Summary
이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 상보적인 분할 루시페라아제 분석법을 포함하는 RAF 패밀리 키나아제의 질병 관련 돌연변이를 특성화하기 위한 실용적이고 실현 가능한 방법 세트를 제시했습니다.
Abstract
급속하게 가속화된 섬유육종 (RAF) 가족 키나아제는 세포 생물학에 있는 중앙 역할을 하고 그들의 역기능은 암과 발달 무질서로 이끌어 냅니다. 질병 관련 RAF 돌연변이체의 특성화는 우리가 이 질병 취급을 위한 적당한 치료 전략을 선택하는 것을 도울 것입니다. 최근 연구에 따르면 RAF 패밀리 키나아제는 촉매 작용과 알로스테릭 활동이 모두 있으며, 이는 이분화에 의해 엄격하게 조절됩니다. 여기에서, 우리는 촉매 및 allosteric 활동 및 RAF 가족 키나아제 및 그들의 돌연변이체의 상대적인 이량친 친화성/안정성을 결정하기 위하여 실용적이고 실행 가능한 방법의 세트를 건설했습니다. 첫째, 완충제의 세제 농도를 줄이고, 완만한 세척 절차를 활용하고, RAF 이분분석(GST) 융합을 사용하여 RAF 이완제 중 해리되는 것을 방지함으로써 고전적인 시험관내 키나아제 분석기를 개정했습니다. 정화. 이를 통해 우리는 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체의 촉매 활성을 적절히 측정할 수 있다. 둘째, N-말단 절단 된 RAF 단백질을 사용하여 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스테릭 활성을 평가하기 위한 새로운 RAF 공동 활성화 분석방법을 개발하여 현재 프로토콜에서 활성 Ras의 요구 사항을 제거하고 더 높은 것을 달성했습니다. 감도. 마지막으로, 우리는 전통적인 동면역침전 분석실험에 비해 더 안정적이고 민감한 다양한 RAF 돌연변이체의 상대적 이량친 친화성/안정성을 정량적으로 측정하기 위해 독특한 상보성 분할 루시페라아아제 분석법을 생성했다. 요약하자면, 이러한 방법에는 다음과 같은 장점이 있습니다: (1) 사용자 친화적인; (2) 고급 장비없이 효과적으로 수행 할 수; (3) 비용 효율적; (4) 매우 민감하고 재현 가능.
Introduction
RAF 계모 키나아제는 RAS/RAF/MEK/ERK 신호 캐스케이드의 핵심 구성 요소로, RAS로부터 신호를 전송하여 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MEK)1,2,3,4를활성화합니다. 키나아제의 이 가족은 세포 성장, 생존 및 분화에 중요한 역할을 하며, 이들의변화는 많은 질병, 특히 암 5,6,7,8을유발한다. 최근, 게놈 염기서열 분석은 RAS/RAF/MEK/ERK 캐스케이드9,10,11의신호 전송에 상이한 특성을 나타내는 많은 질병 관련 RAF 돌연변이체를 확인하였다. RAF 돌연변이체의 신중한 특성화는 RAF 돌연변이체가 RAS/RAF/MEK/ERK 캐스케이드의 신호 출력을 변경하는 방법의 분자 메커니즘을 이해하는 데 도움이 되며, 결국 다양한 RAF 돌연변이 구동 질환 치료에 적합한 접근법을 선택하는 데 도움이 됩니다.
RAF 패밀리 키나제는 3개의 멤버, CRAF, BRAF 및 ARAF를 포함하며, 이는유사한 분자 구조를 가지고 있지만 다운스트림 신호화 1,2,3,4를활성화하는 다른 능력을 가진다. 이러한 파라로그 중에서 BRAF는 인산화된 NtA(N -terminal acidic) 모티프12,13,14,ARAF가 가장 낮은 것으로 나타났습니다. 비 정식 APE 모티프에서 발생하는 활동15. 이것은 질병에 있는 RAF paralogs의 다른 돌연변이 주파수를 설명할 수 있습니다: BRAF>CRAF>ARAF. 더욱이, 동일 RAF paralog 내의, 다른 사이트에 있는 돌연변이는 RAF 가족 키나아제의 규칙에 복잡성의 또 다른 층을 추가하는 별개의 방식으로 다운스트림 신호를 시작할 수 있습니다. 최근 연구는 모든 RAF 키나제는 촉매 및 allosteric 활동모두 13,14,16,17,18을가지고 있음을 입증했다. 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 MEK를 인산화하여 하류 신호를 직접 켜는 반면, 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 좌우 이량화를 통해 야생 형 대응을 트랜스 활성화하고 MEK-ERK 신호 16을 활성화할 수 있습니다. ,19,20. 이량친 친화성/안정성은 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 알로스테릭 활성을 결정할 뿐만 아니라 조직적으로 활성RAF 돌연변이체(15,21)의 촉매 활성에 영향을 미치는 주요 파라미터이다. 22. 높은 이분화 친화성/안정성을 가진 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 내인성 야생형 RAF를 직접 15로 변환 할 수 있으며 중간 이량 친화성 / 안정성을 가진 돌연변이는 활성 Ras 또는 야생 형 RAF 분자의 높은 수준은 기능13,15,20,21,23. 유사하게, 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 이량체 의존적 방식으로 MEK를 인산화하고, 낮은 이량친 친화성/안정성을 가진 사람들은 약한 RAF 이동기를 깨뜨리는 면역 침전 시 시험관내에서 촉매 활성을 잃는다15, 21,22. 이량친친화성/안정성은 또한 그들의 억제제에 대한 RAF 돌연변이체의 민감도를 결정하고, RAF 억제제(24)의 내성에 긍정적으로 상관관계가 있다. 따라서 질병 관련 RAF 돌연변이를 특성화하기 위해서는 촉매 및 알로스테릭 활동을 측정하고 친화성/안정성을 변화시켜야 합니다.
