकने के लिए एक ग्लूटाथियोन एस-ट्रांसफरेज़ (जीएसटी) संलयन को रोजगार देकर क्लासिक इन विट्रो किनेज़ परख में संशोधन किया। शोधन. यह हमें उचित रूप से सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि को मापने के लिए सक्षम बनाता है। दूसरे, हम एक उपन्यास आरएएफ सह सक्रियण परख एन-टर्मिनल छोटा आरएएफ प्रोटीन का उपयोग करके kinase-मृत आरएएफ उत्परिवर्ती की allosteric गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए विकसित की है, वर्तमान प्रोटोकॉल में सक्रिय रास की आवश्यकता को नष्ट करने और इस तरह एक उच्च प्राप्त करने संवेदनशीलता. अंत में, हमने विभिन्न आरएएफ म्यूटेंटकेशों के सापेक्ष द्विमर आत्मीयता/स्थिरता को मात्रात्मक रूप से मापने के लिए एक अद्वितीय पूरक विभाजित ल्यूसिफेरेस परख उत्पन्न की है, जो पारंपरिक सह-प्रतिरक्षा परख की तुलना में अधिक विश्वसनीय और संवेदनशील है। सारांश में, इन विधियों के निम्न लाभ हैं: (1) उपयोगकर्ता के अनुकूल; (2) उन्नत उपकरणों के बिना प्रभावी ढंग से बाहर ले जाने में सक्षम; (3) लागत प्रभावी; (4) अत्यधिक संवेदनशील और पुन: उत्पादन ीय।

Introduction

आरएएफ परिवार kinases आरएएस / RAF/MEK/ERK संकेत झरना का एक प्रमुख घटक है, जो आरएएस से एकसंकेत संचारित mitogen-सक्रिय प्रोटीन kinase (MEK) 1,2,3,4सक्रिय करने के लिए कर रहे हैं। काइनेस का यह परिवार कोशिका विकास , अस्तित्व और भेदभाव में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है , और उनके परिवर्तन कई रोगों , विशेष रूप से कैंसर5,6,7,8को प्रेरित करते हैं . हाल ही में, जीनोमिक अनुक्रमणों ने कई रोग-संबंधी आरएएफ म्यूटेंटों की पहचान की है जोआरएएस/आरएएफ/एमईके/ईआरके झरना 9,10,11के संकेत संचरण में विभिन्न गुणों का प्रदर्शन करते हैं। आरएएफ म्यूटेंट की एक सावधान विशेषता हमें कैसे आरएएफ उत्परिवर्ती आरएएस के संकेत उत्पादन को बदलने के आणविक तंत्र को समझने में मदद मिलेगी / RAF/MEK/ERK झरना, अंततः विभिन्न आरएएफ उत्परिवर्ती संचालित रोगों के इलाज के लिए उपयुक्त दृष्टिकोण का चयन करें।

आरएएफ परिवार kinases तीन सदस्यों, CRAF, BRAF, और ARAF, जो इसी तरह के आणविक संरचनाओं लेकिन विभिन्न क्षमताओं को सक्रिय करने के लिए डाउनस्ट्रीम संकेतन1,2,3,4शामिल हैं. इन पैरालॉगमेंट्स में, बीआरएएफ की सबसे अधिक गतिविधि इसके गठन के कारण की जाती है , जो कि सबसे कम है (एन-टीएरमिनल एसिडिक ) आकृति12,13,14, जबकि एआरएएफ में सबसे कम है अपनी गैर-कैनोनिकल एपीई आकृति15से उत्पन्न होने वाली गतिविधि | यह रोगों में आरएएफ paralogs के विभिन्न उत्परिवर्तन आवृत्तियों की व्याख्या कर सकते हैं: BRAF और CRAF और ARAF. इसके अलावा, एक ही आरएएफ paralog के भीतर, विभिन्न साइटों में उत्परिवर्तन अलग शिष्टाचार में डाउनस्ट्रीम संकेतन ट्रिगर कर सकते हैं, जो आरएएफ परिवार kinases के विनियमन के लिए जटिलता की एक और परत कहते हैं. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि आरएएफ के सभी काइनेस में उत्प्रेरक और एलोसेटिक दोनों गतिविधियां13,14,16,17,18हैं . Contitutively सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट फॉस्फोरीलेटिंग MEK द्वारा सीधे डाउनस्ट्रीम संकेतन पर बारी है, जबकि kinase मृत आरएएफ उत्परिवर्ती पक्ष-से-साइड डिमराइजेशन के माध्यम से अपने जंगली प्रकार समकक्षों को स्थानांतरित कर सकते हैं और MEK-ERK संकेतन 16 सक्रिय करें ,19,20. dimer आत्मीयता / स्थिरता एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है कि न केवल kinase मृत आरएएफ उत्परिवर्ती की allosteric गतिविधि निर्धारित करता है, लेकिन यह भी गठन सक्रिय आरएएफ उत्परिवर्ती की उत्प्रेरक गतिविधि को प्रभावित करता है15,21, 22.उच्च dimer आत्मीयता के साथ kinase-मृत आरएएफ म्यूटेंट / स्थिरता अंतर्जात जंगली प्रकार RAFs सीधे15को निष्क्रिय कर सकते हैं , जबकि मध्यवर्ती dimer आत्मीयता के साथ उन / जंगली प्रकार के आरएएफ अणुओं का ऊंचा स्तर13,15,20,21,23कार्य करने के लिए । इसी प्रकार, एक dimer-निर्भर तरीके से, और कम dimer आत्मीयता के साथ उन लोगों के साथ गठन सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट फॉस्फोरीलेट MEK, और कम dimer आत्मीयता के साथ उन लोगों को प्रतिरक्षा पर विट्रो में अपनी उत्प्रेरक गतिविधि खो देते हैं कि कमजोर आरएएफ dimers टूट जाता है15, 21,22. dimer आत्मीयता / स्थिरता भी उनके inhibitors के लिए आरएएफ उत्परिवर्ती की संवेदनशीलता निर्धारित करता है, और सकारात्मक आरएएफ inhibitors24के प्रतिरोध के लिए संबंधित है. इसलिए, रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट की विशेषता के लिए, उनके उत्प्रेरक और एलोसेटिक गतिविधियों को मापने के लिए आवश्यक है, और डिमर एफ़िनिटी/

