Summary
In questo articolo, abbiamo presentato una serie di metodi pratici e fattibili per caratterizzare i mutanti correlati alla malattia delle chinasi della famiglia RAF, che includono il saggio in vitro chinasi, il saggio di co-attivazione della RAF e il saggio di luciferasi diviso complementare.
Abstract
Le chinasi della famiglia fibrosarcoma (RAF) rapidamente accelerato svolgono un ruolo centrale nella biologia cellulare e la loro disfunzione porta a tumori e disturbi dello sviluppo. Una caratterizzazione dei mutanti RAF correlati alla malattia ci aiuterà a selezionare strategie terapeutiche appropriate per il trattamento di queste malattie. Recenti studi hanno dimostrato che le retisi familiari della RAF hanno attività sia catalitiche che allosteric, che sono strettamente regolate dalla dimerizzazione. Qui, abbiamo costruito una serie di metodi pratici e fattibili per determinare le attività catalitiche e allosteric e la relativa affinità/stabilità di dimero delle chinasi della famiglia RAF e dei loro mutanti. In primo luogo, abbiamo modificato il classico saggio in vitro della chinasi riducendo la concentrazione di detergenti nei tamponi, utilizzando una delicata procedura di lavaggio rapido e impiegando una fusione di glutathione S-transferase (GST) per evitare che i dimeri della RAF si dissocino durante Purificazione. Questo ci permette di misurare l'attività catalitica dei mutanti RAF, in modo virile mente attivo. In secondo luogo, abbiamo sviluppato un nuovo saggio di co-attivazione della RAF per valutare l'attività allostricale dei mutanti NAsie-morti della RAF utilizzando proteine RAF troncate N-terminal, eliminando il requisito di Ras attivo nei protocolli attuali e ottenendo così un livello superiore sensibilità. Infine, abbiamo generato un unico test di lucidferasi diviso complementare per misurare quantitativamente l'affinità/stabilità relativa dei dimeri di vari mutanti RAF, che è più affidabile e sensibile rispetto al tradizionale test di co-immunoprecipitazioni. In sintesi, questi metodi presentano i seguenti vantaggi: (1) user-friendly; (2) in grado di effettuare efficacemente senza attrezzature avanzate; (3) conveniente; (4) altamente sensibili e riproducibili.
Introduction
Le chinasi della famiglia RAF sono un componente chiave della cascata di segnalazione RAS/RAF/MEK/ERK, che trasmette un segnale da RAS per attivare la proteina mitogen -linse (MEK)1,2,3. Questa famiglia di chinasi svolge un ruolo cruciale nella crescita cellulare, sopravvivenza e differenziazione, e le loro alterazioni inducono molte malattie, in particolare il cancro5,6,7,8. Recentemente, i sequenziature genomiche hanno identificato molti mutanti DELLA RAF correlati alla malattia che presentano diverse proprietà nella trasmissione del segnale della cascata RAS/RAF/MEK/ERK9,10,11. Un'attenta caratterizzazione dei mutanti RAF ci aiuterà a capire i meccanismi molecolari di come i mutanti RAF alterano la produzione di segnale della cascata RAS/RAF/MEK/ERK, eventualmente selezionare approcci appropriati per il trattamento di varie malattie basate sui mutanti RAF.
Le chinasi della famiglia RAF comprendono tre membri, CRAF, BRAF e ARAF, che hanno strutture molecolari simili ma abilità diverse per attivare la segnalazione a valle1,2,3,4. Tra questi paraloghi, BRAF ha la più alta attività in virtù del suo coscione costitutivo NtA (N-terminal acidic) motivo12,13,14, mentre ARAF ha il più basso attività derivanti dal suo motivo APE non canonico15. Questo può spiegare le diverse frequenze di mutazione dei paralati RAF nelle malattie: BRAF>CRAF>ARAF. Inoltre, all'interno dello stesso paralogo RAF, le mutazioni in diversi siti possono innescare la segnalazione a valle in modi distinti, il che aggiunge un ulteriore livello di complessità alla regolazione delle chinasi della famiglia RAF. Recenti studi hanno dimostrato che tutte le chinasi RAF hanno attività catalitiche e allosteric13,14,16,17,18. I mutanti RAF constitutivemente attivi attivano la segnalazione a valle direttamente facendo fosfolare MEK, mentre i mutanti RAF che sono morti di parentesi possono trasattivare le loro controparti di tipo selvaggio attraverso la dimerizzazione laterale e attivare la segnalazione MEK-ERK16 ,19,20. L'affinità/stabilità dei dimeri è un parametro chiave che non solo determina l'attività allostricarica dei mutanti RAF cilasi-morti, ma influisce anche sull'attività catalitica dei mutanti RAF complessivamente attivi15,21, 22.I mutanti nasie-morti della RAF ad alta affinità/stabilità dei dimeri possono trasattivare direttamente i RAGF endogeni di tipo selvaggio15, mentre quelli con affinità/stabilità dilettante intermedia richiedono un coordinamento di elevato livello di molecole RAF di tipo selvatico per funzionare13,15,20,21,23. Allo stesso modo, i mutanti della RAF proattivi con stitusivi fosfo MEK in modo dipendente dai dimer, e quelli con bassa affinità/stabilità dei dimeri perdono la loro attività catalitica in vitro dopo l'immunoprecipitazioni che rompe i deboli dimeri della RAF15, 21,22. L'affinità/stabilità dei dimeri determina anche la sensibilità dei mutanti RAF ai loro inibitori, e correla positivamente alla resistenza degli inibitori della RAF24. Pertanto, per caratterizzare i mutanti DELLA RAF correlati alla malattia, è necessario misurare le loro attività catalitiche e allosteric e l'affinità/stabilità delle dimeri.