최근 몇 년 동안, 우리의 실험실 및 다른 RAF 가족 키나아제와 그들의 돌연변이를 특성화 하는 다양 한 방법을 개발 했다. 우리의 실험실 및 다른 사람의 경험에 따르면, 우리는 다음 세 가지 분석이 질병 관련 RAF 돌연변이를 정의하는 데 장점이 있다고 생각합니다: (1) 체외 키나아제 분석제는 구성적으로 촉매 활성을 검출하기 위해 쉽게 수행 될 수 있습니다. 활성 RAF돌연변이체 15; (2) RAF 공동 활성화 분석법은 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체13,15,21, 22,23의알로스테릭 활성을 측정하는 안정적이고 편리한 방법이다. 25; (3) 기존의 동면역침전 분석과 는 달리 RAF 돌연변이체의 상대이량 친화성/안정성을 측정하는 데 훨씬 더 높은 감도를 가지며, 첨단 장비 없이도 수행할 수 있는 무료 분할 루시페라아제 분석 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석15,22와같은 정량적 분석 방법과는 대조적이다. 이 3개의 검사를 결합하는, 우리는 질병 관련 RAF 돌연변이가 어떻게 하류 신호를 바꾸는지 쉽게 이해할 수 있고, 그로 인하여 이 RAF 돌연변이에 기인한 질병을 취급하기 위하여 적당한 치료 전략을 이용하.
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Protocol
1. RAF 돌연변이의 촉매 활동을 측정하기위한 체외 키나제 분석
- Gibson 어셈블리 또는 기존분자 복제 방법을 사용하여 C-종단에서 RAF 돌연변이체(그림 1A)를 FLAG(DYKDDDDK) 태그로 코딩하는 벡터를 생성합니다.
- PRS에 의해 RAF 코딩 서열에 FLAG 태그 및 돌연변이를 소개하고, 깁슨 어셈블리 또는 T4 DNA 결찰을 사용하고 제조의 프로토콜을 따라 pCDNA3.1(+) 벡터에 전체 서열을 삽입합니다. PCR 반응에 대해 다음과 같은 조건을 사용하십시오: (1) 95°C, 2분; (2) 95 °C, 30s; (3) 59 °C, 30s; (4) 68 °C, 3 분; (5) 20 사이클 (2 받는 번째 4); (6) 4 °C 홀드.
참고: 복제를위한 PCR 프라이머 : 5- AAATAATACGACTATATAGGGAGACCC-3 및 5-CAGCGGGTTTAAACGCCCTCTCtA-3. - 1.1.1단계에서 설명한 것과 동일한 방법을 사용하여 GST 융합 RAF 돌연변이를 코딩하는 벡터를 생성하기 위해 RAF 돌연변이 코딩 서열의 상류에 GST 코딩 시퀀스를 삽입한다.
- 형질전환 전에 DNA 염기서열 분석으로 모든 벡터를 검증합니다.
- PRS에 의해 RAF 코딩 서열에 FLAG 태그 및 돌연변이를 소개하고, 깁슨 어셈블리 또는 T4 DNA 결찰을 사용하고 제조의 프로토콜을 따라 pCDNA3.1(+) 벡터에 전체 서열을 삽입합니다. PCR 반응에 대해 다음과 같은 조건을 사용하십시오: (1) 95°C, 2분; (2) 95 °C, 30s; (3) 59 °C, 30s; (4) 68 °C, 3 분; (5) 20 사이클 (2 받는 번째 4); (6) 4 °C 홀드.
- 플레이트 293T 세포는 5 x 105 셀의 밀도로 6 웰 플레이트에서 1 일 전에 형질전환전에 잘. 세포 밀도가 둘째 날에 80~90% 합류에 도달하면, 제조의 형질전환 시약 프로토콜에 따라 1.1단계에서 FLAG 태그가 지정된 RAF 키나제 또는 이들의 돌연변이체를 코딩하는 벡터를 트랜스펙트(표오브재료)로 한다.
- 형질전환 후 배양 배지 24h를 교체한다.
- 배양 배지를 48시간 후 흡인하고 400 μL/well 의 라시스 버퍼(25 mM Tris· HCl, 150 mM NaCl, 1 mM 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA), 0.25% NP-40, pH 7.2) 프로테아제 및 인산아제 억제제로 보충하여 얼음 에 세포를 용해시켰다.
