本稿では、インビトロキナーゼアッセイ、RAF共活性化アッセイ、および相補的なスプリットルシフェラーゼアッセイを含む、RAFファミリーキナーゼの疾患関連変異体を特徴付けるための実用的かつ実行可能な方法のセットを提示した。
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この記事について
サマリー
要約
急速に加速した線維全腫(RAF)ファミリーキナーゼは細胞生物学において中心的な役割を果たし、その機能不全は癌および発達障害につながる。疾患関連のRAF変異体の特徴付けは、これらの疾患を治療するための適切な治療戦略を選択するのに役立ちます。最近の研究では、RAFファミリーキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有し、これは二層化によって厳しく規制されている。ここでは、触媒およびアロステリック活性とRAFファミリーキナーゼとその変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を決定するための実用的かつ実行可能な方法のセットを構築した。まず、バッファー内の洗剤濃度を低減し、緩やかなクイックウォッシュ手順を利用し、グルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)融合を採用して、RAFダイマーの解離を防ぐことで、古典的なインビトロキナーゼアッセイを修正しました。浄化。これにより、構成的に活性なRAF変異体の触媒活性を適切に測定することができる。第二に、N末端切り捨てられたRAFタンパク質を用いてキナーゼ死死性RAF変異体のアロステリック活性を評価する新規RAF共活性化アッセイを開発し、現在のプロトコルにおける活性Rasの要件を排除し、より高いレベルを達成した。感度。最後に、我々は、従来の共免疫沈殿アッセイと比較して、より信頼性が高く、敏感である様々なRAF変異体の相対的なダイマー親和性/安定性を定量的に測定するために、ユニークな相補的な分割ルシフェラーゼアッセイを生成しました。要約すると、これらの方法には、(1) ユーザーフレンドリーな利点があります。(2)高度な機器なしで効果的に行うことができる。(3) 費用対効果が高い。(4)高感度で再現性が高い。
概要
RAFファミリーキナーゼは、RAS/RAF/MEK/ERKシグナル伝達カスケードの重要な構成要素であり、RASからのシグナルを伝達してミトゲン活性化タンパク質キナーゼ(MEK)1、2、3、4を活性化します。キナーゼのこのファミリーは、細胞の増殖、生存および分化に重要な役割を果たし、その変化は多くの疾患、特に癌5、6、7、8を誘発する。近年、ゲノムシーケンシングは、RAS/RAF/MEK/ERKカスケード9、10、11のシグナル伝達において異なる特性を示す多くの疾患関連RAF変異体を同定した。RAF変異体の慎重な特徴付けは、RAF変異体がRAS/RAF/MEK/ERKカスケードの信号出力を変化する方法の分子メカニズムを理解するのに役立ち、最終....
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プロトコル
RAF変異体の触媒活性を測定するためのインビトロキナーゼアッセイ
- ギブソンアセンブリまたは従来の分子クローニング法を用いて、C終産でFLAG(DYKDDK)タグを用いてRAF変異体(図1A)をコードするベクターを構築する。
- FLAGタグと変異をPCRによるRAFコード配列に導入し、ギブソンアセンブリまたはT4 DNAライゲーションを使用してpCDNA3.1(+)ベクターに配列全体を挿入し、製造プロトコルに従います。PCR反応には以下の条件を使用してください: (1) 95 °C, 2 分;(2) 95 °C, 30 s;(3) 59 °C, 30 s;(4) 68 °C、3分;(5) 20サイクル(2~4);。(6)4°Cホールド。
注:クローニング用PCRプライマー:5-AAATTAACGACTCACTATAGGCCCCCCCCCCCCCC-3および5-CAGCGGGTッタACGCGCCCTCTA-3。 - RAF 変異型コーディング シーケンスの上流に GST コード シーケンスを挿入し、ステップ 1.1.1 で説明したのと同じ方法を使用して、GST 融合 RAF 変異体をエンコードするベクトルを生成します。
- トランスフェクションの前にDNAシーケンシングによってすべてのベクターを検証します。
- FLAGタグと変異をPCRによるRAFコード配列に導入し、ギブソンアセンブリまたはT4 DNAライゲーションを使用してpCDNA3.1(+)ベクターに配列全体を挿入し、製造プロトコルに従います。PCR反応には以下の条件を使用してください: (1) 95 °C, 2 分;(2) 95 °C, 30 s;(3) 59 °C, 30 s;(4) 68 °C、3分;(5) 20サイクル(2~4);。(6)4°Cホールド。
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結果
RAFファミリーキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有し、疾患関連変異体が異なるメカニズム13、14、16、17を介して下流シグナル伝達をオンにすることを可能にする 、18.構成的に活性なRAF変異体は基質を直接リン酸化し、キナーゼ死死性RAF変異体は野生型の変異体を通じてその機能を果たす。図1Bに示すように、構成的に活性なRAF変異体(例えば、調節性脊椎(R-spine)変異体(BRAF(L505M)、CRAF(DDEE/L397M)、およびARAF(DGEE/L358M)13、23、25
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ディスカッション
本稿では,インビトロキナーゼアッセイ,RAF共活性化アッセイ,無料のスプリットルシフェラーゼアッセイを含む疾患関連RAF変異体を特徴付けるための3つの方法を紹介した.RAFキナーゼは触媒活性とアロステリック活性の両方を有するので、様々なRAF変異体は、2つの異なるメカニズム13、14、16、17を介して下流シグナル伝達を活性化することができます。18.構成的に活性なRAF変異体は、下流のエフェクターMEKを直接リン酸化し、キナーゼ死んだRAF変異体は野生型の変異体を通じて下流シグナル伝達を引き起こす。しかし、構成的に活性なRAF変異体とキナーゼ死んだRAF変異体の両方は、その機能15、16、17、19、20、およびダイマーを満たすためにダイマ化を必要とします.......
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開示事項
著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。
謝辞
著者らは、元ジミンの支援のための毛深い細胞白血病フェローシップを認めたい。この研究は、アジアファンドがん研究(AFCR2017/2019-JH)、デューク-NUSクーブリッジファンディングアワード(デューク-NUS-KBrFA/2018/0014)、NCCRFブリッジ助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2018-JUL-BG4)、NCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(NCCRF-YR2017-JH)、およびSCCRFパイロット助成金(N研究助成金(AM/TP011/2018)
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 抗リン酸化ERK1/2 | 細胞シグナル伝達技術 | 4370 | |
| 抗リン酸化MEK1/2 | 細胞シグナル伝達技術 | 9154 | |
| 抗ERK1/2 | ABクローン | A0229 | |
| 抗MEK1/2 | 細胞シグナル伝達技術 | 9124 | |
| 抗FLAG(マウス) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-&β;-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugatedanti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning キット | ニューイングランド バイオラボ | E5510 | |
| T4 DNA リガーゼ | ニューイングランド バイオラボ | M0202 | |
| リポフェクタミン 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o フェノール レッド | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-ルシフェリン | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhisタグ付きMEK1(K97A) | 私たちの以前の研究で準備 | されました NA. | 参考文献15. |
| GloMax-マルチ検出システム。 | プロメガ | E7041 |
参考文献
- Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
- Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
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