Summary
I den här artikeln presenterade vi en uppsättning praktiska och genomförbara metoder för att karakterisera sjukdomsrelaterade mutanter av RAF-familjekinaser, som inkluderar in vitro-Kinas-analys, RAF-Co-Activation-analys och kompletterande Split luciferas-analys.
Abstract
Den snabbt accelererade fibrosarkom (RAF) familjen kinaser spelar en central roll i cellbiologi och deras dysfunktion leder till cancer och utvecklingsstörningar. En karakterisering av sjukdomsrelaterade RAF mutanter kommer att hjälpa oss att välja lämpliga terapeutiska strategier för att behandla dessa sjukdomar. Nyligen genomförda studier har visat att RAF familjen kinaser har både katalytiska och Allosteriska aktiviteter, som är tätt reglerade av Dimerization. Här har vi konstruerat en uppsättning av praktiska och genomförbara metoder för att bestämma den katalytiska och Allosteriska verksamheten och den relativa dimeraffinitet/stabiliteten hos RAF-familjekinaser och deras mutanter. För det första har vi ändrat den klassiska in vitro-kinasanalysen genom att minska tvättmedels koncentrationen i buffertar, använda en mild snabb tvätt förfarande och anställa en glutation S-transferas (GST) Fusion för att förhindra att RAF dimerer dissocierar under Rening. Detta gör det möjligt för oss att mäta den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF mutanter på lämpligt sätt. För det andra utvecklade vi en roman RAF Co-Activation assay för att utvärdera Alloster aktivitet av Kinas-döda RAF mutanter genom att använda N-Terminal stympade RAF proteiner, vilket eliminerar kravet på aktiva ras i nuvarande protokoll och därmed uppnå en högre Känslighet. Slutligen genererade vi en unik kompletterande Split luciferas assay att kvantitativt mäta den relativa dimer samhörighet/stabilitet olika RAF mutanter, som är mer tillförlitlig och känslig jämfört med den traditionella Co-immunoprecipitation analysen. Sammanfattnings, dessa metoder har följande fördelar: (1) användarvänlig; 2. kunna utföra effektivt utan avancerad utrustning, (3) kostnadseffektivt. (4) mycket känsliga och reproducerbara.
Introduction
RAF-familjen kinaser är en viktig del av ras/RAF/MEK/erk-signalkaskaden, som sänder en signal från ras för aktivering av mitogenaktiverat proteinkinas (MEK)1,2,3,4. Denna familj av kinaser spelar en avgörande roll i celltillväxt, överlevnad och differentiering, och deras förändringar inducerar många sjukdomar, särskilt cancer5,6,7,8. Nyligen har genomiska sequencings identifierat många sjukdomsrelaterade RAF mutanter som uppvisar olika egenskaper i signalöverföringen av ras/RAF/MEK/erk Cascade9,10,11. En noggrann karakterisering av RAF mutanter kommer att hjälpa oss att förstå de molekylära mekanismerna för hur RAF mutanter förändrar signalen från RAS/RAF/MEK/ERK Cascade, så småningom välja lämpliga metoder för behandling av olika RAF Mutant-drivna sjukdomar.
RAF familjen kinaser omfatta tre medlemmar, craf, BRAF, och ARAF, som har liknande molekylära strukturer men olika förmågor för att aktivera nedströms signalering1,2,3,4. Bland dessa paralogs har BRAF den högsta aktiviteten på grund av dess konstitutivt fosforylerade nta (N-terminal acidic) motiv12,13,14, medan ARAF har lägst verksamhet som härrör från dess icke-kanoniska apa motiv15. Detta kan förklara de olika Mutations frekvenserna för RAF-paralogs vid sjukdomar: BRAF > CRAF > ARAF. Dessutom, inom samma RAF paralog, mutationer i olika platser kan utlösa nedströms signalering i distinkta sätt, vilket tillför ytterligare ett lager av komplexitet till regleringen av RAF familjen kinaser. Nyligen genomförda studier har visat att alla RAF-kinaser har både katalytisk och allosterisk verksamhet13,14,16,17,18. Konstitutivt aktiva RAF mutanter slå på nedströms signalering direkt av fosforylerande MEK, medan Kinas-döda RAF mutanter kan transaktivera sina Wild-Type motsvarigheter genom sida till sida Dimerization och aktivera MEK-ERK signalering16 ,19,20. Dimeraffinitet/stabilitet är en nyckelparameter som inte bara avgör den Allosteriska aktiviteten hos Kinase-döda RAF-mutanter utan även påverkar den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF-mutanter15,21, 22. den Kinas-döda RAF mutanter med hög dimer samhörighet/stabilitet kan transaktivera endogena vildtyp rafs direkt15, medan de med mellanliggande dimer samhörighet/stabilitet kräver en samordning av aktiva ras eller en förhöjda nivåer av vildtyp RAF-molekyler för att fungera13,15,20,21,23. Likaså, konstitutivt aktiva RAF mutanter fosforylera MEK på ett dimer-beroende sätt, och de med låg dimer affinitet/stabilitet förlorar sin katalytisk aktivitet in vitro-på immunoprecipitation som bryter de svaga RAF dimerer15, 21,22. Den dimer affiniteten/stabiliteten avgör också känsligheten av RAF mutanter till deras inhibitorer, och positivt korrelerar till motståndet av RAF-hämmare24. Därför, för att karakterisera sjukdomsrelaterade RAF mutanter, är det nödvändigt att mäta deras katalytisk och allosterisk verksamhet, och dimer samhörighet/stabilitet.