참고: 용해 완충액에서의 NP-40의 농도는 시험관 내에서 중간 정도의 이량친 친화도/안정성을 가진 RAF 돌연변이체의 촉매 활성을 검출하는 데 매우 중요하다. 고농도의 세제 또는 라시스 버퍼의 강한 세제는 RAF 이측정기를 파괴하여 RAF 키나제 또는 돌연변이체의 촉매 활성을 죽일 수 있습니다. - 세포 용해를 1.5 mL 튜브로 옮기고 4 °C에서 10 분 동안 12,000 x g씩 회전하여 세포 파편을 고갈시.
- 깨끗한 전체 세포 의 샘플 당 300 μL을 1.5 mL 튜브로 용해시키고, 안티 플래그 친화 구슬 샘플 당 20 μL을 추가하고, 냉장실 (4 °C)에서 1 시간 동안 회전합니다. 또한 아래에 설명된 바와 같이 RAF 돌연변이체의 발현 및 활성(phospho-ERK1/2)을 검출하기 위해 깨끗한 전체 세포 용해의 샘플당 40 μL을 취한다.
- 용해 완충제로 한 번 반 플래그 구슬을 세척한 다음 키나아제 반응 완충액(20 mM HEPES, 10 mM MgCl2,0.5 mM Na3VO4,0.5 mM DTT, pH 7.2)을 한 번 추가하고 키나아제 반응 혼합물 20 μL(MEK1(K97A) 및 100μg 의 20μg을 추가합니다. 샘플당 작업 버퍼)를 제공합니다.
참고: 비드 세척은 부드럽고 빠르게 완료되어야 하며, 잔류 완충액은 키나아제 반응 혼합물을 첨가하기 전에 완전히 흡인되어야 하며, 이 단계의 모든 작업은 냉장실에서 4°C에서 수행되어야 한다. - 실온(25°C)에서 키나아제 반응을 10분 동안 배양하고, 인큐베이션 동안 다른 분마다 손가락으로 키나아제 반응을 함유하는 튜브를 뒤집는다.
- 5x SDS 샘플 버퍼 5μL 추가(375 mM Tris· HCl, 9% 나트륨 도데실 황산염 (SDS), 50 % 글리세롤, 0.03 % 브로모페놀 블루) 키나아제 반응을 중지한 다음 샘플을 90 °C에서 5 분 동안 가열합니다.
- 0.1% SDS로 9~12% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동 (PAGE)에서 샘플을 실행하고, 단백질을 니트로 셀룰로오스 막으로 옮기고, 면역 혈전에 의한 샘플에서 인포스 포 MEK 및 RAF 돌연변이체의 수준을 검출합니다.
참고: 포스포-MEK는 또한 γ32P-ATP 혼입을 사용하여 정량화될 수 있다. 간략하게, 10 μM γ32P-ATP가 키나아제 반응 완충액에 첨가되고, 인산화된 MEK의 양은 표준 자가방사선, 인광 이미징, 또는 액체 현미 계수 기술을 사용하여 PAGE 분리 후 정량화된다. 해당.
2. 키나제 죽은 RAF 돌연변이의 알로스터활성 평가를 위한 RAF 공동 활성화 분석
- RAF 수신기를 인코딩하는 벡터(CRAF 키나아제 도메인과 비인료 NtA 모티프, AAFF) 또는 키나아제 죽은 RAF 활성제(인산화 모방된 NtA 모티프를 가진 RAF 키나아제 도메인, SSDD, DDEE 또는 DGEE)로(그림1A) 1.1단계에 설명되어 있습니다.
- Transfect 293T 세포는 RAF 수신기 및 키나아제 죽은 RAF 활성제 또는 단계 1.2 및 1.3에 기재된 바와 같이 하나의 단백질을 코딩하는 2개의 벡터를 인코딩한다.
- 형질전환 후 24시간에서 배양배지를 교체하고, 1.4 단계 및 1.5단계에서 기재된 바와 같이 전체 세포 가액을 준비하기 위해 48시간에서 293T 트랜스펙트들을 수확한다.
- 깨끗한 전체 세포용액을 실온(25°C)에서 5x SDS 샘플 버퍼와 빠르게 혼합한 다음 90°C에서 5분간 끓입니다.
- 삶은 전체 세포 용해 샘플을 0.1% SDS로 9~12% PAGE에서 실행하고, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, 인광-ERK1/2 수준을 검출하고 면역혈전으로 단백질을 조절합니다.
3. RAF 돌연변이체의 상대적 이체 친화력/안정성 측정을 위한 무료 분할 루시퍼라제 분석
- 1.1단계에서 설명한 바와 같이, 플래그 태그가 있는 RAF 돌연변이를 Nluc의 N-종단(반딧불 루시페라아제의 N-종점, aa2-416) 또는 C-종단(반딧불 루시페라아제의 C-종점, aa398-550)에 융합한 생성 벡터.
- Transfect 293T 세포는 1.2단계에서 기재된 바와 같이 상이한 Nluc-RAF 돌연변이체 및 Cluc-RAF 돌연변이체를 인코딩하는 한 쌍의 벡터를 갖는다.
