Summary
Die In-vivo-Immunfluoreszenzlokalisationsmethode (IVIL) kann verwendet werden, um die In-vivo-Bioverteilung von Antikörpern und Antikörperkonjugaten für onkologische Zwecke in lebenden Organismen mit einer Kombination aus In-vivo-Tumor-Targeting und Ex-vivo-Immunfärbung zu untersuchen. Methoden.
Abstract
Monoklonale Antikörper (mAbs) sind wichtige Instrumente zur Krebserkennung, -diagnose und -behandlung. Sie werden verwendet, um die Rolle von Proteinen in der Tumorgenese zu entwirren, können auf Krebsbiomarker gerichtet werden, die die Erkennung und Charakterisierung von Tumoren ermöglichen, und können für die Krebstherapie als mAbs oder Antikörper-Wirkstoff-Konjugate verwendet werden, um Immuneffektorzellen zu aktivieren, Signalwege oder direkt töten Zellen, die das spezifische Antigen tragen. Trotz klinischer Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion neuartiger und hochspezifischer mAbs können diagnostische und therapeutische Anwendungen durch die Komplexität und Heterogenität der Tumormikroumgebung beeinträchtigt werden. Für die Entwicklung effizienter Antikörper-basierter Therapien und Diagnostika ist es daher entscheidend, die Bioverteilung und Wechselwirkung des Antikörper-basierten Konjugats mit der lebenden Tumormikroumgebung zu bewerten. Hier beschreiben wir In Vivo Immunofluoreszenzlokalisierung (IVIL) als einen neuen Ansatz zur Untersuchung von Wechselwirkungen von Antikörper-basierten Therapeutika und Diagnostika unter den in vivo physiologischen und pathologischen Bedingungen. Bei dieser Technik wird ein therapeutischer oder diagnostischer Antigen-spezifischer Antikörper invivo in vivo injiziert und ex vivo mit einem sekundären Antikörper in isolierten Tumoren lokalisiert. IVIL spiegelt daher die In-vivo-Bioverteilung von Antikörper- und Targeting-Mitteln wider. Zwei IVIL-Anwendungen werden beschrieben, um die Bioverteilung und Zugänglichkeit von Antikörper-basierten Kontrastmitteln für die molekulare Bildgebung von Brustkrebs zu bewerten. Dieses Protokoll wird es zukünftigen Anwendern ermöglichen, die IVIL-Methode an ihre eigenen Antikörper-basierten Forschungsanwendungen anzupassen.
Introduction
Monoklonale Antikörper (mAb) sind große Glykoproteine (ca. 150 kDa) der Immunglobulin-Überfamilie, die von B-Zellen abgesondert werden und eine primäre Funktion im Immunsystem haben, um die biologische Funktion von bakterielle oder virale Krankheitserreger und kann abnorme Proteinexpression auf Krebszellen erkennen1. Antikörper können eine extrem hohe Affinität zu ihren spezifischen Epitopen bis hin zu Femtomolarenkonzentrationen haben, was sie zu vielversprechenden Werkzeugen in der Biomedizin2macht. Mit der Entwicklung der Hybridom-Technologie durch Milstein und Köhler (Nobelpreis 1984) wurde die Produktion von mAbs möglich3. Später wurden menschliche mAbs mit der Phagenanzeige-Technologie oder transgenen Mausstämmen erzeugt und revolutionierten ihre Verwendung als neuartige Forschungswerkzeuge und Therapeutika4,5.
Krebs ist ein weltweites Gesundheitsproblem und eine der Hauptursachen für den Tod, was die Notwendigkeit neuer Ansätze für Prävention, Erkennung und Therapie schafft6. Bis heute haben mAbs die Extrication der Rolle von Genen und ihren Proteinen bei der Tumorgenese ermöglicht und können, wenn sie gegen Krebsbiomarker gerichtet sind, die Tumorerkennung und Charakterisierung für die Schichtung des Patienten ermöglichen. Für die Krebstherapie werden bispezifische mAbs, Antikörper-Wirkstoff-Konjugate und kleinere Antikörperfragmente als Therapeutika entwickelt, und für die gezielte Wirkstoffabgabe zur Verbesserung der therapeutischen Wirksamkeit7. Zusätzlich dienen Antikörper für die Biomarker-Targeting von Kontrastmitteln für molekulare bildgebende Modalitäten wie Fluoreszenz-geführte Chirurgie, photoakustische (PA) Bildgebung, Ultraschall (US) molekulare Bildgebung und klinisch verwendete Positronenemission Tomographie (PET) oder Einzelphotonen-Emissions-Computertomographie (SPECT)8. Schließlich können Antikörper auch als Theranost-Wirkstoffe eingesetzt werden, die eine Schichtung der Patienten und eine Reaktionsüberwachung für gezielte Therapien ermöglichen9. Daher beginnen neuartige mAbs eine entscheidende Rolle bei der Krebserkennung, -diagnose und -behandlung zu spielen.
Trotz kritischer Fortschritte bei der Entwicklung und Produktion neuartiger und hochspezifischer mAbs können diagnostische und therapeutische Anwendungen aufgrund der Komplexität der Tumorumgebung unwirksam gemacht werden. Antikörperwechselwirkungen sind abhängig von der Art des Epitops, d.h.,ob es linear oder konform10ist. Neben der Erkennung von Antigenen müssen Antikörper natürliche Barrieren wie Gefäßwände, Basalmembranen und tumorstroma überwinden, um Zielzellen zu erreichen, die das Antigen exdrücken. Antikörper interagieren mit dem Gewebe nicht nur durch die variable Fragmentantigenbindung (Fab) Domäne, sondern auch durch das konstante kristalline Fragment (Fc), das weiter zu off-site Interaktionen führt11. Das Targeting wird auch durch die heterogene Expression von Tumormarkern in der Tumormasse und Heterogenität in der Tumorvaskularisation und dem Lymphsystem12,13erschwert. Darüber hinaus besteht die Tumormikroumgebung aus krebsassoziierten Fibroblasten, die Tumorzellen unterstützen, Tumorimmunzellen, die Anti-Tumor-Immunreaktionen unterdrücken, und dem Tumorendothel, das den Transport von Sauerstoff und Nährstoffen unterstützt, die das Eindringen, die Verteilung und die Verfügbarkeit von Antikörper-basierten Therapeutika oder Diagnostika beeinträchtigen. Insgesamt können diese Überlegungen die therapeutische oder diagnostische Wirksamkeit einschränken, das Behandlungsverhalten reduzieren und zu Tumorresistenzführen führen.
