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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59795
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

Summary

Dans cet article, nous avons présenté un ensemble de méthodes pratiques et réalisables pour caractériser les mutants liés à la maladie des kinases de la famille raf, qui comprennent l'analyse in vitro de kinase, l'analyse de co-activation de RAF, et l'analyse de luciferase fractionnée complémentaire.

Abstract

Les kinases de la famille du fibrosarcome accéléré (RAF) jouent un rôle central dans la biologie cellulaire et leur dysfonctionnement conduit à des cancers et des troubles du développement. Une caractérisation des mutants de la RAF liés à la maladie nous aidera à choisir des stratégies thérapeutiques appropriées pour le traitement de ces maladies. Des études récentes ont montré que les kinases de la famille RAF ont à la fois des activités catalytiques et allostériques, qui sont étroitement réglementées par la dimerisation. Ici, nous avons construit un ensemble de méthodes pratiques et réalisables pour déterminer les activités catalytiques et allostériques et l'affinité relative dimer / stabilité des kinases de la famille RAF et de leurs mutants. Tout d'abord, nous avons modifié l'assay kinase in vitro classique en réduisant la concentration de détergent dans les tampons, en utilisant une procédure de lavage rapide doux, et en employant un glutathion S-transferase (GST) fusion pour empêcher les dissécages RAF de se dissocier pendant purification. Cela nous permet de mesurer l'activité catalytique des mutants de la RAF constitutivement actifs de manière appropriée. Deuxièmement, nous avons mis au point un nouvel essai de co-activation de la RAF pour évaluer l'activité allostérique des mutants de la RAF morts par la kinase en utilisant des protéines de la RAF tronquées n-terminales, éliminant ainsi l'exigence de Ras actif dans les protocoles actuels et réalisant ainsi une sensibilité. Enfin, nous avons généré un essai unique de luciferase fractionnée complémentaire pour mesurer quantitativement l'affinité relative dimère/stabilité de divers mutants de RAF, qui est plus fiable et sensible comparée à l'essai traditionnel de co-immunoprécipitation. En résumé, ces méthodes présentent les avantages suivants : (1) conviviale; (2) capable d'effectuer efficacement sans équipement de pointe; (3) rentable; (4) très sensible et reproductible.

Introduction

Les kinases de la famille RAF sont un composant clé de la cascade de signalisation RAS/RAF/MEK/ERK, qui transmet un signal de RAS pour activer la kinase protéine activée par mitogène (MEK)1,2,3,4. Cette famille de kinases joue un rôle crucial dans la croissance cellulaire, la survie et la différenciation, et leurs altérations induisent de nombreuses maladies, notamment le cancer5,6,7,8. Récemment, les séquençages génomiques ont identifié de nombreux mutants de la RAF liés à la maladie qui présentent des propriétés différentes dans la transmission du signal de la cascade RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Une caractérisation minutieuse des mutants de la RAF nous aidera à comprendre les mécanismes moléculaires de la façon dont les mutants de la RAF modifient la production de signaux de la cascade RAS/RAF/MEK/ERK, et éventuellement choisir des approches appropriées pour traiter diverses maladies mutantes de la RAF.

Les kinases de la famille RAF comprennent trois membres, CRAF, BRAF, et ARAF, qui ont des structures moléculaires similaires, mais différentes capacités pour activer la signalisation en aval1,2,3,4. Parmi ces paralogs, BRAF a la plus forte activité en raison de son Formatement phosphorylé NtA (N-terminal acidic) motif12,13,14, tandis que l'ARAF a le plus bas l'activité découlant de son motif APE non canonique15. Ceci peut expliquer les différentes fréquences de mutation des paralogs de RAF dans les maladies : BRAF-gt;CRAF-gt;ARAF. En outre, au sein du même paralog de la RAF, les mutations dans différents sites peuvent déclencher la signalisation en aval de manièredistincte, ce qui ajoute une autre couche de complexité à la régulation des kinases familiales de la RAF. Des études récentes ont démontré que toutes les kinases de la RAF ont à la fois des activités catalytiques et allostériques13,14,16,17,18. Les mutants de la RAF constitutivement actifs allument la signalisation en aval directement en phosphorylisant MEK, tandis que les mutants de la RAF morts par kinase peuvent transactiver leurs homologues de type sauvage par dimerisation d'un côté à l'autre et activer la signalisation MEK-ERK16 ,19,20. L'affinité/stabilité dimère est un paramètre clé qui détermine non seulement l'activité allostérique des mutants de la RAF morts en kinase, mais affecte également l'activité catalytique des mutants de la RAF constitutivement actifs15,21, 22. Les mutants de la RAF morts par la kinase avec une affinité/stabilité élevée de dimère peuvent transactiver les RAF endogènes de type sauvage directement15, tandis que ceux avec l'affinité/stabilité intermédiaire de dimer exigent une coordination de Ras actif ou d'un niveau élevé de molécules de type sauvage RAF pour fonctionner13,15,20,21,23. De même, les mutants de la RAF constitutivement actifs phosphoryent MEK d'une manière dimère-dépendante, et ceux avec l'affinité/stabilité faible dimère perdent leur activité catalytique in vitro sur l'immunoprécipitation qui casse les dimers faibles de RAF15,, 21,22. L'affinité/stabilité dimère détermine également la sensibilité des mutants de RAF à leurs inhibiteurs, et corrèle positivement à la résistance des inhibiteurs de RAF24. Par conséquent, pour caractériser les mutants de la RAF liés à la maladie, il est nécessaire de mesurer leurs activités catalytiques et allostériques, et l'affinité dimer / stabilité.