Negli ultimi anni, il nostro laboratorio e altri hanno sviluppato vari metodi per caratterizzare le chinasi della famiglia RAF e i loro mutanti. Secondo il nostro laboratorio e l'esperienza di altri, riteniamo che i seguenti tre saggi abbiano vantaggi nella definizione dei mutanti della RAF correlati alla malattia: (1) il saggio in vicolo cinsetro che può essere effettuato con facilità per rilevare l'attività catalitica di mutanti RAF attivi15; (2) il saggio di co-attivazione della RAF che è un metodo affidabile e conveniente per misurare l'attività allostricale dei mutanti della RAF ciansioni13,15,21,22,23, 25, (3) il saggio di lucidferasi diviso gratuito che ha una sensibilità molto più elevata nel misurare l'affinità/stabilità relativa dei dimeri dei mutanti RAF in contrasto con il tradizionale analisi di co-immunoprecipitazioni, ed è in grado di svolgere senza attrezzature avanzate in contrasto ai metodi analitici quantitativi come SPR (Surface Plasmon Resonance) analisi15,22. Combinando questi tre saggi, possiamo capire facilmente come un mutante DELLA RAF legato alla malattia alteri la segnalazione a valle e quindi utilizzare una strategia terapeutica appropriata per trattare la malattia causata da questa mutazione della RAF.
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Protocol
1. In Vitro Kinase Saggio per misurare l'attività catalitica dei mutanti RAF
- Costruire vettori codificano i mutanti RAF (Figura1A) con il tag FLAG(DYKDDDDK) al capointroduzione utilizzando Gibson Assembly o i metodi tradizionali di clonazione molecolare.
- Introdurre il tag FLAG e le mutazioni nelle sequenze di codifica RAF dei PCR, quindi inserire intere sequenze nel vettore pCDNA3.1() utilizzando l'assemblaggio Gibson o la legatura del DNA T4 e seguendo i protocolli del manichino. Utilizzare le seguenti condizioni per le reazioni PCR: (1) 95 gradi centigradi, 2 min; (2) 95 gradi centigradi, 30 s; (3) 59 gradi centigradi, 30 s; (4) 68 gradi centigradi, 3 min; (5) 20 cicli di (da 2 a 4); (6) Blocco di 4 gradi centigradi.
NOT: Primer PCR per la clonazione: 5- AAATTAATACGACTCACTATAGGATAGGC-3 e 5-CAGCGGGTTTAACGGGCCCCTCTA-3. - Inserire la sequenza di codifica GST a monte delle sequenze di codifica mutanti RAF per generare vettori che codificano mutanti RAF fusi mediante gli stessi metodi descritti nel passaggio 1.1.1.
- Convalidare tutti i vettori mediante sequenziamento del DNA prima della trasfezione.
- Introdurre il tag FLAG e le mutazioni nelle sequenze di codifica RAF dei PCR, quindi inserire intere sequenze nel vettore pCDNA3.1() utilizzando l'assemblaggio Gibson o la legatura del DNA T4 e seguendo i protocolli del manichino. Utilizzare le seguenti condizioni per le reazioni PCR: (1) 95 gradi centigradi, 2 min; (2) 95 gradi centigradi, 30 s; (3) 59 gradi centigradi, 30 s; (4) 68 gradi centigradi, 3 min; (5) 20 cicli di (da 2 a 4); (6) Blocco di 4 gradi centigradi.
- Piastra 293T cellule in piastre 6-well ad una densità di 5 x 105 cellule / beh un giorno prima della trasfezione. Quando la densità cellulare raggiunge l'80-90% di confluenza il secondo giorno, il transfett con vettori che codificano le chinasi RAF con tag FLAG o i loro mutanti dal passo 1.1 nelle cellule seguendo il protocollo di produzione dei reagenti di trasfezione (Tabella dei materiali).