Daher ist es für die Entwicklung effizienter Antikörper-basierter Therapien und Diagnostika entscheidend, die Bioverteilung und Wechselwirkung des Antikörper-basierten Konjugats innerhalb der Tumormikroumgebung zu bewerten. Derzeit wird in präklinischen Studien die Markerexpression in Tumorforschungsmodellen ex vivo durch Immunfluoreszenz (IF) Färbung von Tumorabschnitten14analysiert. Standard-IF-Färbung wird mit primären markerspezifischen Antikörpern durchgeführt, die dann durch sekundäre fluoreszierend markierte Antikörper auf ex vivo Tumorgewebescheiben hervorgehoben werden, die vom Tier isoliert wurden. Diese Technik hebt die statische Position des Markers zum Zeitpunkt der Gewebefixierung hervor und gibt keinen Einblick, wie sich die antikörperbasierten Therapeutika oder Diagnostika unter physiologischen Bedingungen verteilen oder interagieren könnten. Die molekulare Bildgebung durch PET, SPECT, US und PA kann Informationen über die antikörperkonjugierte Kontrastmittelverteilung in lebenden präklinischen Modellen8,15liefern. Da es sich bei diesen bildgebenden Modalitäten um nicht-invasive, Längsschnittstudien handelt und zeitkritische Daten mit einer minimalen Anzahl von Tieren pro Gruppe gesammelt werden können. Diese nicht-invasiven molekularen bildgebenden Ansätze sind jedoch nicht empfindlich genug und haben nicht genügend Auflösung für die Lokalisierung der Antikörperverteilung auf zellulärer Ebene. Zusätzlich können die physikalischen und biologischen Eigenschaften des primärantikörpers durch die Konjugation eines Kontrastmittels drastisch verändert werden16.
Um die in vivo physiologischen und pathologischen Bedingungen zu berücksichtigen, wie antikörperbasierte Therapeutika und Diagnostika innerhalb der Tumorumgebung interagieren und eine hochauflösende zelluläre und sogar subzelluläre Verteilung zu erhalten Profile von nicht konjugierten Antikörpern schlagen wir einen IF-Ansatz vor, der als In-Vivo-Immunfluoreszenzlokalisation (IVIL) bezeichnet wird, bei dem der antigenspezifische Antikörper intravenös in vivo injiziert wird. Der Antikörper-basierte therapeutische oder diagnostische, als primärer Antikörper wirkt, zirkuliert in funktionellen Blutgefäßen und bindet an sein Zielprotein in der hochgenauen, lebenden Tumorumgebung. Nach isolierung von in vivo-markierten Tumoren mit dem primären Antikörper wird ein sekundärer Antikörper verwendet, um angesammelte und zurückgehaltene Antikörperkonjugate zu lokalisieren. Dieser Ansatz ähnelt einem zuvor beschriebenen IF-Histologie-Ansatz, bei dem fluoreszierend markierte Antikörper17injiziert werden. Obwohl hier, die Verwendung von nicht konjugierten Antikörpern vermeidet eine mögliche Änderung der Bioverteilungseigenschaften durch Antikörpermodifikation induziert. Darüber hinaus vermeidet die Ex-vivo-Anwendung von fluoreszierendem Sekundärantikörper einen möglichen Verlust des Fluoreszenzsignals während der Gewebeentnahme und -verarbeitung und sorgt für eine Verstärkung der Fluoreszenzsignalintensität. Unser Etikettierungsansatz spiegelt die In-vivo-Biodistribution von Antikörper-basierten Medikamenten und gezielten Wirkstoffen wider und kann wichtige Erkenntnisse für die Entwicklung neuartiger diagnostischer und therapeutischer Wirkstoffe liefern.
Hier beschreiben wir zwei Anwendungen der IVIL-Methode, wie sie in früheren Studien zur Bioverteilung und Zugänglichkeit von Antikörper-basierten Kontrastmitteln für molekulare bildgebende Ansätze zur Brustkrebserkennung angewandt wurden. Erstens die Bioverteilung eines Antikörper-nahen Infrarotfarbstoffkonjugats (Anti-B7-H3-Antikörper, der an den nahen Infrarotfluoreszenzfarbstoff, Indocyaningrün, B7-H3-ICG) und des Isotypkontrollmittels (Iso-ICG) für Fluoreszenz und photoakustische molekulare molekulare Bildgebung wird untersucht18. Die Methode dieser Anwendung wird im Protokoll beschrieben. Als nächstes werden die Bioverteilungsergebnisse eines konformen Antikörpers gegen Netrin-1, der in der Regel nicht mit herkömmlicher IF-Bildgebung nachweisbar ist und mit ultraschallmolekularer Bildgebung verwendet wird, quantifiziert und in den repräsentativen Ergebnissen19dargestellt. Am Ende dieses Protokollpapiers sollten sich leserende Menschen wohl fühlen, wenn sie die IVIL-Methode für ihre eigenen Antikörper-basierten Forschungsanwendungen anwenden.
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Protocol
Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Administrative Panel on Laboratory Animal Care (APLAC) der Stanford University genehmigt.
1. Transgenes Mausmodell der Brustkrebsentwicklung
- Beobachten Sie Mäuse aus dem gewünschten Krebsmodell für das entsprechende Tumorwachstum mittels Palpation oder Sattelmessung, bevor Sie fortfahren.
HINWEIS: Hier wurde das transgene murinische Modell der Brustkrebsentwicklung (FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J) (MMTV-PyMT) verwendet. Diese Tiere entwickeln spontan invasive Brustkarzinome zwischen 6 und 12 Wochen in jeder Brustdrüse20. Normale Brustdrüsen wurden als Kontrollen von den transgen-negativen, altersgerechten Littermaten verwendet.
2. Intravenöse Injektion spezifischer und unspezifischer Antikörper
- Reinigen Sie Kaninchen Anti-Maus B7-H3 und Kaninchen IgG Isotyp-Kontrollantikörper auf einer Entsalzungssäule (z. B. PD-10), um Konservierungsstoffe und Speicherpuffer nach Herstelleranweisungen zu entfernen.