हाल के वर्षों में, हमारी प्रयोगशाला और दूसरों आरएएफ परिवार kinases और उनके म्यूटेंट की विशेषता के लिए विभिन्न तरीकों का विकास किया है। हमारी प्रयोगशाला और दूसरों के अनुभव के अनुसार, हमें लगता है कि निम्नलिखित तीन परख रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट को परिभाषित करने में लाभ है: (1) इन विट्रो kinase परख है कि आसानी से किया जा सकता है के लिए गठन की उत्प्रेरक गतिविधि का पता लगाने सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट15; (2) आरएएफ सह सक्रियण परख कि kinase मृत आरएएफ उत्परिवर्ती13,15,21,22,23, के allosteric गतिविधि को मापने के लिए एक विश्वसनीय और सुविधाजनक तरीका है, 25; (3) मानार्थ विभाजन luciferase परख है कि रिश्तेदार dimer आत्मीयता को मापने में बहुत अधिक संवेदनशीलता है / मात्रात्मक विश्लेषणात्मक विधियों जैसे एसपीआर (स्यूफेस पीलास्मोन आरएसनेंस ) विश्लेषण15,22. इन तीन परख के संयोजन, हम आसानी से समझ सकते हैं कि कैसे एक रोग से संबंधित आरएएफ उत्परिवर्ती बहाव संकेतन बदल देता है और इस तरह इस आरएएफ उत्परिवर्तन की वजह से रोग के इलाज के लिए एक उपयुक्त चिकित्सीय रणनीति का उपयोग.

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Protocol

1. आरएएफ उत्परिवर्ती की उत्प्रेरक गतिविधि को मापने के लिए विट्रो काइनेज़ परख में

  1. गिब्सन असेंबली या पारंपरिक आणविक क्लोनिंग विधियों का उपयोग करके सी-टर्मिनस पर FLAG (DYKDDK) टैग के साथ आरएएफ म्यूटेंट एन्कोडिंग वेक्टर (चित्र1A) का निर्माण करें।
    1. पीसीआर द्वारा आरएएफ कोडिंग दृश्यों में FLAG टैग और उत्परिवर्तनों का परिचय दें, और फिर गिब्सन असेंबली या T4 डीएनए लिगेशन का उपयोग करके और निर्माण के प्रोटोकॉल का पालन करके pCDNA3.1(+) वेक्टर में पूरे दृश्यों को सम्मिलित करें। PCR प्रतिक्रियाओं के लिए निम्न शर्तों का उपयोग करें: (1) 95 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट; (2) 95 डिग्री सेल्सियस, 30 s; (3) 59 डिग्री सेल्सियस, 30 s; (4) 68 डिग्री सेल्सियस, 3 मिनट; (5) के 20 चक्र (2 से 4); (6) 4 डिग्री सेल्सियस पकड़।
      नोट: क्लोनिंग के लिए पीसीआर प्राइमर: 5- AaattaaCGACTACTGACC-3 और 5-CAGCGGGTTAAACGGGCCCTCTA-3.
    2. चरण 1.1.1 में वर्णित के रूप में एक ही तरीके का उपयोग करके जीएसटी-फ्यूज्ड आरएएफ उत्परिवर्ती एन्टेक्टर एन्कोडिंग वैक्टर उत्पन्न करने के लिए आरएएफ उत्परिवर्ती कोडिंग दृश्यों के ऊपर जीएसटी कोडिंग अनुक्रम डालें।
    3. ट्रांसफेक्शन से पहले डीएनए अनुक्रमण द्वारा सभी सदिशों को सत्यापित करें।
  2. प्लेट 293T कोशिकाओं में 6 अच्छी तरह से प्लेटों में 5 x 105 कोशिकाओं के घनत्व पर / जब सेल घनत्व दूसरे दिन 80 डिग्री 90% संगम तक पहुँच जाता है, तो ट्रांसफेक्शन अभिकर्मकों के निर्माण प्रोटोकॉल का पालन करके कोशिकाओं मेंचरण 1.1 से FLAG-tagged RAF kinases या उनके उत्परिवर्ती एन्कोडिंग के साथ ट्रांसफेक्ट करें।
  3. transfection के बाद संस्कृति मध्यम 24 ज बदलें।
  4. transfection के बाद संस्कृति मध्यम 48 ज के रूप में प्रेरित करें और 400 [L/वेल lysis बफर (25 m Tris] जोड़ें एचसीएल, 150 एमएम नैकल, 1 एमएम एथिलीनडिऐथिलीनटेरेसेटिक एसिड (ईडीटीए), 0.25% एनपी-40, पीएच 7.2) बर्फ पर लाइसे कोशिकाओं के लिए प्रोटीज़ और फॉस्फेटेस अवरोधकों के साथ पूरक।
    नोट: lysis बफर में एनपी-40 की एकाग्रता इन विट्रो में मध्यम dimer आत्मीयता / स्थिरता के साथ आरएएफ म्यूटेंट के उत्प्रेरक गतिविधि का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण है। डिटर्जेंट या lysis बफर में एक मजबूत डिटर्जेंट की एक उच्च एकाग्रता आरएएफ dimers तोड़ सकते हैं और इस तरह आरएएफ kinases या उनके म्यूटेंट के उत्प्रेरक गतिविधि को मार.
  5. सेल lysates एक 1.5 एमएल ट्यूब के लिए स्थानांतरण, और सेल मलबे को कम करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 12,000 x ग्राम से नीचे स्पिन।
  6. साफ पूरे सेल lysates के प्रति नमूने 300 $L 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए स्थानांतरण, विरोधी FLAG आत्मीयता मोती के प्रति नमूना 20 $L जोड़ें, और 1 एच के लिए एक ठंडे कमरे (4 डिग्री सेल्सियस) में बारी बारी से। इसके अलावा नीचे वर्णित के रूप में इम्यूनोब्लोट्स द्वारा आरएएफ म्यूटेंट की अभिव्यक्ति और गतिविधि (फॉस्फो-ERK1]2) का पता लगाने के लिए एक तरफ साफ पूरे सेल lysate के प्रति नमूना 40 $L ले लो।
  7. एक बार lysis बफर के साथ विरोधी FLAG मोती धो, तो एक बार kinase प्रतिक्रिया बफर के साथ (20 एमएम HEPES, 10 एमएम MgCl2, 0.5 एमएम ना3VO4, 0.5 एमएम डीटीटी, पीएच 7.2), और 20L के kinase प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ें (2 डिग्री एम ई के 97ए) और 100 एम एटीएम 200 एम ई आर ई में कार्रवाई बफर) प्रति नमूना.
    नोट: मनका धोने धीरे और जल्दी से पूरा किया जाना चाहिए, अवशिष्ट बफर पूरी तरह से kinase प्रतिक्रिया मिश्रण जोड़ने से पहले aspirated किया जाना चाहिए, और इस कदम पर सभी आपरेशनों एक ठंडे कमरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए।
  8. कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर 10 मिनट के लिए kinase प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट करें, और ऊष्मायन के दौरान हर दूसरे मिनट उंगलियों के साथ kinase प्रतिक्रियाओं युक्त ट्यूबों फ्लिप।
  9. 5x एसडीएस नमूना बफर के 5 [L जोड़ें (375 m M Tris] एचसीएल, 9% सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस), 50% ग्लिसरोल, 0.03% ब्रोमफेनोल ब्लू) प्रति नमूना काइनाज़ प्रतिक्रियाओं को रोकने के लिए, और फिर 5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर नमूने गर्म करें।
  10. 0.1% एसडीएस के साथ 9 डिग्री 12% polyacrylamide जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (पेज) में नमूने चलाने के लिए, नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली के लिए प्रोटीन हस्तांतरण, और इम्यूनोब्लॉस द्वारा नमूनों में फॉस्फो-एमईके और आरएएफ म्यूटेंट के स्तर का पता लगाने।
    नोट: फॉस्फो-एमईके को भी32पी-एटीपी निगमन का उपयोग करके क्वानवर्तक किया जा सकता है। संक्षेप में, 10 डिग्री सेल्सियस -32पी-एटीपी को काइनाज प्रतिक्रिया बफर में जोड़ा जाता है, और फॉस्फोरिलेडेड एमईके की मात्रा को मानक ऑटोरेडियोग्राफी, फॉस्फोरिइमेजिंग, या तरल प्रस्फुरीकरण गणना तकनीकों का उपयोग करके पेज जुदाई के बाद मात्रा निर्धारित किया जाता है उपयुक्त.