- Sostituire il mezzo di coltura 24 h dopo la trasfezione.
- Aspirare il mezzo di coltura 48 h dopo la trasfezione e aggiungere 400 HCl, 150 mM NaCl, 1 mM di acido etilenediaminetraceacetica (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) integrato con inibitori di proteasi e fosfasi per la lisciviazione delle cellule sul ghiaccio.
NOT: La concentrazione di NP-40 nel buffer di lisi è fondamentale per rilevare l'attività catalitica dei mutanti RAF con moderata affinità/stabilità di dimero in vitro. Un'alta concentrazione di detersivo o un forte detergente nel tampone di lisi può rompere i dimeri della RAF e quindi uccidere l'attività catalitica delle chinasi RAF o dei loro mutanti. - Trasferire le linguette delle cellule in un tubo da 1,5 mL e girare verso il basso di 12.000 x g per 10 min a 4 gradi centigradi per esaurire i detriti cellulari.
- Trasferire 300 ll per campione di listi a cellule intere pulite a tubi da 1,5 mL, aggiungere 20 llà per campione di perline di affinità anti-FLAG e ruotare in una stanza fredda (4 gradi centigradi) per 1 h. Prendete anche 40 LL per campione di lisato a cellule intere pulito da parte per rilevare l'espressione e l'attività (fosforo-ERK1/2) dei mutanti RAF mediante immunoblot, come descritto di seguito.
- Lavare le perline anti-FLAG una volta con il tampone di lisi, poi una volta con buffer di reazione alla chinasi (20 m HEPES, 10 mM MgCl2, 0,5 mM Na3VO4, 0,5 mM DTT, pH 7.2), e aggiungere 20 l di miscela di reazione alla china (2 g di MEK1 (K97A) e 100 ATP in 20 buffer delle azioni) per campione.
NOT: Il lavaggio del tallone deve essere completato delicatamente e rapidamente, il tampone residuo deve essere aspirato completamente prima di aggiungere la miscela di reazione alla chinasi e tutte le operazioni in questa fase devono essere eseguite a 4 gradi centigradi in una stanza fredda. - Incubare le reazioni della chinasi a temperatura ambiente (25 gradi centigradi) per 10 minuti e capovolgere i tubi contenenti reazioni chinasi con le dita ogni due minuti durante l'incubazione.
- Aggiungere 5 luna di buffer campione SDS 5x (375 mM Tris HCl, 9% solfato di sodio al sodio (SDS), 50% Glycerol, 0.03% Bromophenol Blue) per campione per fermare le reazioni alla chinasi, e poi riscaldare i campioni a 90 gradi centigradi per 5 min.
- Eseguire i campioni nell'elettroforesi gel poliacrilamide (PAGE) del 9-12%, con 0,1% di SDS, trasferire le proteine nella membrana di nitrocellulosa e rilevare i livelli di mutanti fosforo-MEK e RAF in campioni di immunoblot.
NOT: Il fosforo-MEK può anche essere quantificato utilizzando l'incorporazione di P-ATP alnumero 32. In breve, al buffer di reazione alla chinasi viene aggiunto 10 M -32P-ATP e la quantità di meK fosforillato viene quindi quantificata dopo la separazione PAGE utilizzando l'autoradiografia standard, il fosforoimaging o le tecniche di conteggio della scintillazione liquida come appropriato.
2. Analisi di co-attivazione della RAF per valutare l'attività allostricale dei mutanti della RAF Kinase-morto
- Costruire vettori che codificano il ricevitore RAF (dominio della chinasi CRAF con motivo NtA unphosphosphosllatable, AAFF) o gli attivatori della rafasi-morto (dominio della chinasi RAF con motivo NtA, SSDD, DDEE o DGEE) (Figura 1A) come descritto nel passaggio 1.1.
- Transfect 293T cellule con due vettori che codificano sia il ricevitore RAF e l'attivatore RAF kinasi-morto o un singolo vettore codifica una delle proteine come descritto nei passaggi 1.2 e 1.3.
- Sostituire il mezzo di coltura a 24 h dopo la trasfezione e raccogliere 293T transfectants a 48 h per preparare l'intera cellula lisati come descritto nei passaggi 1.4 e 1.5.
- Mescolare rapidamente il lisa di intere cellule pulite con 5x buffer di campione SDS a temperatura ambiente (25 gradi centigradi) e poi far bollire a 90 gradi centigradi per 5 min.
- Eseguire i campioni di lisato a cellule intere bollite in 9-12% PAGE con 0,1% SDS, trasferire le proteine nella membrana di nitrocellulosa e rilevare i livelli di fosforo-ERK1/2 e controllare le proteine mediante immunoblot.
