Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Karakterisere sykdom-relaterte mutanter av RAF familie kinaser ved hjelp av et sett av praktiske og gjennomførbare metoder

Published: July 17, 2019 doi: 10.3791/59795
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1,2
1The Laboratory of Cancer Signaling, Division of Cellular and Molecular Research, National Cancer Centre Singapore, 2The Cancer and Stem Cell Program, Duke-NUS Medical School

Summary

I denne artikkelen har vi presentert et sett av praktiske og gjennomførbare metoder for karakteriserer sykdom-relaterte mutanter av RAF familien kinaser, som inkluderer in vitro kinase analysen, RAF co-aktivering analysen, og komplementære Split luciferase analysen.

Abstract

Den raskt akselererte fibrosarcoma (RAF)-familien kinaser spille en sentral rolle i cellebiologi og deres dysfunksjon fører til kreft og utviklingsforstyrrelser. En karakterisering av sykdom-relaterte RAF mutanter vil hjelpe oss å velge passende terapeutiske strategier for behandling av disse sykdommene. Nyere studier har vist at RAF-familien kinaser har både katalysator og nukleosid aktiviteter, som er strengt regulert av dimerization. Her konstruerte vi et sett med praktiske og gjennomførbare metoder for å fastslå katalysatoren og nukleosid aktiviteter og den relative dimer affinitet/stabiliteten til RAF-familiens kinaser og mutanter. For det første har vi endret den klassiske in vitro kinase analysen ved å redusere vaskemiddel konsentrasjonen i buffere, utnytte en mild rask vask prosedyre, og ansette en glutation S-glutamyltransferase (GST) fusjon for å hindre RAF dimers fra dissociating under Rensing. Dette gjør det mulig for oss å måle katalysator for constitutively aktive RAF mutanter hensiktsmessig. Dernest har vi utviklet en roman RAF co-aktivering analysen for å evaluere nukleosid aktivitet av kinase RAF mutanter ved hjelp av N-Terminal avkortet RAF proteiner, eliminerer kravet om aktiv RAS i gjeldende protokoller og dermed oppnå en høyere Følsomhet. Til slutt genererte vi en unik komplementær splitt luciferase analysen til kvantitativt måle den relative dimer affinitet/stabilitet av ulike RAF mutanter, som er mer pålitelig og følsom i forhold til den tradisjonelle co-immunutfelling analysen. Oppsummert har disse metodene følgende fordeler: (1) bruker-vennlig; (2) i stand til å utføre effektivt uten avansert utstyr; (3) kostnadseffektiv; (4) svært følsom og reproduserbar.

Introduction

RAF-familien kinaser er en nøkkelkomponent i RAS/RAF/MEK/erk signalering Cascade, som sender et signal fra RAS for å aktivere mitogen-aktivert protein kinase (MEK)1,2,3,4. Denne familien av kinaser spiller en avgjørende rolle i cellevekst, overlevelse og differensiering, og deres forandringer induserer mange sykdommer, spesielt kreft5,6,7,8. Nylig har genomisk sequencings identifisert mange sykdom-relaterte RAF mutanter som viser ulike egenskaper i signaloverføring av RAS/RAF/MEK/erk Cascade9,10,11. En forsiktig karakterisering av RAF mutanter vil hjelpe oss å forstå den molekylære mekanismer for hvordan RAF mutanter endre signalet utgang av RAS/RAF/MEK/ERK Cascade, til slutt velge hensiktsmessige tilnærminger for behandling av ulike RAF mutant-drevne sykdommer.

RAF-familien kinaser inkluderer tre medlemmer, håndve, BRAF, og ARAF, som har lignende molekylære strukturer, men ulike evner til å aktivere nedstrøms signalering1,2,3,4. Blant disse paralogs har BRAF den høyeste aktiviteten i kraft av sin constitutively fosforylert NtA (N-terminalnummer acidic) motiv12,13,14, mens ARAF har lavest aktivitet som følge av sin ikke-kanoniske APE motiv15. Dette kan forklare de ulike mutasjon frekvensene av RAF paralogs i sykdommer: BRAF > HÅNDVE > ARAF. Videre, innenfor samme RAF paralog, mutasjoner i ulike områder kan utløse nedstrøms signalering i distinkte manerer, som legger et lag av kompleksitet til regulering av RAF familie kinaser. Nyere studier har vist at alle RAF kinaser har både katalysator og nukleosid aktiviteter13, 14,16,17,18. Constitutively aktive RAF mutanter slå på nedstrøms signalering direkte av phosphorylating MEK, mens kinase-Dead RAF mutanter kan transactivate sine ville-type kolleger gjennom side-til-side dimerization og aktivere MEK-ERK signalering16 ,19,20. Dimer affinitet/stabilitet er en nøkkel parameter som ikke bare fastsetter den nukleosid aktiviteten til kinase-Dead RAF mutanter, men også påvirker katalysatoren for constitutively Active RAF mutanter15,21, 22. The kinase-Dead RAF mutanter med høy dimer affinitet/stabilitet kan transactivate den endogene vill-type RAFs direkte15, mens de med mellomliggende dimer affinitet/stabilitet krever en koordinering av aktiv RAS eller en forhøyet nivå av vill-type RAF molekyler til å fungere13,15,20,21,23. Tilsvarende constitutively aktive RAF mutanter phosphorylate MEK på en dimer-avhengig måte, og de med lav dimer affinitet/stabilitet mister sin katalysatorer aktivitet in vitro på immunutfelling som bryter den svake RAF dimers15, 21,22. Dimer affinitet/stabilitet bestemmer også følsomheten til RAF mutanter til sine hemmere, og positivt relaterer til motstanden av RAF hemmere24. Derfor, for å karakterisere sykdoms relaterte RAF mutanter, er det nødvendig å måle sine katalysatorer og nukleosid aktiviteter, og dimer affinitet/stabilitet.