2. RAF सह सक्रियण परख Kinase-मृत आरएएफ उत्परिवर्ती के Allosteric गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए

  1. RAF रिसीवर एन्कोडिंग वेक्टर का निर्माण (CRAF kinase डोमेन unphosphorylatable NTA आकृति, AFF) या kinase मृत आरएएफ activators (RAF kinase डोमेन फॉस्फोरिलेशनके साथ-मिमिक्ट NtA आकृति, SSDD, DDEE या DGEE) के रूप में चरण 1.1 में वर्णित है.
  2. दो वैक्टर के साथ Transfect 293T कोशिकाओं आरएएफ रिसीवर और kinase मृत आरएएफ उत्प्रेरक या एक एकल वेक्टर एन्कोडिंग प्रोटीन में से एक के रूप में चरण 1.2 और 1.3 में वर्णित एन्कोडिंग के साथ.
  3. transfection के बाद 24 h पर संस्कृति माध्यम बदलें, और फसल 293T transfectants 48 h पर पूरे सेल lysates तैयार करने के रूप में कदम 1.4 और 1.5 में वर्णित है.
  4. कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर जल्दी से 5x एसडीएस नमूना बफर के साथ साफ पूरे सेल lysate मिक्स और फिर 5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर फोड़ा।
  5. 0.1% एसडीएस के साथ 9 डिग्री 12% पृष्ठ में उबला हुआ पूरे सेल lysate नमूने चलाने के लिए, नाइट्रोसेलुलोस झिल्ली के लिए प्रोटीन हस्तांतरण, और फॉस्फो-ERK1 डिग्री 2 के स्तर का पता लगाने और इम्यूनोब्लोट्स द्वारा नियंत्रण प्रोटीन।

3. आरएएफ उत्परिवर्ती के सापेक्ष डिमर एफ़िनिटी/स्थिरता को मापने के लिए पूरक विभाजन लुसिफरेसे परख

  1. निर्माण वैक्टरों को एन-टर्मिनस के एन-टर्मिनस (एन-टर्मिनस ऑफ जुगनू लूसिफरेस, aa2-416) या Cluc के C-टर्मिनस (सी-टर्मिनस ऑफ जुगनू ल्यूसिफेस, aa398-550) के लिए जुड़े हुए हैं, जैसा कि चरण 1.1 में वर्णित है।
  2. चरण 1.2 में वर्णित के रूप में विभिन्न Nluc-RAF म्यूटेंट और Cluc-RAF म्यूटेंट एन्कोडिंग वैक्टरकीज की एक जोड़ी के साथ 293T कोशिकाओं transfect।
  3. transfection के बाद 24 ज पर, रंग मुक्त माध्यम के साथ अच्छी तरह से 2x105 की सेल घनत्व पर Kristal काले छवि प्लेटों में 293T सेल transfectants replate (यानी, phenol लाल बिना DMEM).
  4. 24 घंटे बाद, 293T सेल transfectants के लिए डी-luciferin (0.2 mg/mL) जोड़ें, 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट, और एक बहु का पता लगाने प्रणाली का उपयोग करके luciferase संकेतों को मापने (सामग्री कीतालिका).
  5. ल्यूसिफेरेज संकेतों को मापने के बाद, मध्यम और lyse 293T transfectants lysis बफर के साथ aspirate के रूप में कदम 1.4 और 1.5 में वर्णित पूरे सेल lysates तैयार करने के लिए.
  6. 0.1% एसडीएस के साथ 9 $12% पृष्ठ में पूरे सेल lysate नमूने चलाने के लिए और कदम 2.5 में वर्णित के रूप में विरोधी FLAG इम्यूनोब्लॉट द्वारा Nluc-RAF म्यूटेंट और Cluc-RAF म्यूटेंट की अभिव्यक्ति के स्तर का पता लगाने। 293T transfectants में दोनों Nluc-RAF उत्परिवर्ती और Cluc-RAF उत्परिवर्ती के सापेक्ष अभिव्यक्ति के स्तर उनके इम्यूनोब्लॉट्स से छवि जम्मू का उपयोग करके परिमाणित कर रहे हैं।
  7. Nluc-RAF म्यूटेंट और Cluc-RAF म्यूटेंट की अभिव्यक्ति के स्तर के अनुसार 293T सेल transfectants के luciferase संकेतों को सामान्य। संक्षेप में, यह Nluc-RAF म्यूटेंट और Cluc-RAF म्यूटेंट के कदम 3.6 से रिश्तेदार अभिव्यक्ति के स्तर से कच्चे luciferase संकेत विभाजित करके हासिल की है.