- 형질전환 후 24시간에서, 293T 세포 트랜스펙트를 컬러 프리 배지(즉, 페놀 레드가 없는 DMEM)로 잘 당 2x10 5의 세포 밀도에서 크리스탈 블랙 이미지 플레이트로 재플레이트한다.
- 24시간 후, 293T 세포 투명제에 D-루시페린(0.2 mg/mL)을 넣고 30분 동안 배양하고, 다중 검출 시스템(재료 표)을 사용하여 루시퍼라제 신호를 측정한다.
- 루시퍼라제 신호를 측정한 후, 배지를 흡인하고 293T 트랜스펙트와 라시스 버퍼를 사용하여 단계 1.4 및 1.5에 기재된 바와 같이 전체 세포 가해를 준비한다.
- 전체 세포 용해 샘플을 0.1% SDS로 9~12% PAGE에서 실행하고 2.5단계에서 설명한 바와 같이 항-FLAG 면역블롯에 의한 Nluc-RAF 돌연변이체 및 Cluc-RAF 돌연변이체의 발현 수준을 검출한다. 293T 트랜스펙트에서 Nluc-RAF 돌연변이체 및 Cluc-RAF 돌연변이체 모두의 상대발현 수준은 그들의 면역블롯으로부터의 이미지 J를 사용하여 정량화된다.
- Nluc-RAF 돌연변이체 및 Cluc-RAF 돌연변이체의 발현 수준에 따라 293T 세포 트랜스펙트의 루시퍼라아제 신호를 정상화한다. 간략하게, 이것은 3.6 단계에서 Nluc-RAF 돌연변이체 및 Cluc-RAF 돌연변이체의 상대적인 발현 수준으로 원시 루시퍼라아제 신호를 분할함으로써 달성된다.
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Representative Results
RAF 패밀리 키나아제는 촉매 및 알로스테릭 활동을 모두 가지고 있으며, 이는 질병 관련 돌연변이가 다른 메커니즘13,14,16,17을 통해 하류 신호를 켤 수 있게 합니다. ,18. 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체는 직접 그들의 기질을 인산화하고, 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 야생형 대응물질을 거래하여 그들의 기능을 수행한다. 그림 1B에도시된 바와 같이, 두 가지 로구성 활성 RAF 돌연변이체(예: 규제 척추(R-척추) 돌연변이체(BRAF(L505M), CRAF(DDEE/L397M) 및 ARAF(DGEE/L358M))13,23,25 , 26,BRAF(V600E) 및 BRAF(NVTAP)) 및 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체(예: 촉매 척추(C-척추)-융합 된 BRAF(́NVTAP/V471F)15)는293T 세포에서 발현될 때 ERK를 활성화한다. 따라서, 세포에서 ERK 신호를 활성화하는 RAF 돌연변이체의 능력은 적당한 이각 친화도/안정성을 가진 몇몇 키나아제 죽은 돌연변이체와 키나아제 죽은 돌연변이체에서 구성적으로 활성 돌연변이를 구별하는 표준으로 작용할 수 없습니다. 활성 라스의 협력만으로 다운스트림 신호. 우리가 여기에서 제시한 3개의 방법은 우리가 효과적으로 모든 질병 관련 RAF 돌연변이를 특성화하는 것을 도울 수 있습니다. 이러한 변제들을 사용하여 밝혀진 모든 RAF 돌연변이체의 생물학적 특성은 당사의 이전 연구에서 표 1에 요약되어 있다.
우리가 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체로부터 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체를 구별하는 데 사용할 수 있는 첫 번째 방법은 시험관내 키나아제 분석이다. 이 분석에서, RAF 돌연변이체는 면역침전에 의해 정제되었고 촉매 반응은 기질로서 키나아제 죽은 MEK1(K97A) 및 ATP와 함께 시험관내에서 수행되었다. RAF 돌연변이체의 촉매 활성은 면역블롯에의한 키나아제 반응 혼합물에서 MEK1(K97A)의 AL(A ctivation Lop)-인산화로 측정하였다. 그림 1C에도시된 바와 같이, 이 분석은 BRAF, CRAF 및 ARAF13,15,23, BRAF(V600E)9,및 BRAF(NVTAP)15의R-척추 돌연변이체의 촉매 활성을 효과적으로 조사할 수 있습니다. 그러나 융합 된 C-척추가있는 키나아제 죽은 BRAF (V471F / ́ NVTAP)15. 그러나, ARAF R-척추 돌연변이체(ARAF(DGEE/L358M))와 같은 약한 이량친 친화성/안정성을 가진 구성활성 RAF 돌연변이체의 촉매 활성(그림1C,레인 4), 변경된 디머 인터페이스를 가진 CRAF 및 ARAF 돌연변이체(CRAF(DDEE/ L397M/R401H), ARAF (DGEE/L358M/APE/R362H))15,22 (그림1D,E)이 분석기를 사용하여 조사되지 않을 수 있습니다. 강하거나 고농도 세제를 포함하는 완충제으로 수행됩니다. 약한 이각 친화성/안정성을 가진 RAF 돌연변이체의 촉매 활성의 손실을 피하기 위해, 우리는 일반적으로GST (g 루타티온 S-transferase)와 이러한 돌연변이체를 융합, 전에 강한 친화력 / 안정성을 가진 디메릭 단백질 이러한 RAF 돌연변이체의 촉매 활성을 구출할 수 있는 시험관내 키나아제 분석(15,22)을 수행한다(도1E). 일반적으로, 대부분의 RAF 돌연변이체는 이 분석물질을 사용하여 구성적으로 활성 또는 키나제 죽은 돌연변이체로 분류될 수 있다.