3. Test di lucidale diviso complementare per misurare l'affinità/stabilità di dimero relativo dei mutanti RAF
- Costruire vettori codificano mutanti RAF marcati FLAG fusi al N-terminus di Nluc (N-terminus di firefly luciferase, aa2-416) o al Capolino C di Cluc (C-terminus di luciferasi lucciola, aa398-550) come descritto nel passaggio 1.1.
- Cellule transfetate 293T con una coppia di vettori che codificano diversi mutanti Nluc-RAF e mutanti Cluc-RAF come descritto al passaggio 1.2.
- A 24 h dopo la trasfezione, riplaccare 293T transfectants cellulari in lastre di immagine nera Krystal alla densità cellulare di 2x105 per bene con mezzo privo di colore (cioè DMEM senza fenolo rosso).
- 24 h più tardi, aggiungere D-lucidferina (0,2 mg/mL) a 293T transfectanti cellulari, incubare per 30 min, e misurare i segnali luciferasi utilizzando un sistema multi rilevamento (Tabella dei materiali).
- Dopo aver misurato i segnali di luciferasi, aspirare il mezzo e lisci 293T transfectanti con tampone di lisi per preparare l'intera cellula lisati come descritto nei passaggi 1.4 e 1.5.
- Eseguire i campioni di lisato di tutta la cellula in 9-12% PAGE con 0.1% SDS e rilevare i livelli di espressione dei mutanti Nluc-RAF e Cluc-RAF da immunoblot anti-FLAG come descritto nel passo 2.5. I livelli di espressione relativi del mutante Nluc-RAF e del mutante Cluc-RAF nei transfetti 293T sono quantificati utilizzando l'immagine J dai loro immunoblot.
- Normalizza i segnali luciferasi di transfectanti a cellule 293T secondo i livelli di espressione dei mutanti Nluc-RAF e dei mutanti Cluc-RAF. In breve, questo si ottiene dividendo il segnale di luciferasi grezzo per i livelli di espressione relativi dei mutanti Nluc-RAF e dei mutanti Cluc-RAF dal passo 3.6.
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Representative Results
Le retine della famiglia RAF hanno attività sia catalitiche che allosteric, che consentono ai loro mutanti correlati alla malattia di attivare la segnalazione a valle attraverso diversi meccanismi13,14,16,17 ,18. I mutanti della RAF, attivi direttamente, trapolano i loro substrati, mentre i mutanti RAF morti di chinasi compiono la loro funzione trasattivando le controparti di tipo selvaggio. Come mostrato nella Figura 1B, entrambi i mutanti RAF con attività stitutive (come la colonna vertebrale regolamentare (R-spine) mutanti (BRAF(L505M), CRAF(DDEE/L397M), e ARAF(DGEE/L358M))13,23,25 , 26, BRAF (V600E) e BRAF(NVTAP)) e mutanti RAF ciale-morti (come la colonna vertebrale catalitica (C-spine) -fused BRAF(NVTAP/V471F)15) attiva ERK quando espresso in 293T cellule. Pertanto, la capacità dei mutanti RAF di attivare la segnalazione ERK nelle cellule non può servire come standard per distinguere un mutante economicamente attivo da un mutante nasie-morto, anche se alcuni mutanti ciansi-morti con affinità/stabilità di immersione moderata si accende segnalazione a valle solo con la collaborazione di Ras attivo. Tre metodi che abbiamo presentato qui possono aiutarci a caratterizzare efficacemente tutti i mutanti RAF correlati alla malattia. Le proprietà biologiche di tutti i mutanti RAF rivelate utilizzando questi saggi nei nostri studi precedenti sono state riassunte nella Tabella 1.
Il primo metodo che possiamo usare per distinguere i mutanti della RAF, che sono attivi in modo credituziale, dai mutanti RAF cisiale-morti è il saggio della chinasi in vitro. In questo test, i mutanti della RAF sono stati purificati dall'immunoprecipitazioni e le reazioni catalitiche sono state effettuate in vitro con meK1 (K97A) e ATP in catalia. L'attività catalitica dei mutanti RAF è stata misurata come AL(Activation Loop)-phosphorylation di MEK1(K97A) nelle miscele di reazione della chinasi per immunoblot. Come mostrato nella Figura 1C, questo saggio può sondare efficacemente l'attività catalitica dei mutanti R-spine di BRAF, CRAF e ARAF13,15,23, BRAF (V600E)9, e BRAF (-NVTAP)15, ma non quella di chinaase-morto BRAF (V471F / NVTAP)15 che ha un C-spine fuso. Tuttavia, l'attività catalitica dei mutanti RAF con debolezza attiva con debole affinità/stabilità di dimero come il mutante ARAF R-spine (ARAF(DGEE/L358M)) (Figura1C, corsia 4), CRAF e ARAF mutanti con interfaccia dimero alterata (CRAF(DDEE/ L397M/R401H), ARAF(DGEE/L358M/APE/R362H))15,22 (Figura1D,E) non potrebbe essere sondato utilizzando questo test, poiché i loro dimeri sono stati rotti durante la purificazione, soprattutto quando la purificazione è stata con cuscinetti contenenti detergenti resistenti o ad alta concentrazione. Per evitare la perdita di attività catalitica dei mutanti RAF con debole affinità/stabilità di dimero, di solito abbiamo fuso questi mutanti con GST (glutathione S-transferase), una proteina dimeric con forte affinità / stabilità prima esecuzione in vitro di kinise, che può salvare l'attività catalitica di questi mutanti RAF15,22 (Figura 1E). In generale, la maggior parte dei mutanti RAF potrebbe essere classificata come mutanti constitutivemente attivi o morti di chinasi usando questo saggio.