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Representative Results

आरएएफ परिवार kinases दोनों उत्प्रेरक और allosteric गतिविधियों है, जो उनकी बीमारी से संबंधित म्यूटेंट विभिन्न तंत्र13,14,16,17 के माध्यम से बहाव संकेत पर बारी करने के लिए सक्षम ,18. गठनसक्रिय रूप से सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट सीधे अपने substrates फॉस्फोरिलेट, जबकि kinase मृत आरएएफ म्यूटेंट जंगली प्रकार समकक्षों transactivating के माध्यम से अपने कार्य को पूरा करते हैं। जैसा कि चित्र 1बीमें दिखाया गया है , दोनों संरचक रूप से सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट (जैसे विनियामक रीढ़ (आर-स्पाइन) म्यूटेंट (BRAF(L505M), CRAF(DDEE/L397M), और ARAF (DGEE/L358M))13,23,25 , 26, BRAF (V600E), और BRAF ($NVTAP)) और काइनेज़-मृत आरएएफ म्यूटेंट (जैसे उत्प्रेरक रीढ़ (सी-स्पाइन)-फ्यूज्ड BRAF ([NVTAP/V471F)15) 293T कोशिकाओं में व्यक्त किए जाने पर ERK सक्रिय हो जाता है। इसलिए, आरएएफ म्यूटेंट की क्षमता कोशिकाओं में ERK संकेतन को सक्रिय करने के लिए एक मानक के रूप में सेवा नहीं कर सकता एक kinase-मृत उत्परिवर्ती से एक constitutively सक्रिय उत्परिवर्ती भेद करने के लिए, हालांकि मध्यम dimer आत्मीयता के साथ कुछ kinase मृत उत्परिवर्ती / डाउनस्ट्रीम केवल सक्रिय रास के सहयोग से संकेत। तीन तरीकों है कि हम यहाँ प्रस्तुत हमें प्रभावी ढंग से सभी रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट की विशेषता में मदद कर सकते हैं. हमारे पिछले अध्ययनों में इन परखों का उपयोग करके प्रकट किए गए सभी आरएएफ उत्परिवर्तीकेकेके के जैविक गुणों को सारणी 1में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है .

पहली विधि है कि हम kinase-मृत आरएएफ म्यूटेंट से गठन सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट भेद करने के लिए उपयोग कर सकते हैं इन विट्रो kinase परख है। इस परख में, आरएएफ म्यूटेंट इम्यूनोसेरिप्शन द्वारा शुद्ध किए गए थे और उत्प्रेरक प्रतिक्रियाओं kinase-मृत MEK1 (K97A) और एटीपी substrates के रूप में के साथ इनविट्रो में किए गए थे। आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि को इम्युनोब्लॉट द्वारा काइनाज प्रतिक्रिया मिश्रण में एमईके1 (K97A) के एएल(एकctivation Loop)-फॉस्फोरिलेशन के रूप में मापा गया था। जैसा कि चित्र 1ब्में दिखाया गया है , यह परख प्रभावी रूप से BRAF, CRAF और ARAF13,15,23,BRAF (V600E)9, और BRAF ($NVTAP)15के आर-स्पिन म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि की जांच कर सकती है , लेकिन ऐसा नहीं है कि kinase-मृत BRAF (V471F/NVTAP)15 है कि एक जुड़े सी-स्पाइन है. हालांकि, कमजोर dimer आत्मीयता के साथ गठनसक्रिय आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि / स्थिरता जैसे ARAF आर-स्पिन उत्परिवर्ती (ARAF(DGEE/L358M)) (चित्र 1सी, लेन 4), CRAF और ARAF म्यूटेंट बदल dimer इंटरफ़ेस के साथ (CRAF (DDEE/ L397M/R401H), ARAF (DGEE/L358M/APE/R362H)15,22 (चित्र 1डी, ई) इस परख का उपयोग करके जांच नहीं की जा सकती है, क्योंकि उनके dimers शुद्धि के दौरान टूट गया था, खासकर जब शुद्धि थी मजबूत या उच्च सांद्रता वाले डिटर्जेंट डिटर्जेंट वाले बफर के साथ किया जाता है। कमजोर dimer आत्मीयता के साथ आरएएफ म्यूटेंट के उत्प्रेरक गतिविधि के नुकसान से बचने के लिए, हम आम तौर पर जीएसटी के साथ इन म्यूटेंट जुड़े(जीlutathione एस-टीransferase), मजबूत आत्मीयता के साथ एक डिमेरिक प्रोटीन / इन विट्रो गतिज परख में बाहर ले जाने, जो इन आरएएफ उत्परिवर्ती15,22 के उत्प्रेरक गतिविधि को बचा सकता है (चित्र 1ई) . सामान्य में, सबसे आरएएफ म्यूटेंट इस परख का उपयोग करके गठन सक्रिय या kinase मृत म्यूटेंट के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है।