I de senere årene har vårt laboratorium og andre utviklet ulike metoder for å karakterisere RAF-familiens kinaser og mutanter. Ifølge vårt laboratorium og andres erfaring, tror vi at følgende tre analysene har fordeler i å definere sykdoms relaterte RAF mutanter: (1) in vitro kinase analysen som kan utføres med letthet for å oppdage katalysatoren aktivitet av constitutively aktiv RAF mutanter15; (2) RAF co-aktivisering analysen som er en pålitelig og praktisk metode for å måle nukleosid aktivitet av kinase-Dead RAF mutanter13,15,21,22,23, fra 25; (3) gratis Split luciferase analysen som har mye høyere følsomhet i å måle den relative dimer affinitet/stabilitet av RAF mutanter i motsetning til den tradisjonelle co-immunutfelling analysen, og er i stand til å gjennomføre uten avansert utstyr i kontrast til kvantitative analytiske metoder som spr (SUrface Plasmon Resonance) analyse15,22. Ved å kombinere disse tre analysene kan vi lett forstå hvordan en sykdom-relatert RAF-mutant endrer nedstrøms signalene og dermed benytter en hensiktsmessig terapeutisk strategi for å behandle sykdommen forårsaket av denne RAF-mutasjonen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. in vitro kinase analysen for måling av katalysator for RAF mutanter

  1. Konstruere vektorer koding RAF mutanter (figur 1A) med Flag (DYKDDDDK) tag på C-Terminus ved hjelp Gibson Assembly eller tradisjonelle molekylære kloning metoder.
    1. Introduser FLAGGET Tag og mutasjoner i RAF koding sekvenser av PCRene, og deretter sette inn hele sekvenser i pCDNA 3.1 (+) vektor ved hjelp av Gibson forsamlingen eller T4 DNA ligation og følge produsentens protokoller. Bruk følgende betingelser for PCR-reaksjoner: (1) 95 ° c, 2 min; (2) 95 ° c, 30 s; (3) 59 ° c, 30 s; (4) 68 ° c, 3 min; (5) 20 sykluser av (2 til 4); (6) 4 ° c hold.
      Merk: PCR-primere for kloning: 5-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 og 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3.
    2. Sett inn GST koding sekvensen oppstrøms av RAF mutant koding sekvenser for å generere vektorer koding GST-smeltet RAF mutanter ved å bruke samme metoder som beskrevet i trinn 1.1.1.
    3. Valider alle vektorer av DNA sequencings før transfeksjoner.
  2. Plate 293T celler i 6-brønn plater ved en tetthet på 5 x 105 celler/godt en dag før transfeksjoner. Når celle tettheten når 80 ~ 90% samløpet på den andre dagen, transfect med vektorer koding FLAG-Tagged RAF kinaser eller deres mutanter fra trinn 1,1 i celler ved å følge fremstillingen protokoll av transfeksjoner reagenser (tabell av materialer).
  3. Erstatt kulturen medium 24 h etter transfeksjoner.
  4. Aspirer kulturen medium 48 h etter transfeksjoner og tilsett 400 μL/brønn av lyseringsbuffer (25 mM Tris · HCl, 150 mM NaCl, 1 mM ethylenediaminetetraacetic yre (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) supplert med protease og fosfatase hemmere til lyse celler på isen.
    Merk: Konsentrasjonen av NP-40 i lyseringsbuffer er kritisk for påvisning av katalysator for en mutanter i RAF med moderat dimer affinitet/stabilitet in vitro. En høy konsentrasjon av vaskemiddel eller et sterkt vaskemiddel i lyseringsbuffer kan bryte RAF-dimers og dermed drepe katalysator for RAF-kinaser eller mutanter.
  5. Overfør celle lysater til et 1,5 mL rør, og snurr ned med 12 000 x g i 10 min ved 4 ° c for å tømme celle rusk.
  6. Overfør 300 μL per prøve av ren hel celle lysater til 1,5 mL rør, tilsett 20 μL per prøve av anti-FLAG affinitet perler, og roter i et kaldt rom (4 ° c) for 1 t. Også ta 40 μL per prøve av ren hele cellen lysat til side for å oppdage uttrykk og aktivitet (fosfat-ERK1/2) av RAF mutanter av immunoblots som beskrevet nedenfor.
  7. Vask anti-FLAG-perlene én gang med lyseringsbuffer, deretter én gang med kinase reaksjonsbuffer (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mm na3VO4, 0,5 mm DTT, pH 7,2), og tilsett 20 μL av KINASE reaksjons blanding (2 μg MEK1 (K97A) og 100 μM-ATP i 20 μL av kinase re handling buffer) per prøve.
    Merk: Perle vask bør gjennomføres forsiktig og raskt, bør den resterende buffer være pustende helt før du legger kinase reaksjons blanding, og alle operasjoner på dette trinnet skal utføres ved 4 ° c i et kaldt rom.
  8. Ruge de kinase reaksjonene ved romtemperatur (25 ° c) i 10 min, og Vend rørene som inneholder kinase reaksjoner med fingrene hvert andre minutt under inkubasjons.
  9. Tilsett 5 μL 5x prøve buffer (375 mM Tris · HCl, 9% natrium natriumdodecylsulfat sulfat (SDS), 50% glyserol, 0,03% Bromophenol blå) per prøve for å stoppe kinase reaksjoner, og deretter varme prøvene ved 90 ° c i 5 min.
  10. Kjøre prøvene i 9 ~ 12% polyakrylamid gel elektroforese (side) med 0,1% SDS, overføre proteiner til nitrocellulose membran, og oppdage nivåene av fosfat-MEK og RAF mutanter i prøver av immunoblots.
    Merk: Den fosfat-MEK kan også bli kvantifisert ved hjelp γ32P-ATP innlemmelse. Kort, 10 μM γ32P-ATP legges til kinase reaksjonsbuffer, og mengden av fosforylert MEK er deretter KVANTIFISERT etter side separasjon ved hjelp av standard autoradiografi, phosphorimaging, eller flytende scintillation telling teknikker som Riktig.