Under de senaste åren har vårt laboratorium och andra utvecklat olika metoder för att karakterisera RAF-familjekinaser och deras mutanter. Enligt vårt laboratorium och andras erfarenhet, tror vi att följande tre analyser har fördelar med att definiera sjukdomsrelaterade RAF mutanter: (1) in vitro-Kinas analys som kan utföras med lätthet att upptäcka den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF mutanter15; (2) Co-aktiveringsanalysen för RAF som är en tillförlitlig och bekväm metod för att mäta den Allosteriska aktiviteten hos Kinase-döda RAF-mutanter13,15,21,22,23, 25. (3) den kostnadsfria Split luciferas-analysen som har mycket högre känslighet vid mätning av den relativa dimeraffiniteten/stabiliteten hos RAF-mutanter i motsats till den traditionella Co-immunoprecipitation-analysen, och som kan utföra utan avancerad utrustning i kvantitativa analytiska metoder såsom spr (surface Plasmon Resonance) analys15,22. Kombinera dessa tre analyser, kan vi förstå lätt hur en sjukdomsrelaterad RAF Mutant förändrar nedströms signalering och därmed utnyttja en lämplig terapeutisk strategi för att behandla den sjukdom som orsakas av denna RAF-mutation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. in vitro-Kinasanalys för mätning av den katalytiska aktiviteten hos RAF mutanter
- Konstruera vektorer kodning RAF mutanter (figur 1A) med flagga (DYKDDDDK) tag på C-terminus med hjälp av Gibson montering eller traditionella molekylära klonings metoder.
- Introducera flaggan taggen och mutationer i RAF kodning sekvenser av PCRs, och sedan infoga hela sekvenser i pCDNA 3,1 (+) vektor med hjälp av Gibson Assembly eller T4 DNA ligering och efter tillverkningen protokoll. Använd följande villkor för PCR-reaktioner: (1) 95 ° c, 2 min; (2) 95 ° c, 30 s; (3) 59 ° c, 30 s; (4) 68 ° c, 3 min; (5) 20 cykler (2 till 4). (6) 4 ° c håll.
Anmärkning: PCR-primers för kloning: 5-AAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCC-3 och 5-CAGCGGGTTTAAACGGGCCCTCTA-3. - Infoga GST kodning sekvens uppströms RAF Mutant kodning sekvenser för att generera vektorer kodning GST-smält RAF mutanter genom att använda samma metoder som beskrivs i steg 1.1.1.
- Validera alla vektorer med DNA sequencings före transfektion.
- Introducera flaggan taggen och mutationer i RAF kodning sekvenser av PCRs, och sedan infoga hela sekvenser i pCDNA 3,1 (+) vektor med hjälp av Gibson Assembly eller T4 DNA ligering och efter tillverkningen protokoll. Använd följande villkor för PCR-reaktioner: (1) 95 ° c, 2 min; (2) 95 ° c, 30 s; (3) 59 ° c, 30 s; (4) 68 ° c, 3 min; (5) 20 cykler (2 till 4). (6) 4 ° c håll.
- Plate 293T-celler i 6-well-plattor med en densitet av 5 x 105 celler/väl en dag före transfektion. När CELLTÄTHETEN når 80 ~ 90% sammanflödet på den andra dagen, transfect med vektorer kodning flagga-märkta RAF kinaser eller deras mutanter från steg 1,1 i celler genom att följa tillverkarens protokoll av transfektion reagens (tabell över material).
- Byt ut odlingsmediet 24 h efter transfektion.
- Aspirera odlingsmediet 48 h efter transfektion och tillsätt 400 μL/brunn av lyseringsbuffert (25 mM Tris · HCl, 150 mM NaCl, 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 0,25% NP-40, pH 7,2) kompletterat med proteas och fosfatashämmare till lyse celler på is.
Anmärkning: Koncentrationen av NP-40 i lyseringsbuffert är avgörande för att upptäcka den katalytiska aktiviteten av RAF mutanter med måttlig dimer affinitet/stabilitet in vitro. En hög koncentration av tvättmedel eller ett starkt rengöringsmedel i lyseringsbuffert kan bryta RAF dimerer och därmed döda den katalytiska aktiviteten av RAF kinaser eller deras mutanter. - Överför cell celllysat till en 1,5 ml tub, och snurra ner med 12 000 x g i 10 min vid 4 ° c för att tömma Cellrester.
- Överför 300 μl per prov av rena hel cells celllysat till 1,5 ml-rör, tillsätt 20 μl per prov av anti-Flag affinitetspärlor och rotera i ett kallt rum (4 ° c) i 1 h. Ta också 40 μl per prov av ren hela cellen lysate åt sidan för att upptäcka uttryck och aktivitet (Phospho-ERK1/2) av RAF mutanter av Immunoblots som beskrivs nedan.
- Tvätta anti-Flag pärlor en gång med lysis buffert, sedan en gång med Kinas reaktionsbuffert (20 mm Hepes, 10 mm mgcl2, 0,5 mm na3VO4, 0,5 mm DTT, pH 7,2), och tillsätt 20 μl av Kinas reaktionsblandning (2 μg MEK1 (K97A) och 100 μm ATP i 20 μl av Kinas re åtgärdsbuffert) per sampling.
Anmärkning: Pärltvätten bör fyllas försiktigt och snabbt, resterande buffert bör aspireras helt innan du lägger till Kinas reaktionsblandning, och all verksamhet i detta steg bör utföras vid 4 ° c i ett kallt rum. - Inkubera Kinas reaktioner i rumstemperatur (25 ° c) i 10 min, och vänd rören som innehåller Kinas reaktioner med fingrarna varannan minut under inkubering.