दूसरी विधि है कि हम यहाँ वर्णित आरएएफ सह सक्रियण परख है कि kinase मृत आरएएफ म्यूटेंट13,15,21,22,23 के allosteric गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है , 25. यद्यपि कुछ काइनेज-मृत आरएएफ म्यूटेंट, जिनमें बहुत अधिक डाइमर एफ़िनिटी/स्थिरता होती है, तब भी , कोशिकाओं में व्यक्त किए जाने पर अंतर्जात आरएएफ अणुओं को सीधे सक्रिय कर सकते हैं (चित्र 1बी, लेन 7), अधिकांश kinase मृत आरएएफ म्यूटेंट सक्रिय रास के सहयोग की आवश्यकता के लिए जंगली प्रकार RAFs transactivate. हालांकि, सक्रिय रास ERK संकेतन, जिसका परिचय सक्रिय ERK के बेसल स्तर में वृद्धि होगी की एक प्रत्यक्ष उत्प्रेरक है. सक्रिय रास के हस्तक्षेप से बचने के लिए, हमने इस परख में एन-टर्मिनस-टेंके हुए आरएएफ म्यूटेंट का उपयोग किया (चित्र 2ए)। जैसा कि चित्र 2खमें दिखाया गया है, बीआरएएफ के काइनेस-मृत म्यूटेंट, CRAF, और अम्लीय NtA आकृति और सी-स्पिन संलयन के साथ आरएएफ (BRAF(V471F, aa431-766), CRAF (DDEE/V363F, aa323-648), और ARAF (DGEE/V324F, aa284-606) activtoators के रूप में कार्य किया जब 293T कोशिकाओं में सह expressed गैर phosphorylatable NTA आकृति (CRAF रिसीवर, CRAF (Aff, aa323-648)) के साथ CRAF के उत्प्रेरक गतिविधि को ट्रिगर। इसके विपरीत, kinase-मृत BRAF उत्परिवर्ती (V471F/NVTAP, aa431-766) है कि बहुत उच्च dimer आत्मीयता / स्थिरता है (नीचे देखें) endogenous RAFs ट्रिगर द्वारा ERK संकेत पर दिया, यहां तक कि CRAF रिसीवर के सह-अभिव्यक्ति के बिना. कुल मिलाकर, इस परख सभी kinase मृत आरएएफ म्यूटेंट के रूपांतरण क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

आरएएफ परिवार kinases के dimerization न केवल डाउनस्ट्रीम MEK-ERK संकेतन को सक्रिय करने के लिए उनकी क्षमता को नियंत्रित करता है, लेकिन यह भी आरएएफ inhibitors के लिए उनकी संवेदनशीलता निर्धारित करता है15,16,20,22,24,27,28,29,30,31,32. इस मार्ग के बीच अन्य प्रोटीन प्रोटीन बातचीत के विपरीत33,34,35, आरएएफ परिवार kinases और उनके म्यूटेंट के dimerization अपेक्षाकृत कमजोर है और इस तरह के सह प्रतिरक्षा के रूप में पारंपरिक जैव रसायन परख का उपयोग करके मूल्यांकन किया जा करने के लिए मुश्किल है। इस समस्या को हल करने के लिए, हमने हाल ही में आरएएफ परिवार kinases और उनके म्यूटेंट के रिश्तेदार dimer आत्मीयता / स्थिरता को मापने के लिए एक मानार्थ विभाजन luciferase परख विकसित की है15,22,36. जैसा कि में दिखाया गया हैचित्र 3ए, आरएएफ kinase डोमेन (aa431-766 BRAF के लिए, Aa323-648 CRAF के लिए, और ARAF के लिए aa284-606) क्रमशः N-terminus (aa2-416) या सी-टर्मिनस (aa398-550) के साथ जुड़े हुए थे, और एक साथ लाया जाएगा, और एक साथ आग लुसिलुक्स (Nofluc) के साथ इकट्ठा किया गया था, और एक साथ लाया जाएगा, और एक साथ इकट्ठा किया जाएगा RAF dimerization पर luciferase. इस परख में luciferase की गतिविधि सीधे आरएएफ dimers की मात्रा के साथ संबंधित है. यह परख बहुत संवेदनशील है और आरएएफ म्यूटेंट की भी एक बहुत कमजोर dimerization का पता लगा सकते हैं. जैसा कि हम पहले की सूचना दी15, oncogenic BRAF (V600E) एक dimer के रूप में कार्य करता है, और केवल Arg के साथ एक यौगिक उत्परिवर्तन-से-His उत्परिवर्तन (R509H) dimer इंटरफ़ेस में और गैर-कैनोनिक APE (P622A APE में APE आकृति) पूरी तरह से अपने dimerization को समाप्त कर सकते हैं और इस तरह इसके उत्प्रेरक ब्लॉक गतिविधि (चित्र 3बी). इन विट्रो kinase परख में उपयोग करके, हमने आगे पाया कि BRAF (V600E) बदल APE आकृति के साथ संस्करण, BRAF (V600E/AAE), लेकिन नहीं है कि Arg के साथ-से-His उत्परिवर्तन dimer इंटरफ़ेस में, BRAF (V600E/चित्र 3सी), सुझाव है कि पूर्व संस्करण बहुत कम dimer आत्मीयता / dimers फार्म करने के लिए इन BRAF (V600E) वेरिएंट की प्रवृत्ति को सीधे मापने के लिए, हम एक मानार्थ विभाजन luciferase परख बाहर किया, और पुष्टि की है कि इन वेरिएंट BRAF (V600E) BRAF (V600E/ R509H) BRAF(V600E/AAE) से BRAF(V600E/चित्र 3डी). एकामेरिक BRAF (V600E/R509H/AAE) द्वारा उत्पादित ल्यूसिफेरेस सिग्नल गैर-ट्रांसफेक्टेड 293T नियंत्रण के साथ तुलनीय था (चित्र 3डी, छोड़ दिया पैनल लेन 5), यह दर्शाता है कि इस परख एक बहुत कम पृष्ठभूमि है. आगे मानार्थ विभाजन luciferase परख की प्रभावशीलता का निर्धारण करने के लिए, हम अगले इस परख का उपयोग करके मापा रिश्तेदार dimer आत्मीयता / समूहों15,37,38. जैसा कि हम जानते हैं, हालांकि इन उत्परिवर्ती के सभी सक्रिय ERK संकेतन जब 293T कोशिकाओं में व्यक्त (चित्र 3ई), वे इन विट्रो में काफी अंतर उत्प्रेरक गतिविधि का प्रदर्शन किया (चित्र 3एफ). BRAF ([MLN(aa484-486 del)) और BRAF([NVTAP(a486-490 del)) प्रतिरक्षाद्वारा शुद्धीकरण पर बहुत सक्रिय थे, जबकि BRAF ([NVTAPT(a486-491 del) और BRAF(a496-497) जीएसटी संलयन द्वारा बचाया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, BRAF (NVTAP), BRAF (V471F/NVTAP) के किनेस-मृत संस्करण ने कोशिकाओं में व्यक्त किए जाने पर अंतर्जात RAFs को सक्रिय करने के लिए एक प्रबल शक्ति का प्रदर्शन किया (चित्र 1बीलेन 7). इन आंकड़ों से पता चलता है कि BRAF म्यूटेंट्स के इस समूह में BRAF([NVTAP) से अधिक BRAF([NVTAP) और BRAF ($QA) से अधिक अंतर भिन्न dimer समानता/स्थिरता है। दरअसल, मानार्थ विभाजन luciferase परख से परिणाम पूरी तरह से हमारे अनुमान का समर्थन किया (चित्र 3जी). एक साथ लिया, हमारे डेटा से संकेत मिलता है कि मानार्थ विभाजन luciferase परख एक विश्वसनीय तरीका है RAF उत्परिवर्ती के रिश्तेदार dimer आत्मीयता को मापने /