여기서 설명한 두 번째 방법은 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체13,15,21,22,23의 알로스테릭 활성을 평가하는데 사용될 수 있는 RAF 공동 활성화 분석법이다. , 25. BRAF (V471F / ́ NVTAP)와 같은 매우 높은 이분성 친화성 / 안정성을 가진 몇 가지 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체가15,세포에서 발현 될 때 내인성 RAF 분자를 직접 활성화 할 수 있지만 (그림1B, 레인 7), 대부분 키나제 죽은 RAF 돌연변이체는 야생 형 RAF를 변환하기 위해 활성 Ras의 협력이 필요합니다. 그러나, 액티브 라스는 ERK 신호의 직접적인 활성제이며, 그의 소개는 활성 ERK의 기저 수준을 증가시킬 것이다. 활성 Ras의 간섭을 피하기 위해, 우리는 이 분석에서 N-종점 절단 RAF 돌연변이체를 사용하였다(그림2A). 그림 2B에도시된 바와 같이, BRAF의 키나아제 죽은 돌연변이체, CRAF, 및 산성 NtA 모티프와 C 척추 융합 (BRAF (V471F, aa431-766), CRAF (DDEE / V363F, aa323-648), 및 ARAF (DGEE / V324F, aa284-606)) 알로스테릭 액티베이터로 기능 293T 세포에서 공동 발현될 때 비인산성 NtA 모티프(CRAF 수신기, CRAF(AAFF, aa323-648))로 CRAF의 촉매 활성을 트리거한다. 대조적으로, 키나아제 죽은 BRAF 돌연변이체(V471F/́ NVTAP, aa431-766)는 CRAF 수신기의 공동 발현 없이도 내인성 RAF를 트리거하여 ERK 신호를 켜는 매우 높은 이분성 친화성/안정성(아래 참조)을 갖는다. 전반적으로, 이러한 분석은 모든 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 과활성화 능력을 평가하는데 사용될 수 있다.
RAF 패밀리 키나아제의 이량화는 다운스트림 MEK-ERK 신호를 활성화하는 능력을 조절할 뿐만 아니라 RAF 억제제에 대한 민감도를 결정합니다.15세,16세,20개,22세,24세,27세,28세,29세,30개,31세,32세. 이 통로 중 그밖 단백질 단백질 상호 작용과는 대조적으로33세,34세,35세, RAF 패밀리 키나아제 및 이들의 돌연변이체의 이량화는 비교적 약하고 동면역침전과 같은 전통적인 생화학 분석법을 사용하여 평가하기 어렵다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 최근에 RAF 패밀리 키나아제및 돌연변이체의 상대적 이분근 친화성/안정성을 측정하기 위한 무료 분할 루시퍼라제 분석을 개발했습니다.15세,22세,36세. 에 표시된 대로그림 3A.RAF 키나아제 도메인(BRAF의 경우 aa431-766, CRAF의 경우 aa323-648, ARAF의 경우 aa284-606)은 N-종점(aa2-416) 또는 C-종점(aa398-550)과 각각 융합되어 반딧불이 루시라아제(Aa398-550)를 함께 가져왔다. RAF 이분화 시 루시퍼라아제. 이 분석에서 루시퍼라아제의 활동은 RAF 이량제의 양과 직접적으로 상관관계가 있습니다. 이 분석은 매우 민감하고 RAF 돌연변이체의 매우 약한 이분화조차도 검출할 수 있다. 우리가 전에보고 한 바와 같이15세, 종양 발생 BRAF (V600E)는 이량체로서 기능하며, 이량체 인터페이스에서 Arg-to-His 돌연변이 (R509H)를 가진 화합물 돌연변이와 비 정경 APE 변경 (APE 모티프의 P622A)만이 이분화를 완전히 폐지하고 촉매를 차단할 수 있습니다. 활동 (그림 3B). 시험관 내 키나아제 분석법을 사용하여, 우리는 더 변형 된 원숭이 모티프, BRAF (V600E / AAE)와 BRAF (V600E / AAE)를 가진 BRAF (V600E) 변이체가 있음을 발견했지만, DIMER 인터페이스에서 Arg-to-His 돌연변이를 가진 BRAF (V600E / R509H)는 정화 시 촉매 활성을 잃어 버린 것으로 나타났습니다(그림 3C), 전자 변종은 후자보다 훨씬 덜 이량친 친화력 / 안정성을 가지고 있음을 시사한다. 이러한 BRAF(V600E) 변이체의 성향을 직접 측정하여 디머를 형성하기 위해 무료 분할 루시페라아아제 분석법을 실시했으며, 이러한 변종은 BRAF(V600E)보다 높은 BRAF(V600E)와 매우 다른 이량친 친화성/안정성을 가지고 있음을 확인했습니다. R509H) BRAF(V600E/R509H/AAE) (V600E/AAE)보다그림 3D). 단일성 BRAF(V600E/R509H/AAE)에 의해 생성된 루시퍼라아제 신호는 비형질감염 293T 제어(그림 3D, 왼쪽 패널 레인 5), 이 분석이 매우 낮은 배경을 가지고 있음을 나타냅니다. 