2. RAF co-aktivering analysen for evaluering av nukleosid aktivitet av kinase-Dead RAF mutanter

  1. Konstruere vektorer koding av RAF-mottaker (HÅNDVE kinase domene med unphosphorylatable NtA motiv, AAFF) eller kinase RAF aktivator (RAF kinase domene med fosforylering-etterlignet NtA motiv, SSDD, DDEE eller DGEE) (figur 1A) som beskrevet i trinn 1,1.
  2. Transfect 293T celler med to vektorer koding både RAF mottaker og kinase RAF Aktivator eller en enkelt vektor koding en av proteiner som beskrevet i trinn 1,2 og 1,3.
  3. Erstatt kultur medium ved 24 h etter transfeksjoner, og høste 293T transfectants på 48 h for å forberede hele cellen lysater som beskrevet i trinn 1,4 og 1,5.
  4. Bland den rene hele celle lysat med 5x SDS prøve buffer raskt ved romtemperatur (25 ° c) og kok deretter ved 90 ° c i 5 min.
  5. Kjør kokt hele cellen lysat prøver i 9 ~ 12% side med 0,1% SDS, overføre proteiner til nitrocellulose membran, og oppdage nivåene av fosfat-ERK1/2 og kontroll proteiner ved immunoblots.

3. gratis Split luciferase analysen for å måle den relative dimer affinitet/stabilitet av RAF mutanter

  1. Konstruere vektorer koding FLAG-Tagged RAF mutanter smeltet til N-Terminus av Nluc (N-Terminus av Firefly luciferase, Aa2-416) eller C-Terminus av Cluc (C-Terminus av Firefly luciferase, aa398-550) som beskrevet i trinn 1,1.
  2. Transfect 293T celler med et par av vektorer koding ulike Nluc-RAF mutanter og Cluc-RAF mutanter som beskrevet i trinn 1,2.
  3. Ved 24 h etter transfeksjoner, replate 293T celle transfectants inn Krystal sorte bilde plater ved celle tettheten av 2x105 per brønn med farge-fri medium (dvs. DMEM uten fenol rød).
  4. 24 h senere, tilsett D-luciferin (0,2 mg/mL) til 293T celle transfectants, ruge i 30 min, og måle luciferase signalene ved hjelp av et multi Detection System (tabell av materialer).
  5. Etter å ha målt luciferase signalene, aspirer du mediet og lyse 293T transfectants med lyseringsbuffer for å klargjøre hele celle lysater som beskrevet i trinn 1,4 og 1,5.
  6. Kjør hele cellen lysat prøvene i 9 ~ 12% side med 0,1% SDS og oppdage uttrykket nivåer av Nluc-RAF mutanter og Cluc-RAF mutanter av anti-flagg immunoblot som beskrevet i trinn 2,5. Det relative uttrykket nivåer av både Nluc-RAF mutant og Cluc-RAF mutant i 293T transfectants er kvantifisert ved hjelp av bilde J fra deres immunoblots.
  7. Normalisere luciferase signalene av 293T celle transfectants i henhold til uttrykket nivåer av Nluc-RAF mutanter og Cluc-RAF mutanter. Kort, dette oppnås ved å dele den rå luciferase signal av den relative uttrykk nivåer av Nluc-RAF mutanter og Cluc-RAF mutanter fra trinn 3,6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