Figure 1
चित्र 1 : इन विट्रो kinase परख में उपयोग करके आरएएफ उत्परिवर्ती के उत्प्रेरक गतिविधि की जांच. ((क)इस अध्ययन में आरएएफ उत्परिवर्तनों के लिए एक योजनाबद्ध आरेख का प्रयोग किया गया है। (बी) दोनों गठनात्मक रूप से सक्रिय और काइनेज़-मृत आरएएफ म्यूटेंट कोशिकाओं में व्यक्त किए जाने पर ईआरके संकेतन को सक्रिय कर सकते हैं। 293T कोशिकाओं वैक्टर है कि विभिन्न आरएएफ म्यूटेंट सांकेतिक संबंधों के साथ transfected थे, और ERK की गतिविधि विरोधी phospho-ERK1/2 इम्यूनोब्लॉट द्वारा पता लगाया गया था। (ग) कम डाइमर एफ़िनिटी/स्थिरता के साथ-साथ किनेज़-मृत आरएएफ म्यूटेंट के साथ संयोजन रूप से सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट प्रतिरक्षा द्वारा शुद्धि पर विट्रो में फॉस्फोरिलेट एमईके नहीं कर सकते हैं। बी में आरएएफ म्यूटेंट विरोधी FLAG मोती का उपयोग करके शुद्ध थे, और उनके उत्प्रेरक गतिविधि प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में इन विट्रो kinase परख का उपयोग करके जांच की गई थी। (डी-ई) कम dimer आत्मीयता के साथ गठन सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट के इन विट्रो उत्प्रेरक गतिविधि / (घ) संघ की सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट और उनके जीएसटी-फ्यूज्ड समकक्षों को 293T कोशिकाओं में व्यक्त किया गया था और उनकी गतिविधि को एंटी-फॉस्फो-ईआरके1/2 इम्युनोब्लॉट द्वारा मापा गया था। (ई) डी में आरएएफ उत्परिवर्ती प्रतिरक्षा-वर्षा द्वारा शुद्ध किए गए थे, और प्रोटोकॉल में वर्णित इन विट्रो किलेश परख का उपयोग करके उनकी इन विट्रो उत्प्रेरक गतिविधि की जांच की गई थी। आरएएफ आर-स्पिन म्यूटेंट: BRAF (L505M), CRAF (DDEE/L397M), और ARAF (DGEE/ BRAF में aa486-490 को हटाने के लिए "$NVTAP" का प्रतिनिधित्व करता है। ARAF के APE उत्परिवर्तन A475P कि ARAF में एक विहित APE आकृति उत्पन्न करता है मतलब है. "KD" पूर्ण पाठ में "kinase डोमेन" के लिए प्रतिनिधित्व करता है। BRAF (KD) BRAF के aa431-766 टुकड़ा का मतलब है, जबकि CRAF (KD) और ARAF (KD) CRAF के aa323-648 टुकड़ा और Aa284-606 टुकड़ा ARAF के लिए क्रमशः प्रतिनिधित्व करते हैं. इस आंकड़े के परिणाम पहले15,22में सामने आ चुके हैं . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : आरएएफ सह सक्रियण परख का उपयोग करके जंगली प्रकार RAFs transactivate करने के लिए आरएएफ म्यूटेंट की क्षमता का मूल्यांकन। (ए) आरएएफ सह-सक्रियण परख का चित्रण करने वाला एक आरेख। (बी) किनेस-मृत आरएएफ म्यूटेंट्स के साथ अम्लीय एनटीए आकृति के साथ 293T कोशिकाओं में उत्प्रेरक-सक्षम सीएएफ रिसीवर के साथ सह-एक्सप्रेस किया गया था, और 293T ट्रांसफेकेंट्स में ERK1/2 की गतिविधि को एंटी-फोशो-ERK1/2 इम्यूनोब्लाट द्वारा मापा गया था। BRAF (V471F/NVTAP) को छोड़कर अधिकांश काइनेज-मृत आरएएफ म्यूटेंट, जिसमें बहुत अधिक डिमर एफ़िनिटी/स्थिरता है, को ईआरके सिग्नलिंग चालू करने के लिए बहिर्जात आरएएफ रिसीवर के सह-अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है। इस आंकड़े के परिणाम पहले15,22में सामने आ चुके हैं . कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : मानार्थ विभाजन luciferase परख का उपयोग करके RAF उत्परिवर्ती के रिश्तेदार dimer आत्मीयता / स्थिरता को मापने. (ए) मानार्थ विभाजन ल्यूसिफरेस परख का चित्रण करने वाला एक चित्र। (बी-डी) बीआरएएफ (V600E) वेरिएंट का डिमराइजेशन विवो और इन विट्रो में उनकी उत्प्रेरक गतिविधि के लिए आवश्यक है। (बी) मोनोमेरिक BRAF (V600E) संस्करण, BRAF(V600E/R509H/AAE) में विवो में कोई उत्प्रेरक गतिविधि नहीं है, जिसे जीएसटी संलयन द्वारा पुनर्प्राप्त किया जा सकता है। BRAF (V600E) वेरिएंट और उनके जीएसटी-जुड़े समकक्षों 293T कोशिकाओं में व्यक्त किए गए थे, और उनकी गतिविधि विरोधी फॉस्फो-ERK1/2 द्वारा मापा गया था। (ग) बीआरएएफ (V600E) संस्करण जिसमें कम डाइमर एफ़िनिटी/स्थिरता, BRAF(V600E/AAE) ने शुद्धीकरण पर इन विट्रो में अपनी उत्प्रेरक गतिविधि खो दी है, जिसे जीएसटी संलयन द्वारा बचाया जा सकता है। बी से BRAF (V600E) वेरिएंट इम्यूनोवेरिसेशन द्वारा शुद्ध किया गया और उनके उत्प्रेरक गतिविधि इन विट्रो kinase परख के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित द्वारा जांच की गई थी। (घ) BRAF (V600E) वेरिएंट के सापेक्ष dimer आत्मीयता/स्थिरता मानार्थ विभाजन luciferase परख के रूप में प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग करके मापा गया था. (ई-जी) ERK संकेतन को सक्रिय करने के लिए dimers के रूप में $ 3- जेड सी पाश समारोह के इन-फ्रेम विलोपन के साथ BRAF म्यूटेंट। (ई) बीआरएएफ म्यूटेंट, जिनकी इन-फ्रेम विलोपन के साथ ,3-डिग्री सी लूप को कक्षों में व्यक्त किए जाने पर ईआरके सिगनल सक्रिय कर देते हैं। BRAF म्यूटेंट 293T कोशिकाओं में व्यक्त किए गए थे और उनकी गतिविधि को बीमें वर्णित के रूप में मापा गया था . (च) बीआरएएफ म्यूटेंट जिनके पास ई से कम डाइमर एफ़िनिटी/स्थिरता है, ने विट्रो में अपनी उत्प्रेरक गतिविधि खो दी है, जिसे जीएसटी संलयन द्वारा बचाया जा सकता है। बी.ए.एफ. म्यूटेंट्स की इन विट्रो उत्प्रेरक गतिविधि और ई से उनके जीएसटी-जुड़े समकक्षों को सीके रूप में मापा गया था। (छ) बीआरएएफ म्यूटेंट, जिनकी इन-फ्रेम विलोपन के साथ $3--सी लूप में बहुत अलग डिमर एफ़िनिटी/स्थिरता होती है। बी.आर.ए.एफ. म्यूटेंट्स की सापेक्ष द्वि-दशा/स्थिरता, जिसकी इन-फ्रेम विलोपन के साथ $3-जेडसी लूप को डीमें मापा गया था। D और G में त्रुटि पट्टियाँ स्वतंत्र प्रयोगों के बीच प्रसरण दिखाने के लिए s.d. का प्रतिनिधित्व करती हैं (n ] 4). BRAF के एएई उत्परिवर्तन एक गैर-कैनोनिकल एपीई आकृति उत्पन्न करता है कि एपीई आकृति में P6222A का मतलब है। BRAF के aa484-486, aa486-491, aa496-497, aa496-497 के विलोपन के लिए क्रमशः "MLN", "NVTAPT", और "$QA" का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस आंकड़े के कुछ परिणाम पहले15रिपोर्ट किए गए हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1: विभिन्न आरएएफ म्यूटेंट की जैविक संपत्ति। उत्प्रेरक गतिविधि, allosteric गतिविधि और रिश्तेदार dimer आत्मीयता / इस अध्ययन में इस्तेमाल सभी आरएएफ म्यूटेंट की स्थिरता इस तालिका में संक्षेप किया गया है. "Y" का अर्थ है "हाँ", जबकि "N" "नहीं" के लिए खड़ा है. "एन*" इंगित करता है कि उन उत्परिवर्ती गतिविधि है अगर जीएसटी के साथ जुड़े. "+++", "++", "++", "+", "+" और "-" क्रमशः "बहुत मजबूत", "सशक्त", "मध्यस्थ", "कमजोर", और "कोई नहीं") के लिए क्रमशः प्रतिनिधित्व करते हैं।