무료 분할 루시페라아제 분석의 효과를 더욱 확인하기 위해, 당사는 당사 및 기타 에 의해 확인된 β3-αC 루프의 프레임 내 삭제를 가진 종양 발생 성 BRAF 돌연변이체군의 상대이체 친화성/안정성을 이 분석법을 사용하여 측정합니다. 그룹15세,37세,38세. 우리가 알고 있듯이, 이 돌연변이체의 전부는 293T 세포에서 표현될 때 ERK 신호를 활성화했더라도 (그림 3전자) 그들은 시험관 내에서 매우 차동 촉매 활성을 나타냈다 (그림 3F). BRAF (□MLN (aa484-486 del)) 및 BRAF (□NVTAP (aa486-490 del)) 면역 침전에 의한 정제시 매우 적극적이었다, BRAF (nVTAPT (aa486-491 del)) 및 BRAF (□QA (aa496-497 del)))는 동일한 조건에서 촉매 활동을 잃었습니다. GST 융합에 의해 구출 될 수있다. 또한, BRAF(NVTAP), BRAF(V471F/́ NVTAP)의 키나아제 데드 버전은 세포에서 발현될 때 내인성 RAF를 활성화하는 강력한 효능을 나타내었다(그림 1B레인 7). 이 데이터는 BRAF 돌연변이체의 이 단이 BRAF (□NVTAP)보다 BRAF (□NVTAP)와 BRAF (nVTAP) 및 BRAF (QA)보다 높은 BRAF (nVTAP)와 매우 다른 이량 친화성 / 안정성을 가지고 있음을 시사한다. 실제로, 무료 분할 루시페라아제 분석의 결과는 완전히 우리의 추론을 지원 (그림 3G). 종합하면, 우리의 데이터는 무료 분할 루시퍼라아제 분석이 RAF 돌연변이체의 상대적 이량친 친화성/안정성을 측정하는 신뢰할 수 있는 방법임을 나타냅니다.
그림 1 : 시험관내 키나아제 분석기를 사용하여 RAF 돌연변이체의 촉매 활성을 조사합니다. (A) 본 연구에서 사용되는 RAF 돌연변이에 대한 개략도. (b) 둘 다 세포에서 발현될 때 ERK 시그널링을 활성화시킬 수 있다. 293T 세포는 상이한 RAF 돌연변이를 암호화하는 벡터로 형질감염되었고, ERK의 활성은 항포스포-ERK1/2 면역블롯에 의해 검출되었다. (C) 활성 RAF 돌연변이체는 낮은 이량친 친화성/안정성뿐만 아니라 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 면역침전에 의한 정제시 시험관 내에서 MEK를 인산화할 수 없다. B에서RAF 돌연변이체는 항-FLAG 비드를 사용하여 정제되었고, 이들의 촉매 활성은 프로토콜에 기재된 바와 같이 시험관내 키나아제 분석기를 사용하여 조사하였다. (D-E) 낮은 이체 친화도/안정성을 가진 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체의 체외 촉매 활성은 GST 융합에 의해 구출될 수 있다. (D) 293T 세포에서 이들의 GST 융합 된 항체 돌연변이체 및 그들의 GST 융합 대응체를 항인-ERK1/2 면역블롯에 의해 측정하였다. (e) D에서의 RAF 돌연변이체는 면역침전에 의해 정제되었고, 이들의 체외 촉매 활성은 프로토콜에 기재된 바와 같이 시험관내 키나아제 분석기를 사용하여 조사하였다. RAF R-척추 돌연변이체: BRAF (L505M), CRAF (DDEE / L397M), 및 ARAF (DGEE / L358M). "́NVTAP"는 BRAF에서 aa486-490의 삭제를 나타냅니다. ARAF의 APE 돌연변이는 ARAF에서 정식 APE 모티프를 생성하는 A475P를 의미한다. "KD"는 전체 텍스트에서 "키나제 도메인"을 나타냅니다. BRAF(KD)는 BRAF의 aa431-766 단편을 의미하며, CRAF(KD) 및 ARAF(KD)는 각각 CRAF의 aa323-648 단편 및 ARAF의 aa284-606 단편을 나타낸다. 이 수치의 결과는 이전에보고된 15,22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : RAF 공동 활성화 분석기를 사용하여 야생형 RAF를 트랜스활성화하는 RAF 돌연변이체의 능력을 평가한다. (A) RAF 공동 활성화 분석방법을 보여주는 다이어그램. (B) 산성 NtA 모티프를 가진 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 293T 세포에서 촉매 유능한 CRAF 수신기와 공동 발현되었고, 293T 트랜스펙트에서 ERK1/2의 활성을 항포쇼-ERK1/2 면역블롯에 의해 측정하였다. 매우 높은 이량친 친화성/안정성을 가지는 BRAF(V471F/́ NVTAP)를 제외한 대부분의 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 ERK 시그널링을 켜기 위해 외인성 RAF 수신기의 공동 발현이 필요했습니다. 