HINWEIS: Einige Antikörper müssen möglicherweise weiter gereinigt werden mit Protein-A Agarose Perlen basierend Protokoll21. - Aliquot-Dosierungen von 33 g jedes Antikörperkonjugat in einzelnen Mikrozentrifugenröhren.
HINWEIS: Die Dosierung des verabreichten Mittels kann je nach Anwendung variieren und entspricht den Dosierungen, bei denen das Antikörperkonjugat routinemäßig verwendet wird. Die Konzentration der Antikörperlösungen ist erforderlich, wenn das Volumen mehr als 100 l für die Tiersicherheit beträgt. - Zum gewünschten Zeitpunkt vor der Gewebeentnahme, hier 96 h, das tumortragende Tier mit 2% Isofluran, das bei 2 L/min in Sauerstoff fließt, befeuchten und auf eine 37 °C erhitzte Stufe legen. Machen Sie eine Zehenprise, um sicherzustellen, dass das richtige Niveau der Anästhesie vor dem Eingriff erreicht wurde.
- Um sich auf die Endvenenimpfung der Antikörperlösungen vorzubereiten, desinfizieren Sie den Schwanz des Tieres, indem Sie dreimal mit einem Alkoholwisch abwischen. Deperieren Sie die Schwanzadern durch Erwärmung mit einem Wärmepolster für ca. 30 s. Vermeiden Sie das Erhitzen des gesamten Tieres. Wischen Sie den Schwanz noch einmal mit einem Alkoholwisch ab, nachdem Sie das Heatpad entfernt haben.
- Mit einem 27G Schwanzvenenkatheter die Schmetterlingsnadel in eine der beiden seitlichen Schwanzvenen einlegen und den Schwanz mit der eingesetzten Nadel vorsichtig mit einem chirurgischen Band auf die Bühne fixieren.
HINWEIS: Der sichtbare Blutrückfluss in den Katheter zeigt die richtige Position der Nadel in der Schwanzvene an. - Spülen Sie den Katheter mit 25 l steriler Phosphatgepufferte Saline (PBS), und injizieren Sie die Antikörperlösung anschließend mit Insulinspritzen in den Katheter. Spülen Sie den Katheter noch einmal mit 25 l sterilem PBS.
- Entfernen Sie die Nadel aus dem Schwanz und wenden Sie Druck an, um jegliche Blutung zu stoppen.
- Schalten Sie die Anästhesie aus und beobachten Sie das Tier, bis es für Anzeichen von Not vollständig wach ist.
3. Sammlung und Aufbereitung von Zieltumorgeweben
- Zum gewünschten Zeitpunkt das Tier nach dem akzeptablen institutionellen Verfahren human einschläfern, hier durch schrittweises Einatmen von 100%CO2 aus einem komprimierten Gastank mit einer Kammerverschiebungsdurchflussrate von 10-30% Volumen/min.
HINWEIS: Einige Anwendungen der IVIL-Technik erfordern Sterbehilfe durch Herzperfusion mit PBS, um frei zirkulierende Antikörper zu entfernen19,22. - Nach Bestätigung der humanen Euthanasie durch Einstellung der Atemwegs- und Herzbewegung, Mangel an Zehenkneifung und Ergrauung der Schleimhäute, Verbrauch Tumorgewebe mit chirurgischen Scheren und Zangen wie folgt:
- Legen Sie die Maus in die Rückenlage und greifen Sie nur die äußere Schicht der Haut zwischen dem Satz der Brustdrüsen am nächsten an den Schwanz(5.)mit Zange, machen einen kleinen Schnitt mit einem Paar chirurgische Schere.
- Führen Sie die geschlossene Schere in den Schnitt ein und öffnen Sie langsam die Spitze, um die Haut vorsichtig von der darunter liegenden Bauchwandmembran zu trennen, die sie intakt hält.
- Machen Sie einen vertikalen Schnitt in den Bauch, weiterhin die Haut von der inneren Membran zu trennen. Zwischen den3. und4. Brustdrüsen, machen Sie einen horizontalen Schnitt über den Bauch, um das Zurückziehen der Haut und die Visualisierung der Brustdrüsen zu ermöglichen.
HINWEIS: Brusttumoren und Drüsen befinden sich oberflächlich unter der Haut. - Greifen Sie jeden Tumor oder normale Drüse mit Zangen, vorsichtig trimmen Sie die befestigte Haut mit chirurgischer Schere.
- Schneidende Gewebe in Einweg-Basisformen des Gewebes geben, voretikettiert und mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) befüllt werden und die Formen schnell einfrieren, indem Sie sie auf Trockeneis platzieren. Um die Off-Target-Lieferung zu untersuchen, verbrauchen Sie andere Gewebe oder Voninteresse (z.B., Leber oder Lunge).
HINWEIS: Um das Protokoll an dieser Stelle anzuhalten, lagern Sie gefrorene Gewebeblöcke bei -80 °C, bis sie bereit sind, fortzufahren. - Mit Hilfe eines Kryostats, Abschnitt gefroreneGewebe Blöcke mit einer Dicke von 10 m und legen angrenzende Abschnitte auf vorbeschriftete Adhäsionglasrutschen.
HINWEIS: Um das Protokoll an dieser Stelle anzuhalten, speichern Sie Folien bei -80 °C, bis sie bereit sind, fortzufahren.
4. Ex-vivo-Färbeprotokoll
HINWEIS: Für den quantitativen Vergleich zwischen Fluoreszenzmikroskopiebildern werden alle Dias gleichzeitig mit den gleichen vorbereiteten Lösungen befleckt.
- Spülen Sie gefrorene Gewebeschlitten mit Raumtemperatur PBS für 5 min, um OCT zu entfernen.
- Dearcate Gewebeabschnitte mit einem hydrophoben Barriere-Stift, um das Volumen der Lösungen während der Färbung benötigt zu reduzieren.
HINWEIS: Achten Sie darauf, dass der Stift nicht über die Gewebeproben läuft, da er entweder das Gewebe aus dem Dia entfernen oder eine ordnungsgemäße Färbung des betroffenen Gewebeteils verhindern kann. Lassen Sie die Gewebeabschnitte an keiner Stelle dehydrieren. - Fixieren Sie die Gewebeabschnitte mit 4% Paraformaldehydlösung für 5 min.