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Discussion

इस लेख में, हम रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट, जो इन विट्रो kinase परख, आरएएफ सह सक्रियण परख, और मानार्थ विभाजन luciferase परख में शामिल विशेषता के लिए तीन तरीकों प्रस्तुत किया. चूंकि आरएएफ kinases दोनों उत्प्रेरक गतिविधि और allosteric गतिविधि है, विभिन्न आरएएफ उत्परिवर्ती दो अलग तंत्र13,14,16,17के माध्यम से बहाव संकेत सक्रिय कर सकते हैं, 18.संरचक रूप से सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट सीधे डाउनस्ट्रीम प्रभावक एमईके को फॉस्फोरिलेट करते हैं, जबकि काइनेज़-मृत आरएएफ म्यूटेंट अपने जंगली-प्रकार के प्रतिपक्षों को ट्रांसएक्टिव करने के माध्यम से डाउनस्ट्रीम सिग्नल को ट्रिगर करते हैं। हालांकि, दोनों गठन सक्रिय और kinase मृत आरएएफ म्यूटेंट अपने कार्य को पूरा करने के लिए dimerization की आवश्यकता15,16,17,19,20, और dimer आरएएफ म्यूटेंट की प्रवृत्ति न केवल आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक या एलोसेरिक गतिविधि कोनिर्धारित करती है बल्कि आरएएफ अवरोधकों के प्रति उनकी संवेदनशीलता 15,24को भी निर्धारित करती है . इन विट्रो kinase परख, आरएएफ सह सक्रियण परख, और मानार्थ विभाजन luciferase परख हमें kinase-मृत म्यूटेंट से गठन सक्रिय म्यूटेंट भेद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मूल्यांकन के लिए सरल, प्रभावी, और विश्वसनीय तरीकों का एक सेट प्रदान करते हैं उनके डाउनस्ट्रीम संकेतन को सक्रिय करने की क्षमता.