RAF-familien kinaser har både katalysator og nukleosid aktiviteter, som gjør at deres sykdom-relaterte mutanter å slå på nedstrøms signalering gjennom ulike mekanismer13,14,16,17 ,18. Den constitutively aktive RAF mutanter direkte phosphorylate sine underlag, mens kinase-Dead RAF mutanter oppfylle sin funksjon gjennom transactivating vill-type kolleger. Som vist i figur 1B, både constitutively Active RAF mutanter (for eksempel regulatoriske ryggraden (R-rygg) mutanter (BRAF (L505M), håndve (DDEE/L397M), og ARAF (DGEE/L358M))13,23,25 , 26, BRAF (V600E), og BRAF (∆ NVTAP)) og kinase-Dead RAF mutanter (som katalysator (C-ryggrad)-smeltet BRAF (∆ NVTAP/V471F)15) aktiverer erk når uttrykt i 293T celler. Derfor kan evnen til RAF mutanter aktivere ERK signalering i celler ikke tjene som en standard for å skille en constitutively aktiv mutant fra en kinase-død mutant, selv om noen kinase-døde mutanter med moderat dimer affinitet/stabilitet slår på nedstrøms signalering bare med samarbeid med aktiv RAS. Tre metoder som vi presenterte her kan hjelpe oss å effektivt karakterisere alle sykdoms relaterte RAF mutanter. De biologiske egenskapene til alle RAF mutanter avslørt ved hjelp av disse analysene i våre tidligere studier har blitt oppsummert i tabell 1.

Den første metoden som vi kan bruke for å skille den constitutively aktive RAF mutanter fra kinase-Dead RAF mutanter er in vitro kinase analysen. I denne analysen ble RAF mutanter renset ved immunutfelling og katalysatoren ble utført in vitro med kinase-Dead MEK1 (K97A) og ATP som underlag. Den katalysator for at RAF mutanter ble målt som AL (Activation Loop)-FOSFORYLERING av MEK1 (K97A) i kinase reaksjonsblandinger av immunoblot. Som vist i figur 1C, kan denne analysen effektivt granske katalysator for R-ryggrad mutanter av BRAF, håndve og ARAF13,15,23, BRAF (V600E)9, og BRAF (∆ NVTAP)15, men ikke at av kinase-Dead BRAF (V471F/∆ NVTAP)15 som har en smeltet C-rygg. Men katalysatoren aktivitet av constitutively aktive RAF mutanter med svak dimer affinitet/stabilitet som ARAF R-rygg, mutant (ARAF (DGEE/L358M)) (figur 1C, Lane 4), håndve og ARAF mutanter med endret dimer grensesnitt (håndve (DDEE/ L397M/R401H), ARAF (DGEE/L358M/ape/R362H))15,22 (figur 1D, E) kan ikke være analysert ved hjelp av denne analysen, siden deres dimers ble brutt under rensing, spesielt når rensing var med buffere som inneholder sterke eller høy konsentrasjons vaskemidler. For å unngå tap av katalysator for RAF mutanter med svak dimer affinitet/stabilitet, vi vanligvis smeltet disse mutanter med GST (glutathione S-transferase), et dimeric protein med sterk affinitet/stabilitet før utføre in vitro kinase-analysen, som kan redde katalysator for disse RAF mutanter15,22 (figur 1E). Generelt, de fleste RAF mutanter kunne klassifiseres som constitutively aktiv eller kinase-døde mutanter ved hjelp av denne analysen.