- Spülen Sie Dias in PBS für 5 min.
- Permeabilisieren Gewebeabschnitte mit 0,5% Triton-X 100 in PBS für 15 min.
- Spülen Sie Dias in PBS für 5 min.
- Blockieren Sie das Gewebe mit 3% w/v Rinderserumalbumin (BSA) und 5% v/v Ziegenserum, beide in PBS (Blockierlösung) für 1 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Passen Sie das blockierende Lösungsserum mit dem sekundären Antikörper-Wirtstier ab. - Spülen Sie Dias in PBS für 5 min.
- Inkubieren Sie Abschnitte mit aufzeichnungsbasierten Primärantikörpern, möglicherweise einem gemeinsamen Kernkörper (z. B. DAPI), Gefäß (z. B. CD31) oder zytoplasmatischem Marker (z. B. Actin). Hier bei einer Verdünnung von 1:100 wurde in der Blockierlösung über Nacht bei 4 °C, die vor Austrocknung auf einem Diatablett geschützt ist, nach Herstelleranweisungen in der Blockierlösung eingesetzt.
HINWEIS: Fügen Sie keine zusätzlichen primären Antikörper oder Antikörperkonjugat hinzu. Das Konjugat, das injiziert wurde und sich in vivo in das Gewebe anreichern durfte, fungiert als Primärantikörper. - Spülen Sie Dias in PBS für 5 min dreimal, ändern Sie die PBS jedes Mal.
- Inkubieren Sie Dias mit sekundären Antikörpern, um primäre Antikörper zu kennzeichnen. Für diese Anwendung, visualisieren Anti-B7-H3 Antikörper mit AlexaFluor-546 konjugierten Ziegen Anti-Kaninchen-Antikörper (1:200 Verdünnung, optimiert nach Herstelleranweisungen) und CD31 mit AlexaFluor-488 Ziege Anti-Ratten Sekundärantikörper (1:200 Verdünnung, optimiert nach Herstelleranleitung) in Blockierlösung, geschützt vor Licht und Austrocknung auf einem Schiebefach, für 1 h bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Sekundäre Antikörper stammen vom selben Wirtstier, entsprechen jedoch der Affinität der sekundären Antikörper zu den Wirtsarten des jeweiligen Primärantikörpers. Dias sind ab diesem Zeitpunkt vor Licht geschützt. - Spülen Sie Dias in PBS für 5 min dreimal, ändern Sie die PBS jedes Mal.
- Tragen Sie einen Tropfen des Montagemediums in die Mitte der Gewebescheibe auf und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf auf, um das Einschließen von Luftblasen zu vermeiden.
- Versiegeln Sie die Ränder des Deckels mit klarem Nagellack und lassen Sie sie trocknen.
HINWEIS: Um das Protokoll an dieser Stelle bis zu einer Woche pausieren zu können, speichern Sie Folien bei -20 °C, bis sie bereit sind, fortzufahren.
5. Konfokale Mikroskopie-Bildgebung und quantitative Bildanalyse
HINWEIS: Die Vorbereitung des konfokalen Mikroskops und der Bildgebungsparameter hängt vom verwendeten konfokalen System ab. Das hier verwendete Mikroskop wurde kommerziell erworben (z.B. Zeiss LSM 510 Meta-System) und die zugehörige Akquisitionssoftware (z.B. Zen 2009) verwendet. Viele dieser Schritte gelten jedoch für jedes konfokale Mikroskop und setzen grundlegende konfokale Mikroskopiekenntnisse voraus.
- Nachdem das System eingeschaltet und aufgewärmt wurde, wählen Sie das gewünschte Ziel aus. hier wurde ein 20x (numerische Blende = 0,8) Objektiv verwendet.
- Laden Sie einen positiv gesteuerten Schlitten, Abdeckung nach unten, um die Optimierung für das hellste Signal einzustellen. Imaging im roten Kanal, fokussieren Sie das System auf die Probe im Live-Bildgebungsmodus.
- Optimieren Sie für jeden verwendeten Laserkanal die Laserintensität, die Masterverstärkung und die Lochgröße wie folgt:
- Wechseln Sie zum kontinuierlichen Modus für die Bildgebung.
- Optimieren Sie die Laserintensität (die die Laserleistung steuert) und Gain (Master) (die die Spannung für Photomultiplier-Rohr steuert) Diastangen während der Überwachung des Look Up Table (LUT) Histogramm. Passen Sie diese beiden Einstellungen an, bis der Dynamikbereich des Histogramms ohne Sättpixel gefüllt ist.
HINWEIS: Wenn die Laserintensität zu hoch ist, tritt eine Photobleichung auf. Wenn der Gain (Master) zu hoch ist, wird das Bild laut. Im Idealfall befindet sich der Gain (Master) in der Mitte seines Bereichs. - Stellen Sie das Loch auf 1 luftige Einheit (AU) ein, die die höchste Auflösung und die dünnste Z-Scheibe ergibt.
- Schieben Sie die Digital Offset-Leiste, um den Geräuschpegel des LUT-Histogramms für einen echten schwarzen Hintergrund zu minimieren.
HINWEIS: Sobald die Mikroskopieeinstellungen für jeden Laserkanal und jedes Ziel optimiert sind, halten Sie sie während der gesamten Bildgebungssitzung und für die Abbildung aller Dias konstant, um den quantitativen Vergleich zwischen Dias zu ermöglichen.
- Wählen Sie unter der Registerkarte Erfassungsmodus unter Mittelungdie gewünschte Zahl und Bittiefeaus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Optimal, um die optimale Pixelgröße festzulegen.
- Verwenden Sie die Schaltfläche "Aufnahme fangen", um ein hochwertiges Bild zu sammeln. Hier wurden zufällige Sichtfelder aus dem Tumor ausgewählt, aber andere Bereiche von Interesse können für verschiedene Anwendungen gelten (Gefäße, Tumormargen, Penetrationstiefe, etc.)
- Speichern Sie Bilddateien im Format, das von der konfokalen Software (hier ".lsm") für die Offline-Verarbeitung und Quantifizierung verwendet wird.
