Summary
생체 내 면역형광 국소화(IVIL) 방법은 생체내 종양 표적화 및 ex vivo 면역염색의 조합을 사용하여 살아있는 유기체에서 종양학적 목적을 위해 항체 및 항체 접합체의 생체 분포를 검사하는데 사용될 수 있다. 방법.
Abstract
단일 클론 항체 (mAbs)는 암 검출, 진단 및 치료에 중요한 도구입니다. 그(것)들은 종양 발생에 있는 단백질의 역할을 해명하기 위하여 이용되고, 종양 탐지 및 특성화를 가능하게 하는 암 biomarkers에 지시될 수 있고, 면역 이펙터 세포를 활성화하기 위하여 mAbs 또는 항체 약 접합체로 암 치료에 사용될 수 있고, 억제하기 위하여 신호 경로, 또는 직접 특정 항원을 운반 하는 세포를 죽일. 신규하고 고도로 특이적인 mAbs의 개발 및 생산에 대한 임상적 진보에도 불구하고, 진단 및 치료 응용은 종양 미세 환경의 복잡성과 이질성에 의해 손상될 수 있다. 따라서, 효율적인 항체 기반 치료 및 진단의 개발을 위해, 살아있는 종양 미세 환경과 항체 기반 컨쥬게이트의 생체 분포 및 상호작용을 평가하는 것이 중요하다. 여기에서, 우리는 생체 내 면역형 광형 국소화 (IVIL)를 생체 내 생리및 병리학 적 조건에서 항체 기반 치료제 및 진단의 상호 작용을 연구하는 새로운 접근법으로 설명합니다. 이 기술에서, 치료 적 또는 진단 항원 특이적 항체는 정맥 내 생체 내에서 주입되고 분리된 종양에서 이차 항체를 가진 생체외 로 국소화된다. 따라서 IVIL은 항체 기반 약물 및 표적화제의 생체내 생체 분포를 반영한다. 2개의 IVIL 응용은 유방암의 분자 화상 진찰을 위한 항체 기지를 둔 조영제의 biodistribution 그리고 접근성을 평가하는 기술됩니다. 이 프로토콜은 미래 사용자가 자신의 항체 기반 연구 응용 프로그램에 대한 IVIL 방법을 적응 할 수 있습니다.
Introduction
단클론 항체(mAb)는 B 세포에 의해 분비되는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 큰 당단백질(약 150 kDa)이며, 면역계에서 1차 적인 기능을 가지고 있는 것은 생물학적 기능을 식별하고 억제하거나, 또는 파괴, 세균 또는 바이러스 성 병원체, 암 세포에 비정상적인 단백질 발현을 인식할 수 있습니다1. 항체는 생물 의학2에서매우 유망한 도구를 만드는 펨토몰 농도까지 그들의 특정 에피토프에 매우 높은 친화력을 가질 수 있습니다. 밀스타인과 쾰러 (1984 년 노벨상 수상)에 의해 하이브리드 도마 기술의 개발과 함께, mAbs의 생산이 가능하게되었다3. 이후, 인간 mAb는 파지 디스플레이 기술 또는 형질전환 마우스 균주를 이용하여 생성되었고, 그들의 새로운 연구 도구 및 치료제로서의 사용에혁명을일으켰다4,5.
암은 전 세계적으로 건강 문제이며 예방, 탐지 및 치료에 대한 새로운 접근법의 필요성을 만드는 주요 사망 원인6. 현재까지, mAbs는 종양 발생에 있는 유전자 그리고 그들의 단백질의 역할의 구출을 허용하고 암 biomarkers에 대하여 지시될 때, 환자 계층화를 위한 종양 탐지 그리고 특성화를 가능하게 할 수 있습니다. 암 치료의 경우, 이중특이적 mAbs, 항체-약물 접합체 및 더 작은 항체 단편이 치료제로서 개발되고 있으며, 표적 약물 전달을 위한 치료 효능을 향상시키기 위해7. 추가적으로, 항체는 형광 유도 수술, 광음향 (PA) 화상 진찰, 초음파 (미국) 분자 화상 진찰 및 임상으로 이용된 양전자 방출과 같은 분자 화상 진찰 양식에 대한 조영제의 biomarker 표적화를 위해 봉사합니다 단층 촬영 (PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층 촬영 (SPECT)8. 마지막으로, 항체는 또한 표적 치료에 대한 환자의 계층화 및 반응 모니터링을 가능하게 하는 라노스틱 제제로서 사용될 수있다 9. 따라서, 새로운 mAb는 암 탐지, 진단 및 처리에 있는 중요한 역할을 하기 시작됩니다.
신규하고 고도로 구체적인 mAb의 개발 및 생산에 있어 중요한 발전에도 불구하고 종양 환경의 복잡성으로 인해 진단 및 치료 응용 분야는 비효율적일 수 있습니다. 항체 상호작용은 에피토프의 종류에 의존한다,즉,선형 또는형태(10)인지. 항원의 인식 이외에, 항체는 항원을 발현하는 표적 세포에 도달하기 위하여 혈관 벽, 기저 막 및 종양 기질과 같은 자연적인 방벽을 극복할 필요가 있습니다. 항체는 가변 단편 항원 결합(Fab) 도메인을 통해서뿐만 아니라 상수 결정성 단편(Fc)을 통해조직과 상호작용하여 오프사이트상호작용(11)을더욱 유도한다. 표적화는 또한 종양 혈관화 및림프계(12,13)에서종양 벌크 및 이질성을 통하여 종양 마커의 이질적인 발현에 의해 복잡해진다. 또한, 종양 미세 환경은 종양 세포를 지원하는 암 관련 섬유 아세포, 항 종양 면역 반응을 억제하는 종양 면역 세포, 산소 및 영양소의 수송을 지원하는 종양 내피로 구성됩니다. 항체 기반 치료제 또는 진단의 침투, 분배 및 가용성을 방해합니다. 전반적으로, 이러한 고려 사항은 치료 또는 진단 효능을 제한하고, 치료 반응을 감소시키고, 종양 저항성을 초래할 수 있다.
따라서, 효율적인 항체 기반 치료법 및 진단의 개발을 위해, 종양 미세환경 내의 항체 기반 컨쥬게이트의 생체 분포 및 상호작용을 평가하는 것이 중요하다. 현재, 전임상 연구에서, 종양 연구 모델에서마커 발현은 종양섹션(14)의면역형광(IF) 염색에 의해 생체내 생체내를 분석한다. 표준 IF 염색은 동물에게서 분리된 ex vivo 종양 조직 조각에 이차 형광표지된 항체에 의해 그 때 강조되는 1 차적인 마커 특정 항체로 실행됩니다. 이 기술은 조직 고정시의 마커의 정적 위치를 강조하고 항체 기반 치료제 또는 진단이 생리적 조건에서 어떻게 분배하거나 상호 작용할 수 있는지에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. PET, SPECT, 미국 및 PA에 의한 분자 이미징은 살아있는 전임상 모델8,15에서항체 접합조제 분포에 대한 정보를 제공할 수 있다. 이러한 이미징 양식은 비침습적이기 때문에, 종방향 연구를 수행할 수 있으며, 시간에 민감한 데이터는 그룹당 최소한의 동물로 수집될 수 있다. 그러나, 이러한 비침습적 분자 이미징 접근법은 충분히 민감하지 않으며 세포 수준에서 항체 분포의 국소화를 위한 충분한 분해능이 없다. 부가적으로, 1차 항체의 물리적 및 생물학적 특성은조영제(16)의컨쥬게이션에 의해 크게 변화될 수 있다.
항체 기반 치료제 및 진단이 종양 환경 내에서 상호 작용하는 방법을 고려하여 생체 내 생리학적 및 병리학적 조건을 취하고 고해상도 세포 및 심지어 하위 세포 분포를 얻기 위해 비 공액 항체의 프로파일, 우리는 항원 특이적 항체가 생체 내에서 정맥 주사되는 생체 내 면역 형광 국소화 (IVIL)로 간주되는 IF 접근법을 제안합니다. 항체 기지를 둔 치료 또는 진단은, 1 차적인 항체로 작용하고, 기능성 혈관에서 순환하고 고도로 정확한 살아있는 종양 환경에서 그것의 표적 단백질에 묶습니다. 생체 내 표지된 종양을 1차 항체와 분리한 후, 이차 항체는 축적되고 유지된 항체 접합체를 국소화하는 데 사용된다. 이 접근법은 형광 표지된 항체17을주입하는 이전에 기술된 IF 진학 접근법과 유사하다. 여기서, 비공액 항체의 사용은 항체 변형에 의해 유도된 생체 분포 특성의 잠재적 변화를 피한다. 더욱이, 형광 이차 항체의 생체 내 적용은 조직 수집 및 처리 동안 형광 신호의 가능한 손실을 방지하고 형광 신호 강도의 증폭을 제공한다. 당사의 라벨링 접근법은 항체 기반 약물 및 표적 제제의 생체 분포를 반영하며 새로운 진단 및 치료제 개발을 위한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
여기에서, 우리는 유방암 검출을 위한 분자 화상 진찰 접근을 위한 항체 기지를 둔 조영제의 biodistribution 그리고 접근성을 조사하는 이전 연구 결과에서 적용된 것과 같이 IVIL 방법의 2개의 응용을 기술합니다. 첫째, 형광 및 광음향 분자를 위한 항체 근적외선 염료 접합체(근적외선 형광 염료, 인도시아닌 그린, B7-H3-ICG)와 이소타입 제어제(Iso-ICG)의 생체 분포 이미징은18. 이 응용 프로그램의 메서드는 프로토콜에 설명되어 있습니다. 다음으로, 네크린-1에 대한 형태적으로 민감한 항체의 생체 분포 결과는, 통상적으로 기존의 IF 이미징으로 검출할 수 없으며, 초음파 분자 이미징과 함께 사용되며, 대표적인 결과19에제시된다. 이 프로토콜 논문의 끝에서, 독자는 자신의 항체 기반 연구 응용 프로그램에 대한 IVIL 방법을 채택 편안하게 느껴야한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
여기에 설명 된 모든 방법은 스탠포드 대학의 실험실 동물 관리에 기관 관리 패널에 의해 승인되었습니다 (APLAC).
1. 유방암 발달의 형질전환 마우스 모형
- 진행하기 전에 촉진 또는 캘리퍼스 측정을 통해 적절한 종양 성장을 위해 원하는 암 모델로부터 마우스를 관찰하십시오.
참고: 여기에서, 유방암 발달의 형질전환 뮤린 모델 (FVB/N-Tg (MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT)가 사용되었다. 이 동물은 각 유방선20에있는 나이의 6 그리고 12 주 사이에서 침략적인 유방 암종을 자발적으로 개발합니다. 일반적인 유방 땀샘은 이식 유전자 음성, 연령 일치 된 흰자말에서 대조군으로 사용되었습니다.
2. 특정 및 비특이적 항체 에이전트의 정맥 주사
- 토끼 항마우스 B7-H3 및 토끼 IgG 이소타입 대조군 항체를 탈염 컬럼(예를 들어, PD-10)에 정화하여 제조자 지침에 따라 방부제 및 저장 완충제를 제거한다.
참고: 일부 항체는 단백질-A 아가로즈 비드 기반 프로토콜21을통해 추가적인 정제가 필요할 수 있다. - 개별 미세 원심 분리튜브에서 각 항체 컨쥬게이트의 33 μg의 알리쿼트 투여량.
참고: 투여된 제제의 투여량은 적용에 따라 달라질 수 있으며 항체 컨쥬게이트가 일상적으로 사용되는 투여량과 일치한다. 동물의 안전을 위해 부피가 100 μL 이상인 경우 항체 용액의 농도가 필요합니다. - 조직 수집 전에 원하는 시점에서, 여기서 96 시간, 2% 이소플루란이 2 L/min에서 산소로 흐르는 종양 베어링 동물을 마취시키고, 37°C 가열된 단계에 놓는다. 수술 전에 적절한 수준의 마취에 도달했는지 확인하기 위해 발가락 을 꼬집십시오.
- 항체 용액의 꼬리 정맥 접종을 준비하려면 알코올 닦음으로 세 번 닦아 동물의 꼬리를 소독하십시오. 약 30s의 열 패드로 따뜻하게하여 꼬리 정맥을 넓히십시오. 열 패드를 제거 한 후 알코올 닦아 다시 한 번 꼬리를 닦으십시오.
- 27G 꼬리 정맥 카테터를 사용하여 나비 바늘을 두 개의 측면 꼬리 정맥 중 하나에 삽입하고 수술 용 테이프로 삽입 된 바늘로 꼬리를 조심스럽게 고정시다.
참고: 카테터로의 눈에 보이는 혈액 역류는 꼬리 정맥 내바늘의 적절한 위치를 나타냅니다. - 25 μL의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 카테터를 세척 한 다음 인슐린 주사기를 사용하여 카테터에 항체 용액을 주입하십시오. 멸균 PBS 25 μL로 카테터를 다시 한 번 씻어내십시오.
- 꼬리에서 바늘을 제거하고 출혈을 막기 위해 압력을 가하십시오.
- 마취를 끄고 고통의 징후가 완전히 깨어날 때까지 동물을 관찰하십시오.
3. 표적 종양 조직의 수집 및 준비
- 원하는 시점에서, 허용 가능한 제도적 절차에 따라 동물을 인도적으로 안락사시키고, 여기서, 챔버 변위 유속10-30% 부피/분의 압축 가스 탱크로부터 100%CO2를 점진적으로 흡입하였다.
참고: IVIL 기술의 일부 응용은 자유롭게 순환하는 항체19,22를제거하기 위해 PBS와 심장 관류에 의한 안락사를 요구한다. - 호흡기 및 심장 운동 중단, 발가락 꼬집기 반응 의 부족 및 점막의 회색을 통해 인도적 안락사를 확인한 후, 수술가위와 집게를 사용하여 종양 조직을 다음과 같이 절제하십시오.
- 마우스를 척추 위치에 놓고 꼬리에 가장 가까운 유방 땀샘 세트 (5th)사이에피부의 바깥 층만 잡고 집게로 수술 가위로 작은 절개를합니다.
- 닫힌 가위를 잘라내고 팁을 천천히 열어 피부를 기본 복벽 막에서 조심스럽게 분리하여 그대로 유지합니다.
- 복부까지 수직 절개를하고 피부를 내부 막에서 계속 분리하십시오. 3rd와 4유방 땀샘 사이에, 유방 땀샘의 피부 후퇴와 시각화를 허용하기 위해 복부를 가로 질러 수평 으로 잘라냅니다.
참고 : 유방 종양과 땀샘은 피부 아래에 표면적으로 위치합니다. - 포셉으로 각 종양 또는 정상적인 동맥을 잡고 수술 용 가위를 사용하여 부착 된 피부를 조심스럽게 다듬습니다.
- 절제된 조직을 일회용 기본 금형에 넣고, 미리 라벨을 부착하고 최적의 절삭 온도(OCT) 매질로 채우고 드라이 아이스에 배치하여 금형을 빠르게 동결시킴을 느낍니다. 오프 타겟 전달을 연구하기 위해, 관심있는 다른 조직이나 장기를 절제하십시오(예: 간 또는 폐).
참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지하려면 냉동 조직 블록을 -80°C에서 계속 할 준비가 될 때까지 보관하십시오. - 저온 극저온을 사용하여 10 μm 두께의 단면 냉동 조직 블록을 사용하여 미리 표지된 접착 유리 슬라이드에 인접한 섹션을 놓습니다.
참고: 이 시점에서 프로토콜을 일시 중지하려면 슬라이드를 -80°C에서 계속 할 준비가 될 때까지 저장합니다.
4. 엑 생체 염색 프로토콜
참고: 형광 현미경 이미지 간의 정량적 비교를 위해 모든 슬라이드는 동일한 준비된 솔루션으로 동시에 염색됩니다.
- OCT를 제거하기 위해 실온 PBS로 냉동 조직 슬라이드를 5 분 동안 헹구십시오.
- 염색 중에 필요한 용액의 부피를 줄이기 위해 소수성 장벽 펜으로 조직 섹션을 분류합니다.
참고: 슬라이드에서 조직을 제거하거나 영향을받는 조직 부분에 적절한 염색을 방지 할 수 있으므로 펜이 조직 샘플을 통해 실행되지 않도록주의하십시오. 조직 섹션이 언제든지 탈수되지 않도록하십시오. - 조직 섹션을 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 5 분 동안 고정하십시오.
- PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구십시오.
- 15 분 동안 PBS에서 0.5 % 트리톤 - X 100으로 조직 절편을 투과시.
- PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구십시오.
- 실온에서 1시간 동안 PBS(블로킹 용액)에서 3% w/v 소 혈청 알부민(BSA) 및 5% v/v 염소 세럼으로 조직을 차단합니다.
참고: 차단 용액 혈청을 이차 항체 숙주 동물과 일치시다. - PBS에서 5분 동안 슬라이드를 헹구십시오.
- 원하는 대로 기록 유지 1 차 항체, 아마도 일반적인 핵 (예를 들어, DAPI), 혈관 (예를 들어, CD31) 또는 세포질 마커 (예를 들어, 액틴)를 가진 절편을 배양한다. 여기서, 랫트 항-마우스 CD31(혈관 마커)을 1:100 희석에서 슬라이드 트레이상에서 탈수로부터 보호된 4°C에서 하룻밤 동안 차단 용액에서 제조사의 지시에 따라 사용하였다.
참고: 1차 항체 또는 항체 컨쥬게이트를 추가로 추가하지 마십시오. 생체 내에서 조직에 주입및 축적되도록 허용된 컨쥬게이트는 1차 항체로서 작용한다. - PBS에서 5분 동안 3회 씩 슬라이드를 헹구고 매번 PBS를 변경합니다.
- 1 차적인 항체를 표지하기 위하여 이차 항체를 가진 배양 슬라이드. 이 응용 프로그램의 경우, 알렉사플루오르-546 공액 염소 항토끼 항체(제조업체의 지침에 따라 최적화된 1:200 희석)와 AlexaFluor-488 염소 항체를 이용한 CD31(1:200)을 사용하여 항-B7-H3 항체를 시각화합니다. 희석, 제조업체의 지침에 따라 최적화) 차단 솔루션, 슬라이드 트레이에 빛과 탈수로부터 보호, 실온에서 1 시간 동안.
참고: 이차 항체는 동일한 숙주 동물로부터 그러나 각각의 1차 항체의 숙주 종에 이차 항체의 친화도와 일치한다. 슬라이드는 이 시점부터 빛으로부터 보호됩니다. - PBS에서 5분 동안 3회 씩 슬라이드를 헹구고 매번 PBS를 변경합니다.
- 마운팅 매체를 티슈 슬라이스 중앙에 한 방울 떨어뜨리고 기포가 갇히지 않도록 커버슬립을 조심스럽게 놓습니다.
- 뚜껑의 가장자리를 투명 매니큐어로 밀봉하고 건조시도록 하십시오.
참고: 이 시점에서 최대 1주일 동안 프로토콜을 일시 중지하려면 계속 할 준비가 될 때까지 -20 °C에서 슬라이드를 저장합니다.
5. 공초점 현미경 이미징 및 정량적 이미지 분석
참고: 공초점 현미경 및 이미징 파라미터를 준비하는 것은 사용되는 공초점 시스템에 따라 달라집니다. 여기서 사용된 현미경은 상업적으로 구입하였다(예를 들어, 자이스 LSM 510 메타 시스템) 관련 수집 소프트웨어(예를 들어, Zen 2009)를 사용하였다. 그러나, 이 단계의 다수는 어떤 공초점 현미경든지에 적용되고 기본적인 공초점 현미경 지식을 가정할 것입니다.
- 시스템을 켜고 워밍업한 후 원하는 목표를 선택합니다. 여기서 20x(숫자 조리개 = 0.8) 목표가 사용되었습니다.
- 가장 밝은 신호에 대한 최적화를 설정할 수 있도록 포지티브 컨트롤 슬라이드를 아래로 덮어 놓습니다. 빨간색 채널에서 이미징을 하고 라이브 이미징 모드에서 샘플에 시스템을 집중시음합니다.
- 사용되는 각 레이저 채널에 대해 다음과 같이 레이저 강도, 마스터 게인 및 핀홀 크기를 최적화합니다.
- 이미징을 위해 연속 모드로 전환합니다.
- 조회 테이블(LUT) 히스토그램을 모니터링하면서 레이저 강도(레이저 전력을 제어하는) 및 게인(마스터)(광증배관의 전압을 제어하는) 슬라이드 바를 최적화합니다. 픽셀을 포화하지 않고 히스토그램의 동적 범위가 채워지도록 이 두 설정을 조정합니다.
참고 : 레이저 강도가 너무 높으면 광 표백이 발생합니다. 게인(마스터)이 너무 높으면 이미지가 시원해집니다. 이상적으로, 게인 (마스터)는 범위의 중간에있을 것입니다. - 핀홀을 가장 높은 해상도와 가장 얇은 z 슬라이스를 제공하는 통풍이 잘되는 장치(AU)로 설정합니다.
- 디지털 오프셋 바를 밀어 LUT 히스토그램의 노이즈 플로어를 최소화하여 진정한 검은색 배경을 만드십시오.
참고: 현미경 설정이 각 레이저 채널과 목표에 최적화되면, 슬라이드 간의 정량적 비교를 허용하기 위해 이미징 세션 전체와 모든 슬라이드의 이미징을 위해 현미경 을 일정하게 유지하십시오.
- 수집 모드 탭에서 평균화에서 원하는 숫자 및 비트 깊이를선택합니다. 최적의 픽셀 크기를 설정하려면 최적 버튼을 클릭합니다.
- 스냅 수집 버튼을 사용하여 고품질 이미지를 수집합니다. 여기서, 임의의 시야는 종양 내에서 선택되었지만, 다른 관심 분야는 다른 적용(혈관, 종양 마진, 침투 깊이 등)을 신청할 수 있다.
- 오프라인 처리 및 정량화를 위해 공초점 소프트웨어(여기 ".lsm")에서 사용하는 형식으로 이미지 파일을 저장합니다.
참고: 모든 슬라이드가 동일한 세션 중에 이미지화되지 않은 경우 설정을 저장하고 이후 방문 시 다시 로드할 수 있지만 사진 표백으로 인해 동일한 슬라이드를 다시 이미징하는 것은 권장되지 않습니다. - 정량형 형광 강도 측정을 수행합니다. 피지 열기 (피지는 그냥 ImageJ 소프트웨어)19,23 상태 표시줄에 드래그 하 여 .lsm 이미지 파일을 로드 합니다.
- 색상 채널 데이터를 분할합니다. 이미지 > 스택 > 분할 채널로이동합니다.
- 필요에 따라 형광 이미지를 전처리, 즉, 배경 신호를 빼거나(프로세스 > 배경을 빼기)필터링 방법을 통해 노이즈를 감소.
- 신호 강도에 임계값을 설정하여 기준 단백질(혈관, 핵, 세포 얼룩)에 해당하는 색상 채널을 분할합니다(이미지> adjust > 임계값).
참고: 수동 임계값은 이미지 분석에 주관성을 도입하므로 자동 임계값 알고리즘을 사용하거나 이미지 히스토그램을 참조하면 이미지 분석 결과가 편향되지 않습니다. - 이 임계값을 사용하여 이진마스크(Process > 이진 > 마스크로 변환)를만듭니다.
- 마스크 내의 ROI를 측정하고 레이블을 지정합니다(분석> 입자 분석 > 관리자에 추가 확인 > OK).
- 관심 있는 항체에 해당하는 컬러 채널에 ROI를 적용합니다(채널 이미지 클릭, 분석 > 도구 > ROI 관리자 > 측정). 이렇게 하면 마스크 ROI를 항체 이미지에 적용하고 결과 창에서 레이블 섹션에 대한 이미지 측정을 제공합니다. 결과 창저장(파일 > 저장).
- 여기서 설명된 평균 형광 강도와 같은 관심의 원하는 통계를계산한다(24).
- 슬라이드 집합 내에서 각 이미지와 동일하게 모든 처리 단계를 수행합니다. 큰 이미지 일괄 처리23에대해 자동으로 이 작업을 수행하는 매크로를 만듭니다.
- 정량적 측정 후에만 이미지 디스플레이의 경우 정성적 이미지 조정을 적용하여 모든 슬라이드에서 동일한 레벨로 최소, 최대, 밝기 및 대비를 조정하여 바이오 배포 패턴의 시각화를 최적화합니다(이미지> adjust > 밝기/대비)를
- 이미지 유형(이미지 > Type > RGB 색상)을변환하고 프리젠 테이션 및 출판물에 사용하기 위해 .tiff(파일 > 저장 로 > Tiff...)와 같은 무손실 이미지 유형으로 파일을 저장합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
IVIL 방법은 B7-H3-ICG 및 Iso-ICG의 생체 내 생체 분포 및 조직 상호 작용을 검사하기 위해 여기에서 사용되었으며, 살아있는 동물에 정맥 주사 후, 96 시간 동안 표적 조직과 상호 작용한 다음 조직이 일단 조직에 상호 작용하도록 함으로써 에이전트를 허용하였다. 수확, 생체 내 면역 염색 동안 1 차 항체로서 작용한다. 상기 IVIL 방법은 또한 B7-H3 마커에 대한 조직의 표준 생체 내 IF 염색과 비교되었다. 일반적인 뮤린 유방 땀샘은 B7-H3 마커를 발현하지 않으며, 생체 내에서 확인되었으며, 표준 IF 염색을 하고, 다른 수동 메커니즘을 통해 항체를 축적하지 않으며, 따라서 B7-H3-ICG 또는 Iso-ICG의 축적이 검출되지 않았으며, 대표적인 음수 결과(그림 1,맨 위 행). 그러나, 뮤린 유방 종양은 혈관 구조와 상피 둘 다에서 B7-H3를 표현합니까 (표준 IF 염색에 의해 확인된 바와 같이), IVIL은 혈관에 강하게 축적되고 부분적으로 사치화 할 수 있던 B7-H3-ICG 에이전트를 강조할 수 있었습니다 혈관구조로부터 암세포 자체에 결합하는 것은 종양 전반에 걸쳐 B7-H3 마커의 균일한 분포에 비해 이기종 방식으로, 또한 도 1,하단 행에 도시된 것이다. 또한, Iso-ICG 제제는 분자 특이성이 없더라도 Fc 상호 작용, 빈약한 간질 배수 및 뮤린 유방 내 의 향상된 투과성 및 유지 효과로 인해 비특이적 방식으로 축적되는 것으로 나타났습니다. 종양 (그림 1). 이러한 차이는 두 제제 사이에 도시된 생체 분포 패턴에서 강조되고, 특이적 항체 제제의 특이적 결합 결과를 더욱 강화하고, 양성 결과의 두 가지 가능한 결과를 나타낸다.
B7-H3-ICG 대표적인 결과는 IVIL 방법이 일반적인 항체/항체 컨쥬게이트 바이오분배를 설명하는 질적 방법으로 사용될 수 있는 방법을 보여줍니다. 그러나, 때때로, 더 정량적인 해석이 필요할 수 있고, 또는 항체는 매우 민감하고, 형태 특이적 결합 능력을 가질 수 있다. 이러한 상황에서 IVIL은 원하는 정보를 제공할 수도 있습니다. 두 번째 예에서, 종양 조직에서 네트린-1 단백질의 발현및 CD31 양성 종양 내피와의 이의 공동 국소화를 연구한, IVIL 기술도19에성공적으로 적용되었다.
네트린-1은 전이성 유방암25,26과같은 특정 유형의 암에서 과발현되는 분비 된 65 kDa 단백질이다. netrin-1에 대한 분자 이미징 접근법을 개발하기 위해, 단백질의 생체 내 가용성은19를결정해야 했다. 또한, 항네크린-1 항체는 조직 고정 후 항원에 대한 충분한 친화력을 갖지 못함에 따라, 고전면역조직화학 또는 IF 염색에 대한 대체 염색 프로토콜이 요구되었고 IVIL이 구현되었다. 인간화된 항-네크린-1 항체 및 인간 IgG 이소타입 조절 항체는 심장 관류 및 종양 수집 전에 24시간 정맥 주사되었다. 심장 관류는 혈관구조에서 비특이적 배경 염색을 감소시키고 표적 발현이 제한될 때 이소타입 조절 항체 신호에 비해 현저한 항네크린-1 항체 축적의 검출을 향상시키기 위해 적용되었다. 종양 절편은 항 CD31 항체(쥐 항-마우스 CD31항체(물자 표)와형광 이차 항체, 알렉사 488-결합 염소 항쥐 IgG, 1:500 희석 및 알렉사 플루르 594-를 강조하는 혈관내로 생체내를 표지하였다. 결합된 염소 안티-휴먼 IgG, 각각 1:500 희석)은 항-네크린-1/아이소타입 및 항-CD31 mAbs를 밝혀기 위해 사용되었다. 항네크린-1 및 이소형 조절 항체의 형광 신호 강도는 CD31과 공존하는 염색의 차이를 결정하기 위해 정량화되었다. 도 2는 MMTV-PyMT 유방 종양의 상피 종양 구획에 특이적으로 축적된 항네크린-1 항체(긍정적인 결과)가 정상 유방 땀샘에서 신호가 없었던 것을 나타낸다(부정적인 결과). 항체는 내피 마커 CD31과 추가로 국소화하였다. 이소타입 항체 주입 종양 및 정상 분과의 비교는 상피 축적이 종양 조직에 특이적임을 보여주었다. 네테린-1 결합(tumors) 및 비특이적 Fc 상호작용(종양 및 정상 유방 땀샘)으로 인한 종양 및 정상 땀샘 모두의 내피 세포에 신호 축적이 있었다11. 따라서, CD31 기반 이진 마스크를 이용한 형광 신호 정량화가 요구되었고 항네크린-1 항체 신호가 종양 조직에서 이소타입 조절 항체 신호보다 유의히 높다는 것을 입증하였고, 이는 네트린-1을 시사한다. 특히 종양 내피에 축적.
그림 1 : 대표적인 공초점 현미경은 특이적 B7-H3 항체-ICG 컨쥬게이트 및 비특이적 이소타입 조절 항체-ICG 컨쥬게이트 를 정상 또는 암종 조직을 포함하는 뮤린 유방 땀샘에서국소화한다. (맨 위) 이소-ICG 또는 B7-H3-ICG(적색)의 33 μg로 정맥 주사한 동물의 정상 뮤린 유선 및 항체 접합체의 얼룩없음을 나타내는 CD31(녹색)으로 염색하였다. 정상 조직은 표준 생체 내 IF 염색에 의해 B7-H3의 발현이 없는 것으로 나타났다. (하단) B7-H3-ICG 또는 Iso-ICG(적색) 및 혈관 카운터 스테인드 CD31(녹색)의 33 μg로 정맥 주사된 동물의 침습성 유방 종양은 B7-H3-ICG 및 및 모두에 대해 서로 다른 분포 패턴을 가지고 광범위하고 이질적인 염색을 나타내는 아이소 ICG 에이전트. B7-H3-ICG는 생체 내 첫 번째 접촉 지점인 혈관 구조에 강하게 결합한 다음 혈관 구조에서 이질적으로 종양 상피를 염색할 수 있습니다. Iso-ICG는 종양 조직 내의 비특이적 축적을 나타낸다. 표준 생체 내 IF 염색은 상피 및 내피 세포상에서 B7-H3 마커의 균일한 발현을 나타낸다. 노란색은 공동 지역화된 빨간색 및 녹색 채널 신호를 나타냅니다. 스케일 바는 100 μm이며 패널 간에 일관되다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : MMTV-PyMT 유방 종양에서 네트린-1의 생체 내 면역 국소화. (왼쪽) IVIL 방법의 대표적인 공초점 현미경 사진은 뮤린 암종 및 정상 유방 땀샘에서 네트린-1 발현(적색) 또는 이소형 조절 발현(적색)을 검출한다. IVIL은 MMTV-PyMT 종양에서 네트린-1에 대한 상피 신호를 확인하지만 정상적인 유방 땀샘에는 없으며, 유방 종양에서 내피 세포 (CD31 염색, 녹색)에 강한 네트린-1 신호와 정상 유방 땀샘에서 네트린-1의 현저한 약한 신호를 확인합니다. 노란색은 공동 지역화된 빨간색 및 녹색 채널 신호를 나타냅니다. 배율 막대는 20 μm를 나타냅니다. 종양 내피에서 네트린-1 단백질의 검출을 위해, 1차 인간화된 NET1-H-mAb의 100 μg 또는 인간 IgG 이소타입 대조군 항체의 100 μg를 종양 수집 전에 24시간 정맥 주사시켰다. 자유롭게 순환하는 항체는 PBS및 종양 조직을 가진 심장 관류에 의해 제거되었고, 동결, 및 저온 극저온에서 15 μm 두께로 단면화하였다. 내피 세포는 1차 쥐 항마우스 CD31 항체로 표지되었고, 그 뒤를 이어 이차 알렉사 488 결합 염소 항래트 IgG가 뒤따랐다. netrin-1을 표적으로 하는 1 차적인 항체를 밝히기 위하여, 이차 알렉사 플루어 594 결합된 염소 항인간 IgG를 사용했습니다. 염소 이차 항체의 비특이적 상호 작용을 피하기 위해, 조직 샘플은 염소 혈청으로 차단되었다. (오른쪽) 항-CD31 항체 신호와 동자화하는 항네크린-1 또는 이소타입 조절 항체 신호의 정량화를 강조하는 바 그래프. MmTV-PyMT 및 N=7 유방 땀샘(마우스 1개)의 그룹당 N=13종양(2마리의 마우스) 정상 분비선 군당; 오류 막대는 SEM을 제공합니다. 2그룹 비교는 학생의 t-test로 수행되었다. 크리에이티브 커먼즈 라이선스 CC BY 4.0(https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/)에 따라 19의 허가를 받아 재인쇄된 그림입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
이 메서드에는 몇 가지 중요한 단계가 있으며 성공적인 구현을 위해 잠재적인 수정이 필요합니다. 첫째, 항체/항체 컨쥬게이트 정맥 주사의 투여량 및 타이밍은 특정 용도에 맞게 조정되어야 한다. 일반적으로, 투여량은 항체 컨쥬게이트가 전형적으로 사용되는 방법, 즉 치료용 항체 또는 항체 기반 조영제의 매칭 투여량과 일치하는 방식과 일치하는 것을 사용되어야 한다. 또한 표적 조직의 수집 시기를 신중하게 고려해야합니다. 항체 및 항체 접합체는 표준 약물 및 조영제보다 더 긴 순환 시간을 갖지만, 이들은 매우 가변적이며 원하는 적용을 위해 최적화되어야하지만 적어도 24 시간 의 순환 시간 27을 허용하는 것이 좋습니다. . 둘째, 표적 조직 수집 동안, 혈액풀(19)으로부터자유롭게 순환하는 항체를 제거하기 위해 심장 내 관류 기술을 구현할 필요가 있다. B7-H3-ICG의 종양 분포를 살펴보면, 충분히 긴 순환 시간(96h) 및 에이전트의 혈관 외 국소화로 인해 불필요한 것으로 나타났다. 그러나, IVIL 방법의 네트린-1 적용을 위해, 심장 관류는 네트린-1의 내피 발현 및 상대적으로 낮은 발현 수준으로 인해 적절한 것으로 간주되었다. 셋째, 생체 내 조직 염색 동안 동일한 세션 동안 정량적으로 비교될 슬라이드를 염색하고 동일한 용액으로 염색하여 정상적인 배치 간 변이를 방지하는 것이 필수적입니다. 슬라이드가 단계 사이에 제대로 헹구고 소수성 펜 용액이 조직과 접촉하지 않도록 하여 최적이 아닌 염색을 방지합니다. 마지막으로, 공초점 현미경 검사법 동안, 상대 정량화를 허용하고 슬라이드의 광 표백을 방지하기 위해 신속하게 작동하도록 슬라이드 사이에 동일한 이미징 설정을 유지합니다. 이러한 핵심 사항은 성공적인 IVIL 구현 가능성을 높입니다.
IVIL 방법에는 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 방법은 표준 IF 기술과 유사하지만 두 가지는 상당히 다른 정보를 제공합니다. IF 염색은 주어진 시점(조직이 수집되고 고정되었을 때)에서 조직 내의 분자 마커의 해부학적 위치를 나타냅니다. 그러나 IVIL은 B7-H3-ICG의 국소화에 의해 입증된 바와 같이 항체 또는 항체 컨쥬게이트가 표적에서 특이적이거나 비특이적 축적, 내재화 또는 보존여부에 관계없이 분배 및 상호작용하는 방법에 대한 정보를 제공합니다. 조직. 이는 약동학/동적 및 바이오분배 연구에 매우 중요합니다. 둘째, 전통적인 IF 방법은, 때때로, 1차항체(28)에의한 결합을 방지하는 항원 왜곡 또는 마스킹을 유발할 수 있는 조직의 고정에 의해 제한된다. 따라서, IVIL은 표준 IF 염색 또는 면역히스토화학이 실패할 때 유용할 수 있다. IVIL 기술은 그렇지 않으면 탐지될 수 있는 생체 내 항체 활성을 확인하는 상호 보완적인 방법으로 간주될 수 있다. 마지막으로, 기존의 IF 염색 기법에 익숙한 사람들은 실행이 간단하고 필요한 자료의 대부분을 손에있을 것이다 방법을 찾을 수 있습니다.
IVIL 메서드에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 표적 조직을 수확하기 위해 동물을 안락사시킬 필요성으로 인해, IVIL은 단일 시점에서만 생물학적 상호작용 정보를 제공한다. 다른 동물로 다양한 시점에서 원발성 항체 또는 항체 접합체의 주사는 생체 분포 및 생체 내 상호작용에 대한 정보의 광범위한 시간 창을 허용할 것이다. 둘째, 사용자가 정맥 내 꼬리 정맥 주입 또는 잠재적 인 심장 관류와 같은 생체 내 동물 기술에 익숙하지 않은 경우, 이것은 방법에 제한이 있을 수 있습니다. 이러한 방법을 사용하려면 숙련된 인력이 안정적으로 수행해야 합니다. 그러나, 꼬리 정맥 주입 동안 카테터를 사용하면 적절한 바늘 배치가 주사 전에 확인될 수 있기 때문에 전체 용량의 투여를 보장한다. 또한, 간주 될 수 있는 꼬리 정 결 주입에 한 가지 대안은 복고풍 궤도 주입, 일반적으로 덜 숙련 된 인력으로 더 높은 성공률을 가지고. 정량적 평가를 허용하기 위해 동일한 배치로 모든 조직 슬라이드를 염색하고 이미지화할 필요성은 단일 연구에 포함될 수 있는 샘플 및 마커의 수를 제한합니다. 연구 결과는 원하는 정보를 수집하기 위하여 다른 일 및 인접한 조직 조각에 직렬 염색으로 조직될 필요가 있을 지도 모릅니다. 마지막으로, 종 일치 항체의 사용, 즉, 뮤린 전임상 모델에서 뮤린 항 마우스 항체는, 이차 항체로 비특이적 배경 염색의 문제를 제기한다. 따라서, 종-일치하지 않는 1차 항체의 사용은 본 연구에서 제시된 바와 같이 요구되며, 또는 형광표지종-일치하는 1차 항체가 사용되어야 할 것이다.
IVIL 기술은 많은 응용 분야에 대한 진단 및 치료 항체의 생체 분배 분석에 유용합니다. 정맥 내 항체 또는 리간드 주입 및 생체내 조직 분석에 대한 상이한 적용이 이전에 보고되었으며 이러한 염색 절차를 널리 도입하는 것에 대한 관심을 확인하였습니다. 로버트슨 과 동료들은 내피 모세혈관 및 라이코퍼시콘 에스컬렌툼 아글루티닌(tomato lectin)의 정맥 주사를 가진 더 큰 혈관과 같은 혈관 원소를 표지하였다29. 이 기술은 조직 화학 및 면역 세포 화학과 호환되었고 혈관 패턴 및 기능적 자구 특성을 밝혀냈습니다. 하지만, 형광 리간드의 사용은 주입 시 형광의 급속한 분해에 의해제한되었다(30). IVIL 프로토콜에서 입증된 바와 같이, 생체 내 1차 항체의 주사와 이차 형광 항체로 생체 표지를 붙이는 것이 보다 견고한 접근법일 수 있다. 생체 내 IF 염색의 이 모형의 또 다른 흥미로운 응용은 앤더슨과 동료31에의해 입증된 것과 같이 혈관 내 림프구의 표지입니다. 정맥 주사 항체는 혈관에 국한된 림프구를 표지하는 데 사용되었고, 이는 이후에 면역학적 마커의 유세포분석 분석을 위해 수집및 추가로 처리되었다. 마지막으로, 두경부 편평상피세포 암종(HNSCC)을 가진 환자에게 전달된 항체 치료제의 전달 및 조직학적 국소화를 평가하기 위해, 항체 분포에 대한 최초의 인간 내 연구를 체계적으로 사용하여 수행하였다. 근적외선 형광 표지 치료 항체 세툭시맙-IRDye800CW32. 데이터는 조직학적 분석과 비교되었고, 종양으로부터의 거리로 형광 신호가 감소하여 특이성을 확인하는 것으로 나타났다. 그러나, 치료 항체는 항원 발현의 모든 영역에 도달하지 못했으며, 특히 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 항원의 높은 수준을 가진 잘 분화된 종양 영역에 도달하지 못했다. 강력한 저항과 효능의 부족을 발생 표적 요법과 면역 요법의 개발에 초점을 맞춘 암 연구의 현재 맥락에서, IVIL 방법은 치료 항체의 분포를 연구하는 훌륭한 도구가 될 것입니다 PD-1/PD-L-1 또는 HER233,34와 같은. 이 결과는 표적으로 한 치료가 새로운 접근의 발달을 승진시키는 특정 경우에 효과적인 이유를 이해하는 것이 극단적으로 귀중합니다. 이러한 예제를 종합하면 IVIL 접근 방식의 잠재적 중요성을 강조합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 토론 및 장비 사용을 위한 박사 앤드류 올슨 (스탠포드 신경 과학 현미경 검사법 서비스)에게 감사합니다. 유르겐 케이 윌만 박사님의 멘토링에 감사드립니다. 본 연구는 NIH R21EB022214 교부금(KEW), NIH R25CA118681 교육 보조금(KEW), NIH K99EB023279(KEW)에 의해 지원되었다. 스탠포드 신경 과학 현미경 검사법은 NIH NS069375에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
- Forthal, D. N.
- Boder, E. T., Midelfort, K. S., Wittrup, K. D. Directed evolution of antibody fragments with monovalent femtomolar antigen-binding affinity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (20), 10701-10705 (2000).
- Köhler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Lonberg, N., et al. Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications. Nature. 368 (6474), 856-859 (1994).
- McCafferty, J., Griffiths, A. D., Winter, G., Chiswell, D. J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. Nature. 348 (6301), 552-554 (1990).
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. International Journal of Cancer. 136 (5), E359-E386 (2015).
- Reichert, J. M., Valge-Archer, V. E. Development trends for monoclonal antibody cancer therapeutics. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (5), 349-356 (2007).
- Kircher, M. F., Willmann, J. K. Molecular Body Imaging: MR Imaging, CT, and US. Part I. Principles. Radiology. 263 (3), 633-643 (2012).
- Fleuren, E. D. G., et al.
- Forsström, B., Bisławska Axnäs, B., Rockberg, J., Danielsson, H., Bohlin, A., Uhlen, M. Dissecting Antibodies with Regards to Linear and Conformational Epitopes. PLoS ONE. 10 (3), (2015).
- Woof, J. M., Burton, D. R. Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures. Nature Reviews Immunology. 4 (2), 89-99 (2004).
- Brooks, J. D. Translational genomics: The challenge of developing cancer biomarkers. Genome Research. 22 (2), 183-187 (2012).
- Tabrizi, M., Bornstein, G. G., Suria, H. Biodistribution Mechanisms of Therapeutic Monoclonal Antibodies in Health and Disease. The AAPS Journal. 12 (1), 33-43 (2009).
- Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M.
- Gambhir, S. S. Molecular imaging of cancer with positron emission tomography. Nature Reviews. Cancer. 2 (9), 683-693 (2002).
- Freise, A. C., Wu, A. M. In vivo Imaging with Antibodies and Engineered Fragments. Molecular Immunology. 67 (200), 142-152 (2015).
- Cilliers, C., Menezes, B., Nessler, I., Linderman, J., Thurber, G. M. Improved Tumor Penetration and Single-Cell Targeting of Antibody-Drug Conjugates Increases Anticancer Efficacy and Host Survival. Cancer Research. 78 (3), 758-768 (2018).
- Wilson, K. E., et al. Spectroscopic Photoacoustic Molecular Imaging of Breast Cancer using a B7-H3-targeted ICG Contrast Agent. Theranostics. 7 (6), 1463-1476 (2017).
- Wischhusen, J., et al. Ultrasound molecular imaging as a non-invasive companion diagnostic for netrin-1 interference therapy in breast cancer. Theranostics. 8 (18), 5126-5142 (2018).
- Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease. Molecular and Cellular Biology. 12 (3), 954-961 (1992).
- Hober, S., Nord, K., Linhult, M. Protein A chromatography for antibody purification. Journal of Chromatography B. 848 (1), 40-47 (2007).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments JoVE. (65), (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Bachawal, S. V., et al. Earlier detection of breast cancer with ultrasound molecular imaging in a transgenic mouse model. Cancer Research. 73, 1689-1698 (2013).
- Fitamant, J., et al. Netrin-1 expression confers a selective advantage for tumor cell survival in metastatic breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (12), 4850-4855 (2008).
- Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
- Ryman, J. T., Meibohm, B.
- Scalia, C. R., et al. Antigen Masking During Fixation and Embedding, Dissected. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (1), 5-20 (2017).
- Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
- Chen, C. Y., et al. Blood flow reprograms lymphatic vessels to blood vessels. The Journal of Clinical Investigation. 122 (6), 2006-2017 (2012).
- Anderson, K. G., et al. Intravascular staining for discrimination of vascular and tissue leukocytes. Nature Protocols. 9 (1), 209-222 (2014).
- de Boer, E., et al. In Vivo Fluorescence Immunohistochemistry: Localization of Fluorescently Labeled Cetuximab in Squamous Cell Carcinomas. Scientific Reports. 5, (2015).
- Jenkins, R. W., Barbie, D. A., Flaherty, K. T. Mechanisms of resistance to immune checkpoint inhibitors. British Journal of Cancer. 118 (1), 9-16 (2018).
- Rexer, B. N., Arteaga, C. L. Intrinsic and acquired resistance to HER2-targeted therapies in HER2 gene-amplified breast cancer: mechanisms and clinical implications. Critical Reviews in Oncogenesis. 17 (1), 1-16 (2012).