Den andre metoden som vi beskrev her er RAF co-aktivering analysen som kan brukes til å evaluere nukleosid aktivitet av kinase-Dead RAFmutanter13,15,21,22,23 , 25. selv om noen kinase RAF mutanter med svært høy dimer affinitet/stabilitet som BRAF (V471F/∆ NVTAP)15, kan direkte aktivere endogene RAF molekyler når uttrykt i celler (figur 1B, Lane 7), de fleste kinase RAF mutanter krever samarbeid med aktiv RAS til transactivate vill-type RAFs. Imidlertid er aktiv RAS en direkte aktivator av ERK signalering, hvis introduksjonen vil øke basal nivået av aktive ERK. For å unngå forstyrrelser av aktiv RAS, brukte vi N-Terminus-avkortet RAF mutanter i denne analysen (figur 2A). Som vist i figur 2B, kinase-døde MUTANTER av BRAF, håndve, og RAF med Sure NtA motiv og C-ryggrad FUSJON (BRAF (V471F, aa431-766), HÅNDVE (DDEE/V363F, aa323-648), og ARAF (DGEE/V324F, aa284-606)) fungerte som nukleosid aktivator til utløse katalysatoren aktivitet av HÅNDVE med ikke-phosphorylatable NtA motiv (HÅNDVE mottaker, HÅNDVE (AAFF, aa323-648)) når co-uttrykt i 293T celler. I kontrast, den kinase-døde BRAF mutant (V471F/∆ NVTAP, aa431-766) som har svært høy dimer affinitet/stabilitet (se nedenfor) slått på ERK signalering ved å utløse endogene RAFs, selv uten co-uttrykk for HÅNDVE mottaker. Samlet sett kan denne analysen brukes til å evaluere transactivation evne til alle kinase RAF mutanter.

Dimerization av RAF-familiens kinaser regulerer ikke bare deres evne til å aktivere nedstrøms MEK-ERK-signalering, men bestemmer også deres følsomhet for RAF-hemmere15,16,20,22,24,27,28,29,30,31,32. I motsetning til andre protein-protein interaksjoner blant denne veien33,34,35er dimerization av RAF-familiens kinaser og deres mutanter relativt svake og vanskelige å bli evaluert ved å bruke tradisjonelle biokjemi-analyser som co-immunutfelling. For å løse dette problemet, har vi nylig utviklet en gratis Split luciferase analysen for å måle den relative dimer affinitet/stabilitet av RAF familien kinaser og mutanter15,22,36. Som vist iFigur 3Able RAF kinase Domains (aa431-766 for BRAF, aa323-648 for HÅNDVE, og aa284-606 for ARAF) smeltet sammen med N-Terminus (Aa2-416) eller C-Terminus (aa398-550) av Firefly luciferase (Nluc og Cluc), som vil bli samlet for å montere intakt luciferase ved RAF-dimerization. Aktiviteten av luciferase i denne analysen samsvarer direkte med mengden av RAF-dimers. Denne analysen er svært følsom og kan oppdage selv en svært svak dimerization av RAF mutanter. Som vi rapporterte før15, den kreftfremkallende BRAF (V600E) fungerer som en dimer, og bare en sammensatt mutasjon med ARG-til-sin mutasjon (R509H) i dimer grensesnitt og ikke-kanoniske APE endring (P622A i APE motiv) kan fullstendig avskaffe sin dimerization og dermed blokkere sin katalysator aktivitetFigur 3B). Ved å bruke in vitro kinase analysen, vi videre funnet at BRAF (V600E) variant med endrede APE motivet, BRAF (V600E/AAE), men ikke at med ARG-til-hans mutasjon i dimer grensesnitt, BRAF (V600E/R509H), mistet sin katalysator aktivitet ved rensing (Figur 3C), noe som tyder på at den tidligere varianten har mye mindre dimer affinitet/stabilitet enn sistnevnte. For å direkte måle tilbøyelighet av disse BRAF (V600E) varianter å danne dimers, gjennomførte vi en gratis splitt luciferase analysen, og bekreftet at disse variantene hadde ganske forskjellig dimer affinitet/stabilitet med BRAF (V600E) høyere enn BRAF (V600E/ R509H) enn BRAF (V600E/AAE) enn BRAF (V600E/R509H/AAE) (Figur 3D). Den luciferase signal produsert av monomere BRAF (V600E/R509H/AAE) var sammenlignbare med det av ikke-transfekterte 293T kontroll (Figur 3D, venstre panel kjørefelt 5), som indikerer at denne analysen har en svært lav bakgrunn. For ytterligere å fastslå effektiviteten av gratis Split luciferase analysen, vi neste målt ved hjelp av denne analysen den relative dimer affinitet/stabilitet av en gruppe kreftfremkallende BRAF mutanter med in-Frame slettinger av β3-αC loop som ble identifisert av oss og andre Grupper15,37,38. Som vi har kjent, selv om alle disse mutanter aktivert ERK signalering når uttrykt i 293T celler (Figur 3E), viste de ganske differensial katalysator aktivitet in vitro (Figur 3F). Det BRAF (∆ MLN (aa484-486 del)) og BRAF (∆ NVTAP (aa486-490 del)) var svært aktive ved rensing av immunoprecipitaion, mens BRAF (∆ NVTAPT (aa486-491 del)) og BRAF (∆ QA (aa496-497 del)) mistet sin katalysator under samme tilstand om det kan bli reddet av GST fusjon. I tillegg viste den kinase-døde versjonen av BRAF (∆ NVTAP), BRAF (V471F/∆ NVTAP) en sterk potens for å aktivere endogene RAFs når uttrykt i celler (Figur 1Bkjørefelt 7). Disse dataene tyder på at denne gruppen av BRAF mutanter har ganske forskjellig dimer affinitet/stabilitet med BRAF (∆ NVTAP) høyere enn BRAF (∆ MLN) enn BRAF (∆ NVTAPT) og BRAF (∆ QA). Faktisk, resultatet fra gratis Split luciferase analysen fullstendig støttet vår slutning (Figur 3G). Til sammen viser våre data at gratis Split luciferase analysen er en pålitelig metode for å måle den relative dimer affinitet/stabilitet av RAF mutanter.