HINWEIS: Wenn nicht alle Folien während derselben Sitzung abgebildet werden, speichern Sie die Einstellungen und laden Sie sie bei nachfolgenden Besuchen neu, obwohl eine Neuabbildung derselben Folie aufgrund von Photobleichungen nicht empfohlen wird. - Führen Sie die quantitativen Fluoreszenzintensitätsmessungen durch. Öffnen Sie Fidschi (Fiji Is Just ImageJ software)19,23 und laden Sie eine .lsm-Bilddatei, indem Sie auf die Statusleiste ziehen.
- Teilen Sie die Farbkanaldaten auf. Gehen Sie zu Bild > Stapel > Kanäle teilen.
- Verarbeiten Sie die Fluoreszenzbilder nach Bedarf, d. h. subtrahieren Sie das Hintergrundsignal (Prozess > Hintergrund subtrahieren) oder reduzieren Sie das Rauschen über eine Filtermethode.
- Segmentieren Sie den Farbkanal, der dem Referenzprotein (vaskulär, nuklear, zellulärer Fleck) entspricht, indem Sie einen Schwellenwert für die Signalintensität festlegen (Bild > Anpassen > Schwellenwert).
HINWEIS: Die manuelle Schwellenwertierung führt die Subjektivität in die Bildanalyse ein, daher wird die Bildanalyse durch die Verwendung eines automatisierten Schwellenwertalgorithmus oder das Verweisen auf Bildhistogramme weniger verzerrt. - Verwenden Sie diesen Schwellenwert, um eine binäre Maske zu erstellen (Prozess > Binär > In Maske konvertieren).
- Messen und Beschriften von ROIs innerhalb der Maske (Analysieren > Partikel analysieren > Zum Manager hinzufügen > OK )
- Wenden Sie ROIs auf den Farbkanal an, der dem von Interesse sindden Antikörper (Klickkanalbild, Analysieren > Tools > ROI Manager > Messen). Dadurch werden die Masken-ROIs auf das Antikörperbild angewendet und Bildmessungen für Beschriftungsabschnitte im Ergebnisfenster angezeigt. Fenster "Ergebnisse speichern" (Datei > Speichern).
- Berechnen Sie die gewünschte Zinsstatistik, wie z.B. die mittlere Fluoreszenzintensität, wie hier beschrieben24.
- Führen Sie alle Verarbeitungsschritte identisch mit jedem Bild innerhalb einer Gruppe von Folien aus. Erstellen Sie ein Makro, um dies automatisch für große Bildbatches23zu tun.
- Wenden Sie für die Bildanzeige nur nach quantitativen Messungen qualitative Bildanpassungen an, um die Visualisierung von Bioverteilungsmustern zu optimieren, indem Sie Minimum, Maximum, Helligkeit und Kontrast auf allen Folien an die gleichen Werte anpassen(Bild > Anpassen > Helligkeit/Kontrast).
- Konvertieren Sie den Bildtyp (Bild > Typ > RGB-Farbe) und speichern Sie Dateien in einem verlustfreien Bildtyp wie .tiff (Datei > Speichern unter > Tiff...) für die Verwendung in Präsentationen und Publikationen.
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Representative Results
Die IVIL-Methode wurde hier verwendet, um die In-vivo-Bioverteilung und Gewebeinteraktion von B7-H3-ICG und Iso-ICG zu untersuchen, indem die Wirkstoffe nach intravenöser Injektion in ein lebendes Tier 96 h mit dem Zielgewebe interagieren konnten und geerntet werden, um als primäre Antikörper während der Ex-vivo-Immunfärbung zu fungieren. Die IVIL-Methode wurde auch mit der Standard-Ex-vivo-IF-Färbung der Gewebe für den B7-H3-Marker verglichen. Normale murinische Brustdrüsen drücken den im Ex-vivo-Standard-IF-Färbung bestätigten B7-H3-Marker nicht aus und akkumulieren keine Antikörper durch andere passive Mechanismen, so dass keine Ansammlung von B7-H3-ICG oder Iso-ICG nachgewiesen wurde, eines negativen Ergebnisses (Abbildung 1, obere Zeile). Muriner Brusttumoren drücken jedoch sowohl in der Vaskulatur als auch in Epithel (wie durch Standard-IF-Färbung bestätigt) B7-H3-H3 aus, und IVIL konnte das B7-H3-ICG-Erreger hervorheben, das sich stark an der Vaskulatur angesammelt hatte und in der Lage war, von der Vaskulatur an die Krebszellen selbst zu binden, wenn auch in heterogener Weise im Vergleich zur gleichmäßigen Verteilung des B7-H3-Markers über die Tumoren, auch in Abbildung 1, untere Reihe dargestellt. Auch wenn das Iso-ICG-Mittel keine molekulare Spezifität hat, wurde gezeigt, dass er sich aufgrund von Fc-Wechselwirkungen, schlechter interstitielle Drainage und der verbesserten Permeabilitäts- und Retentionswirkung in der murinen Brust auf unspezifische Weise ansammelt. Tumoren ( Abbildung1). Dieser Unterschied wird in den Bioverteilungsmustern zwischen den beiden Wirkstoffen hervorgehoben und verbessert die spezifischen Bindungsergebnisse des spezifischen Antikörpermittels weiter und stellt zwei mögliche Ergebnisse eines positiven Ergebnisses dar.
Die repräsentativen B7-H3-ICG-Ergebnisse zeigen, wie die IVIL-Methode als qualitative Methode zur Beschreibung der allgemeinen Antikörper-Antikörper-Konjugat-Bioverteilung eingesetzt werden kann. Manchmal kann jedoch eine quantitativere Interpretation erforderlich sein, oder ein Antikörper kann eine hochempfindliche, konforme Bindungskapazität haben. In diesen Situationen kann IVIL auch die gewünschten Informationen bereitstellen. In einem zweiten Beispiel, in dem die Expression von Netrin-1-Protein in Tumorgeweben und dessen Kolokalisierung mit CD31-positivem Tumorendothel untersucht werden sollte, wurde auch die IVIL-Technik erfolgreich angewendet19.