이 수치의 결과는 이전에보고된 15,22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 무료 분할 루시퍼라아제 분석법을 사용하여 RAF 돌연변이체의 상대적 이량체 친화성/안정성을 측정합니다. (A) 무료 분할 루시퍼라아제 분석기를 보여주는 다이어그램. (B-D) BRAF (V600E) 변이체의 이각은 생체 외 및 시험관에서의 촉매 활성에 필요합니다. (B) 단모성 BRAF (V600E) 변종, BRAF (V600E / R509H / AAE)는 GST 융합에 의해 회복 될 수있는 생체 내에서 촉매 활성이 없습니다. BRAF(V600E) 변이체 및 그들의 GST 융합 대응체는 293T 세포에서 발현되었고, 그들의 활성은 항인-ERK1/2에 의해 측정되었다. (C) 낮은 이질 친화성/안정성을 가진 BRAF(V600E) 변이체, BRAF(V600E/AAE)는 GST 융합에 의해 구출될 수 있는 정제 시 시험관 내에서 촉매 활성을 잃었다. B로부터의 BRAF(V600E) 변이체는 면역침전에 의해 정제되었고, 이들의 촉매 활성은 프로토콜에 기재된 바와 같이 시험관내 키나아제 분석기에 의해 조사되었다. (D) BRAF(V600E) 변이체의 상대적 이각친화도/안정성은 프로토콜에 기재된 바와 같이 무료 분할 루시페라아아제 분석법을 사용하여 측정하였다. (E-G) ERK 시그널링을 활성화하기 위해 β3-αC 루프 기능을 디머로 프레임 내에서 삭제하는 BRAF 돌연변이체. (E) β3-αC 루프의 프레임 내 결실을 가진 BRAF 돌연변이체는 세포에서 발현될 때 ERK 시그널링을 활성화한다. BRAF 돌연변이체는 293T 세포에서 발현되었고 그들의 활성은 B에서 기재된 바와 같이 측정되었다. (F) E로부터 낮은 이질 친화도/안정성을 가진 BRAF 돌연변이체는 GST 융합에 의해 구출될 수 있는 시험관 내에서 촉매 활성을 잃었다. BRAF 돌연변이체및 E로부터의 그들의 GST 융합 대응물의 시험관내 촉매 활성은 C에서와 같이 측정되었다. (G) β3-αC 루프의 프레임 내 결실을 가진 BRAF 돌연변이체는 매우 다른 이광친성/안정성을 갖는다. β3-αC 루프의 프레임 내 결실을 가진 BRAF 돌연변이체의 상대적 이량체 친화성/안정성은 D에서와 같이 측정되었다. D&G의 오류 막대는 s.d.를 나타내며 독립 실험 간의 차이를 나타냅니다(n = 4). BRAF의 AAE 돌연변이는 비표준 APE 모티프를 생성하는 APE 모티프의 P622A를 의미한다. BRAF의 β3-αC 루프에서 aa484-486, aa486-491, aa496-497의 삭제를 각각 나타낸다. 이 그림의 일부 결과는 이전에 보고 되었습니다15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 다양한 RAF 돌연변이체의 생물학적 성질. 본 연구에서 사용된 모든 RAF 돌연변이체의 촉매 활성, 알로스테릭 활성 및 상대적 이수체 친화성/안정성은 이 표에 요약되어 있다. "Y"는 "예"를 의미하고 "N"은 "아니오"를 의미합니다. "N*" GST와 융합하는 경우 그 돌연변이가 촉매 활성을 가지고 있음을 나타냅니다. "++++", "+++", "++", "+", "-"는 각각 "매우 강한", "강한", "강한", "중간", "약한", "없음"을 나타냅니다.
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Discussion
이 기사에서는 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 무료 분할 루시페라아아제 분석법을 포함하는 질병 관련 RAF 돌연변이를 특성화하는 세 가지 방법을 제시했습니다. RAF 키나아제는 촉매 활성과 알로스테릭 활성을 모두 갖기 때문에, 다양한 RAF 돌연변이체는 두 가지 메커니즘을 통해 다운스트림 신호를 활성화할 수 있다13,14,16,17, 18. 구성활성 RAF 돌연변이체는 하류 이펙터 MEK를 직접 인산화하는 반면, 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체는 야생형 의 대응물질을 거래함으로써 다운스트림 신호를 트리거한다. 그러나, 둘 다 구성적으로 활성 및 키나제 죽은 RAF 돌연변이체는 그들의 기능15,16,17,19,20및 이분법을 이행하기 위하여 이화가 요구됩니다. RAF 돌연변이체의 성향은 RAF 돌연변이체의 촉매 또는 알로스테릭 활성뿐만 아니라 RAF 억제제에 대한 민감도15,24를결정한다. 시험관 내 키나아제 분석, RAF 공동 활성화 분석 및 무료 분할 루시퍼라아제 분석법은 키나아제 죽은 돌연변이체와 구성적으로 활성 돌연변이를 구별하고 평가할 수 있는 간단하고 효과적이며 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 다운스트림 시그널링을 활성화할 수 있습니다.
시험관내 키나아제 분석법은 단백질 키나아제의 촉매 활성을 검출하는 고전적인 방법이다. RAF 돌연변이체의 촉매 활성을 측정하기 위한 이 방법을 채택하기 위해, 우리는 시약 및 절차15,21,22에서몇 가지 중요한 개정을 했다. RAF 패밀리 키나아제는 기질, MEK 및 이량친 친화성/안정성이 상대적으로 낮기 때문에 RAF 단백질정화를 위한 완충제에서 세제 NP-40의 농도를 1%에서 0.25%로 감소시켰습니다. RAF는 해리에서 이동기. 같은 토큰으로, 우리는 또한 RAF 단백질 정제를 위한 온화한 빠른 세척 절차를 이용했습니다. 이러한 변화는 매우 약한 이분화 친화성/안정성을 가진 구성적으로 활성 RAF 돌연변이체의 촉매 활성을 검출하는 데 중요하며, 이는 고전적인 시험관 내 키나아제 분석에 의해 "키나아제 죽은" RAF 돌연변이체로 식별될 수 있다. 또한, GST 융합은이러한 분석15,21,22에서정제 시 RAF 이동기가해리되는 것을 방지하는 좋은 대안적인 방법임을 입증하였다. 키나제 죽은 RAF 돌연변이체에 관해서는, GST와 융합되더라도, 그들은 이 분석에서 어떤 촉매 활성도 나타내지 않는다.
RAF공동 활성화 분석은 야생형 대응13,15,21,22,23을 트랜스활성화하는 키나아제 죽은 RAF 돌연변이체의 능력을 평가하기 위해 개발되었습니다. , 25. 이 새로운 분석법에서, 우리는 N-말단 잘린 RAF 단백질을 사용하고, 따라서 활성 RAS 돌연변이체의 공동 발현또는 RAS를 활성화할 필요가 없으며, 이는 이 분석법을 매우 민감하게 만든다. 또한, 이러한 분석법에서 알로스테리 액티베이터(kinase-dead RAF 돌연변이체)와 수신기(촉매-유능한 RAF 돌연변이체)는 이량화 구동형 트랜스활성화 과정에서 분자 이벤트를 조사하기 위해 용이하게 단리및 정제될 수 있다. 13.
우리가 위에서 언급 한 바와 같이, 이량 친화성 / 안정성은 RAF 패밀리 키나아제와 그 돌연변이체의 기능을 조절하는 핵심 요소이며, 또한 RAF 억제제에 대한 민감도를 결정13,14,15, 16,17,18,24. 그러나, RAF 패밀리 키나아제및 그들의 가장 질병 관련 돌연변이체의 이분성/안정성은 매우 낮다. 이 매개 변수를 측정하기 위해 기존의 생화학 분석법은 복잡한 실험 절차와 고급 장비(예: SPR 분석실험)를 요구하거나 신뢰할 수 있고 재현 가능한 데이터(예: 면역 침전 분석)를 거의 생성하지 않습니다. 대조적으로, 무료 분할 루시퍼라아제 분석법은 RAF 패밀리 키나아제 및 이들의 돌연변이체의 상대적 이분화 친화도/안정성을 측정하기 위한 간단하고, 민감하고, 일관되고, 비용 효율적인방법이다. 22,36. 이 분석은 다양한 RAF 돌연변이체 들 사이에서 이각 친화성/안정성의 미묘한 차이를 조사할 수 있다. 우리가 전에보고15,BRAF (V600E / AAE)는 매우 약한 이광성 / 안정성을 가지고 있으며, 그 이이머는 매우 부드러운 절차를 사용하는 경우에도 정제시 완전히 파손됩니다. 이 분석법을 사용하여 BRAF(V600E/AAE)의 약한 이량친 친화성/안정성을 단면성 BRAF(V600E/AAE/R509H)와구별할 수 있습니다(그림 3).
요약하자면, 이러한 실용적이고 실현 가능한 방법 세트는 모든 질병 관련 RAF 돌연변이를 정의하는 요건을 충족시킬 수 있으며, 따라서 다양한 RAF 돌연변이 구동 질환 을 치료하기 위한 적절한 전략을 선택하는 데 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
저자는 위안 지민의 지원을 위한 털이 많은 세포 백혈병 동호회를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 아시아 펀드 암 연구 (AFCR2017 / 2019-JH), 듀크 누스 쿠 브릿지 자금 조달 상 (듀크 - NUS-KBrFA / 2018 / 0014), NCCRF 브리징 보조금 (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF 파일럿 보조금 (NCCRF-YR2017-2017)에 의해 지원되었습니다. 연구 보조금 (AM/ TP011/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
| GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |
References
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