Il secondo metodo che abbiamo descritto qui è il saggio di co-attivazione RAF che può essere utilizzato per valutare l'attività allostricale dei mutanti RAF ciansie13,15,21,22,23 , 25. Anche se alcuni mutanti RAF a cinefa-morto con un'affinità/stabilità molto elevata,come BRAF(V471F/ mutanti della RAF che sono morti di parentesi richiedono la cooperazione di Ras attivi per trasattivare i RAC di tipo selvaggio. Tuttavia, l'Ag attivo è un attivatore diretto della segnalazione ERK, la cui introduzione aumenterà il livello basale di ERK attivo. Per evitare l'interferenza di Ras attivo, abbiamo usato mutanti RAF troncati n-terminus in questo test (Figura 2A). Come mostrato nella Figura 2B, mutanti cellasi-morti di BRAF, CRAF, e RAF con motivo acido NtA e fusione C-spine (BRAF(V471F, aa431-766), CRAF (DDEE/V363F, aa323-648) e ARAF (DGEE/V324F, aa284-606)) innescare l'attività catalitica della CRAF con motivo NtA non fosforiliabile (ricevitore CRAF (AAFF, aa323-648)) se co-espresso in 293T cellule. Al contrario, il mutante braF lineasi-morto (V471F/ NVTAP, aa431-766) che hanno un'affinità/stabilità di dimero molto elevata (vedi sotto) ha attivato la segnalazione di ERK attivando I RAV endogeni, anche senza la co-espressione del ricevitore C RAF. Nel complesso, questo test può essere utilizzato per valutare la capacità di trasattivazione di tutti i mutanti raf a cui è morta.
La dimerizzazione delle chinasi della famiglia RAF non solo regola la loro capacità di attivare la segnalazione MEK-ERK a valle, ma determina anche la loro sensibilità agli inibitori della RAF15 Mi lasa del sistema,16,20 anni,22 Milia,24 Mi lasa' di,27 mi lapiùdel,28 mi la più del 24,29 del 22 221,30 milio,31 Milia,32 Milia risse. A differenza di altre interazioni proteina-proteina tra questo percorso33 Mi lasa,34 Mi lasa,35 Mi lasa, la dimerizzazione delle chinasi della famiglia RAF e dei loro mutanti è relativamente debole e difficile da valutare utilizzando saggi di biochimica tradizionali come la co-immunoprecipitazioni. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente sviluppato un test di lucidferasi diviso gratuito per misurare l'affinità/stabilità relativa dei dimeri delle chinasi della famiglia RAF e dei loro mutanti15 Mi lasa del sistema,22 Milia,36 Mi lasa. Come mostrato inFigura 3un, i domini della chinasi RAF (aa431-766 per BRAF, aa323-648 per La CRAF e aa284-606 per ARAF) sono stati fusi rispettivamente con N-terminus(aa2-416) o C-terminus (aa398-550) di lucifere lucciolari (Nluc e Cluc), che saranno riuniti per riunirsi per riunirsi per riunirsi luciferasi sulla dimerizzazione RAF. L'attività di luciferate in questo test è direttamente correlata alla quantità di dimeri RAF. Questo test è molto sensibile e può rilevare anche una dimerizzazione molto debole dei mutanti RAF. Come abbiamo riferito prima15 Mi lasa del sistema, il BRAF oncogenico (V600E) funziona come un dimero, e solo una mutazione composta con la mutazione Arg-to-His (R509H) nell'interfaccia dimero e l'alterazione APE non canonica (P622A in motivo APE) può abolire completamente la sua dimerizzazione e quindi bloccarne il catalitico attività (Figura 3B). Utilizzando un saggio in vitro, abbiamo inoltre scoperto che la variante BRAF(V600E) con il motivo APE alterato, BRAF(V600E/AAE), ma non quella con la mutazione Arg-to-His nell'interfaccia dimer, BRAF(V600E/R509H), ha perso la sua attività catalitica al momento della purificazione (Figura 3sec), suggerendo che la prima variante ha molta meno affinità/stabilità dimero rispetto alla seconda. Per misurare direttamente la propensione di queste varianti BRAF(V600E) a formare dimeri, abbiamo effettuato un test di lucidferasi diviso gratuito e abbiamo confermato che queste varianti avevano un'affinità/stabilità di dimero molto diversa con BRAF(V600E) superiore a BRAF(V600E/ R509H) di BRAF(V600E/AAE) rispetto a BRAF(V600E/R509H/AAE) (Figura 3d). Il segnale di luciferasi prodotto dalla BRAF monomerica(V600E/R509H/AAE) era paragonabile a quello del controllo 293T non trasvenuto (Figura 3d, corsia del pannello sinistro 5), che indica che questo saggio ha uno sfondo molto basso. Per determinare ulteriormente l'efficacia del test di lucidferasi diviso in ommondo, abbiamo successivamente