Netrin-1 ist ein abgesondertes 65 kDa-Protein, das bei bestimmten Krebsarten wie metastasierendem Brustkrebs überexprimiert ist25,26. Um einen molekularen bildgebenden Ansatz für Netrin-1 zu entwickeln, musste die In-vivo-Verfügbarkeit des Proteins bestimmt werden19. Da der Anti-Netrin-1-Antikörper nicht genügend Affinität zu seinem Antigen nach Gewebefixierung hat, war ein alternatives Färbeprotokoll zur klassischen Immunhistochemie oder IF-Färbung erforderlich und IVIL wurde implementiert. Humanisierter Anti-Netrin-1-Antikörper und ein humaner IgG-Isotyp-Kontrollantikörper wurden 24 h vor der Herzperfusion und Tumorsammlung intravenös injiziert. Die Herzperfusion wurde angewendet, um unspezifische Hintergrundfärbungen in der Vaskulatur zu reduzieren und den Nachweis einer signifikanten Anti-Netrin-1-Antikörperansammlung im Vergleich zum Isotyp-Kontroll-Antikörpersignal zu verbessern, wenn die Zielexpression begrenzt ist. Tumorabschnitte wurden ex vivo mit Vaskulatur gekennzeichnet, die Anti-CD31-Antikörper (Rattenanti-Maus-CD31-Antikörper (Materialtabelle)und fluoreszierende Sekundärantikörper, Alexa 488-gekoppelte Ziege-Anti-Ratten-IgG, 1:500 Verdünnung und Alexa Fluor 594- gekoppelte Ziege anti-humanIgG, 1:500 Verdünnung bzw.) wurden verwendet, um Anti-Netrin-1/Isotyp und Anti-CD31 mAbs zu offenbaren. Die Fluoreszenzsignalintensitäten des Anti-Netrin-1- und Isotyp-Kontrollantikörpers wurden quantifiziert, um Unterschiede in der mit CD31 kolokalisierten Färbung zu bestimmen. Abbildung 2 zeigt, dass sich der Anti-Netrin-1-Antikörper speziell im epitheliale Tumorfach von MMTV-PyMT-Mammatumoren angesammelt hat (ein positives Ergebnis), während es kein Signal in normalen Brustdrüsen gab (ein negatives Ergebnis). Der Antikörper kolokalisierte weiter mit dem Endothelmarker CD31. Der Vergleich mit Isotyp-Antikörper-injizierten Tumoren und normalen Drüsen zeigte, dass epitheliale Akkumulation spezifisch für das Tumorgewebe war. Es gab Signalansammlung in den Endothelzellen von Tumoren und normalen Drüsen durch Netrin-1-Bindung (Tumoren) und unspezifische Fc-Wechselwirkungen (Tumoren und normale Brustdrüsen)11. Daher war die Fluoreszenzsignalquantifizierung mit einer CD31-basierten binären Maske erforderlich und zeigte, dass das Anti-Netrin-1-Antikörpersignal signifikant höher war als das Isotype-Kontroll-Antikörpersignal im Tumorgewebe, was darauf hindeutet, dass Netrin-1 speziell im Tumorendothel angesammelt.
Abbildung 1 : Repräsentative konfokale Mikrographien des Vergleichs spezifischer B7-H3-Antikörper-ICG-Konjugat- und unspezifischer Isotyp-Kontroll-Antikörper-ICG-Konjugatlokalisierung in murinen Brustdrüsen, die normales oder karzinomhaltiges Gewebe enthalten. (Oben) Normale murinische Brustdrüsen von einem Tier intravenös injiziert mit 33 g Iso-ICG oder B7-H3-ICG (rot) und gegenfärbung mit CD31 (grün) zeigt keine Färbung der Antikörperkonjugate. Es wurde gezeigt, dass normale Gewebe keine Expression von B7-H3 durch Standard-Ex-vivo-IF-Färbung haben. (Unten) Invasive Brusttumoren eines Tieres intravenös injiziert mit 33 g B7-H3-ICG oder Iso-ICG (rot) und vaskulären gegenfärbung CD31 (grün) mit umfangreicher, heterogener Färbung, wenn auch mit unterschiedlichen Verteilungsmustern, sowohl für das B7-H3-ICG als auch für das B7-H3-ICG und Iso-ICG-Agenten. B7-H3-ICG bindet stark an die Vaskulatur, den ersten Kontaktpunkt in vivo, und ist dann in der Lage, aus der Vaskulatur zu extravasieren, um das Tumorepithel heterogen zu färben. Iso-ICG zeigt unspezifische Akkumulation innerhalb des Tumorgewebes. Standard ex vivo IF Färbung zeigt einheitliche Expression des B7-H3-Markers auf Epithel- und Endothelzellen. Gelbe Farbe zeigt das kolokalisierte rot-grüne Kanalsignal an. Die Maßstabsleiste ist 100 m groß und zwischen den Panels konsistent. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2 : In vivo Immunlokalisation von Netrin-1 bei MMTV-PyMT-Brusttumoren. (Links) Repräsentative konfokale Mikroskope der IVIL-Methode zum Nachweis der Netrin-1-Expression (rot) oder der Isotyp-Kontrollexpression (rot) bei murinen Karzinom und normalen Brustdrüsen. IVIL bestätigt epitheliale Signal für Netrin-1 in MMTV-PyMT Tumoren, aber nicht in normalen Brustdrüsen, und starkes Netrin-1-Signal auf Endothelzellen (CD31 Färbung, grün) in Brusttumoren und deutlich schwächeres Signal von Netrin-1 in normalen Brustdrüsen. Gelbe Farbe zeigt das kolokalisierte rot-grüne Kanalsignal an. Skalenbalken zeigen 20 m an. Für den Nachweis von Netrin-1-Protein im Tumorendothel wurden 100 g primär humanisiertes NET1-H-mAb oder 100 g humaner IgG-Isotyp-Kontrollantikörper 24 h vor der Tumorsammlung intravenös injiziert. Frei zirkulierender Antikörper wurde durch Herzperfusion mit PBS entfernt und Tumorgewebe wurde isoliert, blitzgefroren und mit einer Dicke von 15 m auf einem Kryostat geschnitten. Endothelzellen wurden mit primärem Ratten-Anti-Maus-CD31-Antikörper beschriftet, gefolgt von sekundären Alexa 488-gekoppelten Ziegen-Anti-Ratten-IgG. Um den primären Antikörper auf Netrin-1 zu offenbaren, wurde sekundäre Alexa Fluor 594-gekoppelte Ziege anti-human IgG verwendet. Um eine unspezifische Wechselwirkung der Ziegen-Sekundärantikörper zu vermeiden, wurden Gewebeproben mit Ziegenserum blockiert. (Rechts) Balkendiagramm, das die Quantifizierung von Anti-Netrin-1- oder Isotyp-Kontroll-Antikörpersignal hervorhebt, das mit Anti-CD31-Antikörpersignal kolokalisiert wird. N=13 Tumoren (von zwei Mäusen) pro Gruppe von MMTV-PyMT und N=7 Brustdrüsen (von einer Maus) pro Gruppe normaler Drüsen; Fehlerbalken vorhanden SEM; Zwei-Gruppen-Vergleiche wurden mit dem T-Test des Schülers durchgeführt. Abbildung mit Genehmigung von 19 unter der