इन विट्रो काइनेस परख प्रोटीन काइनेस की उत्प्रेरक गतिविधि का पता लगाने के लिए एक शास्त्रीय विधि है। आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि को मापने के लिए इस विधि को अपनाने के लिए, हमने अभिकर्मकों और प्रक्रियाओं में कुछ महत्वपूर्ण संशोधन किएहैं 15,21,22. चूंकि आरएएफ परिवार kinases उनके सब्सट्रेट, MEK, और उनके dimer आत्मीयता / स्थिरता के लिए dimers के रूप में कार्य अपेक्षाकृत कम है, हम डिटर्जेंट एनपी-40 की एकाग्रता को कम कर दिया है 1% से 0.25% RAF प्रोटीन शुद्ध करने के लिए बफर में रोकने के लिए वियोजन से आरएएफ dimers. एक ही टोकन द्वारा, हम भी आरएएफ प्रोटीन शुद्धि के लिए एक कोमल त्वरित धोने की प्रक्रिया का इस्तेमाल किया है. ये परिवर्तन बहुत कमजोर dimer आत्मीयता के साथ गठन सक्रिय आरएएफ म्यूटेंट की उत्प्रेरक गतिविधि का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण हैं / इसके अलावा, हमने दिखा दिया है कि इस परख15,21,22में शुद्धि के दौरान आरएएफ डिमरको को वियोजन से रोकने के लिए जीएसटी संलयन एक अच्छा वैकल्पिक तरीका है . काइनाज-मृत आरएएफ म्यूटेंट के रूप में, भले ही वे जीएसटी के साथ जुड़े हुए हैं, वे इस परख में किसी भी उत्प्रेरक गतिविधि का प्रदर्शन नहीं करते हैं।

आरएएफ सह सक्रियण परख हमारे द्वारा विकसित किया गया है kinase मृत आरएएफ म्यूटेंट की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए अपने जंगली प्रकार समकक्षों13,15,21,22,23 को निष्क्रिय करने के लिए , 25इस उपन्यास परख में, हम एन-टर्मिनस छोटा आरएएफ प्रोटीन का उपयोग करते हैं और इस तरह सक्रिय आरएएस म्यूटेंट के सह-अभिव्यक्ति या आरएएस को सक्रिय करने की आवश्यकता नहीं है, जो इस परख को बहुत संवेदनशील बनाता है। इसके अलावा, allosteric उत्प्रेरक (kinase-मृत आरएएफ उत्परिवर्ती) और रिसीवर (catalysis-सक्षम आरएएफ उत्परिवर्ती) इस परख में आसानी से अलग किया जा सकता है और dimerization संचालित transactivation की प्रक्रिया में आणविक घटनाओं की जांच के लिए शुद्ध 13.

जैसा कि हम ऊपर उल्लेख किया है, dimer आत्मीयता / स्थिरता एक महत्वपूर्ण कारक है कि आरएएफ परिवार kinases और उनके म्यूटेंट के समारोह को नियंत्रित करता है, और यह भी आरएएफ inhibitors के लिए उनकी संवेदनशीलता निर्धारित करता है13,14,15, 16,17,18,24. हालांकि, आरएएफ परिवार kinases और उनके सबसे रोग से संबंधित म्यूटेंट के dimer आत्मीयता / स्थिरता बहुत कम है। इस पैरामीटर को मापने के लिए, पारंपरिक जैव रसायन परख के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और उन्नत उपकरणों (जैसे SPR परख) को जटिल बनाने की आवश्यकता होती है, या शायद ही विश्वसनीय और पुन: उत्पादन योग्य डेटा (जैसे इम्यूनोप्रीप्शन परख) का उत्पादन होता है। इसके विपरीत, मानार्थ विभाजन luciferase परख एक सरल, संवेदनशील, सुसंगत, और RAF परिवार kinases और उनके म्यूटेंट15,21के रिश्तेदार dimer आत्मीयता को मापने के लिए लागत प्रभावी तरीका है 22,36. इस परख विभिन्न आरएएफ म्यूटेंट के बीच dimer आत्मीयता / स्थिरता के सूक्ष्म अंतर की जांच कर सकते हैं. जैसा कि हम15से पहले की सूचना दी, BRAF (V600E/AAE) एक बहुत कमजोर dimer आत्मीयता / इस परख का उपयोग करके, हम BRAF (V600E/AAE) की दुर्बल द्वि-स्थिति/स्थिरता को मोनोमेरिक BRAF (V600E/AAE/R509H) (चित्र3) से अलग कर सकते हैं।

संक्षेप में, व्यावहारिक और व्यावहारिक तरीकों का यह सेट सभी रोग से संबंधित आरएएफ म्यूटेंट को परिभाषित करने की आवश्यकताओं को पूरा कर सकता है, और इस तरह हमें विभिन्न आरएएफ उत्परिवर्ती-चालित रोगों के इलाज के लिए उपयुक्त रणनीतियों का चयन करने में मदद करता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनका कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

लेखकयुआन Jimin के समर्थन के लिए बालों सेल Leukemia फैलोशिप स्वीकार करना चाहते हैं. यह काम एशिया फंड कैंसर रिसर्च (AFCR2017/2019-JH), ड्यूक-NUS फू ब्रिज फंडिंग अवार्ड (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF ब्रिजिंग ग्रांट (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), एनसीसीआरएफ पायलट अनुदान (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), और एस.सी.एफ.आर.एफ. अनुसंधान अनुदान (AM/TP011/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

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कैंसर अनुसंधान अंक 149 आरएएफ परिवार kinases आरएएफ उत्परिवर्तन रास/आरएएफ/MEK/ERK संकेतन dimerization dimer आत्मीयता / स्थिरता उत्प्रेरक गतिविधि allosteric गतिविधि इन इन विट्रो kinase परख आरएएफ सह सक्रियण परख पूरक विभाजन luciferase परख कैंसर
व्यावहारिक और संभावित तरीकों का एक सेट का उपयोग करके आरएएफ परिवार Kinases के रोग से संबंधित उत्परिवर्ती विशेषता
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Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H.,… More

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

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