misurato utilizzando questo saggio l'affinità/stabilità relativa di dimero di un gruppo di mutanti braF oncogeni con eliminazioni in-frame di ciclo di 3- C che è stato identificato da noi e altri Gruppi15 Mi lasa del sistema,37 Mi lasa' di,38 Mi lasa. Come abbiamo saputo, anche se tutti questi mutanti hanno attivato la segnalazione ERK quando espressa in cellule 293T (Figura 3E (in questo modo), hanno mostrato un'attività catalitica piuttosto differenziale in vitro (Figura 3F). I BRAF(MLN(aa484-486 del)) e BRAF(NVTAP(aa486-490 del)) erano molto attivi al momento della purificazione per immunoprecipitazione, mentre i BRAF(NVTAPT(aa486-491 del)) e BRAF (Aa496-497 del)) hanno perso la loro attività catalitica alle stesse condizioni anche se potrebbero essere salvati dalla fusione GST. Inoltre, la versione chinase-morta di BRAF(NVTAP), BRAF (V471F/ NVTAP) presentava una forte potenza per attivare i file AF endogeni quando vengono espressi in celle (Figura 1Bcorsia 7). Questi dati suggeriscono che questo gruppo di mutanti BRAF ha affinità/stabilità di dimero molto diverso con BRAF('NVTAP) superiore a BRAF('MLN') rispetto a BRAF('NVTAPT') e BRAF('N'). Infatti, il risultato del test gratuito split luciferale ha completamente sostenuto la nostra deduzione (Figura 3grammo). Nel loro insieme, i nostri dati indicano che l'analisi della lucidferasi divisa gratuita è un metodo affidabile per misurare l'affinità/stabilità relativa dei dimeri dei mutanti RAF.
Figura 1 : Sondare l'attività catalitica dei mutanti RAF utilizzando il saggio di chinasi in vitro. (A) Un diagramma schematico per le mutazioni della RAF utilizzate in questo studio. (B) Sia i mutanti RAF che, sia in modo tutituamente attivo che quello della chinasi-morto, possono attivare la segnalazione elata' quando viene espressa nelle cellule. 293T cellule sono state trascate con vettori che codificano diversi mutanti RAF, e l'attività di ERK è stata rilevata da immunoblot anti-phospho-ERK1/2. (C) I mutanti RAF attivi con bassa affinità/stabilità del dimero e i mutanti raf morte della chinasi non possono fosforificare MEK in vitro dopo la purificazione per immunoprecipitazioni. I mutanti RAF in B sono stati purificati usando perline anti-FLAG, e la loro attività catalitica è stata sondata usando l'analisi della chinasi in vitro come descritto nel protocollo. (D-E) L'attività catalitica in vitro dei mutanti RAF con bassa affinità/stabilità dei dimeri può essere salvata dalla fusione GST. (D) I mutanti RAF attivi in modo constitutivo e le loro controparti fuse di GST sono stati espressi in 293T cellule e la loro attività è stata misurata da immunoblot anti-phospho-ERK1/2. (E) I mutanti RAF in D sono stati purificati dall'immunoprecipitazioni e la loro attività catalitica in vitro è stata sondata utilizzando il test della chinasi in vitro come descritto nel protocollo. Mutanti R-spine della RAF: BRAF(L505M), CRAF(DDEE/L397M) e ARAF (DGEE/L358M). "NVTAP" rappresenta per l'eliminazione di aa486-490 in BRAF. La mutazione APE di ARAF significa A475P che genera un motivo APE canonico in ARAF. "KD" rappresenta "dominio della chinasi" nel testo completo. BRAF(KD) significa il frammento aa431-766 di BRAF, mentre CRAF (KD) e ARAF (KD) rappresentano rispettivamente per il frammento aa323-648 di CRAF e il frammento aa284-606 di ARAF. I risultati di questa cifra sono stati riportati in precedenza15,22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Valutare la capacità dei mutanti RAF di trasattivare i RAC wild-type utilizzando il saggio di co-attivazione RAF. (A) Un diagramma che illustra il saggio di co-attivazione della RAF. (B) I mutanti Kinase-dead RAF con motivo NoA acido sono stati co-espressi con ricevitore CRAF-competente per la catalisi in cellule 293T, e l'attività di ERK1/2 nei transfectanti 293T è stata misurata da immunoblot anti-fosho-ERK1/2. La maggior parte dei mutanti RAF con cadenza-morta, ad eccezione di BRAF(V471F/NVTAP) che ha un'affinità/stabilità di dime molto elevata, ha richiesto la co-espressione del ricevitore RAF esogeno per attivare la segnalazione ERK. I risultati di questa cifra sono stati riportati in precedenza15,22. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Misurare l'affinità/stabilità relativa dei dimeri dei mutanti RAF utilizzando il saggio lucidferase diviso gratuito. (A) Un diagramma che illustra il saggio di luciferasi diviso gratuito. (B-D) La dimerizzazione delle varianti BRAF(V600E) è necessaria per la loro attività catalitica in vivo e in vitro. (B) La variante monomerica BRAF(V600E), BRAF(V600E/R509H/AAE) non ha alcuna attività catalitica in vivo, che può essere recuperata dalla fusione GST. Le varianti BRAF(V600E) e le loro controparti fuse di GST sono state espresse in cellule 293T e la loro attività è stata misurata da anti-phospho-ERK1/2. (C) La variante BRAF(V600E) con bassa affinità/stabilità del dimero, BRAF(V600E/AAE) ha perso la sua attività catalitica in vitro dopo la purificazione, che può essere salvata dalla fusione GST. Le varianti BRAF(V600E) di B sono state purificate dall'immunoprecipitazioni e la loro attività catalitica è stata sondata dal modo in vitro della chinasi come descritto nel protocollo. (D) L'affinità/stabilità relativa dei dimeri delle varianti BRAF(V600E) è stata misurata utilizzando l'analisi luciferasi divisa gratuita come descritto nel protocollo. (E-G) Mutanti BRAF con delezione in-frame della funzione loop di 3- C come dimer per attivare la segnalazione ERK. (E) I mutanti BRAF con cancellazione in-frame del circuito di 3- C attivano la segnalazione ERK quando espressi nelle cellule. I mutanti BRAF sono stati espressi in cellule 293T e la loro attività è stata misurata come descritto in B. (F) I mutanti BRAF a bassa affinità/stabilità di dimero da E hanno perso la loro attività catalitica in vitro, che può essere salvata dalla fusione GST. L'attività catalitica in vitro dei mutanti BRAF e delle loro controparti fuse di GST da E è stata misurata come in C. (G) I mutanti BRAF con cancellazione in-frame del circuito di 3- C hanno un'affinità/stabilità di dimero molto diversa. L'affinità/stabilità relativa dei dimeri cicli di BRAF con delezione in-frame di 3- c è stata misurata come in D. Le barre di errore in D&G rappresentano s.d. per mostrare la varianza tra esperimenti indipendenti (n e 4). La mutazione AAE di BRAF significa P622A in motivo APE che genera un motivo APE non canonico. Per le eliminazioni di aa484-486, aa486-491, aa496-497, il valore di "NLN", la tipo sbarra", la Alcuni risultati in questa cifra sono stati riportati in precedenza15. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: La proprietà biologica di vari mutanti RAF. L'attività catalitica, l'attività alsusa e la relativa affinità/stabilità dei dimeri di tutti i mutanti RAF utilizzati in questo studio sono state riassunte in questa tabella. "Y" significa "Sì", mentre "N" sta per "No". "N" indica che quei mutanti hanno attività catalitica se fusi con GST. I valori """", """","","", "-" e "-" rappresentano rispettivamente per "molto forte", "forte", "intermedio", "debole" e "nessuno".
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Discussion
In questo articolo, abbiamo presentato tre metodi per caratterizzare i mutanti RAF correlati alla malattia, che includono il saggio in vitro della chinasi, il saggio di co-attivazione della RAF e il saggio di luciferasi diviso gratuito. Dal momento che le chinasi RAF hanno sia attività catalitica che attività allosteric, vari mutanti RAF possono attivare la segnalazione a valle attraverso due meccanismi distinti13,14,16,17, 18. I mutanti della RAF, stitutivamente attivi, trapaliano direttamente l'effetto a valle MEK, mentre i mutanti della RAF ciasi-morti attivano la segnalazione a valle attraverso la transattiva delle loro controparti di tipo selvaggio. Tuttavia, sia i mutanti RAF che attivi in modo stitutivo e la chinaase richiedono la dimerizzazione per adempiere alla loro funzione15,16,17,19,20e il dimero la propensione dei mutanti RAF determina non solo l'attività catalitica o allostricale dei mutanti RAF, ma anche la loro sensibilità agli inibitori della RAF15,24. Il saggio in vitro per la chinasi, il saggio di co-attivazione della RAF e il saggio di lucidferasi diviso gratuiti ci forniscono una serie di metodi semplici, efficaci e affidabili per distinguere i mutanti costitutivi attivi dai mutanti ciasi-morti, oltre a valutare i loro attivare la segnalazione a valle.