Creative Commons Lizenz CC BY 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) neu gedruckt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Diese Methode hat mehrere kritische Schritte und erfordert potenzielle Änderungen, um eine erfolgreiche Implementierung sicherzustellen. Erstens müssen die Dosierung und das Timing der intravenösen Injektion von Antikörper/Antikörperkonjugat auf die jeweilige Anwendung zugeschnitten sein. Im Allgemeinen sollten Dosierungen verwendet werden, die mit der Art und Weise übereinstimmen, wie das Antikörperkonjugat typischerweise verwendet wird, d. h. passende Dosierungen des therapeutischen Antikörpers oder des Antikörper-basierten Kontrastmittels. Auch der Zeitpunkt der Sammlung von Zielgeweben sollte sorgfältig überlegt werden. Antikörper und Antikörperkonjugate haben längere Zirkulationszeiten als Standardmedikamente und Kontrastmittel, diese sind jedoch sehr variabel und sollten für die gewünschte Anwendung optimiert werden, es wird jedoch empfohlen, mindestens 24 h Zirkulationszeit 27 zu ermöglichen. . Zweitens kann es während der Zielgewebeentnahme erforderlich sein, eine intrakardiale Perfusionstechnik zu implementieren, um frei zirkulierende Antikörper aus dem Blutpool zu entfernen19. Bei der Tumorverteilung von B7-H3-ICG wurde es aufgrund ausreichend langer Durchblutungszeiten (96 h) und der extravaskulären Lokalisation des Mittels für unnötig befunden. Für die Netrin-1-Anwendung der IVIL-Methode wurde die Herzperfusion jedoch aufgrund der endothelialen Expression von Netrin-1 und seines relativ niedrigen Expressionsniveaus als relevant angesehen. Drittens ist es bei der Ex-vivo-Gewebefärbung zwingend erforderlich, alle Dias zu färben, die während derselben Sitzung quantitativ verglichen werden, und mit den gleichen Lösungen, um normale Variationen zwischen den Chargen zu verhindern. Stellen Sie sicher, dass die Dias zwischen den Stufen richtig abspült werden und die hydrophobe Stiftlösung nicht mit dem Gewebe in Berührung kommt, um eine suboptimale Färbung zu vermeiden. Während der konfokalen Mikroskopie sollten Sie die gleichen Bildeinstellungen zwischen den Dias beibehalten, um eine relative Quantifizierung zu ermöglichen und schnell zu arbeiten, um photobleichen der Dias zu verhindern. Diese Schlüsselpunkte erhöhen die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen IVIL-Implementierung.
Die IVIL-Methode bietet mehrere Vorteile. Erstens, während die Methode den Standard-IF-Techniken ähnelt, liefern die beiden erheblich unterschiedliche Informationen. IF-Färbung zeigt die anatomische Position molekularer Marker im Gewebe zu einem bestimmten Zeitpunkt an (wenn das Gewebe gesammelt und fixiert wurde). IVIL liefert jedoch Informationen darüber, wie ein Antikörper- oder Antikörperkonjugat, wie die Lokalisierung von B7-H3-ICG zeigt, verteilt und interagiert, unabhängig davon, ob es sich um eine spezifische oder unspezifische Akkumulation, Internalisierung oder Retention im Ziel handelt. gewebe. Dies ist entscheidend für pharmakokinetische/dynamische und Bioverteilungsstudien. Zweitens werden traditionelle IF-Methoden manchmal durch die Fixierung der Gewebe begrenzt, die Antigenverzerrungen oder Maskierungen verursachen können, die eine Bindung durch den primären Antikörper28verhindern. Daher kann IVIL nützlich sein, wenn Standard-IF-Färbung oder Immunhistochemie fehlschlagen. Die IVIL-Technik kann als ergänzende Methode zur Überprüfung der in vivo-Antikörperaktivität betrachtet werden, die andernfalls nicht nachweisbar wäre. Schließlich werden diejenigen, die mit traditionellen IF-Färbetechniken vertraut sind, die Methode in der Ausführung einfach finden und die meisten der benötigten Materialien zur Hand haben.
Die IVIL-Methode hat einige Einschränkungen. Erstens liefert IVIL aufgrund der Notwendigkeit, das Tier einzuschläfern, um das Zielgewebe zu ernten, nur biologische Interaktionsinformationen zu einem einzigen Zeitpunkt. Die Injektion des primären Antikörper- oder Antikörperkonjugats zu unterschiedlichen Zeitpunkten in verschiedene Tiere wird ein breiteres Zeitfenster mit Informationen über die Bioverteilung und In-vivo-Interaktion ermöglichen. Zweitens, wenn Benutzer mit in vivo Tiertechniken nicht vertraut sind, wie intravenöse Schwanzveneninjektion oder mögliche intrakardiale Perfusion, kann dies eine Einschränkung der Methode sein. Diese Methoden erfordern qualifiziertes Personal, um zuverlässig zu arbeiten. Die Verwendung eines Katheters während der Injektion der Schwanzvene stellt jedoch sicher, dass die gesamte Dosis angewendet wird, da die richtige Nadelplatzierung vor der Injektion bestätigt werden kann. Zusätzlich, eine Alternative zur Schwanzveneninjektion, die in Betracht gezogen werden könnte, ist retro-orbitale Injektion, die in der Regel eine höhere Erfolgsrate mit weniger erfahrenem Personal hat. Die Notwendigkeit, alle Gewebedias in derselben Charge zu färben und abzubilden, um eine quantitative Bewertung zu ermöglichen, begrenzt die Anzahl der Proben und Marker, die in eine einzige Studie einbezogen werden können. Die Studie muss möglicherweise in serielle Färbung an verschiedenen Tagen und auf benachbarten Gewebescheiben organisiert werden, um die gewünschten Informationen zu sammeln. Schließlich wirft die Verwendung von artgerechten Antikörpern, d. h. murinen Anti-Maus-Antikörpern in murinen präklinischen Modellen, ein Problem der unspezifischen Hintergrundfärbung mit sekundären Antikörpern auf. Daher ist die Verwendung von artenunübereinstimmenden Primärantikörpern erforderlich, wie in dieser Studie dargelegt, oder es müssten fluoreszierend gekennzeichnete, artgerechte Primärantikörper verwendet werden.