Ces dernières années, notre laboratoire et d'autres ont développé diverses méthodes pour caractériser les kinases de la famille RAF et leurs mutants. Selon notre laboratoire et l'expérience d'autres personnes, nous pensons que les trois essais suivants ont des avantages à définir les mutants de la RAF liés à la maladie : (1) l'analyse in vitro de la kinase qui peut être effectuée facilement pour détecter l'activité catalytique de la maladie mutants actifs de la RAF15; (2) l'analyse de co-activation de la RAF qui est une méthode fiable et pratique pour mesurer l'activité allostérique des mutants de la RAF kinase-morts13,15,21,22,23, 25; (3) l'analyse de luciferase fractionnée gratuite qui a une sensibilité beaucoup plus élevée dans la mesure de l'affinité relative dimer / stabilité des mutants DE la RAF en contraste avec l'analyse traditionnelle co-immunoprécipitation, et est capable d'effectuer sans équipement de pointe dans contraste avec les méthodes d'analyse quantitative s'ils sont telles que l'analyse SPR (Surface Plasmon Resonance)15,22. En combinant ces trois essais, nous pouvons comprendre facilement comment un mutant de la RAF lié à la maladie modifie la signalisation en aval et ainsi utiliser une stratégie thérapeutique appropriée pour traiter la maladie causée par cette mutation de la RAF.