Il saggio in vitro chinasi è un metodo classico per rilevare l'attività catalitica delle chinasi proteiche. Per adottare questo metodo per misurare l'attività catalitica dei mutanti RAF, abbiamo fatto alcune revisioni significative nei reagenti e nelle procedure15,21,22. Poiché le chinasi familiari della RAF fungono da dimer per fosforicolare il loro substrato, MEK, e la loro affinità/stabilità di dimero è relativamente bassa, abbiamo ridotto la concentrazione di detersivo NP-40 dall'1% allo 0,25% in tamponati per purificare le proteine della RAF al fine di prevenire Merchi della RAF dalla dissociazione. Allo stesso modo, abbiamo anche usato una delicata procedura di lavaggio rapido per la purificazione delle proteine RAF. Questi cambiamenti sono fondamentali per rilevare l'attività catalitica dei mutanti RAF costitutivi con un'affinità/stabilità di dime molto debole, che potrebbero essere identificati come mutanti RAF "nasie-morti" dal classico saggio in chinasi in vitro. Inoltre, abbiamo dimostrato che la fusione GST è un buon modo alternativo per impedire ai dimeri della RAF di dissociazione durante la purificazione in questo saggio15,21,22. Per quanto riguarda i mutanti nasie-morti della RAF, anche se sono fusi con gST, non mostrano alcuna attività catalitica in questo saggio.
Il test di co-attivazione della RAF è stato da noi sviluppato per valutare la capacità dei mutanti raf morte di trasattivare le loro controparti di tipo selvatico13,15,21,22,23 , 25. In questo nuovo test, usiamo le proteine N-terminus troncate RAF e quindi non abbiamo bisogno della co-espressione dei mutanti RAS attivi o dell'attivazione di RAS, il che rende questo saggio molto sensibile. Inoltre, l'attivatore allostrico (mutante RAF nasie-morto) e il ricevente (mutante RAF-catalisi-competente) in questo saggio possono essere facilmente isolati e purificati per studiare eventi molecolari nel processo di trasattivazione guidata dalla dimerizzazione 13.
Come abbiamo detto sopra, l'affinità/stabilità dei dimeri è un fattore chiave che regola la funzione delle chinasi della famiglia RAF e dei loro mutanti, e determina anche la loro sensibilità agli inibitori della RAF13,14,15, 16,17,18,24. Tuttavia, l'affinità/stabilità dei dimeri delle chinasi della famiglia RAF e dei loro mutanti più malati è molto bassa. Per misurare questo parametro, i tradizionali saggi di biochimica richiedono procedure sperimentali complicate e attrezzature avanzate (come il saggio SPR), o difficilmente producono dati affidabili e riproducibili (come il test di immunoprecipitazioni). Al contrario, l'analisi della lucidferasi divisa gratuita è un metodo semplice, sensibile, coerente ed economico per misurare l'affinità/stabilità relativa dei dimeri della famiglia RAF e dei loro mutanti15,21, 22,36. Questo test può sondare la sottile differenza di affinità/stabilità dei dimeri tra i vari mutanti RAF. Come abbiamo riportato primadi 15, BRAF(V600E/AAE) ha un'affinità/stabilità del dimero molto debole e i suoi dimeri saranno completamente rotti al momento della purificazione anche se si utilizza una procedura molto delicata. Utilizzando questo saggio, possiamo distinguere la debole affinità/stabilità di dimero di BRAF(V600E/AAE) da quella di BRAF monomerico(V600E/AAE/R509H) (Figura 3).
In sintesi, questa serie di metodi pratici e fattibili può soddisfare i requisiti di definizione di tutti i mutanti della RAF correlati alla malattia, e quindi aiutarci a selezionare strategie appropriate per il trattamento di varie malattie causate da mutanti della RAF.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Gli autori vorrebbero riconoscere la Hairy Cell Leukemia Fellowship per il supporto di Yuan Jimin. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Asia Fund Cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge Funding Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF bridging grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), sovvenzione pilota NCCRF (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) e SHF Academic Medicine Borsa di ricerca (AM/TP011/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
| GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |
References
- Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
- Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
- Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
- Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
- Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
- Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
- McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
- Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
- Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
- Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
- Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
- Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
- Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
- Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
- Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
- Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
- Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
- Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
- Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
- Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
- Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
- Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
- Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
- Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
- Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
- Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
- Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).
- Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
- Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
- Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
- García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
- Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
- Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
- Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).