Figure 1
Figur 1 : Probe katalysatoren aktivitet av RAF mutanter ved hjelp av in vitro kinase analysen. (A) et skjematisk diagram for RAF mutasjoner brukt i denne studien. (B) både constitutively aktive og kinase RAF mutanter kan aktivere erk signalering når uttrykt i celler. 293T celler ble transfekterte med vektorer som koder ulike RAF mutanter, og aktiviteten til ERK ble oppdaget av anti-fosfat-ERK1/2 immunoblot. (C) CONSTITUTIVELY aktive RAF mutanter med lav dimer affinitet/stabilitet så vel som kinase RAF mutanter kan ikke phosphorylate MEK in vitro ved rensing av immunutfelling. RAF mutanter i B ble renset ved hjelp av anti-FLAG perler, og deres katalysator ble analysert ved å bruke in vitro kinase analysen som beskrevet i protokollen. (D-E) Den in vitro katalysatorer aktivitet av constitutively aktive RAF mutanter med lav dimer affinitet/stabilitet kan bli reddet av GST fusjon. (D) CONSTITUTIVELY aktive RAF mutanter og deres GST-smeltet kolleger ble uttrykt i 293T celler og deres aktivitet ble målt ved anti-FOSFAT-ERK1/2 immunoblot. (E) RAF mutanter i D ble renset ved immunutfelling, og deres in vitro katalysator ble analysert ved å bruke in vitro kinase analysen som beskrevet i protokollen. RAF R-ryggrad mutanter: BRAF (L505M), HÅNDVE (DDEE/L397M), og ARAF (DGEE/L358M). "∆ NVTAP" representerer for sletting av aa486-490 i BRAF. APE mutasjonen av ARAF betyr A475P som genererer en Kanonisk APE motiv i ARAF. "KD" representerer "kinase Domain" i full tekst. BRAF (KD) betyr aa431-766 fragment av BRAF, mens HÅNDVE (KD) og ARAF (KD) representerer henholdsvis for aa323-648 fragment av HÅNDVE og aa284-606 fragment av ARAF. Resultatene i dette tallet har blitt rapportert tidligere15,22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Evaluer evnen til RAF mutanter til å transactivate vill-type RAFs ved hjelp av RAF co-aktivering analysen. (A) et diagram som illustrerer RAF co-aktivering analysen. (B) kinase-Dead RAF mutanter med Sure NtA motivet var co-uttrykt med katalyse-kompetent håndve mottaker i 293T celler, og AKTIVITETEN til ERK1/2 i 293T transfectants ble målt ved anti-PHOSHO-ERK1/2 immunoblot. Mest kinase RAF mutanter unntatt BRAF (V471F/∆ NVTAP) som har en svært høy dimer affinitet/stabilitet kreves co-uttrykk for eksogene RAF-mottaker for å slå på ERK signalering. Resultatene i dette tallet har blitt rapportert tidligere15,22. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Mål den relative dimer affinitet/stabiliteten til RAF mutanter ved hjelp av gratis Split luciferase analysen. (A) et diagram som illustrerer den gratis Split luciferase analysen. (B-D) Dimerization av BRAF (V600E)-variantene er nødvendig for deres katalysator i vivo og in vitro. (B) monomere BRAF (V600E) variant, BRAF (V600E/R509H/AAE) har ingen katalysator i Vivo, som kan GJENOPPRETTES ved GST fusjon. BRAF (V600E) varianter og deres GST-smeltet kolleger ble uttrykt i 293T celler, og deres aktivitet ble målt ved anti-fosfat-ERK1/2. (C) den BRAF (V600E) variant med lav dimer affinitet/stabilitet, BRAF (V600E/AAE) mistet sin katalysator i vitro ved rensing, som kan bli REDDET av gst fusjon. BRAF (V600E) varianter fra B ble renset ved immunutfelling og deres katalysator ble analysert av in vitro kinase analysen som beskrevet i protokollen. (D) den relative dimer affinitet/STABILITETEN til BRAF (V600E) varianter ble målt ved hjelp av gratis Split luciferase analysen som beskrevet i protokollen. (E-G) BRAF mutanter med in-Frame sletting av β3-αC loop funksjon som dimers å aktivere ERK signalering. (E) BRAF mutanter med in-Frame sletting av Β3-αC loop aktivere erk signalering når uttrykt i celler. BRAF mutanter ble uttrykt i 293T celler og deres aktivitet ble målt som beskrevet i B. (F) BRAF mutanter med lav dimer affinitet/stabilitet fra E mistet sin katalysator i vitro, som kan bli REDDET av gst fusjon. Den in vitro katalysator for BRAF mutanter og deres GST-smeltet kolleger fra E ble målt som i C. (G) BRAF mutanter med in-Frame sletting av Β3-αC loop har ganske forskjellig dimer affinitet/stabilitet. Den relative dimer affinitet/stabiliteten til BRAF mutanter med in-Frame sletting av β3-αC loop ble målt som i D. Feilfelt i D & G representerer s.d. for å vise varians mellom uavhengige eksperimenter (n = 4). AAE mutasjon av BRAF betyr P622A i APE motiv som genererer en ikke-kanoniske APE motiv. "∆ MLN", "∆ NVTAPT" og "∆ QA" representerer henholdsvis for sletting av aa484-486, aa486-491, aa496-497 i β3-αC-løkken i BRAF. Noen resultater i dette tallet er rapportert tidligere15. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: Den biologiske eiendommen til ulike RAF mutanter. Den katalysator, nukleosid aktivitet og relative dimer affinitet/stabilitet av alle RAF mutanter som brukes i denne studien er oppsummert i denne tabellen. "Y" betyr "ja", mens "N" står for "nei". "N*" indikerer at de mutanter har katalysator hvis smeltet sammen med GST. "+ + + +", "+ + +", "+ +", "+" og "-" representerer henholdsvis "veldig sterk", "sterk", "Intermediate", "svak" og "ingen".