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Protocol

1. In Vitro Kinase Assay for Measuring the Catalytic Activity of RAF Mutants

  1. Construire des vecteurs codant les mutants de la RAF (figure1A) avec l'étiquette FLAG (DYKDDDDDK) au terminus C en utilisant l'assemblage Gibson ou les méthodes traditionnelles de clonage moléculaire.
    1. Introduire l'étiquette FLAG et les mutations dans les séquences de codage RAF par PCR, puis insérer des séquences entières dans le vecteur pCDNA3.1 (MD) en utilisant l'assemblage Gibson ou la ligature d'ADN T4 et en suivant les protocoles de la manufacture. Utiliser les conditions suivantes pour les réactions de PCR : (1) 95 oC, 2 min; (2) 95 oC, 30 s; (3) 59 oC, 30 s; (4) 68 oC, 3 min; (5) 20 cycles de (2 à 4); (6) une cale de 4 oC.
      REMARQUE: Les amorces PCR pour le clonage: 5- AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 et 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCCTTA-3.
    2. Insérez la séquence de codage de la TPS en amont des séquences de codage mutantde de la RAF pour générer des vecteurs codant les mutants de la RAF fusionnés par la TPS en utilisant les mêmes méthodes que décrites à l'étape 1.1.1.
    3. Valider tous les vecteurs par séquençage de l'ADN avant la transfection.
  2. Plaque 293T cellules dans des plaques de 6 puits à une densité de 5 x 105 cellules/ bien un jour avant la transfection. Lorsque la densité cellulaire atteint 80 à 90 % de confluence le deuxième jour, transfect avec des vecteurs codant les kinases DE la RAF marquées par le FLAG ou leurs mutants à partir de l'étape 1.1 dans les cellules en suivant le protocole de fabrication des réactifs de transfection (Tableau des matériaux).
  3. Remplacer le milieu de culture 24 h après la transfection.
  4. Aspirer le milieu de culture 48 h après la transfection et ajouter 400 l/puits de tampon de lyse (25 mM Tris HCl, 150 mM NaCl, 1 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic (EDTA), 0.25% NP-40, pH 7.2) complété par des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase pour lyser les cellules sur la glace.
    REMARQUE: La concentration de NP-40 dans le tampon de lyse est critique pour détecter l'activité catalytique des mutants de RAF avec l'affinité/stabilité modérée de dimer in vitro. Une forte concentration de détergent ou un détergent solide dans le tampon de lyse peut briser les diures de la RAF et ainsi tuer l'activité catalytique des kinases de la RAF ou de leurs mutants.
  5. Transférer les lysates cellulaires dans un tube de 1,5 ml et faire tourner de 12 000 x g pendant 10 min à 4 oC pour épuiser les débris cellulaires.
  6. Transférer 300 L par échantillon de lysates de cellules entières propres à des tubes de 1,5 ml, ajouter 20 l par échantillon de perles d'affinité anti-FLAG et tourner dans une chambre froide (4 oC) pendant 1 h. Prenez également 40 L par échantillon de lysate de cellules entières propres de côté pour détecter l'expression et l'activité (phospho-ERK1/2) des mutants de la RAF par immunoblots comme décrit ci-dessous.
  7. Laver les perles anti-FLAG une fois avec le tampon de lyse, puis une fois avec le tampon de réaction kinase (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 m M Na3VO4, 0,5 mM DTT, pH 7,2), et ajouter 20 oL de mélange de réaction kinase (2 g de MEK1 (K97A) et 100 M ATP en 20 'L de kinase re tampon d'action) par échantillon.
    REMARQUE: Le lavage de perle doit être complété doucement et rapidement, le tampon résiduel doit être aspiré complètement avant d'ajouter le mélange de réaction de kinase, et toutes les opérations à cette étape devraient être effectuées à 4 oC dans une chambre froide.
  8. Incuber les réactions de kinase à température ambiante (25 oC) pendant 10 min, et retourner les tubes contenant des réactions de kinase avec les doigts toutes les deux minutes pendant l'incubation.
  9. Ajouter 5 ll de tampon d'échantillon SDS 5x (375 mM Tris HCl, 9% de sulfate de dodécyl de sodium (SDS), 50% de glycérol, 0,03% de broménol bleu) par échantillon pour arrêter les réactions de kinase, puis chauffer les échantillons à 90 oC pendant 5 min.
  10. Exécuter les échantillons dans 9 -12% polyacrylamide gel électrophoresis (PAGE) avec 0,1% SDS, transférer les protéines à la membrane de nitrocellulose, et de détecter les niveaux de phospho-MEK et RAF mutants dans les échantillons par immunoblots.
    REMARQUE: Le phospho-MEK peut également être quantifié en utilisant l'incorporation de P-ATP32. En bref, 10 'M'32P-ATP est ajouté au tampon de réaction kinase, et la quantité de MEK phosphorylé est ensuite quantifiée après la séparation de PAGE en utilisant l'autoradiographie standard, phosphorimaging, ou des techniques de comptage de scintillation liquide comme approprié.

2. Mise à la co-activation de la RAF pour évaluer l'activité allostérique des mutants de la RAF morts de Kinase

  1. Construire des vecteurs codant le récepteur RAF (domaine Kinase CRAF avec motif NtA non phosphoryltable, AAFF) ou les activateurs RAF kinase-morts (domaine kinase RAF avec motif NtA imité par phosphorylation, SSDD, DDEE ou DGEE) (Figure 1A) comme décrit à l'étape 1.1.
  2. Transfect 293T cellules avec deux vecteurs codant à la fois le récepteur RAF et l'activateur de la RAF kinase-mort ou un seul vecteur codant l'une des protéines telles que décrites dans les étapes 1.2 et 1.3.
  3. Remplacer le milieu de culture à 24 h après la transfection, et récolter 293T transfectants à 48 h pour préparer les lysates de la cellule entière comme décrit dans les étapes 1.4 et 1.5.
  4. Mélanger le lysate de cellules propres avec un tampon d'échantillon SDS de 5 x rapidement à température ambiante (25 oC) et faire bouillir à 90 oC pendant 5 min.
  5. Exécuter les échantillons de lysate de cellules entières bouillies dans 9-12% PAGE avec 0,1% SDS, transférer les protéines à la membrane de nitrocellulose, et de détecter les niveaux de phospho-ERK1/2 et contrôler les protéines par immunoblots.

3. Analyse de Luciferase fractionnée complémentaire pour mesurer l'affinité relative de Dimer/Stabilité des mutants de RAF

  1. Construire des vecteurs codant les mutants de la RAF marqués PAR LE FLAG fusionnés au terminus N de Nluc (N-terminus de luciferase luciferase, aa2-416) ou le terminus C de Cluc (terminus C de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase de luciferase, aa398-550) comme décrit à l'étape 1.1.
  2. Transfect 293T cellules avec une paire de vecteurs codant différents mutants Nluc-RAF et mutants Cluc-RAF comme décrit à l'étape 1.2.
  3. À 24 h après la transfection, replate293T transfectants cellulaires dans des plaques d'image noir Krystal à la densité cellulaire de 2x105 par puits avec milieu sans couleur (c.-à-d., DMEM sans phénol rouge).
  4. 24 h plus tard, ajouter la D-luciferine (0,2 mg/mL) aux transfectants cellulaires 293T, incuber pendant 30 min, et mesurer les signaux de luciferase à l'aide d'un système de détection multi (tableaudes matériaux).
  5. Après avoir mesuré les signaux de luciferase, aspirer le milieu et lyse retasses les transfectants 293T avec un tampon de lyse pour préparer les lysates de la cellule entière telles que décrites dans les étapes 1.4 et 1.5.
  6. Exécutez l'ensemble des échantillons de lysate cellulaire dans 9-12% PAGE avec 0,1% SDS et détecter les niveaux d'expression des mutants Nluc-RAF et Cluc-RAF mutants par immunoblot anti-FLAG tel que décrit à l'étape 2.5. Les niveaux d'expression relatifs des mutants DeLuc-RAF et des mutants de Cluc-RAF dans les transfectants 293T sont quantifiés en utilisant l'image J de leurs immunoblots.
  7. Normalisez les signaux de luciferase des transfectants de cellules 293T selon les niveaux d'expression des mutants De Nluc-RAF et des mutants de Cluc-RAF. En bref, ceci est réalisé en divisant le signal de luciferase brut par les niveaux d'expression relatifs des mutants de Nluc-RAF et des mutants de Cluc-RAF de l'étape 3.6.

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Representative Results

Les kinases de la famille RAF ont des activités catalytiques et allostériques, qui permettent à leurs mutants liés à la maladie d'allumer la signalisation en aval par différents mécanismes13,14,16,17 ,18. Les mutants de la RAF, qui sont constitutifs, phosphoryent directement leurs substrats, tandis que les mutants de la RAF morts par la kinase remplissent leur fonction en transactivant leurs homologues de type sauvage. Comme le montre la figure 1B, les deux mutants de la RAF constitutivement actifs (tels que les mutants de la colonne vertébrale réglementaire (R-épine) (BRAF(L505M), CRAF (DDEE/L397M), et ARAF (DGEE/L358M))13,23,25 , 26, BRAF (V600E), et BRAF (NVTAP)) et les mutants de la RAF morts par kinase (tels que la colonne vertébrale catalytique (épine C)-fusionné BRAF (NVTAP/V471F)15) active ERK lorsqu'il est exprimé dans les cellules 293T. Par conséquent, la capacité des mutants de la RAF d'activer la signalisation ERK dans les cellules ne peut pas servir de norme pour distinguer un mutant constitutivement actif d'un mutant mort de la kinase, bien que certains mutants morts par kinase avec une affinité/stabilité dimère modérée s'allument signalisation en aval uniquement avec la coopération de Ras actif. Trois méthodes que nous avons présentées ici peuvent nous aider à caractériser efficacement tous les mutants de la RAF liés à la maladie. Les propriétés biologiques de tous les mutants de la RAF révélées par l'utilisation de ces essais dans nos études précédentes ont été résumées dans le tableau 1.

La première méthode que nous pouvons utiliser pour distinguer les mutants de la RAF constitutivement actifs des mutants de la RAF morts par la kinase est l'analyse in vitro de la kinase. Dans cet arrêt, les mutants de la RAF ont été purifiés par l'immunoprécipitation et les réactions catalytiques ont été effectuées in vitro avec des MEK1(K97A) et de l'ATP comme substrats morts par la kinase. L'activité catalytique des mutants de RAFa été mesurée comme aL (A ctivation Loop)-phosphorylation de MEK1(K97A) dans les mélanges de réaction de kinase par immunoblot. Comme le montre la figure 1C, cet analyse peut effectivement sonder l'activité catalytique des mutants R-épines de BRAF, CRAF et ARAF13,15,23, BRAF (V600E)9, et BRAF (NVTAP)15, mais pas celle de la kinase-morte BRAF (V471F / NVTAP)15 qui a une voix C-spine. Cependant, l'activité catalytique des mutants de la RAF constitutivement actifs avec une faible affinité/stabilité dimère comme le mutant ARAF R-spine (ARAF(DGEE/L358M)) (Figure1C, voie 4), les mutants cRAF et ARAF avec interface dimère altérée (CRAF(DDEE/ L397M/R401H), ARAF (DGEE/L358M/APE/R362H))15,22 (Figure 1D,E) pourrait ne pas être sondé en utilisant cet exemple, puisque leurs dissipeurs ont été brisés pendant la purification, en particulier lorsque la purification a été avec des tampons contenant des détergents forts ou à forte concentration. Pour éviter la perte de l'activité catalytique des mutants de la RAF avec une faible affinité/stabilité du dimère, nous avons généralement fusionné ces mutants avec la TPS (glutathione S-transferase), une protéine dimérique avec une forte affinité/stabilité avant effectuer des analyses de kinase in vitro, qui peuvent sauver l'activité catalytique de ces mutants de la RAF15,22 (Figure 1E). En général, la plupart des mutants de la RAF pourraient être classés comme mutants constitutivement actifs ou morts par la kinase en utilisant cet exemple.

La deuxième méthode que nous avons décrite ici est l'analyse de co-activation de la RAF qui peut être utilisée pour évaluer l'activité allostérique des mutants de la RAF morts par la kinase13,15,21,22,23 , 25. Bien que quelques mutants de la RAF morts par kinase avec une affinité/stabilité très élevée de dimère comme BRAF (V471F/NVTAP)15, peuvent activer directement les molécules endogènes de raf lorsqu'elles sont exprimées dans les cellules (Figure 1B, lane 7), la plupart les mutants de la RAF morts en kinase ont besoin de la coopération de Ras actifs pour transactiver les RAF de type sauvage. Cependant, Ras actif est un activateur direct de la signalisation ERK, dont l'introduction augmentera le niveau basal de l'ERK actif. Pour éviter l'interférence de Ras actif, nous avons utilisé des mutants de la RAF tronqués par N-terminus dans cet essai (Figure 2A). Comme le montre la figure 2B, les mutants morts par la kinase du BRAF, CRAF, et RAF avec motif ntA acide et fusion C-spine (BRAF(V471F, aa431-766), CRAF (DDEE/V363F, aa323-648), et ARAF (DGEE/V324F, aa284-606)) ont fonctionné comme activateurs allostériques déclencher l'activité catalytique de CRAF avec le motif NtA non phosphorylatable (récepteur cRAF, CRAF (AAFF, aa323-648)) lorsqu'il est co-exprimé dans les cellules 293T. En revanche, le mutant BRAF mort par la kinase (V471F/NVTAP, aa431-766) qui ont une affinité/stabilité très élevée de dimère (voir ci-dessous) a activé la signalisation ERK en déclenchant des RAF endogènes, même sans la co-expression du récepteur CRAF. Dans l'ensemble, cet analyse peut être utilisé pour évaluer la capacité de transactivation de tous les mutants de la RAF morts par la kinase.

La dimerisation des kinases de la famille RAF régule non seulement leur capacité à activer la signalisation MEK-ERK en aval, mais détermine également leur sensibilité aux inhibiteurs de la RAF15 Annonces,16 Annonces,20 Ans, états-unis,22 Ans,24 Ans, états-unis,27 Annonces,28 Annonces,29 Ans et plus,30 Ans, états-unis (,31 Ans, états-unis (,32 Ans, états-unis (. Contrairement à d'autres interactions protéines-protéines entre cette voie33 Ans, états-unis (,34 Ans, états-unis (,35 Annonces, la dimerisation des kinases de la famille de la RAF et de leurs mutants est relativement faible et difficile à évaluer en utilisant des tests de biochimie traditionnels tels que la co-immunoprécipitation. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment développé un analyse de luciferase fractionnée gratuite pour mesurer l'affinité relative de dimère/stabilité des kinases de famille de RAF et de leurs mutants15 Annonces,22 Ans,36 Annonces. Comme le montre leFigure 3un, les domaines kinase de la RAF (aa431-766 pour BRAF, aa323-648 pour le CRAF et aa284-606 pour l'ARAF) ont été fusionnés respectivement avec N-terminus (aa2-416) ou C-terminus (aa398-550) de luciferase luciferase luciferase (Nluc et Cluc), qui seront réunis pour s'assembler intacts luciferase sur la dimerisation raf. L'activité de la luciferase dans cet analyse est directement corrélée avec la quantité de dimers RAF. Cet analyse est très sensible et peut détecter même une dimerisation très faible des mutants de la RAF. Comme nous l'avons signalé précédemment15 Annonces, l'oncogène BRAF (V600E) fonctionne comme un dimère, et seulement une mutation composée avec la mutation Arg-to-His (R509H) dans l'interface dimère et l'altération non canonique APE (P622A dans le motif APE) peut complètement abolir sa dimerisation et ainsi bloquer son catalytique activité active (Figure 3B). En utilisant l'épissage in vitro de kinase, nous avons en outre constaté que la variante braF (V600E) avec le motif modifié d'APE, BRAF (V600E/AAE), mais pas cela avec la mutation d'Arg-to-His dans l'interface de dimer, BRAF (V600E/R509H), a perdu son activité catalytique sur la purification (Figure 3C), suggérant que la première variante a beaucoup moins d'affinité/stabilité que la seconde. Pour mesurer directement la propension de ces variantes BRAF (V600E) à former des dissipateurs, nous avons effectué un analyse de luciferase fractionnée gratuite, et confirmé que ces variantes avaient une affinité/stabilité dimer tout à fait différente avec BRAF (V600E) plus élevé que BRAF (V600E/ R509H) que BRAF (V600E/AAE) que BRAF (V600E/R509H/AAE) (Figure 3D). Le signal de luciférase produit par le BRAF monomeric (V600E/R509H/AAE) était comparable à celui du contrôle 293T non transfecté (Figure 3D, voie de panneau gauche 5), indiquant que cet analyse a un fond très bas. Pour déterminer davantage l'efficacité de l'analyse de luciferase fractionnée complémentaire, nous avons ensuite mesuré en utilisant cet analyse l'affinité relative dimer/stabilité d'un groupe de mutants BRAF oncogènes avec des suppressions dans le cadre de la boucle de '3- 'C qui a été identifiée par nous et d'autres Groupes15 Annonces,37 Ans, états-unis (,38 Annonces. Comme nous l'avons su, bien que tous ces mutants aient activé la signalisation ERK lorsqu'ils sont exprimés dans des cellules 293T (Figure 3E), ils présentaient une activité catalytique tout à fait différentielle in vitro (Figure 3F). Les BRAF (MLN(aa484-486 del)) et BRAF (NVTAP(aa486-490 del)) étaient très actifs lors de la purification par immunoprecipitaion, considérant que le BRAF (NVTAPT(aa486-491 del)) et le BRAF (Aa496-497 del)) ont perdu leur activité catalytique dans la même condition pourrait être sauvé par la fusion de la TPS. En outre, la version kinase-morte de BRAF(NVTAP), BRAF (V471F/NVTAP) a montré une forte puissance pour activer les RAF endogènes lorsqu'ils sont exprimés dans les cellules (Figure 1Bvoie 7). Ces données suggèrent que ce groupe de mutants BRAF ont une affinité/stabilité dimer très différente avec BRAF (NVTAP) plus élevé que BRAF (MLN) que BRAF (NVTAPT) et BRAF(QA). En effet, le résultat de l'assouviement gratuit de la luciferase fractionnée a complètement soutenu notre inférence (Figure 3gr). Prises ensemble, nos données indiquent que l'analyse de luciferase fractionnée gratuite est une méthode fiable pour mesurer l'affinité relative dimer/stabilité des mutants de la RAF.

Figure 1
Figure 1 : Sonde l'activité catalytique des mutants de la RAF en utilisant l'in vitro kinase assay. (A) Un diagramme schématique pour les mutations de la RAF utilisé dans cette étude. (B) Les mutants de la RAF, actifs et kinase-morts, peuvent activer la signalisation ERK lorsqu'ils sont exprimés dans les cellules. Les cellules 293T ont été transfectées avec des vecteurs qui codent différents mutants de RAF, et l'activité d'ERK a été détectée par l'immunoblot anti-phospho-ERK1/2. (C) Mutants de la RAF constitutivement actifs avec une faible affinité/stabilité du dimère ainsi que des mutants de la RAF morts par la kinase ne peuvent pas phosphoryler MEK in vitro lors de la purification par immunoprécipitation. Les mutants de la RAF en B ont été purifiés en utilisant des perles anti-FLAG, et leur activité catalytique a été sondée en utilisant des in vitro kinase comme décrit dans le protocole. (D-E) L'activité catalytique in vitro des mutants de la RAF constitutivement actifs avec une faible affinité/stabilité de dimère peut être sauvée par la fusion de TPS. (D) Les mutants de la RAF constitutivement actifs et leurs homologues munis de tPS ont été exprimés dans des cellules 293T et leur activité a été mesurée par l'immunoblot anti-phospho-ERK1/2. (E) Les mutants de la RAF en D ont été purifiés par l'immunoprécipitation, et leur activité catalytique in vitro a été sondée en utilisant l'assiduité in vitro de kinase comme décrit dans le protocole. Mutants de la Colonne R de la RAF : BRAF(L505M), CRAF (DDEE/L397M) et ARAF (DGEE/L358M). « NVTAP » représente pour la suppression de aa486-490 dans BRAF. La mutation APE de l'ARAF signifie A475P qui génère un motif aPE canonique dans aRAF. "KD" représente pour "domaine kinase" dans le texte intégral. BRAF(KD) signifie le fragment aa431-766 de BRAF, tandis que CRAF(KD) et ARAF(KD) représentent respectivement pour le fragment aa323-648 de CRAF et le fragment aa284-606 de l'ARAF. Les résultats de ce chiffre ont été rapportés précédemment15,22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Évaluer la capacité des mutants de la RAF à transactiver les RAF de type sauvage en utilisant l'évaluation de co-activation de la RAF. (A) Un diagramme illustrant l'analyse de co-activation de la RAF. (B) Les mutants de la RAF morts par la kinase avec le motif acide de NtA ont été co-exprimés avec le récepteur CRAF catalysis-compétent dans les cellules 293T, et l'activité d'ERK1/2 dans les transfectants 293T a été mesurée par l'immunoblot anti-phosho-ERK1/2. La plupart des mutants de la RAF morts par la kinase, à l'exception de BRAF (V471F/NVTAP) qui a une affinité/stabilité très élevée de dimère ont exigé la co-expression du récepteur exogène de RAF pour allumer la signalisation d'ERK. Les résultats de ce chiffre ont été rapportés précédemment15,22. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Mesurer l'affinité relative dimère /stabilité des mutants de la RAF en utilisant l'analyse de luciferase fractionnéegratuite. (A) Un diagramme illustrant l'analyse de luciferase fractionnée gratuite. (B-D) La dimerisation des variantes BRAF(V600E) est nécessaire pour leur activité catalytique in vivo et in vitro. (B) La variante monomeric BRAF(V600E), BRAF(V600E/R509H/AAE) n'a pas d'activité catalytique in vivo, qui peut être récupérée par fusion de TPS. Les variantes braF(V600E) et leurs homologues munis de TPS ont été exprimées dans des cellules 293T, et leur activité a été mesurée par anti-phospho-ERK1/2. (C) La variante BRAF (V600E) à faible affinité/stabilité du dimère, BRAF (V600E/AAE) a perdu son activité catalytique in vitro lors de la purification, qui peut être sauvée par la fusion de la TPS. Les variantes BRAF (V600E) de B ont été purifiées par immunoprécipitation et leur activité catalytique a été sondée par l'assay in vitro de kinase comme décrit dans le protocole. (D) L'affinité/stabilité relative de dimer des variantes de BRAF (V600E) a été mesurée en utilisant l'analyse de luciferase fractionnée complémentaire comme décrit dans le protocole. (E-G) Les mutants BRAF avec suppression dans le cadre de la boucle de 3 c fonctionnent comme des diétrages pour activer la signalisation ERK. (E) Les mutants BRAF avec suppression dans le cadre de la boucle de 3 c activent la signalisation ERK lorsqu'ils sont exprimés dans les cellules. Les mutants BRAF ont été exprimés dans les cellules 293T et leur activité a été mesurée comme décrit dans B. (F) Les mutants BRAF ayant une faible affinité/stabilité de E ont perdu leur activité catalytique in vitro, qui peut être sauvée par la fusion de la TPS. L'activité catalytique in vitro des mutants BRAF et de leurs homologues de La TPS de E a été mesurée comme en C. (G) les mutants BRAF avec suppression dans le cadre de la boucle de 3 -C ont une affinité/stabilité dimer tout à fait différente. L'affinité/stabilité relative de dimère des mutants BRAF avec la suppression dans le cadre de la boucle de 3 c a été mesurée comme dans D. Les barres d'erreur dans le D et G représentent s.d. pour montrer la variance entre les expériences indépendantes (n ' 4). La mutation AAE de BRAF signifie P622A dans le motif APE qui génère un motif APE non canonique. « MLN », « NVTAPT » et « QA » représentent respectivement les suppressions d'aa484-486, aa486-491, aa496-497 dans la boucle de BRAF. Certains résultats dans ce chiffre ont été rapportés précédemment15. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Table 1
Tableau 1 : La propriété biologique de divers mutants de la RAF. L'activité catalytique, l'activité allostérique et l'affinité/stabilité relative de dimère de tous les mutants de RAF utilisés dans cette étude ont été résumées dans ce tableau. "Y" signifie "Oui", tandis que "N" signifie "Non". « N»indique que ces mutants ont une activité catalytique s'ils sont fusionnés avec la TPS. « , » « ô », « ô », « ô », « ô », « » et « - » représentent respectivement « très fort », « fort », « intermédiaire », « faible » et « aucun ».

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Discussion

Dans cet article, nous avons présenté trois méthodes pour caractériser les mutants de la RAF liés à la maladie, qui incluent l'analyse in vitro de kinase, l'analyse de co-activation de RAF, et l'analyse fractionnée gratuite de luciferase. Puisque les kinases de RAF ont l'activité catalytique et l'activité allosteric, divers mutants de RAF peuvent activer la signalisation en aval par deux mécanismes distincts13,14,16,17, 18. Les mutants de la RAF constitutivement actifs phosphoryent directement l'effecteur en aval MEK, tandis que les mutants de la RAF morts par la kinase déclenchent la signalisation en aval en transactivant leurs homologues de type sauvage. Cependant, les mutants de la RAF constitutivement actifs et kinase-morts exigent la dimerisation pour remplir leur fonction15,16,17,19,20, et le dimer la propension des mutants de la RAF détermine non seulement l'activité catalytique ou allostérique des mutants de la RAF, mais aussi leur sensibilité aux inhibiteurs de la RAF15,24. L'analyse in vitro de kinase, l'analyse de co-activation de RAF, et l'analyse fractionnée gratuite de luciferase nous fournissent un ensemble de méthodes simples, efficaces et fiables pour distinguer les mutants constitutivement actifs des mutants kinase-morts aussi bien qu'évaluer leur capacité d'activer la signalisation en aval.

L'analyse in vitro de kinase est une méthode classique pour détecter l'activité catalytique des kinases protéiques. Pour adopter cette méthode pour mesurer l'activité catalytique des mutants de la RAF, nous avons fait quelques révisions significatives dans les réactifs et les procédures15,21,22. Puisque les kinases de famille de RAF fonctionnent comme doudure pour phosphorylate rincer leur substrat, MEK, et leur affinité/stabilité dimère est relativement basse, nous avons réduit la concentration de détergent NP-40 de 1% à 0.25% dans des tampons pour purifier des protéines de RAF afin de empêcher RAF dimers de la dissociation. Dans le même ordre d'idées, nous avons également utilisé une procédure de lavage rapide doux pour la purification des protéines RAF. Ces changements sont essentiels pour détecter l'activité catalytique des mutants de la RAF constitutivement actifs avec une affinité/stabilité très faible, qui pourrait être identifiée comme mutants de la RAF « morts-kinases » par l'analyse classique de la kinase in vitro. En outre, nous avons démontré que la fusion de la TPS est une bonne alternative pour empêcher les dissocieurs de la RAF de se dissocier pendant la purification dans cet exemple15,21,22. Quant aux mutants de la RAF morts par la kinase, même s'ils sont fusionnés avec la TPS, ils ne présentent aucune activité catalytique dans cet état d'œil.

L'analyse de co-activation de la RAF a été développée par nous pour évaluer la capacité des mutants de la RAF morts par kinase à transactiver leurs homologues de type sauvage13,15,21,22,23 , 25. Dans ce nouveau essai, nous utilisons les protéines tronquées n.terminus de la RAF et n'avons donc pas besoin de la coexpression des mutants RAS actifs ou de l'activation du RAS, ce qui rend cet essai très sensible. En outre, l'activateur allostérique (mutant de la RAF mort de la famille) et le récepteur (mutant RAF compétent en catalyse) dans cet analyse peuvent être facilement isolés et purifiés pour étudier les événements moléculaires dans le processus de transactivation dimerisation-conduite 13.

Comme nous l'avons mentionné ci-dessus, l'affinité dimère / stabilité est un facteur clé qui régule la fonction des kinases de la famille RAF et leurs mutants, et détermine également leur sensibilité aux inhibiteurs de la RAF13,14,15, 16,17,18,24. Cependant, l'affinité/stabilité dimère des kinases de la famille de la RAF et de leurs mutants les plus malades est très faible. Pour mesurer ce paramètre, les essais traditionnels de biochimie nécessitent des procédures expérimentales compliquées et des équipements de pointe (tels que l'analyse SPR), ou ne produisent guère de données fiables et reproductibles (comme l'analyse de l'immunoprécipitation). En revanche, l'analyse de luciferase fractionnée gratuite est une méthode simple, sensible, cohérente, et rentable pour mesurer l'affinité relative de dimère/stabilité des kinases de famille de RAF et de leurs mutants15,21, 22,36. Cet analyse peut sonder la différence subtile d'affinité/stabilité dimer parmi divers mutants de RAF. Comme nous l'avons signalé avant15, BRAF (V600E /AAE) a une affinité dimère très faible / stabilité et ses disolrons seront complètement brisés lors de la purification, même si l'utilisation d'une procédure très douce. En utilisant cet analyse, nous pouvons distinguer la faible affinité/stabilité de BRAF(V600E/AAE) de celle du BRAF monomeric (V600E/AAE/R509H) (figure3).

En résumé, cet ensemble de méthodes pratiques et réalisables peut répondre aux exigences de la définition de tous les mutants de la RAF liés à la maladie, et ainsi nous aider à choisir des stratégies appropriées pour le traitement de diverses maladies de la RAF à l'aide de mutants.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Les auteurs aimeraient reconnaître la bourse hairy Cell Leukemia Fellowship pour le soutien de Yuan Jimin. Ce travail a été soutenu par Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), and SHF Academic Medicine Subvention de recherche (AM/TP011/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

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References

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Caractériser les mutants liés à la maladie des kinases familiales de la RAF en utilisant un ensemble de méthodes pratiques et réalisables
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Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

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