Die IVIL-Technik ist für die Bioverteilungsanalyse diagnostischer und therapeutischer Antikörper für viele Anwendungen nützlich. Verschiedene Anwendungen für den intravenösen Antikörper oder Die Ligandeninjektion und die Ex-vivo-Gewebeanalyse wurden bereits berichtet und bestätigen das Interesse, dieses Färbeverfahren weit zu einführen. Robertson und Kollegen bezeichneten Gefäßelemente wie Endothelkapillaren und größere Gefäße mit intravenösen Injektionen von Lycopersicon esculentum agglutinin (Tomatenlectin)29. Die Technik war kompatibel mit der Histochemie und Immunzytochemie und zeigte Gefäßmuster und funktionelle parenchymale Eigenschaften. Obwohl, die Verwendung von fluoreszierenden Liganden wurde durch den schnellen Abbau der Fluoreszenz bei injektion30begrenzt. Wie das IVIL-Protokoll zeigt, könnte die Injektion eines primären Antikörpers in vivo gefolgt von einer Ex-vivo-Kennzeichnung mit einem sekundären fluoreszierenden Antikörper ein robusterer Ansatz sein. Eine weitere interessante Anwendung dieser Art der in vivo IF Färbung ist die Kennzeichnung von intravaskulären Lymphozyten, wie Anderson und Kollegen31gezeigt haben. Intravenös injizierte Antikörper wurde verwendet, um in Blutgefäßen lokalisierte Lymphozyten zu kennzeichnen, die anschließend gesammelt und zur Analyse der Durchflusszytometrie von immunologischen Markern weiterverarbeitet wurden. Um schließlich die Verabreichung und histologische Lokalisation von Antikörpertherapeutika zu bewerten, die Patienten mit Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) geliefert wurden, wurde eine erste in-humane Studie zur Antikörperverteilung mit systemischer verabreichten Nahinfrarot-fluoreszierend markierten therapeutischen Antikörper cetuximab-IRDye800CW32. Die Daten wurden mit histologischen Analysen verglichen und zeigten, dass das fluoreszierende Signal mit der Entfernung vom Tumor abnahm, der die Spezifität bestätigte. Obwohl der therapeutische Antikörper nicht alle Regionen der Antigenexpression erreichte, insbesondere die gut differenzierten Tumorregionen mit hohen Konzentrationen des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR)-Antigens. Im aktuellen Kontext der Krebsforschung, die sich auf die Entwicklung gezielter Therapien und Immuntherapien konzentriert, die auf starke Resistenzen und mangelnde Wirksamkeit stoßen, wäre die IVIL-Methode ein ausgezeichnetes Instrument, um die Verteilung von therapeutischen Antikörpern zu untersuchen. wie PD-1/PD-L-1 oder HER233,34. Diese Ergebnisse sind äußerst wertvoll, um zu verstehen, warum gezielte Therapien in bestimmten Fällen wirksam sind und die Entwicklung neuartiger Ansätze fördern. Zusammengenommen unterstreichen diese Beispiele die potenzielle Bedeutung des IVIL-Ansatzes.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Andrew Olson (Stanford Neuroscience Microscopy Service) für Diskussionen und den Einsatz von Geräten. Wir danken Dr. Jürgen K. Willmann für seine Betreuung. Diese Studie wurde durch das NIH R21EB022214 Grant (KEW), NIH R25CA1118681 Training Grant (KEW) und NIH K99EB023279 (KEW) unterstützt. Der Stanford Neuroscience Microscopy Service wurde von NIH NS069375 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Model | |||
| FVB/N-Tg(MMTV-PyMT)634Mul/J | The Jackson Laboratory | 002374 | Females, 4-6 weeks of age |
| Animal Handling Supplies | |||
| 27G Catheter | VisualSonics | Please call to order | Vevo MicroMarker Tail Vein Access Cannulation Kit |
| Alcohol Wipes | Fisher Scientific | 22-246073 | |
| Gauze Sponges (4" x 4" 16 Ply) | Cardinal Health | 2913 | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29404 | |
| Ophthalmic Ointment | Fisher Scientific | NC0490117 | |
| Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
| Tissue Collection | |||
| Disposable Base Molds | Fisher Scientific | 22-363-556 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Medium | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Surgical London Forceps | Fine Science Tools | 11080-02 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Antibodies | |||
| AlexaFluor-488 goat anti-rat IgG | Life Technologies | A-11006 | |
| AlexaFluor-546 goat anti-rabbit IgG | Life Technologies | A-11010 | |
| AlexaFluor-594 goat anti-human IgG | Life Technologies | A11014 | |
| Human IgG Isotype Control | Novus Biologicals | NBP1-97043 | |
| Humanized anti-netrin-1 antibody | Netris Pharma | contact@netrispharma.com | |
| Rabbit anti-Mouse CD276 (B7-H3) | Abcam | ab134161 | EPNCIR122 Clone |
| Rat anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 550274 | MEC 13.3 Clone |
| Reagents | |||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153-50G | |
| Clear Nail Polish | Any local drug store | ||
| Indocyanine Green - NHS | Intrace Medical | ICG-NHS ester | |
| Mounting Medium | ThermoFisher Scientific | TA-006-FM | |
| Normal Goat Serum | Fisher Scientific | ICN19135680 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Sterile Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher Scientific | 14190250 | |
| Triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Supplies | |||
| Adhesion Glass Slides | VWR | 48311-703 | |
| Desalting Columns | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| Glass Cover Slips | Fisher Scientific | 12-544G | |
| Hydrophobic Barrier Pen | Ted Pella | 22311 | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | |
| Slide Staining Tray | VWR | 87000-136 | |
| Software | |||
| FIJI | LOCI, UW-Madison. | Version 4.0 | https://fiji.sc/ |
References
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