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne artikkelen har vi presentert tre metoder for karakteriserer sykdom-relaterte RAF mutanter, som inkluderer in vitro kinase analysen, RAF co-aktivering analysen, og gratis Split luciferase analysen. Siden RAF kinaser har både katalysator aktivitet og nukleosid aktivitet, ulike RAF mutanter kan aktivere nedstrøms signalering gjennom to distinkte mekanismer13,14,16,17, 18. den CONSTITUTIVELY aktive RAF mutanter direkte phosphorylate nedstrøms effektor MEK, mens kinase-Dead RAF mutanter utløse nedstrøms signalering gjennom transactivating deres vill-type kolleger. Både constitutively aktive og kinase RAF mutanter krever imidlertid dimerization forå oppfylle sin funksjon15,16,17,19,20, og dimer tilbøyelighet av RAF mutanter bestemmer ikke bare katalysatoren eller nukleosid aktivitet av RAF mutanter, men også deres følsomhet for RAF hemmere15,24. The in vitro kinase analysen, RAF co-aktivering analysen, og gratis Split luciferase analysen gi oss et sett med enkle, effektive og pålitelige metoder for å skille constitutively aktive mutanter fra kinase-døde mutanter samt evaluere deres evne til å aktivere nedstrøms signalering.

The in vitro kinase analysen er en klassisk metode for å oppdage katalysatoren aktivitet av protein kinaser. For å vedta denne metoden for måling av katalysator for RAF mutanter, har vi gjort noen vesentlige revisjoner i reagenser og prosedyrer15,21,22. Siden RAF familien kinaser fungere som dimers å phosphorylate sitt substrat, MEK, og deres dimer affinitet/stabilitet er relativt lav, har vi redusert konsentrasjonen av vaskemiddel NP-40 fra 1% til 0,25% i buffere for rensing RAF proteiner for å hindre RAF dimers fra dissosiasjon. Av samme token, har vi også brukt en mild rask vask prosedyre for RAF protein rensing. Disse endringene er avgjørende for å oppdage katalysator for constitutively aktive RAF mutanter med svært svak dimer affinitet/stabilitet, som kan identifiseres som "kinase-Dead" RAF mutanter av den klassiske in vitro kinase analysen. I tillegg har vi vist at GST Fusion er en god alternativ måte å hindre RAF dimers fra dissosiasjon under rensing i denne analysen15,21,22. Når det kinase RAF mutanter, selv om de er smeltet sammen med GST, har de ikke viser noen katalysator i denne analysen.