- Tillsätt 5 μL 5x SDS prov buffert (375 mM Tris · HCl, 9% natriumdodecylsulfat (SDS), 50% glycerol, 0,03% bromfenolblått) per prov för att stoppa Kinas reaktioner, och sedan värma proverna vid 90 ° c i 5 min.
- Kör proverna i 9 ~ 12% polyakrylamid gel elektrofores (sida) med 0,1% SDS, överföra proteiner till nitrocellulosa membran, och upptäcka halterna av fosformemek och RAF mutanter i prover av Immunoblots.
Anmärkning: Phospho-MEK kan också kvantifieras med hjälp av γ32P-ATP-inkorporering. Kort, 10 μM γ32P-ATP tillsätts till Kinas reaktionsbuffert, och mängden fosforylerad MEK sedan kvantifieras efter sid separation med hjälp av standard Autoradiography, fosfor, eller flytande scintillationoräknande tekniker som Lämpliga.
2. RAF-Co-Activation-analys för utvärdering av allosterisk aktivitet av Kinase-döda RAF-mutanter
- Konstruera vektorer som kodar RAF-mottagaren (CRAF-kinasdomänen med ofosforylatable NtA-motiv, AAFF) eller Kinas-döda RAF-aktivatorer (RAF-kinasdomänen med fosforylationshärmade NtA-motiv, SSDD, DDEE eller DGEE) (figur 1A) som beskrivs i steg 1,1.
- Transfect 293T-celler med två vektorer som kodar både RAF-mottagaren och Kinas-döda RAF-aktivator eller en enda vektor kodning ett av proteinerna enligt beskrivningen i steg 1,2 och 1,3.
- Ersätt odlingsmediet vid 24 h efter transfektion, och skörda 293t transfektanter på 48 h för att förbereda hela cellen celllysat som beskrivs i steg 1,4 och 1,5.
- Blanda den rena hela cellen lysate med 5x SDS prov buffert snabbt vid rumstemperatur (25 ° c) och sedan koka vid 90 ° c i 5 min.
- Kör kokt hela cellen lysate prover i 9 ~ 12% sida med 0,1% SDS, överföra proteiner till nitrocellulosa membran, och upptäcka nivåerna av Phospho-ERK1/2 och kontroll proteiner av Immunoblots.
3. gratis Split Luciferase-analys för mätning av relativ Dimeraffinitet/stabilitet för RAF mutanter
- Konstruera vektorer kodning flagga-märkta RAF mutanter smält till n-Terminus av nluc (n-Terminus av Firefly luciferase, AA2-416) eller c-Terminus av Cluc (C-terminus i Firefly luciferase, aa398-550) som beskrivs i steg 1,1.
- Transfect 293T-celler med ett par vektorer som kodar olika Nluc-RAF-mutanter och Cluc-RAF-mutanter enligt beskrivningen i steg 1,2.
- Vid 24 h efter transfektion, replate 293T cell transfektanter i Krystal svart bildplattor på CELLTÄTHETEN av 2x105 per brunn med färg-fritt medium (dvs., DMEM utan fenolrött).
- 24 h senare, tillsätt D-Luciferin (0,2 mg/ml) till 293t cell transfectants, inkubera i 30 min, och mäta luciferas signaler med hjälp av en multi Detection System (tabell över material).
- Efter mätning av luciferas signaler, aspirera medium och lyse 293t transfektanter med lysis buffert för att förbereda hela cellen celllysat som beskrivs i steg 1,4 och 1,5.
- Kör hela cellen lysate prover i 9 ~ 12% sida med 0,1% SDS och upptäcka uttrycks nivåer av Nluc-RAF mutanter och Cluc-RAF mutanter av anti-flagga immunoblot som beskrivs i steg 2,5. De relativa uttrycksnivåerna för både Nluc-RAF Mutant och Cluc-RAF Mutant i 293T-transfektiva ämnen kvantifieras med hjälp av bild J från deras Immunoblots.
- Normalisera luciferas signaler av 293t cell transfectants enligt uttrycks nivåer av nluc-RAF mutanter och Cluc-RAF mutanter. Kortfattat uppnås detta genom att dividera den råa luciferas signalen med relativa uttrycks nivåer av nluc-RAF mutanter och Cluc-RAF mutanter från steg 3,6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
RAF-familjen kinaser har både katalytisk och allosterisk verksamhet, vilket gör det möjligt för deras sjukdomsrelaterade mutanter att slå på nedströms signalering genom olika mekanismer13,14,16,17 ,18. Den konstitutivt aktiva RAF mutanter direkt fosforylera sina substrat, medan Kinas-döda RAF mutanter uppfylla sin funktion genom transaktiverande Wild-Type motsvarigheter. Som visas i figur 1B, båda konstitutivt aktiva RAF mutanter (såsom regulatoriska ryggrad (R-Spine) mutanter (BRAF (L505M), craf (ddee/L397M) och ARAF (dgee/L358M))13,23,25 , 26, BRAF (V600E) och BRAF (∆ nvtap)) och Kinas-döda RAF-mutanter (såsom katalytisk ryggrad (C-Spine)-SMÄLT BRAF (∆ nvtap/V471F)15) aktiverar erk när det uttrycks i 293t-celler. Därför kan RAF mutanter förmåga att aktivera erk signalering i celler inte fungera som en standard för att skilja en konstitutivt aktiv Mutant från en Kinas-död Mutant, även om vissa Kinas-döda mutanter med måttlig dimer samhörighet/stabilitet slås på nedströms signalering endast med samarbete mellan aktiva ras. Tre metoder som vi presenterade här kan hjälpa oss att effektivt karakterisera alla sjukdomsrelaterade RAF mutanter. De biologiska egenskaperna hos alla RAF mutanter avslöjade genom att använda dessa analyser i våra tidigare studier har sammanfattats i tabell 1.
Den första metoden som vi kan använda för att särskilja de konstitutivt aktiva RAF-mutanterna från Kinas-döda RAF-mutanter är in vitro-kinasanalysen. I denna analys renades RAF-mutanterna genom immunoprecipitation och de katalytiska reaktionerna utfördes in vitro med Kinase-Dead MEK1 (K97A) och ATP som substrat. Den katalytiska aktiviteten av RAF mutanter mättes som Al (enctivation LOOP)-fosforylering av MEK1 (K97A) i Kinas reaktion blandningar av immunoblot. Som visas i figur 1C, kan denna analys effektivt sond katalytisk aktivitet av R-ryggrad mutanter av BRAF, craf och ARAF13,15,23, BRAF (V600E)9, och BRAF (∆ nvtap)15, men inte för Kinase-Dead BRAF (V471F/∆ NVTAP)15 som har en smält C-Spine. Emellertid, den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF mutanter med svag dimer samhörighet/stabilitet såsom ARAF R-Spine Mutant (ARAF (dgee/L358M)) (figur 1C, Lane 4), craf och ARAF mutanter med förändrad dimer Interface (craf (ddee/ L397M/R401H), ARAF (dgee/L358M/APE/R362H))15,22 (figur 1D, E) kanske inte är sonderade genom att använda denna analys, eftersom deras dimerer bröts under rening, särskilt när rening var utföras med buffertar som innehåller starka eller högkoncentrationsbaserade rengöringsmedel. För att undvika förlust av katalytisk aktivitet av RAF mutanter med svag dimer samhörighet/stabilitet, vi vanligtvis smält dessa mutanter med gst (glutathione S-transferase), ett dimeriskt protein med stark affinitet/stabilitet innan som utför in vitro-kinasanalys, som kan rädda den katalytiska aktiviteten hos dessa RAF-mutanter15,22 (figur 1E). I allmänhet kan de flesta RAF mutanter klassificeras som konstitutivt aktiva eller Kinas-döda mutanter med hjälp av denna analys.
Den andra metoden som vi beskrev här är RAF Co-Activation assay som kan användas för att utvärdera Alloster aktivitet av Kinas-döda RAF mutanter13,15,21,22,23 , 25. även om ett fåtal Kinas-döda RAF-mutanter med mycket hög dimertillhörighet/stabilitet såsom BRAF (V471F/∆ nvtap)15, direkt kan aktivera endogena RAF-molekyler när de uttrycks i celler (figur 1B, Lane 7), Kinas-döda RAF mutanter kräver samarbete med Active ras för att transaktivera vildtyp RAFs. Emellertid, aktiv ras är en direkt aktivare av ERK signalering, vars inledning kommer att öka den basala nivån av aktiv ERK. För att undvika interferens av aktiva ras, använde vi N-Terminus-stympade RAF mutanter i denna analys (figur 2a). Som visas i figur 2BKinas-döda mutanter av BRAF, craf och RAF med sura nta-motiv och C-Spine fusion (BRAF (V471F, aa431-766), craf (ddee/V363F, aa323-648) och ARAF (dgee/V324F, aa284-606)) fungerade som Allosteriska aktivatorer för att utlösa den katalytiska aktiviteten hos CRAF med icke-fosforylatable NtA-motiv (CRAF-mottagare, CRAF (AAFF, aa323-648)) när de samuttrycks i 293T-celler. I motsats, den Kinas-döda BRAF Mutant (V471F/∆ NVTAP, aa431-766) som har mycket hög dimer samhörighet/stabilitet (se nedan) vände på ERK signalering genom att utlösa endogena RAFs, även utan Co-uttryck av CRAF mottagare. Sammantaget kan denna analys användas för att utvärdera transaktiveringsförmågan hos alla Kinase-döda RAF-mutanter.
Dimeriseringen av RAF-familjekinaser reglerar inte bara deras förmåga att aktivera nedströms MEK-ERK-signalering, utan avgör också deras känslighet för RAF-hämmare15,16,20,22,24,27,28,29,30,31,32. I motsats till andra protein-proteininteraktioner mellan denna väg33,34,35, Dimerization av RAF familj kinaser och deras mutanter är relativt svag och svår att utvärderas med hjälp av traditionella biokemiska analyser såsom Co-immunoprecipitation. För att lösa detta problem utvecklade vi nyligen en kostnadsfri Split luciferas-analys för mätning av relativ dimertillhörighet/stabilitet för RAF-familjekinaser och deras mutanter15,22,36. Som visas iFigur 3Avar RAF Kinas-domänerna (aa431-766 för BRAF, aa323-648 för craf och aa284-606 för ARAF) sammansvetsade med N-Terminus (AA2-416) eller C-terminus (aa398-550) av Firefly luciferas (nluc och Cluc), som kommer att samlas för att montera intakt luciferas på RAF Dimerization. Aktiviteten av luciferas i denna analys korrelerar direkt med kvantiteten av RAF dimers. Denna analys är mycket känslig och kan upptäcka även en mycket svag Dimerization av RAF mutanter. Som vi rapporterade tidigare15, den onkogena BRAF (V600E) fungerar som en dimer, och endast en sammansatt mutation med arg-till-hans mutation (R509H) i dimer gränssnitt och icke-kanoniska APE förändring (P622A i APE motiv) kan helt avskaffa dess Dimerization och därmed blockera dess katalytiska aktivitetFigur 3B). Genom att använda in vitro kinasanalys fann vi vidare att BRAF (V600E) variant med det förändrade APE-motivet, BRAF (V600E/AAE), men inte att med arg-till-hans mutation i dimer gränssnitt, BRAF (V600E/R509H), förlorade sin katalytiska aktivitet vid rening (Figur 3C), vilket tyder på att den tidigare varianten har mycket mindre dimer samhörighet/stabilitet än den senare. För att direkt mäta benägenheten av dessa BRAF (V600E) varianter att bilda dimers, genomförde vi en gratis Split luciferas assay, och bekräftade att dessa varianter hade helt olika dimer samhörighet/stabilitet med BRAF (V600E) högre än BRAF (V600E/ R509H) än BRAF (V600E/AAE) än BRAF (V600E/R509H/AAE) (Figur 3D). Den luciferas signal producerad av monomer BRAF (V600E/R509H/AAE) var jämförbar med den för icke-transfected 293t kontroll (Figur 3D, vänster panel Lane 5), vilket indikerar att denna analys har en mycket låg bakgrund. För att ytterligare fastställa effektiviteten av gratis Split luciferas assay, vi nästa mätas med hjälp av denna analys den relativa dimer samhörighet/stabiliteten hos en grupp onkogena BRAF mutanter med i-Frame borttagningar av β3-αc loop som identifierades av oss och andra Grupper15,37,38. Som vi har känt, även om alla dessa mutanter aktiveras ERK signalering när den uttrycks i 293T celler (Figur 3E) uppvisade de ganska differential katalytisk aktivitet in vitro (Figur 3F). BRAF (∆ MLN (aa484-486 del)) och BRAF (∆ NVTAP (aa486-490 del)) var mycket aktiva vid rening av immunoprecipitaion, medan BRAF (∆ NVTAPT (aa486-491 del)) och BRAF (∆ QA (aa496-497 del)) förlorade sin katalytiska aktivitet under samma tillstånd även om det kan räddas av GST fusion. Dessutom uppvisade Kinas död version av BRAF (∆ NVTAP), BRAF (V471F/∆ NVTAP) en stark styrka för att aktivera endogena RAFs när den uttrycks i celler (Figur 1BLane 7). Dessa data tyder på att denna grupp av BRAF mutanter har helt olika dimer samhörighet/stabilitet med BRAF (∆ NVTAP) högre än BRAF (∆ MLN) än BRAF (∆ NVTAPT) och BRAF (∆ QA). Faktum är att resultatet från den kostnadsfria Split luciferas assay helt stödde vår inferens (Figur 3G). Sammantaget visar våra data att den kostnadsfria Split luciferas-analysen är en tillförlitlig metod för att mäta den relativa dimeraffinitet/stabiliteten hos RAF mutanter.
Figur 1 : Sond katalytisk aktivitet av RAF mutanter med hjälp av in vitro Kinas assay. A) ett Schematiskt diagram för de RAF-mutationer som används i denna studie. (B) både konstitutivt aktiva och Kinas-döda RAF mutanter kan aktivera erk signalering när den uttrycks i celler. 293t celler var transfekterade med vektorer som kodar olika RAF mutanter, och aktiviteten av erk upptäcktes av anti-fosho-ERK1/2 immunoblot. C) konstitutivt aktiva RAF-mutanter med låg dimeraffinitet/stabilitet samt kinasdöd RAF-mutanter kan inte fosforylera MEK in vitro vid rening genom immunoprecipitation. RAF mutanter i B renades med hjälp av anti-Flag pärlor, och deras katalytiska aktivitet var sonderade genom att använda in vitro-kinasanalys som beskrivs i protokollet. (D-E) In vitro katalytisk aktivitet av konstitutivt aktiva RAF mutanter med låg dimer samhörighet/stabilitet kan räddas av GST fusion. D) konstitutivt aktiva RAF-mutanter och deras gst-smält motsvarigheter uttrycktes i 293T-celler och deras aktivitet mättes med immunoblot mot fosfor-ERK1/2. E) RAF mutanter i D har renats genom immunoprecipitation och deras in vitro-katalytisk aktivitet har sonderade med hjälp av in vitro-kinasanalys enligt beskrivningen i protokollet. RAF R-ryggrad mutanter: BRAF (L505M), CRAF (DDEE/L397M) och ARAF (DGEE/L358M). "∆ NVTAP" representerar för strykningen av aa486-490 i BRAF. Apmutationen av ARAF betyder A475P som genererar ett kanoniskt apa motiv i ARAF. "KD" representerar "Kinas domän" i den fullständiga texten. BRAF (KD) är det aa431-766 fragmentet av BRAF, medan CRAF (KD) och ARAF (KD) representerar respektive för aa323-648 fragment av CRAF och aa284-606 fragment av ARAF. Resultaten i denna siffra har rapporterats tidigare15,22. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Utvärdera möjligheten för RAF mutanter att transaktivera vildtyp rafs med hjälp av RAF Co-Activation assay. A) ett diagram som illustrerar RAF-Co-aktiveringsanalysen. B) Kinase-döda RAF-mutanter med surt nta-motiv var tillsammans uttryckta med katalys-behörig craf-mottagare i 293t-celler, och AKTIVITETEN hos ERK1/2 hos 293t-transfektiva medel mättes genom anti-phosho-ERK1/2 immunoblot. De flesta Kinas-döda RAF mutanter utom BRAF (V471F/∆ NVTAP) som har en mycket hög dimer samhörighet/stabilitet krävs Co-uttryck av exogena RAF mottagare att slå på ERK signalering. Resultaten i denna siffra har rapporterats tidigare15,22. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Mät den relativa dimeraffinitet/stabiliteten hos RAF mutanter genom att använda den kostnadsfria Split luciferas-analysen. A) ett diagram som illustrerar den kostnadsfria Split luciferas-analysen. (B-D) Dimerization av BRAF (V600E) varianter krävs för deras katalytisk aktivitet in vivo och in vitro. B) monomeren BRAF-variant (V600E), BRAF (V600E/R509H/AAE) har ingen katalytisk aktivitet in vivo, som kan återvinnas genom gst-fusion. BRAF (V600E) varianter och deras GST-smält motsvarigheter uttrycktes i 293T celler, och deras aktivitet mättes genom anti-Phospho-ERK1/2. (C) BRAF (V600E) variant med låg dimer affinitet/stabilitet, BRAF (V600E/AAE) förlorade sin katalytiska aktivitet in vitro vid rening, som kan räddas genom gst fusion. BRAF (V600E) varianter från B renades genom immunoprecipitation och deras katalytiska aktivitet sonderade av in vitro-kinasanalys enligt beskrivningen i protokollet. D) den relativa dimeraffiniteten/stabiliteten hos BRAF-varianter (V600E) mättes med hjälp av den kostnadsfria Split luciferas-analysen enligt beskrivningen i protokollet. (E-G) BRAF mutanter med in-Frame radering av β3-αc loop funktion som dimerer att aktivera erk signalering. (E) BRAF mutanter med in-Frame radering av β3-αc loop aktivera erk signalering när den uttrycks i celler. BRAF-mutanter uttrycktes i 293T-celler och deras aktivitet mättes enligt beskrivningen i B. F) BRAF mutanter med låg dimeraffinitet/stabilitet från E förlorade sin katalytisk aktivitet in vitro, som kan räddas genom gst fusion. In vitro-katalytisk aktivitet av BRAF mutanter och deras GST-smält motsvarigheter från E mättes som i C. (G) BRAF mutanter med in-Frame radering av β3-αc loop har helt olika dimer samhörighet/stabilitet. Den relativa dimeraffiniteten/stabiliteten hos BRAF-mutanter med in-Frame-radering av β3-αC-slingan mättes som i D. Felstaplarna i D & G representerar SD för att Visa variansen mellan oberoende experiment (n = 4). AAE-mutationen av BRAF betyder P622A i APE-motiv som genererar ett icke-kanoniskt apa motiv. "∆ MLN", "∆ NVTAPT" och "∆ QA" representerar respektive för borttagningar av aa484-486, aa486-491, aa496-497 i β3-αC-slingan i BRAF. Några resultat i denna siffra har rapporterats tidigare15. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1: Biologiska egendom olika RAF mutanter. Den katalytiska aktiviteten, alloster aktivitet och relativ dimer affinitet/stabilitet för alla RAF mutanter som används i denna studie har sammanfattats i denna tabell. "Y" betyder "Ja", medan "N" står för "nej". "N*" indikerar att dessa mutanter har katalytisk aktivitet om de är brända med gst. "+ + + +", "+ + +", "+ +", "+", och "-" representerar respektive för "mycket stark", "stark", "mellanliggande", "svag", och "ingen".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel, presenterade vi tre metoder för att karakterisera sjukdomsrelaterade RAF mutanter, som inkluderar in vitro Kinas assay, RAF Co-Activation assay, och gratis Split luciferas assay. Eftersom RAF-kinaser har både katalytisk aktivitet och allosterisk aktivitet kan olika RAF-mutanter aktivera nedströms signalering genom två distinkta mekanismer13,14,16,17, 18. den konstitutivt aktiva RAF mutanter direkt fosforylera nedströms effektor MEK, medan Kinas-döda RAF mutanter utlösa nedströms signalering genom att transaktivera sina Wild-Type motsvarigheter. Men, både konstitutivt aktiva och Kinas-döda RAF mutanter kräver Dimerization att fullgöra sin funktion15,16,17,19,20, och dimer benägenhet för RAF mutanter bestämmer inte bara den katalytiska eller Allosteriska aktiviteten hos RAF mutanter utan även deras känslighet för RAF-hämmare15,24. Den in vitro Kinas assay, RAF Co-Activation assay, och gratis Split luciferas assay ger oss en uppsättning enkla, effektiva och pålitliga metoder för att särskilja de konstitutivt aktiva mutanter från Kinas-döda mutanter samt utvärdera deras möjlighet att aktivera nedströms signalering.
In vitro Kinas-analysen är en klassisk metod för att detektera den katalytiska aktiviteten hos proteinkinaser. För att anta denna metod för mätning av den katalytiska aktiviteten hos RAF Mutants har vi gjort några betydande revideringar av reagenser och procedurer15,21,22. Eftersom RAF-familjen kinaser fungerar som dimerer för att fosforylera deras substrat, MEK, och deras dimeraffinitet/stabilitet är relativt låg, har vi reducerat koncentrationen av diskmedel NP-40 från 1% till 0,25% i buffertar för rening av RAF-proteiner för att förhindra RAF dimerer från dissociation. På samma sätt har vi också använt en mild snabb tvätt förfarande för RAF Proteinrening. Dessa förändringar är avgörande för att upptäcka den katalytiska aktiviteten av konstitutivt aktiva RAF mutanter med mycket svag dimer samhörighet/stabilitet, som kan identifieras som "Kinas-döda" RAF mutanter av den klassiska in vitro Kinas assay. Dessutom har vi visat att GST fusion är ett bra alternativt sätt att förhindra RAF dimerer från dissociation under rening i detta test15,21,22. När det gäller Kinas-döda RAF mutanter, även om de är smält med GST, de uppvisar inte någon katalytisk aktivitet i denna analys.
RAF-Co-Activation-analysen har utvecklats av oss för att utvärdera förmågan hos Kinase-döda RAF-mutanter att transaktivera sina Wild-Type-motsvarigheter13,15,21,22,23 , 25. i denna nya analys använder vi N-Terminus TRUNKERADE RAF proteiner och därmed inte behöver Co-Expression av aktiva ras mutanter eller aktivera ras, vilket gör denna analys mycket känslig. Dessutom kan Alloster Activator (Kinas-döda RAF Mutant) och mottagaren (katalys-kompetent RAF Mutant) i denna analys lätt isoleras och renas för att undersöka molekylära händelser i processen för Dimerization-driven transaktivering 13.
Som vi nämnde ovan, den dimer affinitet/stabilitet är en nyckelfaktor som reglerar funktionen av RAF familjen kinaser och deras mutanter, och även avgör deras känslighet för RAF-hämmare13,14,15, 16,17,18,24. Emellertid, dimer affinitet/stabiliteten i RAF familj kinaser och deras mest sjukdomsrelaterade mutanter är mycket låg. För att mäta denna parameter, de traditionella biokemiska analyserna kräver komplicera experimentella procedurer och avancerad utrustning (såsom SPR-analys), eller knappast producera tillförlitliga och reproducerbara data (t. ex. immunoprecipitation assay). Däremot är den kostnadsfria Split luciferas-analysen en enkel, känslig, konsekvent och kostnadseffektiv metod för att mäta den relativa dimeraffiniteten/stabiliteten hos RAF-familjekinaser och deras mutanter15,21, 22,36. Denna analys kan söka den subtila skillnaden av dimer samhörighet/stabilitet bland olika RAF mutanter. Som vi rapporterade före15, BRAF (V600E/AAE) har en mycket svag dimer samhörighet/stabilitet och dess dimerer kommer att vara helt bruten på rening även om du använder en mycket skonsam förfarande. Med denna analys kan vi särskilja den svaga dimeraffinitet/stabiliteten hos BRAF (V600E/AAE) från monomerisk BRAF (V600E/AAE/R509H) (figur 3).
Sammanfattningsvis kan denna uppsättning av praktiska och genomförbara metoder uppfylla kraven för att definiera alla sjukdomsrelaterade RAF mutanter, och därmed hjälpa oss att välja lämpliga strategier för behandling av olika RAF Mutant-drivna sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna skulle vilja erkänna Hairy cell leukemi Fellowship för stöd av Yuan Jimin. Detta arbete stöddes av Asien fonden cancer Research (AFCR2017/2019-JH), Duke-NUS Khoo Bridge finansiering Award (Duke-NUS-KBrFA/2018/0014), NCCRF överbryggande Grant (NCCRF-YR2018-JUL-BG4), NCCRF pilot Grant (NCCRF-YR2017-JUL-PG3) och SHF akademisk medicin Forskningsbidrag (ÄNDR/TP011/2018).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-phosphoERK1/2 | Cell Signaling Technologies | 4370 | |
| anti-phosphoMEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9154 | |
| anti-ERK1/2 | AB clonal | A0229 | |
| anti-MEK1/2 | Cell Signaling Technologies | 9124 | |
| anti-FLAG(mouse) | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| anti-HA | Novus Biologicals | MAB6875 | |
| anti-FLAG(Rabbit) | Cell Signaling Technologies | 14793 | |
| anti-β-actin | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| anti-FLAG beads(M2) | Sigma-Aldrich | A4596 | |
| HRP-conjugated anti-mouse IgG | Jackson Laboratories | 115-035-003 | |
| HRP-conjugated anti-Rabbit IgG | Jackson Laboratories | 111-035-144 | |
| pcDNA3.1(+) | In vitrogen | V79020 | |
| Gibson Assembly Cloning Kit | New England Biolabs | E5510 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| Fugene 6 | Roche | 11 814 443 001 | |
| DMEM w/o phenol red | Invitrogen | 21063-029 | |
| D-luciferin | GoldBio | LUCK-100 | |
| 6xhis-tagged MEK1 (K97A) | prepared in our previous studies | N.A. | Reference 15. |
| GloMax-Multi Detection System. | Promega | E7041 |
References
- Chong, H., Vikis, H. G., Guan, K. L. Mechanisms of regulating the Raf kinase family. Cellular Signalling. 15 (5), 463-469 (2003).
- Wellbrock, C., Karasarides, M., Marais, R. The RAF proteins take center stage. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (11), 875-885 (2004).
- Baccarini, M. Second nature: biological functions of the Raf-1 "kinase". FEBS Letter. 579 (15), 3271-3277 (2005).
- Lavioe, H., Therrien, M. Regulation of RAF protein kinases in ERK signaling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (5), 281-298 (2015).
- Schreck, R., Rapp, U. R. Raf kinases: oncogenesis and drug discovery. International Journal of Cancer. 119 (10), 2261-2271 (2006).
- Roberts, P. J., Der, C. J. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 26 (22), 3291-3310 (2007).
- McCubrey, J. A., et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant transformation and drug resistance. Biochemistry Biophysics Acta. 1773 (8), 1263-1284 (2007).
- Schubbert, S., Shannon, K., Bollag, G. Hyperactive Ras in developmental disorders and cancer. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 295-308 (2007).
- Davies, H., et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature. 417 (6892), 949-954 (2002).
- Garnett, M. J., Marais, R. Guilty as charged: B-RAF is a human oncogene. Cancer Cell. 6 (4), 313-319 (2004).
- Pandit, B., et al. Gain-of-function RAF1 mutations cause Noonan and LEOPARD syndromes with hypertrophic cardiomyopathy. Nature Genetics. 39 (8), 1007-1012 (2007).
- Mason, C. S., Springer, C. J., Cooper, R. G., Superti-Furga, G., Marshall, C. J., Marais, R. Serine and tyrosine phosphorylations cooperate in Raf-1, but not B-Raf activation. EMBO Journal. 18 (8), 2137-2148 (1999).
- Hu, J., et al. Allosteric activation of functionally asymmetric RAF kinase dimers. Cell. 154 (5), 1036-1046 (2013).
- Desideri, E., Cavallo, A. L., Baccarini, M. Alike but different: RAF paralogs and their signaling outputs. Cell. 161 (5), 967-970 (2015).
- Yuan, J., et al. The dimer-dependent catalytic activity of RAF family kinases is revealed through characterizing their oncogenic mutants. Oncogene. 37 (43), 5719-5734 (2018).
- Wan, P. T., et al. Mechanism of activation of the RAF-ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell. 116 (6), 855-867 (2004).
- Shaw, A. S., Kornev, A. P., Hu, J., Ahuja, L. G., Taylor, S. S. Kinases and pseudokinases: lessons from RAF. Molecular and Cellular Biology. 34 (9), 1538-1546 (2014).
- Taylor, S. S., Shaw, A. S., Hu, J., Meharena, H. S., Kornev, A. P. Pseudokinases from a structural perspective. Biochemistry Society Transactions. 41 (4), 981-986 (2013).
- Rajakulendran, T., Sahmi, M., Lefrançois, M., Sicheri, F., Therrien, M. A dimerization-dependent mechanism drives RAF catalytic activation. Nature. 461 (7263), 542-545 (2009).
- Heidorn, S. J., et al. Kinase-dead BRAF and oncogenic RAS cooperate to drive tumor progression through CRAF. Cell. 140 (2), 209-221 (2010).
- Yuan, J., et al. Activating mutations in MEK1 enhance homodimerization and promote tumorigenesis. Science Signaling. 11 (554), 6795 (2018).
- Yuan, J., et al. The AMPK inhibitor overcomes the paradoxical effect of RAF inhibitors through blocking phospho-Ser-621 in the C terminus of CRAF. Journal of Biological Chemistry. 293 (37), 14276-14284 (2018).
- Hu, J., et al. Kinase regulation by hydrophobic spine assembly in cancer. Molecular and Cellular Biology. 35 (1), 264-276 (2015).
- Poulikakos, P., et al. RAF inhibitor resistance is mediated by dimerization of aberrantly spliced BRAF(V600E). Nature. 480 (7377), 387-390 (2011).
- Hu, J., et al. Mutation that blocks ATP binding creates a pseudokinase stabilizing the scaffolding function of kinase suppressor of Ras, CRAF and BRAF. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (15), 6067-6072 (2011).
- Taylor, S. S., Kornev, A. P. Protein kinases: evolution of dynamic regulatory proteins. Trends Biochemistry Sciences. 36 (2), 65-77 (2011).
- Farrar, M. A., Alberol-Ila, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383 (6596), 178-181 (1996).
- Luo, Z., Tzivion, G., Belshaw, P. J., Vavvas, D., Marshall, M., Avruch, J. Oligomerization activates c-Raf-1 through a Ras-dependent mechanism. Nature. 383 (6596), 181-185 (1996).
- Weber, C. K., Slupsky, J. R., Kalmes, H. A., Rapp, U. R. Active Ras induces heterodimerization of cRaf and BRaf. Cancer Research. 61 (9), 3595-3598 (2001).
- Garnett, M. J., Rana, S., Paterson, H., Barford, D., Marais, R. Wild-type and mutant B-RAF activate C-RAF through distinct mechanisms involving heterodimerization. Molecular Cell. 20 (6), 963-969 (2005).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Poulikakos, P. I., Zhang, C., Bollag, G., Shokat, K. M., Rosen, N. RAF inhibitors transactivate RAF dimers and ERK signalling in cells with wild-type BRAF. Nature. 464 (7287), 427-430 (2010).
- Kolch, W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/RAF/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochemistry Journal. 351, Pt 2 289-305 (2000).
- Cseh, B., Doma, E., Baccarini, M. "RAF" neighborhood: protein-protein interaction in the Raf/Mek/Erk pathway. FEBS Letters. 588 (15), 2398-2406 (2014).
- García-Gómez, R., Bustelo, X. R., Crespo, P. Protein-Protein Interactions: Emerging Oncotargets in the RAS-ERK Pathway. Trends Cancer. 4 (9), 616-633 (2018).
- Luker, K. E., Smith, M. C., Luker, G. D., Gammon, S. T., Piwnica-Worms, H., Piwnica-Worms, D. Kinetics of regulated protein–protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (33), 12288-12293 (2004).
- Chen, S. H., et al. Oncogenic BRAF deletions that function as homodimers and are sensitive to inhibition by RAF dimer inhibitor LY3009120. Cancer Discovery. 6 (3), 300-315 (2016).
- Foster, S. A., et al. Activation mechanism of oncogenic deletion mutations in BRAF, EGFR, and HER2. Cancer Cell. 29 (4), 477-493 (2016).