The RAF co-aktivisering analysen er utviklet av oss for å evaluere evnen til kinase-Dead RAF mutanter til å transactivate deres vill-type kolleger13, 15,21,22,23 , 25. i denne romanen analysen, bruker vi N-Terminus avkortet RAF proteiner og dermed ikke trenger co-uttrykk for aktiv RAS mutanter eller aktivere RAS, som gjør denne analysen svært følsom. I tillegg nukleosid aktivator (kinase-Dead RAF mutant) og mottakeren (katalyse-kompetent RAF mutant) i denne analysen kan lett isolert og renset for å undersøke molekylære hendelser i ferd med dimerization-drevet transactivation 13 i år.

Som vi har nevnt ovenfor, er dimer affinitet/stabilitet en viktig faktor som regulerer funksjonen til RAF familie kinaser og deres mutanter, og også bestemmer deres følsomhet for RAF hemmere13,14,15, 16,17,18,24. Men dimer affinitet/stabilitet av RAF familien kinaser og deres mest sykdoms-relaterte mutanter er svært lav. For å måle denne parameteren, den tradisjonelle biokjemi analysene krever komplisere eksperimentelle prosedyrer og avansert utstyr (for eksempel SPR-analysen), eller neppe produsere pålitelige og reproduserbar data (for eksempel immunutfelling analysen). I kontrast, gratis Split luciferase analysen er en enkel, følsom, konsistent og kostnadseffektiv metode for å måle den relative dimer affinitet/stabilitet i RAF familien kinaser og deres mutanter15,21, 22,36. Denne analysen kan undersøke den subtile forskjellen av dimer affinitet/stabilitet blant ulike RAF mutanter. Som vi rapporterte før15, BRAF (V600E/AAE) har en veldig svak dimer affinitet/stabilitet og dimers vil være helt ødelagt ved rensing selv om du bruker en svært skånsom prosedyre. Ved hjelp av denne analysen, kan vi skille de svake dimer affinitet/stabilitet på BRAF (V600E/AAE) fra at av monomere BRAF (V600E/AAE/R509H) (Figur 3).

Oppsummert kan dette settet med praktiske og gjennomførbare metoder oppfylle kravene til å definere alle sykdoms relaterte RAF mutanter, og dermed hjelpe oss å velge passende strategier for behandling av ulike RAF mutant-drevet sykdommer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne erkjenne den hårete Cell leukemi Fellowship for støtte av yuan Jimin. Dette arbeidet ble støttet av Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge finansiering Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bygge bro Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3), og SHF akademisk medisin Forskningsstipend (AM/TP011/2018).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-phosphoERK1/2 Cell Signaling Technologies 4370
anti-phosphoMEK1/2 Cell Signaling Technologies 9154
anti-ERK1/2 AB clonal A0229
anti-MEK1/2 Cell Signaling Technologies 9124
anti-FLAG(mouse) Sigma-Aldrich F3165
anti-HA Novus Biologicals MAB6875
anti-FLAG(Rabbit) Cell Signaling Technologies 14793
anti-β-actin Sigma-Aldrich A2228
anti-FLAG beads(M2) Sigma-Aldrich A4596
HRP-conjugated anti-mouse IgG Jackson Laboratories 115-035-003
HRP-conjugated anti-Rabbit IgG Jackson Laboratories 111-035-144
pcDNA3.1(+) In vitrogen V79020
Gibson Assembly Cloning  Kit New England Biolabs E5510
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668019
Fugene 6 Roche 11 814 443 001
DMEM w/o phenol red Invitrogen 21063-029
D-luciferin  GoldBio LUCK-100
6xhis-tagged MEK1 (K97A)  prepared in our previous studies N.A. Reference 15.
GloMax-Multi Detection System. Promega E7041

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
  2. Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
  3. Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
  4. Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
  5. Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
  6. Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
  7. McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
  8. Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
  9. Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
  10. Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
  11. Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
  12. Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
  13. Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
  14. Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
  15. Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
  16. Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
  17. Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
  18. Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
  19. Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
  20. Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
  21. Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
  22. Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
  23. Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
  24. Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
  25. Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
  26. Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
  27. Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
  28. Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
  29. Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).
  30. Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
  31. Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
  32. Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
  33. Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
  34. Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
  35. García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
  36. Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  37. Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
  38. Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).

Tags

Kreftforskning RAF familien kinaser RAF mutasjon RAS/RAF/MEK/ERK signalering dimerization dimer affinitet/stabilitet katalysatorer aktivitet nukleosid aktivitet in vitro kinase analysen RAF co-aktivering analysen komplementære Split luciferase analyse kreft
Karakterisere sykdom-relaterte mutanter av RAF familie kinaser ved hjelp av et sett av praktiske og gjennomførbare metoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H.,… More

Yap, J., Yuan, J., Tee, Z. H., Huang, X., Ng, W. H., Hu, J. Characterize Disease-related Mutants of RAF Family Kinases by Using a Set of Practical and Feasible Methods. J. Vis. Exp. (149), e59795, doi:10.3791/59795 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter